CN114272440B - 一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，所述的制备方法包括：配制含硫酸软骨素钠和胶原蛋白的浆液，将浆液通过冷冻干燥制成单层或多层胶原膜，对单层或多层胶原膜进行干燥处理、高温真空交联以及灭菌。本发明所述的制备方法，通过对单层或多层胶原膜进行干燥处理以控制含水率至特定范围，以及对高温真空交联的工艺参数进行优化，使得最终制备的生物膜，胶原蛋白变性程度显著降低，DSC热变性温度、防渗漏性能以及回弹性能明显提升。
Description
技术领域
本发明属于人工硬脑膜技术领域，具体涉及一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法。
背景技术
颅底创伤时常伴有硬脑膜的破坏，从而导致不同程度的脑脊液漏。脑脊液漏是颅底创伤的主要并发症之一，也是引起颅内感染的重要危险因素。因此修复硬脑膜、减少脑脊液漏的发生是颅底创伤手术治疗的重要目标之一，近年来国内外学者采用了多种方法进行硬脑膜重建。经鼻蝶入路的颅底手术是较为常见的修复颅底硬脑膜损伤的手术，其中手术操作空间小、缝合困难，是最大的难点。因此需要一款防渗漏效果好、收缩后回弹性能好、展开的顺应性好并且免缝合的硬脑膜修复产品。
目前市场中的硬脑膜产品中，由脱细胞基质(如CN113082294A)制作的硬脑膜顺应性较好，但是其收缩效果并不理想，无法压缩到需要的体积，经鼻蝶入路手术会有困难，并且需要与周围组织缝合；现有的高分子合成类材料(如CN101507661)的硬脑膜产品，其诱导组织再生的能力不足，并且都需要进行缝合；现有的胶原蛋白类硬脑膜产品，如CN107050519 B公开的胶原蛋白硬脑膜产品虽然无需缝合，收缩性能较好，但是回弹性能不佳，防渗漏性能也需要提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无需缝合，且收缩性能、回弹性能、防渗漏性能均优异的专用于经鼻蝶入路颅底重建手术的生物膜的制备方法，以解决现有硬脑膜产品存在的上述问题。
为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸软骨素钠和胶原蛋白的醋酸溶液，搅拌使溶解或溶胀均匀，真空脱泡，得到浆液，备用；
(2)将浆液通过一次冷冻干燥制成单层胶原膜，或先将浆液通过一次冷冻干燥制成单层胶原膜以后，将单层胶原膜压制成致密胶原膜，然后通过浆液使单层胶原膜和致密胶原膜粘附在一起后进行二次冷冻干燥制成多层胶原膜；
(3)将单层胶原膜或多层胶原膜进行干燥处理使含水率降至10％以下，得到干燥的单层胶原膜或多层胶原膜；
(4)将干燥的单层胶原膜或多层胶原膜于温度为90-110℃，真空度为0.05-0.1bar条件下进行高温真空交联48-72h；
(5)灭菌，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
优选的，步骤(1)中，所述的浆液中，硫酸软骨素钠的质量体积浓度为0.03-0.1％，胶原蛋白的质量体积浓度为0.3-1.0％，所述的醋酸溶液为0.05M醋酸溶液。
优选的，步骤(1)中，所述的搅拌为采用均质机以15000-20000r/min的速度搅拌1-2h。
优选的，步骤(2)中，所述的冷冻干燥均包括如下步骤：
恒温阶段，温度：3～5℃，时间：120～180min；
预冻阶段，温度：-45～-35℃，时间：310～360min；
抽空干燥阶段，温度：-10～-8℃，时间：740～920min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-13.5～-10.5℃，时间：380～460min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：350～420min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80～90min，真空度：0.2bar。
第四干燥阶段，温度：20～30℃，时间：70～100min，真空度：0.2bar。
优选的，步骤(2)中，所述的单层胶原膜的厚度为3mm-7mm，所述的致密胶原膜的厚度为1mm-2mm，所述的致密胶原膜的孔隙≤100μm。
优选的，步骤(3)中，所述的干燥处理为采用负压室温干燥或层流干燥。
优选的，步骤(3)中，所述的高温真空交联的温度为105℃，真空度为0.09bar，时间为60h。
优选的，步骤(5)中，所述的灭菌为使用环氧乙烷、Co-60γ射线辐照、紫外辐照中的任意一种进行灭菌。所述的环氧乙烷灭菌包括：环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40～60％，温度为50～60℃，湿度为20～50％RH，时间为2～5h，换气次数为4～7次。
本发明的有益效果为：
1、本发明所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，在将单层胶原膜或多层胶原膜进行高温真空交联以前，先将其含水率降至10％以下，原因在于，冷冻干燥法制备的单层胶原膜或多层胶原膜无法完全去除全部自由水和结合水，其含水量(热重分析法)约为15％～20％，实际操作中发现，如直接对其进行高温真空交联，温度和压力无法瞬间达到设定值，会发生一定程度的胶原蛋白变性，且含水量越高变性程度越高，从而影响了回弹性能及防渗漏性能，因此需要在进行高温真空交联以前进行含水量的控制。试验显示，采用本发明方法制备的生物膜的胶原蛋白变性程度显著降低，DSC热变性温度、防渗漏性能以及回弹性能明显提升。
2、本发明所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，对高温真空交联的工艺参数进行了优化，进一步提升了最终制备的生物膜的回弹性能。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下实施例中，胶原蛋白为牛跟腱中提取的高纯度胶原蛋白，其中I型胶原蛋白占总蛋白含量不小于99％，羟脯氨酸的含量不小于10％。
实施例1
本实施例提供一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.03％，胶原蛋白质量体积浓度为0.3％的0.05M醋酸溶液，采用均质机18000r/min搅拌2h，真空脱泡，得到浆液，备用；
(2)向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为3mm，然后置于冻干机中冻干，得到单层胶原膜，所述的冷干包括如下步骤：
恒温阶段，温度：3℃，时间：180min；
预冻阶段，温度：-45℃，时间：310min；
抽空干燥阶段，温度：-10℃，时间：740min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-13.5℃，时间：380min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：350min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80min，真空度：0.2bar。
第四干燥阶段，温度：20℃，时间：100min，真空度：0.2bar。
(3)将单层胶原膜真空室温干燥使含水率降至8％，得到干燥的单层胶原膜；
(4)将干燥的单层胶原膜放入真空干燥箱中，于温度为90℃，真空度为0.1bar条件下进行高温真空交联72h；
(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40％，温度为50℃，湿度为20％RH，时间为5h，换气次数为4次，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
实施例2
本实施例提供一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.1％，胶原蛋白质量体积浓度为1.0％的0.05M醋酸溶液，采用均质机15000r/min搅拌2h，真空脱泡，得到浆液，备用；
(2)向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为4mm，然后置于冻干机中进行第一次冻干，得到单层胶原膜；用压胶原机对单层胶原膜进行压制，15MPa压制1min，得到厚度为2mm，孔隙≤100μm的致密胶原膜；将致密胶原膜铺在冻干盘中，均匀刷上一层浆液，然后铺入单层胶原膜，完毕后置于冻干机中进行第二次冻干，得到双层胶原膜；
所述的冷干均包括如下步骤：
恒温阶段，温度：5℃，时间：120min；
预冻阶段，温度：-35℃，时间：360min；
抽空干燥阶段，温度：-8℃，时间：920min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-10.5℃，时间：460min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：420min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：90min，真空度：0.2bar。
第四干燥阶段，温度：30℃，时间：70min，真空度：0.2bar。
(3)将双层胶原膜真空室温干燥使含水率降至10％，得到干燥的双层胶原膜；
(4)将干燥的双层胶原膜放入真空干燥箱中，于温度为105℃，真空度为0.09bar条件下进行高温真空交联60h；
(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为60％，温度为60℃，湿度为50％RH，时间为2h，换气次数为7次，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
实施例3
本实施例提供一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.05％，胶原蛋白质量体积浓度为0.5％的0.05M醋酸溶液，采用均质机20000r/min搅拌1h，真空脱泡，得到浆液，备用；
(2)向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为3mm，然后置于冻干机中进行第一次冻干，得到单层胶原膜；用压胶原机对单层胶原膜进行压制，5MPa压制3mm，得到厚度为1毫米，孔隙≤100μm的致密胶原膜；将致密胶原膜铺在冻干盘中，均匀刷上一层浆液，铺入单层胶原膜，再刷一层浆液，然后铺入致密胶原膜，完毕后置于冻干机中进行第二次冻干，得到三层胶原膜；
所述的冷干包括如下步骤：
恒温阶段，温度：3℃，时间：150min；
预冻阶段，温度：-40℃，时间：330min；
抽空干燥阶段，温度：-10℃，时间：800min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-13.5℃，时间：400min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：380min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80min，真空度：0.2bar。
第四干燥阶段，温度：20℃，时间：90min，真空度：0.2bar。
(3)将三层胶原膜层流干燥使含水率降至6％，得到干燥的三层胶原膜；
(4)将干燥的三层胶原膜放入真空干燥箱中，于温度为110℃，真空度为0.05bar条件下进行高温真空交联48h；
(5)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为50％，温度为60℃，湿度为30％RH，时间为3h，换气次数为5次，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
对比例
本对比例提供一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制硫酸软骨素钠质量体积浓度为0.1％，胶原蛋白质量体积浓度为1.0％的0.05M醋酸溶液，采用均质机15000r/min搅拌2h，真空脱泡，得到浆液，备用；
(2)向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为4mm，然后置于冻干机中进行第一次冻干，得到单层胶原膜；用压胶原机对单层胶原膜进行压制，15MPa压制1min，得到厚度为2mm，孔隙≤100μm的致密胶原膜；将致密胶原膜铺在冻干盘中，均匀刷上一层浆液，然后铺入单层胶原膜，完毕后置于冻干机中进行第二次冻干，得到双层胶原膜；
所述的冷干包括如下步骤：
恒温阶段，温度：5℃，时间：120min；
预冻阶段，温度：-35℃，时间：360min；
抽空干燥阶段，温度：-8℃，时间：920min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-10.5℃，时间：460min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：420min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：90min，真空度：0.2bar。
第四干燥阶段，温度：30℃，时间：70min，真空度：0.2bar。
(3)将双层胶原膜放入真空干燥箱中，于温度为110℃，真空度为0.05bar条件下进行高温真空交联32h；
(4)环氧乙烷灭菌，环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为60％，温度为60℃，湿度为50％RH，时间为2h，换气次数为7次，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
一、胶原蛋白变性程度检测：将生物膜放置于胰蛋白酶溶液中进行酶解，通过液相法测量酶解液中羟脯氨酸含量得出胶原蛋白变性程度。见表1。可以看出，与对比例样品相比，本发明各实施例方法制备的生物膜样品的胶原蛋白变性程度均明显降低。
表1
| 样品 | 变性程度 |
| 实施例1 | 3.6％ |
| 实施例2 | 5.1％ |
| 实施例3 | 4.5％ |
| 对比例 | 15.8％ |
二、DSC热变性温度：
表2
| 样品 | 热变性温度(℃) |
| 实施例1 | 54.8±1.3 |
| 实施例2 | 57.5±1.5 |
| 实施例3 | 56.4±1.1 |
| 对比例 | 43.6±2.3 |
三、防渗漏性能测试：为了验证本发明方法制备的生物膜的防渗漏效果，我们在100mm×100mm的生物膜样品上缓慢注射适量生理盐水，记录水滴落的时间，水滴滴落的时长可以直接反应产品的防渗漏性能，见表3。可以看出，与对比例样品相比，本发明各实施例方法制备的生物膜样品的防渗漏性能明显提升。
表3
四、回弹性能测试：为了验证本发明方法制备的生物膜的回弹性能，我们分别取实施例以及对比例各生物膜样品，先测量其压缩前的厚度，统一使用0.5MPa压缩10s，之后测量其回弹后的厚度，见表4。可以看出，与对比例样品相比，本发明各实施例方法制备的生物膜样品的压缩回弹性能更好。
表4
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制硫酸软骨素钠和胶原蛋白的醋酸溶液，搅拌使溶解或溶胀均匀，真空脱泡，得到浆液，备用；
（2）向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为3mm，然后置于冻干机中冻干，得到单层胶原膜，或者；
向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为4mm，然后置于冻干机中进行第一次冻干，得到单层胶原膜；用压胶原机对单层胶原膜进行压制，15MPa压制1min，得到厚度为2mm，孔隙≤100μm的致密胶原膜；将致密胶原膜铺在冻干盘中，均匀刷上一层浆液，然后铺入单层胶原膜，完毕后置于冻干机中进行第二次冻干，得到双层胶原膜，或者；
向冻干盘中倒入浆液，轻摇使其分布均匀，控制其厚度为3mm，然后置于冻干机中进行第一次冻干，得到单层胶原膜；用压胶原机对单层胶原膜进行压制，5MPa压制3mm，得到厚度为1毫米，孔隙≤100μm的致密胶原膜；将致密胶原膜铺在冻干盘中，均匀刷上一层浆液，铺入单层胶原膜，再刷一层浆液，然后铺入致密胶原膜，完毕后置于冻干机中进行第二次冻干，得到三层胶原膜；
（3）将单层胶原膜或双层胶原膜或三层胶原膜进行干燥处理使含水率降至10%以下，得到干燥的单层胶原膜或双层胶原膜或三层胶原膜；
（4）将干燥的单层胶原膜或双层胶原膜或三层胶原膜于温度为90-110℃，真空度为0.05-0.1bar条件下进行高温真空交联48-72h；
（5）灭菌，即得所述的用于颅底重建手术的生物膜。
2.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的浆液中，硫酸软骨素钠的质量体积浓度为0.03-0.1%，胶原蛋白的质量体积浓度为0.3-1.0%，所述的醋酸溶液为0.05M醋酸溶液。
3.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的搅拌为采用均质机以15000-20000r/min的速度搅拌1-2h。
4.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的冻干均包括如下步骤：
恒温阶段，温度：3~5℃，时间：120~180min；
预冻阶段，温度：-45~-35℃，时间：310~360min；
抽空干燥阶段，温度：-10～-8℃，时间：740～920min，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-13.5～-10.5℃，时间：380～460min，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：350～420min，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80～90min，真空度：0.2bar；
第四干燥阶段，温度：20～30℃，时间：70～100min，真空度：0.2bar。
5.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的干燥处理为采用负压室温干燥或层流干燥。
6.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的高温真空交联的温度为105℃，真空度为0.09bar，时间为60h。
7.根据权利要求1所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的灭菌为使用环氧乙烷、Co-60 γ射线辐照、紫外辐照中的任意一种进行灭菌。
8.根据权利要求7所述的用于颅底重建手术的生物膜的制备方法，其特征在于，所述的环氧乙烷灭菌包括：环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40～60％，温度为50～60℃，湿度为20～50％RH，时间为2～5h，换气次数为4～7次。
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