CN114286677A - 作为β-连环蛋白/TCF4相互作用调节剂的杂环化合物 - Google Patents

Abstract

本文提供可用于抑制β‑连环蛋白或破坏β‑连环蛋白与T细胞因子4之间相互作用的化合物或抑制β‑连环蛋白或破坏β‑连环蛋白与T细胞因子4之间相互作用的方法，它们可用于治疗疾病或健康状况，例如癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病。在一个方面，所述化合物具有式1：

其中，R¹是‑(CR⁴ ₂)_mXR⁵；R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；且R³是‑(CR⁶ ₂)_nR⁷。

Description

作为β-连环蛋白/TCF4相互作用调节剂的杂环化合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月4日提交的新加坡专利申请号10201908175Q的优先权，其全部内容通过引用并入此文。

技术领域

本公开总体涉及抑制Wnt/β-连环蛋白(β-cat)信号通路的方法。更具体而言，本公开提供β-cat/T细胞因子(TCF4)的小分子抑制剂，相互作用导致下游Wnt表达减弱。本文提供的化合物和方法可用于治疗、管理或预防通过抑制β-cat和TCF4相互作用而改善的疾病，例如癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病。

背景技术

经典Wnt/β-cat信号通路是胚胎正常发育和成体组织自我更新所需的重要信号转导通路。通路的激活是通过Wnt配体蛋白与卷曲蛋白(Frizzled)和低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)结合实现的。在缺乏Wnt激活的情况下，由Axin、酪蛋白激酶1α(CK1α)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和结肠腺瘤样息肉(APC)组成的破坏复合体磷酸化β-cat，Wnt信号的关键核效应器，并以其为泛素化和蛋白酶体降解的靶点。当Wnt配体激活该通路时，破坏复合体重新聚集到膜上，导致其失活。对破坏复合体的抑制会导致非磷酸化β-cat的细胞质积累，并使其随后迁移到细胞核，在那里它与淋巴增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)家族转录因子以及包括Bcl-9和Pygopus的许多其他辅因子结合，激活下游靶基因表达。

由于Wnt通路在维持组织内稳态方面的重要性，Wnt通路的异常激活，尤其是在干细胞中的异常激活，通常是疾病(例如癌症)的驱动因素。特别是，已经证实在大多数结直肠癌(CRC)中，APC抑癌基因功能的丧失是肿瘤发生的早期驱动因素，导致腺瘤的形成。此外，Axin2功能缺失突变和β-cat激活突变在肝细胞癌(HCC)中普遍存在，但它们也能在CRC中以较低频率被发现。除了癌症，Wnt通路的失调也与疾病(例如神经退行性疾病、代谢性疾病和骨病)的发展有关。因此，许多Wnt通路靶向药剂，包括小分子抑制剂和基于抗体的治疗方法，多年来已被报道。尽管Wnt靶向药物实体有大量有希望的发现，但大多数都未能进行人体临床实验。已经有一些小分子抑制剂的单独实例进入了I期实验；然而，到目前为止，还没有一个被批准用于临床。这些药剂在作为治疗方法的发展过程中面临的一个挑战是，Wnt信号通路与其他通路(例如Notch和Hedgehog)之间存在显著的串扰。通路之间的串扰可能限制这些药剂的特异性，或通过代偿性激活影响其治疗反应的疗效。另外，Wnt通路线性级联中各种成分的驱动突变也可能限制这些药剂的通路抑制效果。

因此，可以预测，通过抑制下游Wnt靶基因表达所需的β-cat-TCF4相互作用，可以实现Wnt通路的有效和特异性下调。这种策略的优点有两个方面。首先，靶向β-cat-TCF4相互作用在Wnt途径下游组分存在突变的疾病中更有效，从而使上游抑制剂的效果降低。其次，这一策略专门针对β-cat的转录功能而不影响其与E钙粘蛋白(ECAD)在细胞-细胞粘附连接处(AJs)的相互作用。有人提出，特异性可以通过选择性靶向不同于β-cat-TCF4结合袋的β-cat-TCF4结合袋来实现。

此前有报道称，一种基于细胞基RNA干扰(RNAi)的化学遗传筛查识别了抑制β-cat-TCF4相互作用的化合物。由筛查可知，发现3种化合物；iCRT3、iCRT5和iCRT14能够破坏β-cat-TCF4的相互作用，而不会影响β-cat与ECAD的相互作用。iCRT3与β-cat的电子对接预测iCRT3与β-cat上与TCF4延伸区(残基13-25)结合的位点结合。该预测的β-cat上的iCRT3结合位点由Arg469和Lys435排列(line)，其与TCF4的Asp16形成盐桥且对TCF4与β-cat的高亲和力至关重要。由于这种结合袋(binding pocket)对β-cat-TCF4相互作用的重要性，多年来，它一直是用于识别β-cat-TCF4相互作用抑制剂的电子对接研究的一个有吸引力的目标位点。

因此，需要改进方法来抑制β-cat-TCF4相互作用和伴随的下游Wnt信号的衰减，以解决或克服至少一些上述挑战。

还需要能够治疗可通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用而改善的疾病或健康状况的治疗试剂。

发明内容

利用已知β-cat-TCF4相互作用抑制剂的现有的蛋白质x-射线晶体结构和的生物活性，本文描述了一个计算模型，该模型可以更好地预测这种蛋白质-蛋白质相互作用表面的潜在小分子抑制剂。为证明计算模型系统的可预测性，对小分子库进行了电子筛选，并识别了27种化合物作为与β-cat的潜在粘合剂。苗头化合物的实验验证识别了3种有效的Wnt报告活性抑制剂，其中化合物GB1874在体外和体内表型分析中被发现能诱导强烈的Wnt肿瘤抑制表型。基于这些结果和进一步的电子及生物筛选，识别了强烈抑制Wnt报告活性的化合物家族。

在一个方面中，本文提供化合物在制造用于治疗疾病或健康状况的药物中的用途，所述疾病或健康状况通过抑制β-连环蛋白(β-cat)或破坏β-cat与T细胞因子4(TCF4)之间的相互作用而得到改善，其中化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

在另一个方面中，本本提供一种抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用的方法，所述方法包括：使β-cat与式1的化合物：

或其药学上可接受的盐接触，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

在另一个方面中，本文提供一种治疗有需要的受试者的疾病或健康状况的方法，所述疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-ca与TCF4之间的相互作用而得到改善，所述方法包括施用治疗有效量的式1的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

在另一个方面中，本文提供一种用于治疗疾病或健康状况的化合物，所述疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用而得到改善，其中所述化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元环烷基或4至7元杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

在另一个方面中，本文提供一种用于治疗的化合物，其中所述化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

附图说明

当结合附图时，本公开的上述以及其他目的和特征将从以下对本公开的描述变得易懂。

图1描述了用于配体发现的β-连环蛋白结构生成的建模和对接平台。3种晶体结构用作起始模型(N＝3)。小分子训练库包括3种已知的β-连环蛋白抑制剂(M＝3)。在一次迭代中，每一个靶结构都将在3种已知对接配体中每一种的存在下进一步优化。

图2描述了对Wnt信号抑制预测化合物的电子研究。(a)HEK293T STF细胞中预测化合物的TOPFlash报告活性。细胞用10μM的化合物处理，同时用500ng/mL的Wnt3A刺激24小时，然后再测量荧光素酶活性。化合物处理细胞的TOPFlash报告活性被标准化为细胞活力，并呈现为DMSO处理细胞的差异倍数。误差条代表4次重复的标准偏差。(b)iCRT3和苗头化合物对TOPFlash报告活性的二次剂量反应抑制。在测量荧光素酶活性之前，STF细胞用不同浓度的化合物处理，同时用500ng/mL的Wnt3A刺激24小时。用不同浓度的化合物处理的细胞的荧光素酶活性首先被标准化为相同浓度的细胞活力，并呈现为DMSO处理细胞的差异倍数。使用四参数非线性回归计算IC₅₀值。误差条代表3次重复的标准偏差。(c)iCRT3和前三名苗头化合物的化学结构。(d)iCRT3(i)，以及本研究中发现的3个新的苗头化合物：GB8679(ii)、GB6853(iii)和GB1874(iv)的在优化、最丰富的β-连环蛋白结构(部分透明表面)中的预测结合模式。对接配体突出显示(实心棒)，关键β-连环蛋白结合位点残基(部分透明棒)。图中还显示了β-连环蛋白/TCF4晶体复合体结构(PDBID 1JPW)中的TCF4肽片段(实线)，以指示PPI界面。

图3描述了苗头化合物通过Wnt信号通路对HCT116细胞的影响。(a)β-连环蛋白及其内源性结合配偶体(parter)的共免疫沉淀。HCT116细胞用指定浓度的苗头化合物处理18小时。从处理过的细胞的蛋白质裂解物中免疫沉淀出β-连环蛋白，并通过Western blot分析与β-连环蛋白结合的TCF4和E钙粘蛋白的量(上图)。TCF4(右下图)或E钙粘蛋白(左下图)在不同处理下与β-连环蛋白结合的定量化，并针对DMSO处理的细胞进行标准化。误差条代表n＝4独立实验的标准偏差。DMSO对照和化合物处理之间进行双尾配对学生t检验。*P<0.05，ns P>0.05。(b)HCT116细胞用DMSO或50μM的化合物处理18小时。通过Western印迹法测定Wnt靶蛋白c-Met、细胞周期蛋白D1和生存素的表达。(c)HCT116细胞用DMSO或50μM的化合物处理18小时。通过Western印迹法测定Wnt通路相关蛋白E钙粘蛋白、β-连环蛋白和TCF4的表达。(d)表面等离子体共振(SPR)研究的化合物GB1874对β-连环蛋白的代表性结合曲线。根据化合物GB1874的各浓度绘制稳态响应值，并使用特异性结合与Hill slope曲线拟合方程计算解离常数K_D(n＝3)。(e)化合物GB1874对β-连环蛋白和GST-TCF4结合的SPR剂量反应抑制。采用四参数非线性回归计算IC50值(n＝2)。

图4描述了苗头化合物对生长的抑制作用及其对Wnt驱动细胞的干性的影响。(a)每天用10μM化合物处理的HCT116细胞的生长曲线。采用Dunnett多重比较实验进行单向重复ANOVA，以确定化合物处理和DMSO对照之间的显著性。*P<0.05，***P<0.001。(b)苗头化合物对HCT116细胞集落形成的影响。HCT116细胞在6孔板中生长，并以DMSO或30μM的化合物处理7天，然后固定细胞并用结晶紫染色。计数获得的集落数。在化合物处理和DMSO对照之间进行双尾学生t检验。***P<0.001。(c)苗头化合物对HCT116细胞球体形成的影响。HCT116细胞在超低附着96孔板中生长，并以DMSO或30μM的化合物处理14天，然后确定尺寸为≥200μm的球体的数量。在化合物处理和DMSO对照之间进行双尾学生t检验。***P<0.001，**P<0.01。比例尺代表1mm。(d)用HCT116细胞异种移植的NSG小鼠每隔一天用载体对照(n＝6)或50mg/kg GB1874(n＝6)经腹腔注射治疗2周。随时间推移监测肿瘤体积。在第17天，在对照和治疗之间进行双尾学生t检验。*P<0.05。

图5描述了iCRT类似物的电子预测对接的分数和体外基于细胞的IC50值。对接(DOCK)分数越低，结合预测越好。等级(RANK)分数越低，预测结合越好。有利(1)，中性(0)，不利(-1)。(*)越多，排名越高。nd＝未确定。

图6A描述了从烯胺药理多样性化合物库中识别出的前27种化合物的DOCK分数。

图6B描述了从烯胺药理多样性化合物库中识别出的前27种化合物的结构。

图7描述了(a)化合物处理24小时后STF细胞的细胞活力。将化合物处理细胞的活力测量标准化为DMSO处理细胞。误差条代表4次重复的标准偏差。(b)iCRT3和苗头化合物在24小时处理后对STF细胞活力的剂量反应效应。将化合物处理细胞的活力测量标准化为DMSO处理细胞。使用四参数非线性回归计算IC₅₀值。误差条代表3次重复的标准偏差。

图8描述了(a)不同浓度的分析物化合物GB1874与β-连环蛋白配体的结合传感图。(b)50nMβ-连环蛋白分析物与GST-TCF4配体的结合传感图。在与GST-TCF4结合之前，将β-连环蛋白与不同浓度的化合物GB1874预孵育15分钟。

图9描述了苗头化合物对(a)DLD-1和(b)SW480细胞球体形成的影响。细胞在超低附着96孔板中生长，并以DMSO或30μM化合物处理7天，然后确定尺寸为≥200μm的球体的数量。在化合物处理和DMSO对照之间进行双尾学生t检验。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。比例尺代表1mm。(c)用HCT116细胞异种移植的NSG小鼠每隔一天用载体对照(n＝6)或50mg/kgGB1874(n＝6)经腹腔注射治疗2周。随时间推移监测小鼠体重。在第17天，在对照和治疗之间进行双尾学生t检验。ns P>0.05。

图10描述了GB1874及其类似物对β-连环蛋白(CTNNB1)和Wnt靶基因表达的影响。

图11描述了GB1874通过抑制Wnt信号在体内抑制Wnt驱动细胞的生长。(a)用HCT116细胞异种移植的NSG小鼠每隔一天用载体对照(n＝6)或50mg/kg GB1874(n＝6)经腹腔注射治疗2周。随时间推移监测肿瘤体积(左图)。在载体对照和治疗肿瘤体积之间进行双向ANOVA。*P<0.05。误差条代表平均值±SEM。右图显示了治疗结束时的肿瘤图像。比例尺代表1cm。(b)肿瘤中Ki67和细胞周期蛋白D1表达的代表性IHC染色(左图)。比例尺代表100μm。每单位肿瘤面积表达细胞周期蛋白D1和Ki67的细胞数量的量化(右图)。在载体对照和治疗之间对每个标记物进行单尾学生t检验。**P<0.01，*P<0.05，ns P>0.05。误差条代表3个肿瘤的平均值±SD。

具体实施方式

以下是一些有助于理解本发明描述的定义。这些术语旨在作为一般定义，并且不应以任何方式使本发明的范围仅限于这些术语，而是为了更好地理解以下描述而提出的。

除非上下文另有要求或明确说明相反，否则本文所述的作为单数整数、步骤或元素的本发明的整数、步骤或元素清楚地包括所述整数、步骤或元素的单数形式和复数形式。

在本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包含(comprise)”一词或变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为包含一个所述步骤或元素或整数或多个步骤或元素或整数的组，但不排除任何其他步骤、元素、整数或多个元素或整数的组。因此，在本说明书的上下文中，术语“包括(comprising)”指“主要包括但不一定仅限于”。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明容易受到除具体描述的那些以外的变化和修改的影响。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。

在本说明书的上下文中，术语“氨基酸”被定义为具有至少一个伯、仲、叔或季氨基，以及至少一个酸基团，其中酸基可以是羧酸基、磺酸基或膦酸基，或其混合物。相对于一个或多个酸基，氨基可以是“α”、“β”、“γ”……到“ω”。“氨基酸”的主链可被一个或多个选自由卤素、羟基、胍基、杂环基团组成的组的基团取代。因此，术语“氨基酸”在其范围内还包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和组氨酸、牛磺酸、甜菜碱、N-甲基丙氨酸等。氨基酸的(L)和(D)形式包括在本发明的范围内。

如本文所用，术语“烷基基团”在其含义内包括一价(“烷基”)和二价(“亚烷基”)直链或支链饱和脂肪族基团，其具有1至10个碳原子，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。例如，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。

术语“烯基基团”在其含义内包括一价(“烯基”)和二价(“亚烯基”)直链或支链不饱和脂肪烃基，其具有2至10个碳原子，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，并在烷基链中的任何位置具有至少一个E、Z、顺式或反式立体化学双键(如适用)。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。

本文中使用的术语“炔基基团”在其含义内包括一价(“炔基”)和二价(“亚炔基”)直链或支链不饱和脂肪族烃基，具有2至10个碳原子，并在碳链中的任何位置具有至少一个三键。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、1-壬炔基、1-癸炔基等。

如本文所用，“芳基”是指芳香族单环烃环系统或多环环系统，其中两个或更多个芳香族烃环稠合(即，具有共同键)在一起，或至少一个芳香族单环烃环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环。芳基基团在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-C24芳基基团)，其中可以包括多个稠环。在某些实施方式中，多环芳基基团可具有8至24个碳原子。芳基基团的任何合适的环位置都可以与所定义的化学结构共价连接。仅具有一个或多个芳香碳环的芳基基团的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、并五苯基(五环)及类似基团。其中至少一个芳香碳环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环的多环环系统的实例包括以下物质的苯并衍生物：环戊烷(即，二氢茚基基团，其为5,6-二环环烷基/芳香环系统)、环己烷(即四氢萘基基团，是6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉(即苯并咪唑啉基基团，是5,6-双环杂环烷基/芳香环系统)和吡喃(即苯并吡喃基基团，是6,6-双环杂环烷基/芳香环系统)。芳基基团的其他实例包括苯并二噁烷基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基基团等。在某些实施方式中，芳基基团可以任选地地被取代。在某些实施方式中，芳基基团被另一个芳基基团取代，可以称为联芳基基团。联芳基基团中的每一个芳基基团均可任选地被取代。

如本文所用，“杂芳基”是指包含至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的环杂原子的芳香族单环环系统，或其中存在于环系统中的至少一个环为芳香族且包含至少一个环杂原子的多环系统。多环杂芳基基团包括具有两个或更多个稠合在一起的杂芳环的基团，以及具有至少一个稠合到一个或多个芳香碳环、非芳香碳环和/或非芳香环杂烷基环的单环杂芳基环的基团。杂芳基基团作为一个整体可具有例如5至24个环原子，并包含1至5个环杂原子(即，5至20元杂芳基基团)。杂芳基基团可以在任何杂原子或碳原子处连接到限定的化学结构上从而形成稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基基团中的一个或多个N或S原子可以被氧化(例如，吡啶N-氧化物噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基基团的实例包括例如如下所示的5元或6元单环和5至6双环系统：其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH₂、SiH(烷基)、Si(烷基)₂、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)₂或Si(烷基)(芳基烷基)。此类杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯丙呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、lH-吲唑基、2H-吲唑基、吲嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、2，3-二氮杂萘基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑吡啶基、噻唑吡啶基、咪唑吡啶基、呋喃吡啶基、噻吩吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基基团的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩吡啶基、苯并呋喃吡啶基等。在某些实施方式中，杂芳基基团可以被任选地取代。

本文中使用的术语“环烷基”是指环状饱和脂肪族基团，并在其含义内包括一价(“环烷基”)和二价(“环亚烷基”)、饱和的、单环的、双环的、多环的或稠合的多环烃自由基，其具有3至10个碳原子，例如，3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、2-甲基环丙基、环丁基、环戊基、2-甲基环戊基、3-甲基环戊基、环己基等。

本文中使用的术语“环烯基”是指环状不饱和脂肪族基团，在其含义中包括一价(“环烯基”)和二价(“环亚烯基”)、单环的、双环的、多环的或稠合的多环烃自由基，其具有3至10个碳原子，并在烷基链中的任何位置具有至少一个E、Z、顺式或反式立体化学双键(如适用)。环烯基基团的实例包括但不限于环丙烯基、环戊烯基、环己烯基等。

本文中使用的术语“杂环烷基”在其含义内包括一价(“杂环烷基”)和二价(“杂环亚烷基”)、饱和的、单环的、双环的、多环的或稠合的烃自由基，其具有3至10个环原子，其中1至5个环原子是选自O、N、NH或S的杂原子。实例包括吡咯烷基、哌啶基、奎宁环基、氮杂环丁烷基、吗啉基、四氢苯硫基、四氢呋喃基、四氢吡喃基等。

本文中使用的术语“杂环烯基”在其含义内包括一价(“杂环烯基”)和二价(“杂环亚烯基”)、饱和的、单环的、双环的、多环的或稠合的多环烃自由基，其具有3至10个环原子，并至少具有1个双键，其中，1至5个环原子是选自O、N、NH或S的杂原子。

术语“杂芳香基团”和本文中使用的变体例如“杂芳基”或“杂亚芳基”在其含义内包括一价(“杂芳基”)和二价(“杂亚芳基”)、单核、多核、共轭和稠合芳族自由基，其具有6至20个原子，其中1至6个原子是选自O、N、NH和S的杂原子。此类基团的实例包括吡啶基、2,2'-联吡啶基、菲咯啉基、喹啉基、苯硫基等。

本文中使用的术语“卤素”或变体例如“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。

本文中使用的术语“杂原子”或变体例如“杂原子-”是指O、N、NH和S。

本文中使用的术语“烷氧基”是指直链或支链烷氧基基团。实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。

本文中使用的术语“氨基”是指形式-NR_aR_b的基团，其中R_a和R_b单独选自包括但不限于氢、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基和任选的取代的芳基基团的组。

本文中使用的术语“芳香族基团”或变体例如“芳基”或“亚芳基”是指具有6至10个碳原子芳烃的一价(“芳基”)和二价(“亚芳基”)单、多核、共轭和稠合残基。此类基团的实例包括苯基、联苯、萘基、菲基等。

本文中使用的术语“芳烷基”在其含义内包括连接到二价的、饱和的、直链和支链亚烷基的一价(“芳基”)和二价(“亚芳基”)、单核、多核、共轭和稠合芳烃自由基。

本文中使用的术语“杂芳烷基”在其含义内包括连接到二价饱和的、直链和支链亚烷基的一价(“杂芳基”)和二价(“杂亚芳基”)、单核、多核、共轭和稠合芳烃自由基。

本文中使用的术语“任选地取代的”指的是该术语所指的基团可以未被取代，或者可以被一个或多个独立地选自烷基、烯基、炔基、硫烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰胺基、二酰胺基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基硫基、烷基羰氧基、烷基硫代、酰基硫代、含磷基团例如膦酰基和氧膦基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)₂的基团取代。

本发明在其范围内包括本文公开的化合物的所有异构形式，包括所有非对映异构体、外消旋体和对映体。因此，式(I)和(II)应当理解为包括，例如化合物的E、Z、顺式、反式、(R)、(S)、(L)、(D)、(+)和/或(-)形式，视情况而定。

在本发明的上下文中，术语“施用(administering)”以及该术语的变体包括“施用(administer)”和“施用(administration)”，包括通过任何适当的方式将本发明的化合物或组合物接触、应用、递送或提供给生物体或表面。

本文中使用的术语“受试者”指将成为或曾经成为治疗、观察和/或实验对象的动物，通常为哺乳动物或人类。当该术语与化合物或药物的施用结合使用时，则受试者已成为治疗、观察和/或化合物或药物施用的对象。在本说明书中，术语“受试者”包括人类和具有社会、经济或研究重要性的任何物种的个体，包括但不限于：绵羊、牛、马、猪、猫、狗、灵长类动物(包括人类和非人灵长类)、啮齿动物、小鼠、山羊、野兔和鸟类的成员。在某些实施方式中，受试者是人类。在某些实施方式中，术语“受试者”可指源自受试者的细胞样本、组织样本或器官样本，包括例如培养的细胞系、活检、血液样本或含有细胞的液体样本。

术语“取代的”旨在表示使用“取代的”表述中所示基团上的一个或多个(例如，1、2、3、4或5；在一些实施方式中为1、2或3；在其他实施方式中为1或2)氢原子被替换为来自所示一个或多个有机或无机基团中选择，或替换为本领域技术人员已知的合适的有机或无机基团，前提是不超过所示原子的正常价，并且取代产生稳定的化合物。合适的所示有机或无机基团包括，例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代、卤代烷基、羟基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环、环烷基、烷酰基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、二烷基胺基、三氟甲基硫基、二氟甲基、酰胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、羧基烷基、酮基、硫酮基、烷基硫代、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基硅烷基和氰基。另外，合适的所示基团可包括，例如，-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR₂、-S(＝O)₂O-、-S(＝O)₂R、-OS(＝O)₂OR、-S(＝O)₂NR₂、-OP(＝O)(OR)₂、-P(＝O)(OR)₂、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(S)R、-C(＝O)OR、-C(＝O)O-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR₂、-C(＝S)NR₂、-C(＝NR)NR₂，其中每个X独立地为卤素(或“卤”基团)：F、Cl、Br或I；每个R独立地为H、烷基、芳基、杂环、保护基或前药部分。如本领域技术人员容易理解的，当取代基为酮基(即，＝O)或硫酮基(即，＝S)等时，则被取代原子上的两个氢原子被取代基取代。

在本说明书的上下文中，术语“治疗”是指治疗疾病状态或症状、防止疾病形成或其他以任何方式防止、阻碍、延缓或逆转疾病或其他不良症状进展的任何和所有用途。

在本说明书的上下文中，术语“治疗有效量”在其含义内包括提供所需治疗效果的足量的本发明化合物或组合物。所需的确切剂量因受试者而异，取决于以下因素，例如被治疗的种类、受试者的年龄和一般状况、被治疗状况的严重程度、待施用的特定药剂、施用方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

本公开提供一种可用于抑制β-cat或破坏β-cat和TCF4之间的相互作用的化合物，其中化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；和

X是-O-、-S-或不存在。

在某些实施方式中，式I的化合物不包括以下化合物：

在某些实施方式中，X是-O-、-S-或不存在。在X不存在的情况下，R¹可具有结构：-(CR⁴ ₂)_mR⁵，其中m、R⁴和R⁵如本文所述任何一个或多个实施方式中所定义。

在某些实施方式中，m是0至3、0至2、0至1或1至2。在某些实施方式中，X是O或S；m是1。在某些实施方式中，X不存在，且m是1或2。

在某些实施方式中，m是0至3、0至2、0至1或1-2。

在某些实施方式中，n是0至3、0至2、0至1或1至2。

在某些实施方式中，R²是烷基、芳烷基、杂芳烷基；或-(CR⁹ ₂)_pR¹⁰，其中p是选自0至4的整数；R⁹每次出现时独立地为氢或烷基；且R10是烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。在某些实施方式中，R¹⁰是任选地取代的苯基、任选地取代的呋喃、任选地取代的噻吩、任选地取代的吡咯、任选地取代的咪唑、任选地取代的噁唑、任选地取代的异噁唑、任选地取代的噻唑、任选地取代的吡啶、任选地取代的吡嗪或任选地取代的三嗪。

在R²是-(CR⁹ ₂)_pR¹⁰的情况中，P可以是0至3、0至2、0至1或1至2。在某些实施方式中，R⁹每次出现时独立地为氢或烷基。在某些实施方式中，R²是-(CH₂)R¹⁰或-(CHMe)R¹⁰；且R¹⁰如本文中所定义。

在某些实施方式中，R⁴每次出现时为氢或烷基；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元或3至6元环烷基。在某些实施方式中，R⁴是氢。

在某些实施方式中，R⁵是环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基。在某些实施方式中，R⁵是芳基或杂芳基。在某些实施方式中，R⁵是任选地取代的苯基。

在某些实施方式中，R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂，其中R⁸是烷基、环烷基、芳基；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基。

在两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基的情况下，3至7元杂环烷基在其环系统中可包含1或2个选自氧、硫和氮的杂原子。

在R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的杂环烷基的情况下，化合物可具有式5：

或其药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R⁶和R⁸中的每一个独立地如本文中所定义；m是0至4；A表示4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基(在其环系统中包含1或2个选自氧、硫和氮的杂原子)；Y是-O-、-N(R⁸)-或不存在；或化合物可具有式6：

或其药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R⁶和R⁸中的每一个独立地如本文中所定义；m是0至3；A表示4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基(在其环系统中包含1或2个选自氧、硫和氮的杂原子)；Y是-O-、-N(R⁸)-或不存在。

在某些实施方式中，R⁸是C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基、联芳或多环烃；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7、4至7、5至7或5至6元任选地取代的杂环烷基；或化合物具有式6，其中A是5至6元任选地取代的环烷基。

在R⁷是具有式2部分的情况下，化合物可由式7表示：

或其药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R⁶和m中的每一个均各自独立地如本文中所定义。

在某些实施方式中，化合物具有式3：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁴每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁵是芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式4的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基；

R⁹每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R¹⁰是环烷基、芳基或杂芳基；和

X是-O-或不存在。

在某些实施方式中，化合物具有式3，其中R⁴是氢；R⁵是芳基；R⁹每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；R¹⁰是芳基；R⁶每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；R⁷是-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂，其中R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基。

在某些实施方式中，化合物具有式8：

或其药学上可接受的盐，其中

q是选自0至2的整数；

t是1或2；

R⁵是任选地取代的苯基；

R⁹是氢或烷基；

R¹⁰是任选地取代的苯基；

R¹¹每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SR、-OR、-O(C＝O)R、-O(C＝O)OR、-O(C＝O)N(R)₂、-NR₂或-N(R)(C＝O)N(R)₂,组成的组，其中R每次出现是独立地为氢、烷基、芳基或杂芳基；或两个R与它们所连接的一个氮或多个氮一起形成3至7元杂环烷基。

在某些实施方式中，化合物具有式8，q是0或1；t是1；R⁹是氢或C₁-C₃烷基；R¹¹是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基。

在某些实施方式中，化合物选自由以下物质组成的组：

或其药学上可接受的盐。

本文所述化合物的药学上可接受的盐可包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如来自无毒有机酸或无机酸。例如，此类常规无毒盐包括源自无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；以及由有机酸，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸等制备的盐。

在其他情况下，本文所述化合物可包含一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些实例中，术语“药学上可接受的盐”可指本文所述化合物的相对无毒、无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用载体或剂型制造过程中原位制备，或通过将游离酸形式的纯化化合物与合适的碱(例如，药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨、或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应。代表性碱或碱土盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用可在体外、体内或离体进行。

可通过将本文所述的一种或多种化合物与β-cat和β-cat-TCF4复合体中的至少一种接触来抑制β-cat或破坏β-cat和TCF4之间的相互作用。

将β-cat或β-cat/TCF4复合体与式1化合物接触可导致以下情况中的一种或多种：抑制一个或多个β-cat功能、抑制β-cat和TCF4之间的相互作用以及破坏β-cat/TCF4复合体，并可进一步导致Wnt信号的衰减。

因此，抑制β-cat或破坏β-cat和TCF4之间相互作用的方法可用于治疗抑制β-cat、破坏β-cat/TCF4复合体和/或减弱Wnt信号通路导致疾病或健康状况改善的疾病。

破坏β-cat和TCF4之间的相互作用可指抑制β-cat与TCF4结合或诱导β-cat-TCF4复合体解离从而形成β-cat和TCF4的一者或两者。

所需施用的式1化合物的量或浓度可由本领域普通技术人员使用众所周知的方法和本文提供的公开内容容易地确定。

本文提供了一种治疗疾病或健康状况的方法，该疾病或健康状况通过抑制有需要的受试者的β-cat和TCF4之间的相互作用而得到改善，该方法包括施用治疗有效量的本文所述化合物。在某些实施方式中，受试者是人类。

本公开还提供了一种用于治疗疾病或健康状况的如本文所述的化合物，该疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间相互作用而得到改善。

本公开进一步提供如本文所述的化合物在制造用于治疗疾病或健康状况的药物中的用途，该疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用而得到改善。

疾病或健康状况可以是癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病。

在某些实施方式中，疾病或健康状况是以Wnt、Myc和Hippo信号通路中的一个或多个异常活化为特征的癌症。

在某些实施方式中，疾病或健康状况是以Wnt/β-cat信号通路异常活化为特征的癌症。

Wnt/β-cat信号通路异常与许多不同的癌症有关，该通路中的许多基因缺陷可能有助于肿瘤的促进和进展。^1.Wnt/β-cat通路的激活是许多种人类癌症中最常见的信号异常之一，例如结直肠癌，^2.黑色素瘤，^3.肝母细胞瘤，^4.髓母细胞瘤，^5.前列腺癌，^6.子宫和卵巢子宫内膜样腺癌。^7-10.Wnt/β-V通路激活在乳腺化生癌中也很常见。^11.

因此，所提供的方法可用于治疗选自由结直肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、甲状腺癌、脑癌、髓母细胞瘤、肝母细胞瘤、硬纤维瘤、骨瘤、头颈癌以及子宫和卵巢子宫内膜样腺癌组成的组的癌症。

在某些实施方式中，癌症是以Wnt/β-cat信号通路异常激活为特征的结直肠癌。

实施例

虚拟化学库的生成

训练库由三种已知的β-cat-tcf4复合体抑制剂(包括iCRT3、iCRT5和iCRT14，^12.)和通过DUD-E方法^14.从ZINC数据库^13.中选择的作为阴性对照的150个属性匹配的计算诱饵组成。验证库由DasGupta实验室合成的63个iCRT3类似物组成。虚拟筛选库由从Enamine(https://enamine.net/)购买的10240个化合物组成。

分子对接筛选

对接之前生成球体和网格。通过用受体衍生的球体扩充配体衍生的球体，生成45个用于定位该位点中数据库化合物的匹配球体。配体衍生的球体在开始时由TCF4肽片段晶体结构的非氢原子位置表示，并在接下来的几轮中由iCRT配体的对接位点代替。从结合位点的分子表面使用SPHGEN^15.程序计算受体衍生的球体。对接筛选使用DOCK版本3.6^16.执行。对接化合物按对接能排序，对接能是范德华、泊松-玻尔兹曼静电和配体去溶剂化惩罚因子(penalty terms)的总和。

对接性能评估

配体预测中结构模型的准确性通过对得分最高的化合物中的已知配体富集来评估，通过早期富集因子EF1和总体富集logAUC测量，后者类似于接收器工作特性(ROC)曲线下面积(AUC)，但赋予早期富集更多权重。^16,17.

细胞系

Wnt-STF报告细胞(以TOPFlash报告稳定转染的HEK 293细胞)和STF3A报告细胞(具有Wnt3A固有分泌的STF细胞)是来自David Virshup(Duke-NUS Graduate MedicalSchool，新加坡)的馈赠。HCT116、DLD-1和SW480细胞系获自ATCC。Hippo通路TEAD报告(目录号60618)和Myc信号通路报告(目录号60520)细胞系购自BPS Bioscience，Inc。

培养基

STF、STF3A和DLD-1细胞在Dulbecco改良的伊格尔培养基(DMEM，Gibco目录号11965084)中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS，Hyclone目录号SV30160.03)和100U/mL青霉素-链霉素(Gibco目录号15140122)。HCT116、SW480和Myc信号通路报告细胞在McCoy的5A培养基(Gibco目录号16600108)中培养，该培养基补充有10％FBS和100U/mL青霉素-链霉素。Myc信号通路报告细胞的培养基另外补充有400μg/mL G-418硫酸盐(GoldBiotechnology目录号G-418-5)。Hippo通路TEAD报告细胞在含有Earle平衡盐(EBSS)(Hyclone目录号SH30024.01)的最低必需培养基(MEM)中培养，该培养基补充有10％FBS、100U/mL青霉素-链霉素、1％MEM非必需氨基酸(NEAA，Gibco目录号11140050)、1mM丙酮酸钠(Gibco目录号11360070)、400μg/mL G-418硫酸盐和10μg/mL胰岛素(Sigma Aldrich目录号I1882-100MG)。球体形成的培养基是DMEM/F-12(Gibco目录号11320082)，其补充有B27(Gibco目录号12587010)、100U/mL青霉素-链霉素、20ng/mL EGF(Gibco目录号PHG0313)、20ng/mL bFGF(Gibco目录号PHG0023)和3％基质胶(Corning目录号354234)。

TOPFlash(信号)报告筛选

STF细胞以每孔100μL的培养基中20,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903&3904)上接种。第二天，将DMSO中的候选化合物以10μM，1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。细胞也用Wnt3A条件培养基刺激。孵育24小时后，根据制造商的协议，用PrestoBlue活力试剂(Invitrogen目录号A13262)测定细胞活力，同时用Steady-Glo荧光素酶试剂(Promega目录号E2550)测定TOPFlash报告活性。

报告系剂量反应

Wnt信号报告

Wnt STF报告细胞以每孔100μL的培养基中20,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903，Falcon目录号353072)上接种。第二天，将5倍的化合物在DMSO中的稀释液以1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。细胞也用500ng/mL重组人Wnt3A(RnD体系，目录号5036-WN-010)刺激。孵育24小时后，根据制造商的协议，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Dojindo目录号CK04)细胞活力试剂测定细胞活力，同时使用Steady-Glo荧光素酶试剂测定TOPFlash报告活性。

STF3A报告细胞以每孔100μL的培养基中20,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903，Falcon目录号353072)上接种。第二天，将5倍的化合物在DMSO中的稀释液以1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。孵育24小时后，根据制造商的协议，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Dojindo目录号CK04)细胞活力试剂测定细胞活力，同时使用Steady-Glo荧光素酶试剂测定TOPFlash报告活性。

Myc信号报告

Myc报告(Luc)-HCT116细胞以每孔100μL的分析培养基中25,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903，Falcon目录号353072)上接种。分析培养基由不含G-418的生长培养基组成。第二天，将4倍的化合物在DMSO中的稀释液以1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。孵育24小时后，用PrestoBlue细胞活力试剂测定细胞活力，同时使用Steady-Glo荧光素酶试剂测定荧光素酶报告活性。

Hippo信号报告

Hippo TEAD报告细胞以每孔100μL的分析培养基中100,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903，Falcon目录号353072)上接种。分析培养基由不含G-418的生长培养基组成。第二天，将5倍的化合物在DMSO中的稀释液以1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。孵育24小时后，用CCK-8细胞活力试剂测定细胞活力，同时使用Steady-Glo荧光素酶试剂测定荧光素酶报告活性。

CRC细胞系的剂量反应研究

HCT116、DLD-1和SW480细胞以每孔100μL的生长培养基中5,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903)上接种。第二天，将化合物在DMSO中的5倍稀释液以1％DMSO的最终浓度添加到细胞中。孵育24小时后，根据制造商的协议，用CellTiter-Glo发光细胞活力试剂(Promega目录号G7573)测定细胞活力。

剂量反应研究的数据分析

计算每个板的DMSO处理孔的平均信号，并将每个处理孔的信号针对相应板的平均DMSO信号进行归一化。使用GraphPad Prism 5绘制标准化值与测试浓度的关系图，并通过三参数或四参数非线性回归确定EC₅₀值。

增殖实验

HCT116细胞以每孔100μL的生长培养基中3,000个细胞在96孔板(Corning目录号3903)上接种并允许吸附过夜。然后细胞用最终浓度为10％，0.1M DMSO的化合物连续处理4天，每天更换培养基。根据制造商的方案，使用CellTiter Glo发光细胞活力测定(Promega目录号G7573)测定每天的细胞增殖。

球体形成实验

HCT116、DLD-1和SW480以每孔200μL的球体介质中150个细胞在96孔超低吸附板(Corning目录号3474)上接种。化合物在细胞接种当天以30μM，0.5％DMSO的最终浓度添加。细胞在37℃，5％CO₂下生长，并使用Operetta CLS系统(Perkin Elmer)在细胞接种后第7天和第10天拍摄形成的球体图像。

蛋白质印迹

HCT116细胞用最终浓度为50μM，1％DMSO的化合物处理18小时。细胞于RIPA缓冲液(Thermo目录号89900)中在冰上裂解，该缓冲液包含cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche目录号11697498001)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche目录号04906837001)。每个样品30μg的总细胞蛋白通过SDS-PAGE解析，并印迹到PVDF薄膜(Millipore目录号PVH00010)上。一极抗体在4℃孵育过夜，并用IRDye 800CW山羊抗兔抗体(LI-COR目录号926-32211)或IRDye 680RD山羊抗鼠抗兔(LI-COR目录号926-68070)以1:5000的稀释度检测印迹。使用LI-COR Odyssey CLx成像系统对信号进行可视化，并使用LI-COR ImageStudio数据分析软件对波段进行量化。使用的一极抗体是Met(Cell SignallingTechnology目录号8198，1:1000)、细胞周期蛋白D1(Cell Signalling Technology目录号2978，1:1000)、生存素(Santa Cruz目录号sc-10811，1:500)、ECAD(Cell SignallingTechnology目录号3195，1:1000)、TCF4/TCF7L2(Cell Signalling Technology目录号2569，1:1000)、β-cat(Cell Signalling Technology目录号8480，1:1000)、β-肌动蛋白(Abcam目录号ab8226，1:3000)。

共免疫沉淀

HCT116细胞用指定浓度的化合物处理18小时。细胞于裂解缓冲液中在冰上裂解，该缓冲液包含20mM HEPES，pH 7.5、137mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1mM EGTA、1mM二硫苏糖醇(DTT)、1％Triton X-100、10％甘油、cOmplete蛋白酶抑制剂混合物(Roche目录号11697498001)和1mM Na₃VO₄。每个澄清蛋白质裂解物样品在4℃用4μg抗β-cat抗体(Sigma目录号C7207)孵育过夜，随后在4℃用50μL Dynabeads Protein G(Invitrogen目录号10004D)的浆液孵育1小时。然后在4℃用裂解缓冲液洗涤珠粒三次，并通过在95℃用30μL(每个样品)SDS样品缓冲液加热珠粒7分钟来洗脱结合蛋白。蛋白质通过SDS-PAGE解析，并印迹到PVDF薄膜(Millipore目录号IPVH00010)上。一级抗体在4℃孵育过夜，并用IRDye800CW山羊抗兔抗体(LI-COR目录号926-32211)或IRDye 680RD山羊抗鼠抗体(LI-COR目录号926-68070)以1:5000的稀释度检测印迹。使用LI-COR Odyssey CLx成像系统对信号进行可视化，并使用LI-COR Image Studio数据分析软件对波段进行量化。使用的一级抗体是E-钙粘蛋白(Abcam目录号ab15148，1:1000)、TCF4/TCF7L2(Cell SignallingTechnology目录号2569，1:1000)、β-cat(Cell Signalling Technology目录号8480，1:1000)。

蛋白质的表达与纯化

带有His标记的人β-cat(134至668)的pET-28β-cat表达载体的BL21(DE3)细胞在37℃培养直到OD600＝0.6至0.8。细胞然后用500μM异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)在23℃诱导6至8小时。细胞在裂解缓冲液中超声裂解，该缓冲液包含20mM Tris(pH 8.8)、250mM NaCl、2mM DTT、5％甘油、0.1％Triton X-100和cOmplete蛋白酶抑制剂混合物(无EDTA，Roche目录号11873580001)。裂解物与Ni-NTA琼脂糖珠粒(Qiagen目录号30210)在4℃孵育1小时，然后用含有20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤珠粒。结合蛋白用包含20mM Tris(pH8.8)、250mM NaCl、0.5mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、5％甘油和250mM咪唑的缓冲液洗脱。

GST标记的TCF4 N-末端结构域在BL21(DE3)细胞中类似地表达，在23℃以IPTG诱导2至4小时，并使用包含20mM Tris(pH 8.8)、250mM NaCl、0.5mM TCEP、5％甘油和10mM还原型谷胱甘肽的缓冲液从谷胱甘肽琼脂糖珠粒(Pierce目录号16100)中纯化。

表面等离子体共振(SPR)研究

与β-cat结合

使用BIACORE T100(GE Healthcare)在CM5系列S传感器芯片(GE Healthcare目录号BR-1005-30)上进行表面等离子体共振实验。使用胺偶联化学固定His标记的β-cat(60kDa，基于SDS-PAGE纯度>90％)。流动池(flow cells)1和2的表面使用0.1M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和0.1M EDC(3-(N,N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺)的1:1混合物以5μL/min的流率激活。PBS中的浓度为1μM、pH值为6.0的配体以8000RU的密度固定在流动池2上，流动池1保留空白作为参考表面。两个表面都用1M乙醇胺(pH为8.0)封闭。为了收集结合数据，将含有5％DMSO的PBS(pH 7.5)中的化合物GB1874以125、100、80、60、40和20μM的浓度以30μL/min的流率和25℃的温度注入两个流动池中。使复合体分别结合和解离120和600秒。表面通过以30秒注射50mM NaOH进行再生。收集RU响应，并使用GraphPad Prism 5针对测试的GB1874浓度绘图。利用Hill斜率曲线拟合函数，通过非线性特异性结合得到解离常数K_D。

抑制β-cat-TCF4相互作用

使用胺偶联化学在CM5系列S传感器芯片上固定GST标记的TCF4N-末端结构域(31kDa，基于SDS-PAGE纯度>90％)。10mm柠檬酸盐缓冲液(pH为4.0)中的浓度为0.5μM的配体以400RU的密度固定在流动池4上，流动池3保留空白作为参考表面。为进行抑制研究，将50nM His标记的β-cat与含有5％DMSO的PBS中的不同浓度的化合物GB1874在室温预孵育15分钟。混合物以30μL/min的流率和25℃的温度将注入两个流动池。使复合体分别结合和解离60秒，表面通过以30秒注射50mM NaOH进行再生。收集RU响应，并使用GraphPad Prism 5针对测试的GB1874浓度绘图。通过四参数非线性回归得到化合物GB1874的抑制IC₅₀值。

小鼠异种移植物及化合物治疗

将HCT116细胞(每个部位1×106细胞)皮下植入到5至7周龄NSG(NOD scid gamma)(Jackson Laboratory，库存号005557)小鼠的右胁。当肿瘤体积达到60至100mm³时，将动物随机分为治疗组或对照组。治疗组小鼠隔天经腹腔注射以50mg/kg施用化合物GB1874。同时，对照组的动物在没有化合物的情况下施用稀释剂。化合物GB1874的制备方法是将其溶解在DMSO中至浓度为60mg/mL，并将其在5％PEG 300和5％Tween-80的盐水中稀释至最终浓度为3mg/mL，5％DMSO。每2天用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。使用以下修改的椭球体公式估计肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2(长度×宽度²)。当对照组的肿瘤达到2000mm³时，对小鼠实施安乐死。

结果

β-cat结构模型的生成

用于前瞻性配体预测的β-cat的最终结构模型源自三种β-cat晶体结构，包括β-cat-Tcf3、β-cat-TCF4和β-cat-BCL9-TCF4复合体(PDB代码：分别为1G3J、^18.1JPW^19.和2GL7^20.)，经过2个阶段：1)优化(训练)和2)基于EF1和logAUC测量的配体富集度的盲测(验证)。由内部自动建模和对接平台完成优化(图1)。首先，MetaPocket^21.预测了β-cat晶体结构(PDB代码：1JPW)中的一个假定配体结合位点，其与β-cat犰狳重复序列4至9产生的带电沟槽重叠，后者与β-cat-TCF4相互作用界面重叠。因此，该位点是目前研究的重点。其次，通过SCWRL^22.对β-cat的三种晶体结构进行侧链取样，引入另外三种结构。这组6β-cat结构用作训练的起点。第三，为了更广泛地探索β-cat构象空间，训练库(153个化合物)与所有6个β-cat结构对接，评估配体富集方面的对接性能，并在各对接配体(iCRT3、iCRT5和iCRT14)的存在下使用PLOP(Protein Local Optimization Program)^23.优化结合位点侧链。重复这一步骤，直到一些优化结构显示配体富集性能优于任意阈值：logAUC>＝40和EF1>＝30。

β-cat-TCF4相互作用小分子抑制剂的预测

训练阶段的最佳β-cat结构显示，训练库的整体配体富集logAUC＝44.2，早期配体富集EF1＝33.3。已知的最有效的抑制剂iCRT3在训练库的153种化合物中排名最佳。分析了β-cat和iCRT3在对接生成的复合结构中的相互作用。iCRT3中的噁唑基与R469形成氢键，与K508形成阳离子-π相互作用，在β-cat-TCF4晶体结构中与TCF4的E17形成盐桥(图2D)。同时，iCRT3中的苯基装入已证明与TCF4的I19和F21相互作用的R386、N426和P463列出的袋(pocket)中，。另外，连接噁唑基和苯基的iCRT3的酰胺基通过与β-cat中的E462的另一个氢键稳定，iCRT3的乙基苯基基团填充了K508、V511和R515列出的袋。

在包含63个iCRT3类似物的验证库的帮助下，对这种最丰富的β-cat结构进行盲测(图5)。考虑了通过DOCK能量评分确定的对接等级和通过人工干预确定的对接姿势二者，从虚拟筛选中选择了19个配体候选物(图5)。同时，所有63种化合物均在Wnt reporter实验中进行了测试，其中HEK 293细胞以单一浓度的TOPFlash报告(STF细胞)稳定转染，12种化合物显示出活性(数据未显示)。这12种化合物在一定浓度范围内针对STF细胞进行了进一步测试，其中5种化合物的IC₅₀值与已知抑制剂iCRT3相当或更低(图5)。事实上，所有这5种强抑制剂都是通过对接而优先作为顶级配体候选物，这表明训练产生的最丰富的结构可以预测新的配体。

在对新配体预测进行功能验证后，根据最丰富的β-cat结构计算筛选了10240个小分子(购自Enamine)的库。人工分析500个(占筛选库的4.0％)得分最高的苗头化合物。基于三个标准选择27种化合物(图6)进行实验测试：(1)破坏β-cat-TCF4相互作用，(2)与β-cat残基形成有利的相互作用，例如氢键，和(3)其支架的化学新颖性。

使用TOPFlash/Wnt-报告实验对预测抑制剂进行功能验证

对接研究识别的27种化合物首先在10μM下对它们在STF报告细胞中抑制Wnt信号的能力(图2A)进行筛选。从该筛选中，识别出3种化合物，与DMSO对照相比，它们平均抑制Wnt信号超过50％，而对细胞的毒性小于25％(图7A)。3种苗头化合物对STF报告的剂量反应研究显示，它们以低微摩尔IC₅₀值抑制Wnt信号通路(图2B)。虽然它们也影响报告细胞的活力，但细胞活力EC₅₀值是报告细胞IC₅₀值的至少4倍(图7B)。令人鼓舞的是，与我们之前报道的化合物iCRT3相比，这3种苗头化合物是Wnt通路的大约2至5倍的有效抑制剂。有趣的是，这三种苗头化合物具有不同的化学结构(图2C)。

候选抑制剂的特异性

为进一步了解候选苗头化合物的作用机制，使用报告细胞系研究了这些小分子对其他信号通路活动的影响。最初的筛选和剂量反应研究是在STF报告细胞系中进行的，其中Wnt信号必须通过添加外源性Wnt3A激活。也研究了对STF3A报告细胞系(具有内源性表达Wnt3A的STF报告细胞系)的影响。因此，Wnt信号在STF3A报告细胞系中具有组成性活性。根据获得的IC50值，无论初始激活状态如何，iCRT3和化合物GB1874二者均被确定为Wnt途径的有效抑制剂(表1)。然而，尽管化合物GB6853和GB8679可有效抑制Wnt途径的激活(STFIC₅₀值分别为4.8μM和7.0μM)，但是当Wnt途径已经被激活时(STF3A IC₅₀值为>100μM)它们是无效的。这可能是由于这些化合物破坏预先存在的(例如STF3A细胞)与新形成的(例如STF细胞)β-cat-TCF4复合体的能力不同所致。

我们还研究了化合物对Myc报告细胞系的影响，其中荧光素酶基因的表达受Myc反应元件的控制。由于Wnt靶基因之一是Myc，因此Wnt信号的抑制也会导致Myc信号的抑制。这些化合物对Myc报告的效力与STF3A报告相似，STF3A报告中Wnt通路的有效抑制剂也是Myc报告的有效抑制剂(表1)。

最后，针对Hippo pathway reporter对候选苗头化合物进行测试，TEAD响应元件驱动荧光素酶的表达。由于Hippo途径的激活导致TEAD转录激活减少，因此能减少报告信号的化合物可激活Hippo途径，反之亦然。有趣的是，发现iCRT3可以激活Hippo途径，化合物GB8679是Hippo途径的有效抑制剂(表1)。由于Wnt通路可以和Hippo通路串扰，^24.因此怀疑GB8679对Hippo信号的抑制可能会间接影响其降低Wnt靶基因表达的有效性。

电子预测β-cat的3种候选小分子结合剂的不同结合模式

β-cat中两种苗头化合物GB8679和GB6853的预测结合模式与iCRT3的模式类似。例如，两种化合物以其大量的疏水基团占据分别由R386、N426、P463和K508、V511、R515排列出的的两个袋。同时，K508和R469之间的裂隙也被这两种化合物中的噻唑基团填充，形成氢键和盐桥(图2D)。然而，第三中苗头化合物GB1874显示了与iCRT3和其他两种苗头化合物不同的结合模式。它仍然以其三唑基团填充在K508和R469之间的裂隙中，和以其大量的疏水基团填充在R386、N426、P463和K508、V511、R515配列的两个袋中。另外，GB1874中的乙基苯基基团装在H470、R474和K435排列的袋中。引人注目的是，β-cat-TCF4晶体复合体结构中的这个袋被TCF4 D16残基(与β-cat中的K435形成盐桥)占据，并代表了关键的β-cat-TCF4相互作用。^25.TCF4上D16或β-cat上K435的单氨基酸取代足以破坏它们的相互作用并显著降低下游转录活性。^25,26.综上所述，与iCRT3和其他两种苗头化合物相比，可以假设GB1874的这种独特结合模式允许其更有效地破坏β-cat-TCF4相互作用。

苗头化合物破坏β-cat-TCF4相互作用并降低Wnt靶基因的表达

由于这些化合物是通过对β-cat蛋白的电子对接研究识别的，因此研究了其他化合物在生物相关细胞系中破坏β-cat-TCF4相互作用的能力。因此，在HCT116 CRC细胞中进行了β-cat及其相互作用配偶体的共免疫沉淀(co-IP)。对化合物处理下与β-cat结合的蛋白质进行的Western blot分析表明，在3种苗头化合物中，只有化合物GB1874能够将β-cat-TCF4相互作用降低到与iCRT3相同的程度(图3A)。令人鼓舞的是，尽管观察到化合物GB1874影响β-cat-TCF4相互作用，但其对β-cat-ECAD相互作用具有最小的影响(图3A)。

随后，研究了苗头化合物对Wnt靶基因表达的影响。HCT116细胞用50μM化合物处理，并通过Western印迹分析Wnt靶基因的表达，包括c-Met、细胞周期蛋白D1和生存素。化合物GB1874在减少这些蛋白质的表达方面最为有效(图3B)。事实上，化合物GB1874对Wnt靶蛋白表达减少的效果与iCRT3相当。另外，虽然化合物GB1874减少了Wnt靶基因的表达，但其对β-cat本身或其伴侣蛋白(partner proteins)，例如ECAD和TCF4的表达影响极小(图3C)。这些结果表明，GB1874可以通过特异性破坏β-cat-TCF4相互作用来调节β-cat的核转录功能，而不影响其在E-cad介导的粘附连接处的膜功能。

另一方面，化合物GB6853和GB8679对所研究的Wnt靶基因的表达影响最小(图3B)。这些化合物在破坏β-cat-TCF4相互作用方面也不如化合物GB1874有效(图3A)。这些结果，加上它们在STF3A报告细胞系(表1)中缺乏抑制活性，表明它们无法在Wnt信号已经活跃的细胞中抑制Wnt通路。

化合物GB1874体外破坏β-cat-TCF4相互作用

由于经电子对接研究预测GB1874化合物可与β-cat结合，因此进行了实验以确定其是否能在体外与纯化的β-cat相互作用，并抑制其与TCF4的相互作用。利用纯化蛋白编码β-cat(ARM-结构域重复区)和已知与β-cat相互作用的TCF4 N-末端结构域进行表面等离子体共振(SPR)研究。纯化的β-cat蛋白首先固定在SPR传感器芯片上，并将不同浓度的化合物GB1874注射到β-cat上。根据传感器图(图8A)，观察到化合物GB1874与β-cat的剂量依赖性结合。稳态响应值与化合物GB1874浓度的图表明该化合物与β-cat结合，K_D为76±13μM(n＝3，图3D)。然而，最佳拟合曲线的Hill斜率大于1，表明化合物GB1874以正协同性结合至β-cat上的多个位点。

为确定化合物GB1874是否能在体外直接抑制β-cat和TCF4之间的相互作用，进行了SPR竞争实验。将TCF4 N-末端结构域而非β-cat固定在SPR传感器芯片上。然后将与不同浓度的化合物GB1874一起预孵育的50nM的β-cat注射至TCF4 N-末端结构域。从传感图(图8B)可以明显看出，化合物GB1874被发现可抑制β-cat和TCF4之间的相互作用，IC₅₀值为25±8μM(n＝2)(图3E)。

候选苗头化合物影响“Wnt成瘾”癌细胞的增殖和干性

除了破坏β-cat-TCF4相互作用和减少Wnt靶基因的表达外，还进行实验以确定苗头化合物是否会诱发暗示生物学相关癌细胞系中Wnt活性降低的表型。首先，研究候选化合物GB6853、GB8679和GB1874对HCT116结直肠癌(CRC)细胞的影响。HCT116细胞具有β-cat基因的杂合突变，导致蛋白质中Ser45残基的缺失。Ser45是CK1α引发磷酸化的位点，是破坏复合体的关键成员，其随后针对β-cat进行蛋白酶体降解。因此，Ser45突变导致Wnt信号组成性激活，因为突变的β-cat不能被降解。据推测，抑制HCT116细胞中β-cat下游的Wnt信号将对其生长产生更大的影响。

HCT116细胞每天用10μM的每种化合物处理，并使用CellTiter-Glo活力实验监测其生长。为了进行比较，包括针对沿Wnt信号转导级联的不同成分的化合物例如IWP-2、XAV939和iCRT3。^27.如图4A所示，用三种苗头化合物(GB1874、GB6853和GB8679)中的任何一种处理都能有效抑制HCT116细胞的生长。值得注意的是，在生长抑制试验中，它们都比iCRT3更有效。化合物IWP-2和XAV939(分别为豪猪碱(Porcupine)和端锚聚合酶(Tankyrase)抑制剂)抑制β-cat-TCF4相互作用上游的Wnt信号，在抑制HCT116细胞生长方面效果较差。化合物GB8679、GB6853和GB1874在30μM时还可以显著降低HCT116群体中癌症干细胞类细胞的存活率，这可以通过它们对集落形成效率(图4B)和球体形成试验(图4C)的影响来证明。另外，苗头化合物也影响APC突变的CRC细胞系DLD-1和SW480的球体形成(图9A和9B)，尽管程度不同。随后研究了这些化合物对CRC细胞活力的影响。从针对HCT116、DLD-1和SW480细胞系的EC₅₀值(表2)来看，化合物GB1874对CRC细胞系最有效，其次是化合物GB8679。

GB1874抑制小鼠异种移植物的生长

基于上述研究，化合物GB1874被确定为对Wnt驱动的CRC细胞最有效的化合物。为了研究其体内疗效，将HCT116细胞接种到NSG小鼠的胁腹。随后，每隔一天(q.a.d.)用溶剂对照或化合物GB1874(50mg/kg)通过腹腔注射对荷瘤小鼠治疗。化合物GB1874在体内有效抑制HCT116异种移植物的生长(图4D)，同时对小鼠产生最小的全身毒性(图9C)。

表1.苗头化合物对不同信号通路的影响

表2.苗头化合物对Wnt驱动的CRC细胞活力的影响

使用GB1874的结构为支架，检索化学数据库寻找GB1874的类似物。然后将这些化合物连接到我们的β-连环蛋白电子模型上，以预测β-连环蛋白的强候选结合物。由此识别出GB1874的8个结构类似物，并对其进行测试。

我们首先使用STF和STF3A报告细胞测试这些化合物抑制Wnt报告活性的能力(表3)。总的来说，与针对STF3A细胞的相应值相比，针对STF细胞的抑制IC50值较低，表明这些化合物对具有组成性Wnt激活的生物系统的活性较低。例外情况是GB1874A，其中与STF细胞相比，它对STF3A细胞更有效。

比较GB1874(STF IC₅₀＝6.8μM，STF3A IC₅₀＝27μM)与GB1874F(STF IC₅₀＝5.4μM，STF3A IC₅₀＝10μM)、GB1874G(STF IC₅₀＝3.9μM，STF3A IC₅₀＝6.7μM)和GB1874H(STF IC₅₀＝5.0μM，STF3A IC₅₀＝11μM)的IC₅₀值，观察到增加1,2,4-三唑的C3取代基的大小不会影响化合物对STF或STF3A报告的活性。由于GB1874的新类似物在1,2,4-三唑的C3取代基上大部分不同，因此无法推断改变其他位置取代基的影响。因此，为了更好地理解GB1874的构效关系，需要购买或合成GB1874的更多类似物。

表3.GB1874的结构类似物及其对STF和STF3A报告细胞系的活性

检测GB1874类似物对HCT116 CRC细胞中Wnt靶基因表达的影响。从获得的结果(图5)可以看出，Wnt靶基因下调的程度与化合物抑制STF报告的效力相关。最有效的化合物是iCRT3、GB1874、GB1874C、GB1874E、GB1874F、GB1874G和GB1874H。这些化合物有效地抑制Wnt靶基因，例如AXIN2、BIRC5、BMP4和CCND1，而对β-连环蛋白(CTNNB1)基因表达的影响较小。

我们还在原发性患者来源的结直肠癌(CRC)细胞系上测试了最热门的苗头化合物GB1874(表4)。与Tankyrase抑制剂XAV939相比，GB1874被发现对原发性CRC细胞系的作用更强。

表4.GB1874和XAV939对原发性患者来源的结直肠癌细胞系的EC50值

对体内研究获得的HCT116异种移植肿瘤进行了分析。如图4D所示且再如图11A所示，每隔一天(q.a.d.)用GB1874以50mg/kg通过i.p.处理HCT116异种移植物，抑制HCT116异种移植物的生长。通过免疫组织化学染色和量化，发现肿瘤生长的抑制与Wnt靶基因，细胞周期蛋白D1以及增殖标记物Ki67的表达减少有关(图11B)。

工业适用性

本文公开的化合物可用于抑制β-cat或破坏β-cat和TCF4之间的相互作用，因此可用于治疗选自由癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病组成的组的疾病或健康状况。

显而易见的是，不脱离本发明的精神和范围的本发明的各种其他修改和改编对本领域技术人员在阅读前述公开内容后将是显而易见的，并且所有此类修改和改编都在所附权利要求书的范围内。

参考文献

1.Polakis,2000,Genes Dev.14:1837-1851

2.Morin et al.,1997,Science 275:1787-1790

3.Rubinfeld et al.,1997,Science 275:1790-1792

4.Koch et al.,1999,Cancer Res.59:269-273

5.Zurawel et al,1998,Cancer Res.58:896-899

6.Voeller et al,1998,Cancer Res.58:2520-2523

7.Schlosshauer et al.,2000,Mod.Pathol.13:1066-1071

8.Mirabelli-Primdahl et al,1999,Cancer Res.59:3346-3351

9.Saegusa and Okayasu,2001,J.Pathol.194:59-67

10.Wu et al.,2001,Cancer Res.61:8247-8255

11.Hayes et al.,2008,Clin.Cancer Res.14:4038-4044

12.Gonsalves FC,Klein K,Carson BB,Katz S,Ekas LA,Evans S,et al.AnRNAi-based chemical genetic screen identifies three small-molecule inhibitorsof the Wnt/wingless signalling pathway.Proc Nat.Acad Sci USA 2011；108,5954-63

13.Irwin JJ,Sterling T,Mysinger MM,Bolstad ES,Coleman RG.ZINC:a freetool to discover chemistry for biology.J Chem Inf Model 2012；52:1757-68

14.Mysinger MM,Carchia M,Irwin JJ,Shoichet BK.Directory of usefuldecoys,enhanced(DUD-E):better ligands and decoys for better benchmarking.JMed Chem 2012；55:6582-94

15.Kuntz ID,Blaney JM,OatleySJ,Langridge R,Ferrin TE.A geometricapproach to macromolecule-ligand interactions.J Mol Biol 1982；161:269-88

16.Mysinger MM,Shoichet BK.Rapid context-dependent ligand desolvationin molecular docking.J Chem Inf Model 2010；50:1561-73

17.Fan H,Irwin JJ,Webb BM,Klebe G,Shoichet BK,Sali A.Moleculardocking screens using comparative models of proteins.J Chem Inf Model 2009；49:2512-27

18.Graham TA,Weaver C,Mao F,Kimelman D,Xu W.Crystal structure of abeta-catenin/TCF4 complex.Cell 2000；103:885-96

19.Poy F,Lepourcelet M,Shivdasani RA,Eck MJ.Structure of a humanTCF4-β-catenin complex.Nat Struct Biol 2001；8:1053-7

20.Sampietro J,Dahlberg CL,Cho US,Hinds TR,Kimelman D,Xu W.Crystalstructure of a beta-catenin/BCL9/TCF4 complex.Mol Cell 2006；24:293-300

21.Zhang Z,Li Y,Lin B,Schroeder M,Huang B.Identification of cavitieson protein surface using multiple computational approaches for drug bindingsite prediction.Bioinformatics 2011；27:2083-8

22.Krivov GG,Shapovalov MV,Dunbrack RL Jr.Improved prediction ofprotein side-chain conformations with SCWRL4.Proteins 2009；77:778-95

23.Sherman W,Day T,Jacobson MP,Friesner RA,Farid R.Novel procedurefor modeling ligand/receptor induced fit effects.J Med Chem 2006；49:534-53

24.Piccolo S,Dupont S,Cordenonsi M.The biology of Yap/TAZ:Hipposignalling and beyond.Physiol Rev 2014；94:1287-312

25.Fasolini M,Wu X,Flocco M,Trosset JY,Oppermann U,Knapp S.Hot Spotsin TCF4 for the Interaction withβ-Catenin.J Biol Chem 2003；278:21092-8

26.Liu J,Wang H,Zuo Y,Farmer SR.Functional Interaction betweenPeroxisome Proliferator-Activated Receptorγandβ-Catenin.Mol Cell Biol 2006；26:5827-37

27.Kahn M.Can we safely target the WNT pathway？Nat Rev Drug Discovery2014；13:513-32

Claims (24)

1.化合物在制造用于治疗疾病或健康状况的药物中的用途，所述疾病或健康状况通过抑制β-连环蛋白(β-cat)或破坏β-cat与T细胞因子4(TCF4)之间的相互作用而得到改善，其中所述化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

2.根据权利要求1所述的用途，其中m是1或2；且X是-O-或不存在。

3.根据权利要求2所述的用途，其中R⁵是环烷基或芳基。

4.根据权利要求1所述的用途，其中R²是环烷基、芳烷基或杂芳烷基。

5.根据权利要求1所述的用途，其中R²是-(CR⁹ ₂)_pR¹⁰，其中p是选自0至4的整数；R⁹每次出现时独立地为氢或烷基；且R¹⁰是环烷基、芳基或杂芳基。

6.根据权利要求1所述的用途，其中n是1或2；R⁶每次出现时独立地为氢或烷基；R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基。

7.根据权利要求6所述的用途，其中R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物具有式3：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁴每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁵是芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式4的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基；

R⁹每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R¹⁰是环烷基、芳基或杂芳基；且

X是-O-或不存在。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的盐。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述疾病或健康状况选自由癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病组成的组。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述疾病或健康状况是选自由结直肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病组成的组的癌症。

12.一种抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用的方法，所述方法包括：使β-cat与式1的化合物：

或其药学上可接受的盐接触，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

13.根据权利要求12所述的方法，其中m是1或2；且X是-O-或不存在。

14.根据权利要求13所述的方法，其中R⁵是环烷基或芳基。

15.根据权利要求12所述的方法，其中R²是环烷基、芳烷基或杂芳烷基。

16.根据权利要求12所述的方法，其中R²是-(CR⁹ ₂)_pR¹⁰，其中p是选自0至4的整数；R⁹每次出现时独立地为氢或烷基；且R¹⁰是环烷基、芳基或杂芳基。

17.根据权利要求12所述的方法，其中n是1；R⁶每次出现时独立地为氢或烷基；R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基。

18.根据权利要求17所述的方法，其中R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物具有式3：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁴每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁵是芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式4的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、环烷基和芳基组成的组；或R⁸的两个实例与它们所连接的氮一起形成5至6元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成5至6元环烷基；

R⁹每次出现时独立地选自由氢和烷基组成的组；

R¹⁰是环烷基、芳基或杂芳基；且

X是-O-或不存在。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的盐。

21.一种治疗有需要的受试者的疾病或健康状况的方法，所述疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用而得到改善，所述方法包括施用治疗有效量的式1的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

22.一种用于治疗疾病或健康状况的化合物，所述疾病或健康状况通过抑制β-cat或破坏β-cat与TCF4之间的相互作用而得到改善，其中所述化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元环烷基或4至7元杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

23.根据权利要求22所述的使用的化合物，其中所述疾病或健康状况选自由癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、纤维化和骨病组成的组。

24.一种用于治疗的化合物，其中所述化合物具有式1：

或其药学上可接受的盐，其中

R¹是-(CR⁴ ₂)_mXR⁵；

R²是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R³是-(CR⁶ ₂)_nR⁷；

R⁴每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁴的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁵是氢、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基或杂芳基；

R⁶每次出现时独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或R⁶的两个实例与它们所连接的一个碳或多个碳一起形成3至7元环烷基；

R⁷是-(C＝O)R⁸、-(C＝O)OR⁸或-(C＝O)N(R⁸)₂；或R⁷是具有式2的部分：

R⁸每次出现时独立地选自由烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基组成的组；或两个R⁸与它们所连接的氮一起形成3至7元杂环烷基；或R⁶和R⁸与它们所连接的多个原子一起形成4至7元任选地取代的环烷基或4至7元任选地取代的杂环烷基；

m是选自0至4的整数；

n是选自0至4的整数；且

X是-O-、-S-或不存在。

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