CN114272209A - 一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球、以及该纳米脂质微球与肿瘤免疫治疗药物的联合应用 - Google Patents

Abstract

本发明构建了：可以选择性地在肿瘤部位释放药物的抗肿瘤化学药物的纳米脂质微球；以及将该纳米脂质微球与肿瘤免疫治疗药物、例如抗PD‑1单抗(αPD‑1)联合应用于恶性肿瘤的治疗的方案。本发明主要根据对上述纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物在体内起效时间的分析，设计了三种联合治疗的方案，包括同时注射上述纳米脂质微球与肿瘤免疫治疗药物，先注射上述纳米脂质微球、两天后再注射肿瘤免疫治疗药物，以及先注射肿瘤免疫治疗药物、两天后再注射上述纳米脂质微球。通过上述联合应用，能够省去在单独使用抗肿瘤化学药物的情形下需要预先给予激素的步骤，而且能够增敏免疫治疗，达到肿瘤的化学治疗效果与免疫治疗效果的协同作用。

Description

一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球、以及该纳米脂质微球 与肿瘤免疫治疗药物的联合应用

技术领域

本发明涉及用于癌症治疗的化学药物、例如多西他赛的纳米脂质微球及其制备方法，还涉及通过联合使用该纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物，实现了抗肿瘤作用的协同效果，从而得到最优治疗策略，属于公共卫生医疗领域。

技术背景

近年来，随着生活环境的持续恶化以及人口老龄化的趋势，癌症的发病率和死亡率逐年上升，严重威胁着人类的健康。作为一个亟待解决的世界性难题，癌症的治疗一直受到国内外学者的高度重视与关注。纳米材料因其独特的电学、光学、磁学和热学等性质受到了广泛的关注，被广泛应用于肿瘤治疗的研究，在生物学领域中具有较大的应用潜力，为肿瘤的治疗带来了新的机会。此外，为了取得更为理想的抑瘤效果，开展合理的联合治疗来提升抗肿瘤效果，甚至抑制肿瘤复发和转移是非常必要的。

免疫系统控制肿瘤细胞的能力是一个多世纪以前提出的，在过去几十年中得到证明，最近被用于癌症的治疗。免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂(Immune checkpointinhibitors，ICIs)，旨在刺激免疫反应，以抑制肿瘤逃避免疫监视，临床上已广泛用于治疗恶性黑色素瘤等。ICIs主要分为细胞毒性T淋巴细胞抗原4蛋白(CTLA-4)和程序性死亡因子(PD-1) 及其配体(PD-L1和PD-L2)，迄今为止，科学家已经对各种ICIs途径进行了很好的表征。ICIs开启了癌症治疗的新纪元，并为包括恶性黑色素瘤在内的几种癌症提供了一种新的临床治疗策略。然而，仅有很少一部分患者对ICIs阻断单一疗法有良好的临床反应，临床数据显示，在绝大多数晚期实体瘤中，ICIs抗PD-1单抗(Anti-PD-1antibody,αPD-1)单独使用时，有效率仅为20％-30％左右，因此需要开发新的免疫治疗的途径。

化疗可以在一定程度上增敏免疫治疗，因为细胞毒性化学疗法的潜在免疫原性作用可以增强ICIs对免疫应答的调节作用。因而，近年来临床上出现了多种ICIs与化疗药物联合应用的方案，均取得了优于ICIs单一疗法的治疗效果。在这些联合方案中，ICIs与小分子化疗药物的联合使用备受青睐，而与紫杉烷类化疗药(如紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛)的联合使用更广泛。例如，临床上已采用这种联合方案对非小细胞肺癌进行了广泛的研究与治疗，结果呈现明显优于单一疗法的治疗效果，患者的客观缓解率以及疾病控制率均有明显的提高。

然而相同的药物以不同的剂型给药时，药物起到最优治疗效果的时间具有显著的差异，联合治疗中不同治疗的起效时间对联合的效果具有重要影响，因此探索药物达到最优治疗效果的时间是很重要的。临床上进行免疫治疗与化学疗法组合治疗时，一般都是按照既定的给药方案进行联合治疗，并未对治疗顺序进行深入探讨，尤其是针对不同剂型的药物，很少有人研究，目前仍无定论。我们认为根据药物剂型的特点设计给药方案，才能达到最优的联合效果，即化疗药物和免疫制剂在体内相应的靶部位达到最优治疗效果的时间一致时，联合治疗才有最大治疗输出的效果。

基于以上介绍，本发明通过将高浓度的维生素E(VE)包裹于磷脂形成的纳米粒中构建了一种多西他赛的纳米载体，因其可以积极响应肿瘤部位高浓度的活性氧(ROS)水平，因而具有肿瘤靶向的作用，并且其对正常细胞的毒性很小。根据对纳米粒和αPD-1在体内起效时间的分析，本发明设计了三种联合治疗的方案，包括DTX-VNS(负载多西他赛的纳米脂质微球)与αPD-1同时给药，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1，以及先注射αPD-1两天后再注射DTX-VNS。相同化疗药与免疫治疗剂的联合使用，不同的治疗顺序也会带来意想不到的不同的治疗结果。与其他两组给药方案相比，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1治疗组发挥了最强的抗肿瘤治疗的作用。最佳治疗方案中两种药物在体内达到最优治疗效果的时间达到最大程度的重叠，因而发挥了最强的免疫微环境改善作用，体现了最优的治疗效果。为了获得一个最佳的治疗输出，纳米粒子针对肿瘤的作用规律很大程度决定了与其他治疗的联用方式。此治疗方案能为临床上进行化疗与免疫治疗的联合应用提供有价值的指导意见。

现有技术文献

专利文献

CN110859959A

发明内容

发明要解决的问题

现有技术中已经开发出了多种治疗恶性肿瘤的方案，但是其疗效有待进一步提高。此外，部分化学抗肿瘤药物在给药前还需要给予其他药物，例如，病人在接受多西他赛治疗前，均需要口服糖皮质激素类。

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤化学药物的纳米脂质微球与免疫治疗药物的组合，其通过适当设定给药方式，可以实现意想不到的优异的治疗结果。

本发明的目的还在于提供一种抗肿瘤化学药物的纳米脂质微球及其制造方法，该纳米脂质微球的稳定性良好，且具有一定的靶向性。

解决问题的技术手段

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合用于治疗恶性肿瘤，其中，上述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，上述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少一种，上述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少一种，上述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1 种。

关于本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合，在向有需要的患者给药时，同时注射所述纳米脂质微球与肿瘤免疫治疗药物；或者先注射所述纳米脂质微球两天后再注射肿瘤免疫治疗药物；或者先注射肿瘤免疫治疗药物两天后再注射所述纳米脂质微球。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，上述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少一种，上述乳化剂包含蔗糖以及选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少一种。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球的制造方法，其具有以下步骤：

(1)制备油相：在20～45℃条件下，将抗肿瘤药物、乳化剂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入注射用油，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)制备水相：将稳定剂加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm 微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)制备初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在5000～20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以10000～20000rpm持续剪切10～30分钟，即得初乳；

(4)制备终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1000～1500bar条件下，均质3～6次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8～24小时、升华温度-25℃～-40℃、升华时间48～96小时、解析温度15～30℃、解析时间8～20小时、真空度10～30pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用冻干脂质微球，

上述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，

上述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，

上述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

发明的效果

如上所述，本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含特定的成分，可以将作为有效成分的多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、奥沙利铂、喜树碱、卡铂以及阿糖胞苷等定向地送达肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤疗效，降低毒副作用。

此外，本发明的上述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球以及选自免疫检查点抑制剂、单克隆抗体及小分子抑制剂等的肿瘤免疫治疗药物的组合使用，不仅能够省去在单独使用抗肿瘤化学药物的情形下需要预先给予激素的步骤，而且能够增敏免疫治疗，达到肿瘤的化学治疗效果与免疫治疗效果的协同作用，甚至能够抑制肿瘤复发和转移。

进而，本发明人等还发现，在组合使用上述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球以及肿瘤免疫治疗药物时，通过调整治疗顺序也会带来意想不到的不同的治疗结果。例如，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1治疗组发挥了最强的抗肿瘤治疗的作用。

本发明中涉及的肿瘤为恶性肿瘤，其包括黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、恶性淋巴瘤等。

附图说明

图1显示了冻干DTX-VNS复溶前后形态、粒径及电镜图片。

图2显示了不同浓度Blank VNS(VE纳米脂质微球)下4T1和A549细胞的存活情况。

图3显示了DTX-VNS和αPD-1联合治疗对黑色素瘤B16小鼠肿瘤模型的抗肿瘤作用。(A)B16皮下肿瘤小鼠模型的构建与给药方案。(B)B16 肿瘤小鼠接受治疗后各组每只小鼠的肿瘤曲线。(C)B16肿瘤小鼠接受治疗后各组小鼠的平均肿瘤曲线。(D)B16肿瘤小鼠接受治疗后各组小鼠的生存率曲线，每组7只小鼠。

图4显示了DTX-VNS和αPD-1联合治疗对Luc-CT26肺转移瘤模型的抗肿瘤作用。(A)Luc-CT26肺转移小鼠肿瘤模型的构建与给药方案。(B) DTX-VNS与αPD-1联合治疗抑制Luc-CT26肿瘤小鼠肺转移效果。(C) Luc-CT26肺转移瘤荧光强度曲线。(D)Luc-CT26肺转移瘤小鼠接受治疗后各组小鼠的生存率曲线。(E)Luc-CT26肺转移瘤小鼠肺部脏器系数。 (F)Luc-CT26肺转移肿瘤小鼠肺部肿瘤结节数，每组6只小鼠。

图5显示了Luc-CT26肺转移小鼠经DTX-VNS和αPD-1联合治疗后小鼠的免疫微环境变化情况，(A)Luc-CT26肺转移瘤小鼠接受治疗后小鼠肿瘤组织中CD4+T和CD8+T细胞的含量。(B)经治疗后，小鼠肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞和IFN-γ的免疫荧光图片。Luc-CT26肺转移肿瘤小鼠的肺部转移节结(C)和H&E染色切片(D)，标尺100μm。(E)根据(A) 中的流式结果进行定量分析。(F)使用“ImageJ”计算图5B中肿瘤中CD8+ CTL和IFN-γ的荧光强度。每组平行6次。

图6显示了DTX-VNS和αPD-1联合治疗对Luc-CT26腹腔转移瘤模型的抗肿瘤作用，(A)Luc-CT26腹腔转移小鼠肿瘤模型的构建与给药方案。 (B)DTX-VNS与αPD-1联合治疗抑制Luc-CT26肿瘤小鼠腹腔转移效果。 (C)Luc-CT26腹腔转移瘤小鼠接受治疗后各组小鼠的生存率曲线。(D) Luc-CT26腹腔转移瘤荧光强度曲线，每组3只小鼠。

图7显示了质谱流式分析小鼠经DTX-VNS和αPD-1联合治疗后黑色素瘤B16肿瘤的免疫微环境，(A)B16皮下肿瘤小鼠模型的构建与给药方案。(B)小鼠肿瘤组织免疫细胞亚群分布的viSNE图。(C)各组小鼠经过治疗后肿瘤组织中免疫细胞亚群分布的viSNE图。(D)各组小鼠经过治疗后肿瘤组织中免疫细胞不同亚群表面分子和功能分子表达热图。

图8显示了质谱流式分析小鼠经DTX-VNS和αPD-1联合治疗后黑色素瘤B16肿瘤的免疫微环境变化差异，(A)各组小鼠经过治疗后肿瘤组织中免疫细胞各种不同亚群的百分比。(B)小鼠经过DTX-VNS plusαPD-1 和DTX-VNS@αPD-1治疗后肿瘤组织免疫细胞各种不同亚群的百分比。 (C)小鼠经过DTX-VNS plusαPD-1和αPD-1plus DTX-VNS治疗后肿瘤组织免疫细胞各种不同亚群的百分比。

图9显示了Luminex分析小鼠经DTX-VNS和αPD-1联合治疗后黑色素瘤B16肿瘤的免疫因子变化差异。

图10小鼠经DTX-VNS和αPD-1联合治疗后不同时间点的黑色素瘤 B16肿瘤免疫微环境。(A)B16皮下肿瘤小鼠模型的构建、治疗及手术方案。经治疗后，小鼠肿瘤组织中(B)CD8+T淋巴细胞、(C)IFN-γ水平、 (D)CD11c+CD80+DC和(E)CD4+Foxp3+的Treg细胞的免疫荧光图片，标尺100μm。使用ImageJ计算(B)—(E)中肿瘤中CD8+CTL(F)、 IFN-γ(G)、CD11c+CD80+DC(H)和CD4+Foxp3+Treg(I)细胞的荧光强度，每组平行3次。

图11不同方案治疗后DTX-VNS与αPD-1在小鼠体内的拟合药时曲线。(A)DTX-VNS中DTX暴露在体内的药时曲线。DTX-VNS@αPD-1 (B)、αPD-1plus DTX-VNS(C)和DTX-VNS plusαPD-1(D)治疗后 DTX-VNS与αPD-1在小鼠体内的拟合药时曲线。

具体实施方式

以下，分别针对本发明涉及的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球及其制造方法、化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合及其应用等进行详细说明。

[化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球及其制造方法]

本发明的创新性在于利用肿瘤细胞ROS水平远高于正常细胞，构建了可以在肿瘤部位选择性释放药物的脂质微球，并利用冻干技术将脂质微球进行了冻干处理。本发明的纳米载体具有在肿瘤部位选择性释放药物的能力。通过将高浓度的维生素E包裹于磷脂形成的纳米粒中形成VE脂质纳米粒微球。由于VE对免疫微环境的调控，假设本发明的纳米系统可以表现出较高的抗肿瘤功效，并且可以通过消除药物刺激引起的ROS积累来同步减少氧化应激的失衡，从而降低治疗过程中的毒副作用。由于肿瘤部位具有更高水平的ROS，本发明的纳米系统在肿瘤部位的药物选择性释放比在正常器官更迅速，实现靶向肿瘤部位的效果。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含以下成分：抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，由此可以实现良好的稳定性，且实现良好的靶向性。由此能够提高抗肿瘤的治疗效果，降低毒副作用。

上述抗肿瘤有效成分可以是现有公知的药物，例如选自多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、奥沙利铂、喜树碱、卡铂以及阿糖胞苷中的至少一种。

上述抗肿瘤有效成分优选为选自多西他赛、紫杉醇以及卡巴他赛中的至少一种。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球中包含的注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少一种。所述维生素E及其衍生物优选为d-α-生育酚、dl-α-生育酚、d- α-生育酚醋酸酯、或dl-α-生育酚醋酸酯。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球能够有效的改善肿瘤微环境，如肿瘤中IFN-γ和CD8+CTL的水平均显着改善；在脾中测量CD3，CD8和CD4阳性T细胞的量呈现更强的增殖，可以更有效地提高免疫制剂在肿瘤微环境中发生的免疫应答。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球中包含的乳化剂仅使用磷脂。本发明中使用的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少一种。作为合成磷脂，可列举出二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰基卵磷脂 (DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂 (POPC)、或1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂(SOPC)等。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球中包含的稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的1种以上。

本发明的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球为冻干制剂，相对于液体制剂化学稳定性更好，且能够在较高的温度下存放，降低了低温储存和冷链运输的成本。

作为本发明的注射用多西他赛冻干微乳，从载药量和稳定性等方面考虑，优选：按重量百分比计，含有下述成分：

以下针对化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球的制造方法阐述如下：

(1)制备油相：在20～45℃条件下，将抗肿瘤药物、乳化剂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入注射用油，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)制备水相：将稳定剂加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm 微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)制备初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在5000～20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以10000～20000rpm持续剪切10～30分钟，即得初乳；

(4)制备终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1000～1500bar条件下，均质3～6次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8～24小时、升华温度-25℃～-40℃、升华时间48～96小时、解析温度15～30℃、解析时间8～20小时、真空度10～30pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用冻干脂质微球，上述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，上述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，上述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

[化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合应用]

本发明描述了对于癌症进行化疗与免疫治疗联合治疗的新策略。将上述纳米脂质微球与肿瘤免疫治疗剂例如αPD-1等联合用于抗肿瘤治疗，探索出了适合本发明中的纳米制剂与免疫治疗的最佳联合治疗方案，为临床上化疗与免疫治疗的合理联用提供有价值的参考。

该联合治疗方案中采用的化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球如前文所述。

该联合治疗方案中采用的肿瘤免疫治疗药物选自肿瘤免疫检查点抑制剂、单克隆抗体及小分子抑制剂中的至少1种，所述肿瘤免疫检查点抑制剂为选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂和IDO抑制剂中的至少1种。在本发明的技术方案中，从更有效地实现所联用的抗肿瘤制剂之间的协同作用的观点出发，上述肿瘤免疫治疗药物优选为肿瘤免疫检查点抑制剂，更优选为PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。

作为上述PD-1抑制剂可以是现有公知的药物，例如选自Opdivo(纳武利尤单抗)、Keytruda(帕博丽珠单抗)、特瑞普利单抗、卡瑞利珠单抗、 IMFINZI(度伐利尤单抗)中的至少一种。

本发明具体设计了三种联合治疗方式以实现最大程度的化疗增敏免疫治疗，包括：DTX-VNS(负载多西他赛的纳米脂质微球)与αPD-1同时给药，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1，以及先注射αPD-1两天后再注射DTX-VNS。下文中对多种恶性肿瘤模型进行考察，结果表明在注射DTX-VNS两天后再进行αPD-1注射的方案在多种不同的肿瘤模型中均表现出了最强的抗肿瘤效果，并显著延长了小鼠的生存期。通过质谱流式、多因子检测等手段研究发现，本发明提出的最优治疗方案更能改善肿瘤免疫微环境，导致显著增强的抗肿瘤免疫反应，这可能与该方案能引起最大的治疗叠加效应以及协同效果有关，上述叠加效应大小主要由 DTX-VNS与αPD-1在肿瘤部位的起效行为决定。本发明通过分析药物在体内的起效行为探索出了适合本发明的纳米粒与免疫治疗的最佳联合治疗方案，为临床上化疗与免疫治疗的合理联用提供了有价值的参考。

本发明中通过将上述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球以及肿瘤免疫治疗药物组合使用，能够省去在单独使用抗肿瘤化学药物的情形下需要预先给予激素的步骤，而且能够增敏免疫治疗，达到肿瘤的化学治疗效果与免疫治疗效果的协同作用。本发明中涉及的上述药物的联合应用可以针对恶性肿瘤、例如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、恶性淋巴瘤等发挥优异的肿瘤治疗效果，甚至能够抑制肿瘤复发和转移。

<实施例>

下面列举出实施例对本发明做进一步说明，单本发明并不限于以下实施例等。需要说明的是，在各实施例中，对于处方中的各组成成分的用量，若无特殊说明，则均为“按重量比计算”。

下述实施例中所使用的原辅料及设备具体示于表1和表2。

[表1]

名称	规格	制造商	执行标准
				多西他赛	原料药	福建南方制药	企业标准
紫杉醇	原料药	江苏红豆杉	中国药典二部2020版
				卡巴他赛	原料药	江苏红豆杉	企业标准
奥沙利铂	原料药	苏州立新制药	中国药典二部2020版
				大豆油	供注射用	德国lipoid公司	进口注册标准
中链甘油三酯	供注射用	德国lipoid公司	进口注册标准
				维生素E	原料药	BASF	进口注册标准
α-生育酚	供注射用	BASF	企业标准
				蛋黄卵磷脂	Lipoid E80	德国lipoid公司	进口注册标准
大豆磷脂	Lipoid S100	德国lipoid公司	进口注册标准
				蔗糖	注射用	湖南尔康制药	中国药典四部2020版
枸橼酸	注射用	湖南尔康制药	中国药典四部2020版
				无水乙醇	药用级	安徽安特食品	中国药典四部2020版

[表2]

名称	型号	制造商
			高速分散机	T18	IKA公司
高压均质机	Panda PLUS 2000	GEA Niro Soavi公司
			冷冻干燥机	2.5L Triad Freeze Dry System	LABCONCO公司
纳米粒度仪	ZS90	Malvern公司
			激光粒度仪	Accusizer 780APS	美国PSS公司
超纯水仪	Milli-Q	美国Millipore公司
			液相色谱仪	1260、UV检测器	安捷伦公司

实施例1

纳米脂质微球的构建及其表征 1)负载多西他赛的纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20～45℃条件下，将多西他赛、蛋黄卵磷脂、枸橼酸和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在 20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以15000rpm 持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1350bar条件下，均质4次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间15小时、升华温度-25℃、冻干时间72小时、解析温度20℃、解析时间 8小时真空度12pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用多西他赛冻干脂质微球。

冻干型多西他赛冻干脂质微球(DTX-VNS)的粒径约为107.5nm，在透射电子显微镜(TEM)下呈现典型的乳剂形态(见图1)，并且具有良好的稳定性，易于储存，在4度存放12个月其粒径、电位、药物含量以及杂质含量基本无变化(见表3)；具有较好的生物安全性，在较高的给药剂量下，空白脂质微球对肿瘤细胞无显著细胞毒性(见图2)。

表3冻干多西他赛脂质纳米微球在4度和25度存放12个月的稳定性。

由此可见，按照本发明的上述制备方法所获得的多西他赛冻干脂质微球的稳定性优异，且生物安全性高，无显著的细胞毒性。

实施例2

负载紫杉醇的纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20～45℃条件下，将紫杉醇、大豆卵磷脂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯和，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在 15000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以15000rpm 持续剪切25分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1200bar条件下，均质6次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8小时、升华温度-25℃、冻干时间48小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

紫杉醇脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗乳腺癌以及黑色素肿瘤。

实施例3

负载卡巴他赛的纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20-45℃条件下，将卡巴他赛、蛋黄卵磷脂、枸橼酸和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，利用0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30-50℃，然后利用高速分散机在 20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以15000rpm 持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1200bar条件下，均质4次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间24小时、升华温度-35℃、冻干时间72小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

卡巴他赛冻干脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗前列腺癌。

实施例4

负载奥沙利铂的纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20-45℃条件下，将奥沙利铂、大豆卵磷脂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、大豆油，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，利用0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30-50℃，然后利用高速分散机在 10000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以12000rpm 持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1200bar条件下，均质5次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间16小时、升华温度-30℃、冻干时间48小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

奥沙利铂脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗结肠癌以及卵巢癌。

实施例5

负载喜树碱的VE纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20～45℃条件下，将喜树碱、大豆卵磷脂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在 18000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以15000rpm 持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其转移至高压均质机中，在5～ 35℃下，在1200bar条件下，均质4次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8小时、升华温度-25℃、冻干时间48小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

喜树碱脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗胃癌以及结肠癌等。

实施例6

负载卡铂的纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在20～45℃条件下，将卡铂、大豆卵磷脂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，利用0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至30～50℃，然后利用高速分散机在 20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以18000rpm 持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其转移至高压均质机中，在5～ 35℃下，在1350bar条件下，均质5次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8小时、升华温度-25℃、冻干时间48小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

卡铂脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗卵巢癌以及小细胞肺癌等。

实施例7

负载阿糖胞苷的VE纳米脂质微球

制备方法：

(1)油相：在40-70℃条件下，将阿糖胞苷、大豆卵磷脂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入维生素E、中链甘油三酸酯，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)水相：将蔗糖加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，利用0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)初乳：首先预热水相和油相至50-70℃，然后利用高速分散机在 5000～20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以 15000rpm持续剪切30分钟，即得初乳；

(4)终乳：将初乳冷却至室温，然后将其转移至高压均质机中，在25～ 45℃下，在1200bar条件下，均质4次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8小时、升华温度-25℃、冻干时间48小时、解析温度20℃、解析时间10小时、真空度20pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用紫杉醇冻干脂质微球。

阿糖胞苷脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用治疗恶性淋巴瘤，肺癌以及头颈部癌等。

实施例8

本发明具体考察了按照上述制备的纳米脂质微球与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合治疗的效果及其作用机制。以实施实例1的多西他赛脂质微球为例，与免疫检查点抑制剂抗PD-1单抗联合应用于抗肿瘤治疗，进行以下方面的考察：

联合治疗方案：

将小鼠随机分成8组进行治疗，治疗周期为三周。1-8组小鼠分别静脉注射：

1.Saline(生理盐水)；

2.αPD-1(250μg/只/次/周)(BioX cell Inc.(USA))；

3.Taxotere(泰索帝)(10mg DTX/kg/次/周)(市售注射液)；

4.DTX-VNS(10mg DTX/kg/次/周)(由上述实施例1制得)；

5.Taxotere与αPD-1同时给药(Taxotere@αPD-1,250μgαPD-1/只/ 次/周，10mgDTX/kg/次/周)；

6.DTX-VNS与αPD-1同时给药(DTX-VNS@αPD-1,250μgαPD-1/ 只/次/周，10mg DTX/kg/次/周)；

7.先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1(DTX-VNS plusαPD-1,250 μgαPD-1/只/次/周，10mg DTX/kg/次/周)；

8.先注射αPD-1两天后再注射DTX-VNS(αPD-1plus DTX-VNS,250 μgαPD-1/只/次/周，10mg DTX/kg/次/周)。

(A)DTX-VNS与αPD-1联合抗肿瘤效果研究

1)DTX-VNS与αPD-1联合治疗对黑色素瘤B16皮下肿瘤模型的抗肿瘤效果

B16皮下肿瘤模型的建立：取对数生长期的B16肿瘤细胞用胰酶消化，然后用培养液制备成单细胞悬液，离心5分钟(1000rpm)，用PBS洗涤，离心，然后将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，使其分散均匀，用细胞计数板计数后，按照所需细胞量进行稀释。将B16细胞按照1×10⁶个/0.1mL/只注射于C-57雄性小鼠右后肢皮下。待肿瘤生长至时100mm³，将小鼠随机分成8组，开始治疗。治疗周期内监测小鼠的肿瘤体积、体重以及生存率，并按肿瘤体积-时间绘制肿瘤生长曲线。治疗结束后，麻醉小鼠，剥离每只小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾和脑)，用冰PBS洗涤，用4％的多聚甲醛固定后制备H&E染色切片。另外，取新鲜肿瘤组织200mg，对肿瘤浸润淋巴细胞进行流式分析。具体方法如下：

1.将肿瘤组织放入组织研磨器中，加入2mL的PBS，缓慢研磨至匀浆；

2.然后加入5mL研磨液冲洗研磨器内的细胞并收集细胞悬液，过200目的不锈钢滤网过滤；

3. 1000rpm离心5min，弃掉上清，细胞沉淀用PBS洗涤3次，离心得到肿瘤组织的细胞沉淀；

4.加入100μL的PBS重悬细胞，然后加入流式抗体FITC-anti-CD3， PE-anti-CD4、APC-anti-CD8和Percpy-anti-Foxp3标记T淋巴细胞，孵育30min；

5. 1000rpm离心5min，弃掉上清，加入4％的多聚甲醛固定20min，PBS 洗涤一次，沉淀用300μL的PBS重悬，过200目细胞筛，随后用流式分析仪分析。

DTX-VNS联合αPD-1治疗的三个组，治疗效果均强于单独的 DTX-VNS和Taxotere组以及Taxotere与αPD-1联合治疗组。说明 DTX-VNS与αPD-1的联合治疗起到了一定的叠加效果。另外，DTX-VNS 和αPD-1联合治疗的三个组因治疗顺序的不同，肿瘤的抑制效果也出现了一定的差异。小鼠生存率的差异尤为显著，三种不同联合治疗组不同程度地提高了小鼠的生存率，且各组之间存在显著性差异。和DTX-VNS @αPD-1(同时给药)、αPD-1plus DTX-VNS(先给αPD-1，两天后再给 DTX-VNS)组相比，DTX-VNS plusαPD-1(先DTX-VNS，两天后再给αPD-1)治疗组提高小鼠生存率，抑制肿瘤生长的效果最明显(见图3，图3C最后三条曲线，由下到上分别为DTX-VNS plusαPD-1治疗组，αPD-1 plus DTX-VNS治疗组和DTX-VNS@αPD-1治疗组)。

2)DTX-VNS与αPD-1联合治疗对Luc-CT26肺转移肿瘤模型的抗肿瘤效果

为了验证这种不同给药顺序带来的治疗差异是否适用于其他肿瘤模型，本发明构建了一种更恶性的Luc-CT26肺肿瘤转移模型进行验证。 Luc-CT26肺转移模型的建立：取对数生长期的Luc-CT26肿瘤细胞用胰酶消化，然后用培养液制备成单细胞悬液，离心5分钟(1000rpm)，用PBS 洗涤，离心，然后将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，使其分散均匀，用细胞计数板计数后，按照所需细胞量进行稀释。然后将Luc-CT26细胞按照 1×10⁶个/0.1mL/只经尾静脉注射于balb/c雄性小鼠。

Luc-CT26小鼠肺转移模型验证：接种一周后，小鼠腹腔注射200μL 的D-荧光素DPBS溶液(15mg/mL)，10min后在生物荧光影像分析系统下检测，小鼠肺部观察到荧光，说明模型构建成功。于接瘤后第7天用小动物活体生物发光成像仪检测小鼠肺部转移瘤的生成情况，将小鼠随机分成8组，然后开始治疗。分别于第13天和第26天检测小鼠肺肿瘤的生物发光的荧光强度，并绘制荧光强度-时间曲线。治疗周期内监测小鼠的体重和生存率。治疗结束后，麻醉小鼠，剥离每只小鼠的肺组织，拍照记录肺的形态，观察并统计小鼠肺部的肿瘤结节数。同时取小鼠的主要脏器(心、肝、脾和肾脏)，用冰PBS洗涤，称重，计算脏器系数，然后用4％的多聚甲醛固定后进行H&E染色切片，用光学显微镜观察切片结果并拍照。另外，取新鲜肿瘤组织200mg，对肿瘤浸润淋巴细胞进行流式分析，观察肿瘤组织中CD8⁺T和CD4⁺T细胞的比例。剩余肿瘤组织用冰PBS洗涤，然后用4％的多聚甲醛固定后进行免疫荧光切片，分析肿瘤组织中的CD8⁺ T细胞浸润情况和IFN-γ水平。

在给药一周后，Saline、Taxotere，PD-1单抗组小鼠肺部的荧光强度明显高于DTX-VNS与αPD-1@Taxotere治疗组，最后三组小鼠肺转移肿瘤荧光强度变化程度较小。到第26天后，由于肺转移瘤对小鼠呼吸系统产生较大的压制作用，小鼠的生存状态较差，随着肿瘤的日渐恶化，前五组小鼠相继死亡。剩余的主要治疗组保留了20-80％的生存率。尤其是 DTX-VNS plusαPD-1组的小鼠，6只小鼠中，只有一只小鼠因生存状态较差而死亡，其余小鼠肺肿瘤转移灶大部分被抑制。通过绘制荧光强度-时间曲线，对小鼠的肺转移肿瘤进行量化分析，结果让我们更清楚的看到， DTX-VNS plusαPD-1治疗组的小鼠肿瘤体积显著小于其他方式处理的小鼠的肿瘤，抑瘤效果最明显，明显地提高了小鼠的生存率，并且肺部转移最少(见图4，图4C最后三条曲线，由下到上分别为DTX-VNS plusαPD-1 治疗组，αPD-1plus DTX-VNS治疗组和DTX-VNS@αPD-1治疗组)。

待治疗结束之后，处死小鼠，取肿瘤进行流式分析，测量CD3，CD8 和CD4阳性T细胞的数量，发现DTX-VNS plusαPD-1治疗组中呈现比其他组更强的增殖。取出肿瘤切片，用于分析IFN-γ水平和CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞(CD8⁺CTL)的浸润，结果发现联合治疗组的IFN-γ和CD8⁺ CTL的水平远高于单独治疗组，同样地，DTX-VNS plusαPD-1治疗组 IFN-γ和CD8⁺CTL的浸润最多。另外，从肺部形态照片可以看出，每组小鼠的肺上都出现了肿瘤转移灶。Saline组的小鼠的肺组织几乎看不见完整的肺的形态，Taxotere、αPD-1、DTX-VNS和αPD-1@Taxotere治疗组小鼠的肺组织基本也被肿瘤转移灶覆盖，使用DTX-VNS与αPD-1联合治疗的小鼠的肿瘤转移灶相对较少，但是DTX-VNS plusαPD-1治疗组的小鼠肺部肿瘤转移灶最少。从肺组织HE图片结果可以看到Saline、Taxotere 和αPD-1治疗组肺部被大量肿瘤巢占据，其他治疗组同样出现了不同数量的肿瘤巢。只有DTX-VNS plusαPD-1组小鼠肺部组织能观察到完整而稀疏的细胞核排列，被肿瘤侵蚀的部分最少，说明DTX-VNS plusαPD-1的治疗能够最大程度的抑制肿瘤的生长及其转移(见图5)。并且从小鼠体重、各组织的脏器系数比值以及其他主要脏器的HE切片结果可以看出， DTX-VNS plusαPD-1治疗组具有良好的生物安全性。

3)DTX-VNS与αPD-1联合治疗对Luc-CT26腹腔转移肿瘤模型的抗肿瘤效果

随后，本发明又构建了一个更加恶性的晚期肿瘤模型，小鼠结肠腹腔转移模型。Luc-CT26腹腔转移模型的建立：取对数生长期的Luc-CT26肿瘤细胞用胰酶消化，然后用培养液制备成单细胞悬液，离心5分钟(1000 rpm)，用PBS洗涤，离心，然后将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，使其分散均匀，用细胞计数板计数后，按照所需细胞量进行稀释。然后将Luc-CT26 细胞按照1×10⁶个/0.1mL/只注射于balb/c雄性小鼠腹腔。

于接瘤后第7天用小动物活体生物发光成像仪检测小鼠腹腔转移瘤生成情况，将小鼠随机分成8组，然后开始治疗。分别于第12天和第21天检测小鼠腹腔肿瘤的生物发光的荧光强度，并绘制荧光强度-时间曲线。治疗结束后，麻醉小鼠，取每只小鼠的肿瘤，用冰PBS洗涤，然后用4％的多聚甲醛固定后进行免疫荧光切片，分析肿瘤组织中的CD8⁺T细胞、成熟DC的浸润情况和IFN-γ水平。

以CT26-Luc结肠癌腹腔肿瘤小鼠为动物模型，以Luciferase的发光强度测定肿瘤体积变化，评价不同程序性给药方案的体内抗肿瘤活性。以生理盐水为阴性对照，Taxotere，αPD-1，DTX-VNS与αPD-1@Taxotere 作为阳性对照。第7天每只小鼠的腹部均出现了较强的荧光蛋白信号，信号强度基本一致，表明每只小鼠的起始肿瘤生长情况基本一致，且腹腔转移已经比较严重。将上述小鼠随机分成8组进行治疗，分别于第12天和第21天监测小鼠腹腔肿瘤的生物发光强度，并绘制荧光强度-时间曲线。先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1治疗组的抑瘤效果最明显。治疗第 12天后，由于结肠肿瘤体积过大以及严重的肿瘤腹腔转移，对照组小鼠开始死亡，其他组也相继有小鼠死亡。待治疗结束时，DTX-VNS plusαPD-1 组小鼠的存活率明显高于其余各组，说明DTX-VNS plusαPD-1这种治疗方案具有较强的肿瘤缓解作用以及较高的安全性。通过生物发光荧光强度结果，我们发现DTX-VNS plusαPD-1组的荧光强度最弱，证明该治疗方式对肿瘤生长抑制最明显。实验结束后，收集小鼠腹腔主肿瘤，切片肿瘤用于分析IFN-γ水平、CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞(CD8⁺CTL)以及CD11c CD80阳性的DC细胞的浸润。发现单独的αPD-1、DTX-VNS以及αPD-1@Taxotere组中引起肿瘤中IFN-γ水平、CD8⁺CTL以及DC浸润的轻微增加。有趣的是，用DTX-VNS与αPD-1联合治疗组肿瘤中IFN-γ、 CD8⁺CTL以及DC浸润的水平均显着改善，并且DTX-VNS plusαPD-1组增加的最明显。以上结果表明DTX-VNS plusαPD-1可以通过改善肿瘤免疫微环境而达到较强的抗肿瘤效力(见图6，图6D最后三条曲线，由下到上分别为DTX-VNS plusαPD-1治疗组，αPD-1plus DTX-VNS治疗组和DTX-VNS@αPD-1治疗组)。

(B)质谱流式分析DTX-VNS与αPD-1联合抗肿瘤机制

接下来，为了探究不同程序性治疗带来的疗效差异的机制，本发明考察了肿瘤免疫微环境的变化情况。构建B16皮下肿瘤模型，待肿瘤体积达到100mm³时开始给药。将小鼠随机分成4组(每组5只)。1-4组小鼠分别静脉注射生理盐水，αPD-1(250μg/只/次/周)，αPD-1与DTX-VNS同时给药(DTX-VNS@αPD-1,10mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/次/ 周)，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1(DTX-VNS plusαPD-1,10mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/次/周)，先注射αPD-1两天后再注射 DTX-VNS(αPD-1plus DTX-VNS,10mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/ 次/周)。第14天处死小鼠，收集肿瘤。

获取新鲜肿瘤组织后，立即放置于含有组织保存液的5mL离心管中，然后将肿瘤组织消化，得到细胞沉淀，染色上机，具体操作如下：

1.组织放入6cm培养皿中，弃掉组织保存液，加入2mL RPMI-1640培养液清洗组织2次；

2.使用眼科剪小心将肿瘤组织剪碎至1mm³大小的碎片，然后加入消化酶:C-IV酶、D酶各1份，补加RPMI-1640培养液至5mL体系；

3.随后在组织解离器中进行解离，放置在恒温摇床进行消化，消化条件：37℃,145rpm,1h；

4.使用70μm滤筛将消化液过滤到收集管中，1000rpm离心10min；

5.弃掉上清，使用1mL ACK裂解沉淀中的红细胞，1000rpm离心5 min；

6.使用FACS buffer重悬细胞，1000rpm离心10min，得到细胞沉淀；

7.随后向细胞沉淀中加入预先配制好的抗体溶液重悬细胞，冰上染色30 min；

8.加入固定液固定过夜，1000rpm离心5min，弃上清，加入1mL的ddH₂O 重悬细胞，取10μL计数，然后上机测试。

治疗两周后，三个不同的联合治疗组已经产生明显的肿瘤生长差异，此时处死小鼠，收集肿瘤。将肿瘤分解在重金属标记的mAb面板染色后，用CyTOF分析它们的免疫细胞含量，并利用一种经过验证的数据驱动的无监督聚类方法对细胞群进行分类。为了全面表征肿瘤浸润性T细胞群体，我们设计了一个包含42个表面标记的染色面板。使用TSNE算法，用高维聚类分析CD45+免疫细胞治疗前后的动力学。计算了来自四个治疗组的数据，结合已知的细胞类型标记物进行评估，并使用基于图形的聚类来识别单个细胞类型组成的细胞簇。肿瘤免疫细胞被分成了24个clusters，考虑到我们目前对DTX-VNS和αPD-1生物学的理解、染色面板的设计，以及对总CD45⁺细胞间的分析，我们可以将这24个clusters分为T细胞(CD3⁺)、B细胞(CD19⁺B220⁺)、NK细胞(CD161⁺)、巨噬细胞(F4/80⁺ CD11b⁺)以及粒细胞(CD11b⁺Gr-1⁺)等5个主要的细胞群。肿瘤免疫微环境响应于不同的治疗发生了细胞亚群比例、转录谱和蛋白表达上的戏剧性的变化(见图7)。和Saline治疗组相比，三个联合治疗组的γδT细胞、活性B细胞、功能性中性粒细胞等功能性的免疫细胞的数量均有较大幅度的增加，并且CD4 Tex、Treg细胞、CD8 Tex、Resting NK、M2-TAM、 M-MDSC、髓性单核细胞等抑制性免疫细胞的数量均大幅减少(图7C、 7D)，说明DTX-VNS与αPD-1的联合治疗极大地增强了免疫功能，因而可以发挥较强的抗肿瘤效果。

通过一一比较发现，和Saline治疗组相比，三个联合治疗组的γδT细胞、活性B细胞、功能性中性粒细胞等功能性的免疫细胞的数量均有较大幅度的增加，并且CD4 Tex、Treg细胞、CD8 Tex、Resting NK、M2-TAM、 M-MDSC、髓性单核细胞等抑制性免疫细胞的数量均大幅减少，说明 DTX-VNS与αPD-1的联合治疗极大地增强了免疫功能，因而可以发挥较强的抗肿瘤效果。通过将DTX-VNS plusαPD-1与DTX-VNS@αPD-1治疗组进行对比发现，相对于同时给药组，DTX-VNS plusαPD-1可以大幅度提高CD4 Tef、CD8 Tef、活性B细胞、活性和效应NK细胞等细胞的数量，极大地激活抗肿瘤免疫系统，同时，DTX-VNS plusαPD-1治疗减少了抑制型细胞如Breg、M2-TAM、M-MDSC、髓性单核细胞等细胞的数量，抑制了免疫抑制性细胞的功能，从而发挥双重的免疫增强作用。同样地，通过将DTX-VNS plusαPD-1与αPD-1plusDTX-VNS治疗组进行对比，发现DTX-VNS plusαPD-1治疗大幅度地增加了CD4 Tef、CD8 Tef、活性 NK细胞、N1/Neutrophil等细胞的数量，同时减少了Breg、Resting NK、 N2/Neutrophil等抑制型细胞的数量，从而表现出较优的抗肿瘤作用(见图 8)。

3、Luminex检测技术分析DTX-VNS与αPD-1联合抗肿瘤机制

构建B16皮下肿瘤模型，待肿瘤体积达到100mm³时开始给药。将小鼠随机分成4组(每组5只)。1-4组小鼠分别静脉注射生理盐水，αPD-1 (250μg/只/次/周)，αPD-1与DTX-VNS同时给药(DTX-VNS@αPD-1,10 mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/次/周)，先注射DTX-VNS两天后再注射αPD-1(DTX-VNS plusαPD-1,10mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/ 次/周)，先注射αPD-1两天后再注射DTX-VNS(αPD-1plus DTX-VNS,10 mg DTX/kg/次/周，250μgαPD-1/只/次/周)。第14天处死小鼠，收集肿瘤。将肿瘤切成小块，用组织裂解液裂解，得到肿瘤裂解液，1000rpm离心5 min，取上清，然后使用Luminex试剂盒进行检测。

通过Luminex检测实验，相对于其他治疗组，DTX-VNS plusαPD-1 治疗组中促免疫因子IL-2、IL-12p70、IFN-γ、GranzymeB以及CXCL10 的分泌大幅提高，从而进一步增强抗肿瘤免疫系统，发挥了强效的肿瘤抑制作用(见图9)。

4、DTX-VNS与αPD-1联合治疗后肿瘤免疫微环境变化机制研究

为了进一步探究不同程序性化疗与免疫治疗带来的不同的治疗效果的机制，本发明使用B16肿瘤模型进行了机制研究，考察了给药0小时、 48小时和96小时后小鼠肿瘤免疫微环境的变化。模型构建：取对数生长期的B16肿瘤细胞用胰酶消化，然后用培养液制备单细胞悬液，离心5分钟(1000rpm)，用PBS洗涤，离心，然后将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，使其分散均匀，用细胞计数板计数后，按照所需细胞量进行稀释。将B16 细胞按照1×10⁶个/0.1mL/只分别注射于C-57雄性小鼠后背三处。小鼠体内免疫微环境的变化(不同给药时间点)：待肿瘤体积达到100mm³时开始进行治疗。分别于给药0小时,48小时以及96小时时，经过手术，取下一处肿瘤，冰PBS洗涤，然后用4％的多聚甲醛固定后进行免疫荧光切片，对CD8⁺T细胞、IFN-γ水平、CD11c⁺CD80⁺DC以及CD4⁺FOXP3⁺T 细胞进行染色，用“ImageJ”进行半定量分析。

在48小时的时刻，DTX-VNS与αPD-1联合治疗的三组小鼠肿瘤中 CD8⁺T细胞、CD11c⁺CD80⁺DC的浸润和IFN-γ水平均明显高于其他对照组，并且DTX-VNS@αPD-1治疗组在48小时的时刻上述细胞浸润最多。随着时间的延长，即在96小时的时刻，DTX-VNS@αPD-1与αPD-1plus DTX-VNS治疗组中CD8⁺T细胞的浸润开始减少，但是DTX-VNS plus αPD-1治疗组CD8⁺T细胞的浸润是累积增多的。另一方面，DTX-VNS plus αPD-1治疗后小鼠肿瘤微环境中的Treg水平下降最明显，并且能够维持在较低的水平。以上结果表明，DTX-VNS plusαPD-1治疗组可能通过持续的增加肿瘤微环境中的CD8⁺T细胞、CD11c⁺CD80⁺DC的浸润以及IFN-γ水平，并有效地减少抑制性CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量，使得小鼠的免疫功能增强，从而发挥较好的抗肿瘤免疫效果(见图10)。在48小时时， DTX-VNS与αPD-1联合治疗的三组小鼠肿瘤中CD8+T细胞、CD11c+ CD80+DC的浸润和IFN-γ水平均明显高于其他对照组，并且 DTX-VNS@αPD-1治疗组在48小时的时刻上述细胞浸润最多。随着时间的延长，即在96小时的时刻，DTX-VNS@αPD-1与αPD-1plus DTX-VNS 治疗组中CD8+T细胞的浸润开始减少，但是DTX-VNS plusαPD-1治疗组CD8+T细胞的浸润是累积增多的。另一方面，DTX-VNS plusαPD-1 治疗后小鼠肿瘤微环境中的Treg水平下降最明显，并且能够维持在较低的水平。以上结果表明，DTX-VNS plusαPD-1治疗组可能通过持续的增加肿瘤微环境中的CD8+T细胞、CD11c+CD80+DC的浸润以及IFN-γ水平，并有效地减少抑制性CD4+Foxp3+Treg细胞的数量，使得小鼠的免疫功能增强，从而发挥较好的抗肿瘤免疫效果。

根据DTX-VNS在体内药物暴露的时间分布，本发明拟合了一条 DTX-VNS在体内的药时曲线，DTX-VNS在体内达到最大效果的时间大约在70小时。另外根据0-96小时肿瘤微环境中CD8⁺T细胞、IFN-γ水平以及Treg的浸润情况，进一步拟合了DTX-VNS与αPD-1在体内的药时曲线。DTX-VNS和αPD-1同时注射治疗时，αPD-1可能在最初24小时内就达到最优的效果，此时DTX-VNS在体内刚刚开始起效，因此两者的联合治疗只能起到部分叠加的效果；而先注射αPD-1两天后再注射 DTX-VNS治疗时，αPD-1起效结束后，纳米粒的治疗效果才开始，两者的联合只有很小一部分的叠加治疗效果。然而，有趣的是先注射DTX-VNS 两天后再注射αPD-1治疗时，因DTX-VNS在体内有一个持续释放药物的作用，可能在给药后70小时左右时达到最佳的效果，而此时后注射的αPD-1也开始起效，两者在体内发挥最大治疗效果的时间刚好完全重叠，达到最佳的叠加效果，因而发挥了最强的改善免疫微环境的作用，体现了最优的治疗效果(见图11)。

Claims (16)

1.一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合，其用于治疗恶性肿瘤，其中，

所述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，

所述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，

所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，

所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

2.根据权利要求1所述的组合，其中，优选的联合给药方式为，向患者给药时，先注射所述纳米脂质微球后再注射肿瘤免疫治疗药物。

3.根据权利要求1或2所述的组合，其中，

所述抗肿瘤有效成分为选自多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、奥沙利铂、喜树碱、卡铂以及阿糖胞苷中的至少1种。

4.根据权利要求1或2所述的组合，其中，

所述肿瘤免疫治疗药物选自肿瘤免疫检查点抑制剂、单克隆抗体及小分子抑制剂中的至少1种。

5.根据权利要求4所述的组合，其中，

所述肿瘤免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂和IDO抑制剂中的至少1种。

6.根据权利要求1或2所述的组合，其中，

所述抗肿瘤有效成分为多西他赛，多西他赛与注射用油的重量比例为1：10～50。

7.一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球和肿瘤免疫治疗药物的组合在制备抗恶性肿瘤药物中的用途，其中，

所述化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球包含抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，

所述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，

所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，

所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

所述组合的联合给药方式为，向患者给药时，先注射所述纳米脂质微球后再注射肿瘤免疫治疗药物。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述恶性肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、恶性淋巴瘤。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，

所述抗肿瘤有效成分为选自多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、奥沙利铂、喜树碱、卡铂以及阿糖胞苷中的至少1种。

10.根据权利要求7或8所述的用途，其中，

所述肿瘤免疫治疗药物选自肿瘤免疫检查点抑制剂、单克隆抗体及小分子抑制剂中的至少1种。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，

所述肿瘤免疫检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂和IDO抑制剂中的至少1种。

12.根据权利要求7或8所述的用途，其中，

所述抗肿瘤有效成分为多西他赛，多西他赛与注射用油的重量比例为1：5～50。

13.一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球，其包含抗肿瘤有效成分、注射用油、乳化剂和稳定剂，

所述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，

所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，

所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

14.根据权利要求13所述的纳米脂质微球，其中，

所述抗肿瘤有效成分为选自多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、奥沙利铂、喜树碱、卡铂以及阿糖胞苷中的至少1种。

15.根据权利要求13或14所述的纳米脂质微球，其中，

所述抗肿瘤有效成分为多西他赛，多西他赛与注射用油的重量比例为1：5～50。

16.一种化学抗肿瘤药物的纳米脂质微球的制造方法，其具有以下步骤：

(1)制备油相：在20～45℃条件下，将抗肿瘤药物、乳化剂和无水乙醇混合并搅拌至澄清，再加入注射用油，搅拌至澄清，真空挥去乙醇，即得油相；

(2)制备水相：将稳定剂加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得水相；

(3)制备初乳：首先预热所述水相和所述油相至30～50℃，然后利用高速分散机在5000～20000rpm的剪切搅拌下，将水相缓慢加入油相中，待完全加入后，以10000～20000rpm持续剪切10～30分钟，即得初乳；

(4)制备终乳：将初乳冷却至室温，然后将其经高压均质机，在5～35℃下，在1000～1500bar条件下，均质3～6次；

(5)过滤分装：经0.45μm微孔滤膜过滤终乳，将经过滤的终乳分装于西林瓶中，并充氮气；

(6)冷冻干燥：将分装后的终乳置于冷冻干燥机中，在预冻温度-55℃、预冻时间8～24小时、升华温度-25℃～-40℃、升华时间48～96小时、解析温度15～30℃、解析时间8～20小时、真空度10～30pa的条件下进行冷冻干燥，即得注射用冻干纳米脂质微球，

所述注射用油为选自大豆油、橄榄油、薏仁油、中链甘油三酯、以及维生素E及其衍生物中的至少1种，

所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的至少1种，

所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、枸橼酸、琥珀酸和酒石酸中的至少1种。

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