CN114269332A - 涉及拴系的乙氧二羟丁酮衍生物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

实施方案涉及包含乙氧二羟丁酮衍生物的治疗性、诊断性或功能性复合物。

Description

涉及拴系的乙氧二羟丁酮衍生物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月22日提交的美国临时专利申请第62/851386号和2020年3月11日提交的美国临时专利申请第62/987932的优先权权益，其全部内容均通过引用整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的HG008935的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
发明领域
实施方案一般涉及分子和细胞生物学。特别地，实施方案涉及用于标记核酸的方法和组合物。
发明内容
已开发点击化学乙氧二羟丁酮衍生物(“乙氧二羟丁酮衍生物”)(例如N3-乙氧二羟丁酮)，其通过与鸟嘌呤碱基的沃森-克里克界面反应，有效地与活细胞中的单链DNA和/或RNA连接。经标记的产物可以例如使用生物素/生物素结合配偶体或其他试剂进一步功能化和富集。
某些实施方案涉及与乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂或结合部分(例如治疗剂(小分子、核酸、肽等)、诊断剂(成像剂等)或功能剂(探针、标记物等))的复合物。在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有以下通式：
Figure BDA0003481847720000011
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式I的通式，其中E选自反应性基团、点击化学部分、结合基团或治疗剂；D是任选地接头或直接键；R是连接元件或基团；A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分；G是二羰基定义基团。
在某些方面，R可选自经取代或未取代的碳、氮、芳基、烷芳基或杂环基基团。
在某些方面，A可由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基基团或其组合取代(单取代、二取代等)。在某些方面，A可由接头单取代或二取代。在某些方面，A可由反应性基团例如点击化学部分、治疗剂或结合部分单取代或二取代。在其他方面，A可以是第二E基团(E2相对于E2)。
在某些方面，D是接头，其选自酯、酰胺、四嗪、四唑、三嗪、三唑、芳基基团、杂环、磺酰胺、硫脲，经取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团。在某些情况下，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个上述接头的串联体(包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个接头)。
Figure BDA0003481847720000021
在一些方面，D可以由反应性基团例如点击化学部分取代。在一些方面，D可以是E和R之间的直接键。在某些方面，D可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，包括烷氧基、醚、羰基、芳基、吸电子基团或给电子基团、亲电中心或亲核中心或H键受体。
在某些方面，G可独立地选自H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3或烷基基团。
在某些方面，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。在一些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在某些方面，E还可连接至试剂或结合部分。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接靶标(蛋白质或核酸)连接。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
具体化合物包括但不限于式I化合物，其中(i)G是H，R是C，A是甲基，D是-OCH2CH2-三唑-吡啶-芳基-酰胺-CH2CH2，并且E是N3(叠氮化物)；(ii)G是H；R是C，A是F，D是-OCH2CH2-三唑-酰胺-苯并咪唑-苯基-NHCO-CH2CH2，E是炔烃；(iii)G是H，R是C，A是R的二氟取代基，D是-OCH2CH2-三唑-CH2-吡啶-苯并咪唑-NHCO-CH2CH2CH2-，E是N3(叠氮化物)；(iv)G是H，R是C，A是甲基，D是-OCH2CH2-三唑-，E是苯酚或二苯酚。
在某些方面，乙氧二羟丁酮复合物选自3-叠氮基-2-氧代丙醛、3-叠氮基-2-氧代丁醛、3-叠氮基-3-氟-2-氧代丙醛、2-氧代-6-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)己醛、2-((1S，4S)-二环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-2-氧代乙醛、2-氧代-2-苯乙醛、2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-氧代乙醛、2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙醛、N-(2，3-二氧丙基)-N-甲基-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺、N-((1-(2-((3，4-二氧丁烷-2-基)氧基)乙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺、2-氧代-3-(丙-2-炔-1-基氧基)丁醛、(E)-3-(2-(环辛-4-烯-1-基氨基)乙氧基)-2-氧代丁醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丙醛、3，4-二氧丁烷-2-基2-叠氮基乙酸酯、3-(2-叠氮基乙氧基)-3-甲基-2-氧代丁醛、5-叠氮基-2-氧代戊醛、2-叠氮基-N-(3，4-二氧丁烷-2-基)-N-甲基乙酰胺、3-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丁醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-3-氟-2-氧代丙醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-3，3-二氟-2-氧代丙醛、4-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丁醛或3-(((1S，4S)-二环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)甲氧基)-2-氧代丁醛。可明确排除这些化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种。
Figure BDA0003481847720000041
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式II的通式，其中E选自反应性基团、点击化学、结合基团或治疗剂；D任选地是接头或直接键。
在某些方面，D是接头，其选自酯、酰胺、四嗪、四唑、三嗪、三唑、芳基、杂环、磺酰胺，经取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其j是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。在一些方面，D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团。在某些情况下，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个上述接头的串联体(包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个接头)。
Figure BDA0003481847720000051
在一些方面，D可由反应性基团例如点击化学部分取代。在一些方面，D可以是E和连接A的碳原子之间的直接键。在某些方面，D可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，其选自烷氧基、醚、羰基、芳基基团、吸电子基团(例如，硝基-、三氟甲基-、氰基、三甲基硅烷基-、酯类，其作为独立的取代基或芳基上的取代基)或给电子基团(例如，烷基、硫醇、胺、氮丙啶、环氧乙烷、烯烃-，其作为独立的取代基或芳基上的取代基)、亲电中心或亲核中心(例如，醛、酮、酸酐、亚胺、腈、烯烃、炔烃、芳基、杂芳基)，或H键受体或供体(例如，醚、醇、羰基、胺、硫醇、硫醚、磺酰胺、卤化物)。
在某些方面，E选自反应性基团、点击化学、结合基团或治疗剂。在某些情况下，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。在一些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在某些方面，E还可连接至试剂或结合部分。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
Figure BDA0003481847720000061
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式III的通式，其中E选自反应性基团、点击化学部分、结合基团或治疗剂；A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分；G是二羰基定义基团。
在某些方面，E是点击化学部分，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃和双吖丙啶。在某些方面，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。在某些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在一些方面，E还可包含接头(E可以是具有末端点击化学部分的反应性基团)。
在某些方面，A可以是接头(如对D所定义的)，A还可连接至试剂或结合部分。A或G可独立地选自H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3或烷基基团。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
Figure BDA0003481847720000071
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式IV的通式，其中A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。在某些方面，A由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基基团或其组合取代(单取代、二取代等)。在某些方面，A可由接头单取代或二取代。在某些方面，A可由反应性基团例如点击化学部分、治疗剂或结合部分单取代或二取代。在某些方面，叠氮化物部分还与试剂或结合部分连接。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
Figure BDA0003481847720000072
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式V的通式，其中E选自反应性基团、点击化学部分、结合基团或治疗剂，并且A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。
在某些方面，E是点击化学部分，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃和双吖丙啶。在某些方面，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。在一些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在某些方面，E还可连接至接头(E可以是具有末端点击化学部分的接头)。
A由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基基团或其组合取代(单取代、二取代等)。在某些方面，A可由接头单取代或二取代。在某些方面，A可由反应性基团例如点击化学部分、治疗剂或结合部分单取代或二取代。在某些方面，叠氮化物部分还与试剂或结合部分连接。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
在某些方面，E、A或E和A可独立地连接至试剂或结合部分。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
Figure BDA0003481847720000081
在某些方面，化合物/乙氧二羟丁酮衍生物可具有式VI的通式，其中A可由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基或其组合取代；D是任选地接头或直接键；E可以是反应性官能团。在某些方面，A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。
在某些方面，E是点击化学部分，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃和双吖丙啶。在某些方面，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在某些方面，E还可连接至接头(E可以是具有末端点击化学部分的接头)。
在某些方面，D是接头，其选自酯、酰胺、四嗪、四唑、三嗪、三唑、芳基基团、杂环、磺酰胺，经取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。在一些方面，D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团。在某些情况下，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个上述接头的串联体(包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个接头)。
Figure BDA0003481847720000101
在一些方面，D可由反应性基团例如点击化学部分取代。在一些方面，D可以是E和连接A的碳原子之间的直接键。在某些方面，D可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，其选自烷氧基、醚、羰基、芳基基团、吸电子基团(例如，硝基-、三氟甲基-、氰基基团、三甲基硅烷基-、酯类-，作为独立的取代基或芳基上的取代基)或给电子基团(例如，烷基、硫醇、胺、氮丙啶、环氧乙烷、烯烃-，其作为独立的取代或芳基上的取代基)、亲电中心或亲核中心(例如，醛、酮、酸酐、亚胺、腈、烯烃、炔烃、芳基、杂芳基)，或H键受体或供体(例如，醚、醇、羰基、胺、硫醇、硫醚、磺酰胺、卤化物)。
A由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基或其组合取代(单取代、二取代等)。在某些方面，A可由接头单取代或二取代。在某些方面，A可由反应性基团例如点击化学部分、治疗剂或结合部分而单取代或二取代。在某些方面，叠氮化物部分还与试剂或结合部分连接。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
在本文提供的所有制剂中，反应性基团可通过pH变化、氧化、光、金属或其他催化剂活化。在某些方面，E可含有可检测的标记，其包括但不限于：药物、毒素、肽、多肽、表位标签、特异性结合对的成员、荧光团、固体载体、核酸(DNA/RNA)、脂质或碳水化合物。在某些方面，E可含有亲和基团，包括生物素(或生物素上的四氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-2(3H)-酮部分)、配体、底物、与另一分子有亲和力的大分子、大分子或表面。在某些方面，E可以是具有图2A所示的式VIIIA-F的化学式的基团。图2B提供式VI的这种化合物的实例。
复合物可将试剂或结合部分拴系到核酸上，因此乙氧二羟丁酮衍生物在功能剂和功能剂附近的核酸之间起到拴系作用。乙氧二羟丁酮衍生物是拴系物或双功能实体，可称为生物功能部分。试剂可以是小分子、寡核苷酸等。在某些方面，试剂、结合部分或小分子与蛋白质或核酸连接。在某些方面，试剂是治疗剂。治疗剂可以是用于治疗、控制或预防疾病或医学病症的小分子、药物(drug)、药剂、药品、激素、抗生素、蛋白质、基因、核酸生长因子、生物活性材料等。在其他方面，试剂或治疗剂是核酸。核酸可以是抑制性核酸，例如siRNA。乙氧二羟丁酮衍生物可以是N3-乙氧二羟丁酮并且可与试剂或结合剂可操作地连接。
某些实施方案涉及将试剂或治疗剂定位于核酸的方法，其包括将细胞与本文所述的复合物或生物功能复合物接触。
乙氧二羟丁酮衍生物及其复合物可在体内、离体或体外使用。如本文所用，术语“体内”是指在活体对象内发生的任何过程/事件。如本文所用，术语“体外”是指在在活体对象外部的人工环境中，例如但不限于，在试管或培养基中，发生的任何过程/事件。在一些实施方案中，体外是指在细胞培养物中生长的细胞系。在一些实施方案中，体外是指在细胞培养物中生长的肿瘤细胞。在一些实施方案中，体外是指与活细胞无关的试验品或组合物中的组分。术语“离体”是指使用取自本体的生物样品的细胞或组织培养技术。
某些实施方案涉及用于将试剂或治疗剂定位于细胞中的方法，其包括(i)将目标细胞与本文所述的复合物或生物功能复合物接触以形成经处理的细胞；(ii)将复合物或生物功能复合物通过与鸟嘌呤碱基连接的乙氧二羟丁酮衍生物与核酸连接。
术语“乙氧二羟丁酮衍生物”是指具有乙氧二羟丁酮[-(O)C-C(O)-]的基本骨架结构且在骨架结构中增加的另外取代基的化合物。
术语“核苷”和“核苷酸”是指如下化合物，其具有嘧啶核碱基，例如胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)、肌苷(I)，或嘌呤核碱基，例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，与“天然糖”(即，-核糖、2′-脱氧核糖等)或其糖类似物的C-1′碳相连，包括2′-脱氧和2′-羟基形式。通常，当核碱基是C、U或T时，戊糖连接到核碱基的N1位。当核碱基是A或G时，核糖连接到核碱基的N9位(Kornberg and Baker，DNA Replication，2nd Ed.，Freeman，San Francisco，Calif.，(1992))。如本文所用，术语“核苷酸”是指作为单体单元或多核苷酸内的核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是连接在核糖C-5′位置的羟基。
如本文所用，术语“试剂”包括与乙氧二羟丁酮衍生物连接的化学部分，并且包括治疗剂、诊断剂和/或功能剂。
如本文所用，“治疗剂”是与乙氧二羟丁酮衍生物缀合以产生可用于治疗的缀合物或复合物的分子或原子。治疗剂的非限制性实例包括药物、前药、毒素、酶、激活前药成为药物的酶、酶抑制剂、核酸酶、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂，例如细胞因子，即白介素，例如白介素-2，淋巴因子、干扰素和肿瘤坏死因子、寡核苷酸(例如反义寡核苷酸或干扰RNA，即小干扰RNA(siRNA))、螯合剂、硼化合物、光活性剂或染料、放射性同位素或放射性核素。
合适的另外施用的药物、前药和/或毒素可包括阿普立定、阿扎利滨、阿那曲唑、氮胞苷、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、更生霉素、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素及其类似物、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-门冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀、链脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉烷、紫杉醇、丙酸睾酮、酞胺哌啶酮、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、红豆因、核糖核酸酶、核糖核酸酶例如豹蛙酶、rapLR1、脱氧核糖核酸酶I、金黄色葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞杆菌内毒素、氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、经取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素或其组合。
合适的放射性核素可包括18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、77As、86Y、89Sr、89Zr、90Y、94Tc、94mTc、99Mo、105pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-158Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac或其混合物。如果放射性核素用于治疗，则可能需要放射性核素发射70keV至700keV的伽马粒子或正电子。如果放射性核素用于诊断，可能需要放射性核素发射25keV至4000keV的伽马粒子和/或正电子。放射性核素可用于进行正电子发射断层扫描(PET)，并且方法可包括进行PET。
合适的光活性剂和染料包括用于光动力疗法的试剂，例如光敏剂，例如苯并卟啉单酸环A(BPD-MA)、初卟啉锡(SnET2)、磺化铝酞菁(AISPc)和德赛卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)(Lutex)。
如本文所用，“诊断剂”是可用于诊断或成像的与乙氧二羟丁酮衍生物缀合的分子或原子。诊断剂的非限制性实例包括光活性剂或染料、放射性核素、不透射线材料、造影剂、荧光化合物、用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)及其组合。合适的增强剂是Mn、Fe和Gd。
治疗剂和/或诊断剂可与乙氧二羟丁酮衍生物直接结合(例如，共价或非共价结合)。
“核苷类似物”和“核苷酸类似物”是指具有经修饰的核碱基部分(例如，下面描述的嘧啶核碱基类似物和嘌呤核碱基类似物)、经修饰的糖部分和/或经修饰的磷酸酯部分的化合物(例如参见Scheit，Nucleoside Analogs，John Wiley and Sons，(1980)；F.Eckstein，Ed.，Oligonucleotides and Analogs，Chapters 8and 9，IRL Press，(1991))。核糖或核糖类似物可以是经取代或未取代的。经取代的核糖包括但不限于如下那些核糖，其中一个或多于一个碳原子(例如2′-碳原子或3′-碳原子)可由一个或多于一个相同或不同的取代基例如-R、-OR、-NRR或卤素(例如氟、氯、溴或碘)取代，其中每个R基团可独立地是-H、C1-C6烷基或C3-C14芳基。特别地，核糖是核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、3′-卤代核糖(例如3′-氟核糖或3′-氯核糖)和3′-烷基核糖、阿拉伯糖、2′-O-甲基核糖和锁核苷类似物(参见例如PCT公布第WO 99/14226号)，尽管许多其他类似物也是本领域已知的。
如本文所用，术语“核酸”可指核酸材料本身并且不限于表征特定的核酸的序列信息(即，选自五个碱基字母A、C、G、T或U的连续字母)，例如DNA或RNA分子。除非另有说明，否则本文所述的核酸以5′→3′方向呈现。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指天然核苷酸单体或其类似物的聚合物，包括双链和单链脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其α-异头异构形式等。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用。通常核苷单体通过核苷酸间磷酸二酯键连接，而本文使用的术语“磷酸二酯键”是指磷酸二酯键或包括其磷酸酯类似物的键，并且如果存在抗衡例子，包括相关的抗衡离子，包括但不限于H+、NH4 +、NR4 +、Na+。多核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸组成、完全由核糖核苷酸组成，或由其混合物组成。
“RNA”是指核糖核酸，是在基因的编码、解码、调控和表达中具有多种生物学作用的聚合分子。RNA通过催化生物反应、控制基因表达或感知和传达对细胞信号的反应，在细胞内发挥积极作用。信使RNA将蛋白质氨基酸序列的信息携带到核糖体，通过核糖体翻译合成蛋白质。
“DNA”是指脱氧核糖核酸，是存在于几乎所有生物体中作为染色体的主要成分和遗传信息的载体的聚合分子。在各种实施方案中，术语DNA是指基因组DNA、重组DNA、合成DNA或互补DNA(cDNA)。在一个实施方案中，DNA是指基因组DNA或cDNA。在特定实施方案中，DNA是DNA片段。
术语“点击化学”是指K.Barry Sharpless引入的化学哲学，描述了通过将包含反应性基团的小单元连接在一起来专门用于快速可靠地生成共价键的化学。点击化学不是指特定反应，而是指概念，其包括模拟自然界中发现的反应的反应。在一些实施方案中，点击化学反应是模块化的、范围广、产生高化学产率、产生无害的副产物、是立体定向的、表现出＞84kJ/mol的高热力学驱动力以有利于与单一反应产物的反应，和/或可在生理条件下进行。明显的放热反应使反应物“弹性加载”(“spring loaded”)。在一些实施方案中，点击化学反应表现出高原子经济性，可在简单反应条件下进行，使用容易获得的起始材料和试剂，不使用有毒溶剂或使用良性或容易去除的溶剂(优选水)，和/或通过非色谱方法(结晶或蒸馏)提供简单的产品分离。
如本文所用，术语“点击化学柄”或“点击化学部分”是指可参与点击化学反应的反应物或反应性基团。例如，叠氮化物是点击化学柄。一般而言，点击化学反应需要至少两个包含可以相互反应的互补点击化学柄的分子。这种可相互反应的成对的点击化学柄有时在本文中称为配对点击化学柄。例如，叠氮化物是环辛炔或任何其他炔烃的配对点击化学柄。本文描述适用于根据本发明的一些方面的示例性点击化学柄。其他合适的点击化学柄是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“接头”是指与另一分子共价连接的化学基团或分子。在一些实施方案中，接头位于两个基团、分子或部分之间或两侧，并且通过共价键连接到每个基团、分子或部分，从而连接这两个基团、分子或部分。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团或化学部分。
术语“稳定化取代基”是指通过空间或电子效应例如氢键、吸电子或给电子基团的添加、迈克尔受体等，使产物(在乙氧二羟丁酮衍生物与靶标反应后)稳定/去稳定的取代基。
如本文所用，术语“标签”或“亲和标签”是指可连接至化合物、核苷酸或核苷酸类似物并且与配对部分特异性结合的部分。亲和标签与其配对的相互作用提供携带亲和标签的分子的检测、分离等。实例包括但不限于生物素或亚氨基生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。亲和标签的一个亚类是“表位标签”，它是指被抗体或其抗原结合片段识别并且特异性结合的标签。合适标签的实例包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、核酸、多核苷酸、糖、碳水化合物、聚合物、脂质、脂肪酸和小分子。其他合适的标签对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且本发明在这方面不受限制。在一些实施方案中，标签包含用于纯化、表达、溶解和/或检测靶标的序列。在一些实施方案中，标签可提供多种功能。在一些实施方案中，标签包括HA、TAP、Myc、6×His、Flag或GST标签，这里仅举几个例子。在一些实施方案中，标签是可切割的，因此它可以被去除。在一些实施方案中，这通过在标签中包括例如与标签的功能部分相邻或连接的蛋白酶切割位点来实现。示例性蛋白酶包括例如凝血酶、TEV蛋白酶、Xa因子、PreScission蛋白酶等。在一些实施方案中，使用“自切割”标签。
本申请中通篇讨论了本发明的其他实施方案。关于本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适用于本发明的其他方面，反之亦然。本文描述的每个实施方案理解为适用于本发明所有方面。预想到本文讨论的任何实施方案可关于本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。
术语“一个”或“一种”在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时可表示“一个/一种”，但也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义一致。
术语“约”或“大约”定义为接近本领域技术人员所理解的含义。在一个非限制性实施方案中，该术语定义为包括在10％以内，优选在5％以内，更优选在1％以内，并且最优选在0.5％以内的范围。
术语“基本上”及其变体定义为包括10％以内、5％以内、1％以内或0.5％以内的范围。
如在说明书和/或权利要求中使用的术语“有效”，，是指足以实现所需、预计或预期的结果。
术语“重量％”、“体积％”或“摩尔％”分别是指组分基于包括该组分的材料的总重量、总体积或总摩尔数的重量、体积或摩尔百分比。在一个非限制性实例中，100摩尔材料中的10摩尔组分是10摩尔％的组分。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。
如在本说明书和权利要求中使用的，措辞“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性或开放式的，并且不排除另外未提及的要素或方法步骤。
本发明的组合物和制备与使用方法可“包含”、“基本上组成为”或“组成为”整个说明书中公开的特定成分、组分、共混物、方法步骤等。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应该理解，详细说明和具体实施例虽然指示本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述对于本领域技术人员来说将变得明显。
本文公开的任何实施方案可以实施或与本文公开的任何其他实施方案组合，包括化合物的实施方案的方面可组合和/或替代，并且任何和所有化合物可在本文所述任何方法的上下文中实施。类似地，任何方法实施方案的方面可与本文公开的任何其他方法实施方案组合和/或替代。此外，本文公开的任何方法可以实现该方法的“组合物的用途”的形式来叙述。特别预想到的是，关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制都可适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于制备或利用本发明的任何组合物。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多于一幅并且结合在此呈现的说明书实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
图1A-F：N3-乙氧二羟丁酮及其选择性、细胞渗透性和可逆性的实验评价。(a)N3-乙氧二羟丁酮的结构和与鸟嘌呤的反应。(b)变性凝胶电泳证明N3-乙氧二羟丁酮仅与单链RNA(ssRNA)反应。(c)RNA寡核苷酸与N3-乙氧二羟丁酮反应的质谱分析。在具有四个鸟嘌呤的RNA 1中，所有鸟嘌呤并且仅有鸟嘌呤由N3-乙氧二羟丁酮标记。在不含鸟嘌呤的RNA 2中，未观察到N3-乙氧二羟丁酮标记。(d)上图：乙氧二羟丁酮和N3-乙氧二羟丁酮与FAM-RNA寡核苷酸(5’-FAM-GAGCAGCUUUAGUUUAGAUCGAGUGUA(SEQ ID NO：3，泳道1-3)的标记反应和生物素-DBCO的生物素化(泳道5、6)的变性凝胶电泳分析。仅有N3-乙氧二羟丁酮标记的RNA可生物素化(泳道6)。下图：标记和生物素化反应后RNA的斑点印迹。亚甲蓝斑点结果列为对照。(e)从mES细胞分离的总RNA的斑点印迹，其通过用N3-乙氧二羟丁酮以不同时间1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟进行处理。(f)在95℃在50mM GTP的存在下，N3-乙氧二羟丁酮标记的mRNA的可逆性的斑点印迹分析。孵育10分钟后，mRNA中的N3-乙氧二羟丁酮修饰彻底去除。
图2A-B.说明具有式VIII(A)的化学式的基团和具有式VI(B)的化学式的乙氧二羟丁酮衍生物的实例。图2中的R代表与乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂。
图3.苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮的标记活性，这两种化合物分别与含有四个鸟嘌呤碱基的12聚体合成RNA寡核苷酸一起孵育。10分钟后，将反应净化并且通过MALDI-TOF进行分析。
图4.测试苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮的细胞渗透性。将细胞分别用苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮处理10分钟，并且从处理的细胞中分离RNA。通过将这些乙氧二羟丁酮衍生物标记的RNA与生物素苯酚、辣根过氧化物酶(HRP)和H2O2混合，进行体外生物素化反应。
图5.缀合物的实例的说明。
图6.式I中母体化合物的一般描述的说明。
图7.式I的非限制性实例的说明。
图8A-8F.式I的各种非限制性实例的表格的说明。
图9A-B.遵循游离鸟苷相对量的LCMS结果实例。
具体实施方式
核酸的化学标记对于一系列应用非常有用，例如探测核酸结构、核酸位置、核酸邻近信息、转录和翻译。典型的标记策略包括代谢标记。预想将连接或拴系到核酸的部分作为用于治疗剂或诊断剂到该部分连接或结合的位置的锚或拴链。某些实施方案涉及乙氧二羟丁酮衍生物(例如，N3-乙氧二羟丁酮)作为拴系剂的开发。
目前的方法没有专门地定位抑制剂和/或将抑制剂共价锁定就位。本文所述的实施方案包括定位于结合位点并且可与所述位点共价连接的实体，例如将抑制性RNA连接至其靶标。方法和组合物通过乙氧二羟丁酮衍生物将试剂定位到特定靶标附近。
可将乙氧二羟丁酮衍生物形式的适当定位信号拴系在治疗剂上，以使其精确定位或固定在其靶标或结合配偶体上或附近。这种定位锚唯一地识别靶标，或将靶标与大多数不正确的靶标区分开来。例如，基于RNA的病毒复制抑制剂可以与靶标RNA相拴系。此外，可将转录复合物的抑制剂锁定就位，从而改变抑制剂的开/关动力学并且阻断转录位点。
方面包括用于增强治疗剂体内效果的方法。所述方法包括使试剂在体内定位于其靶标或其附近的步骤。
“增强”治疗剂在体内的作用是指定位锚将试剂靶向细胞内的特定位点，从而使该试剂更有效地起作用。因此，给予体内细胞的较低浓度的试剂可具有与较大浓度的非定位试剂相同的效果。可通过本领域技术人员熟知的任何标准程序来测量靶向或定位剂的这种增加的效率。一般而言，通过将试剂放置和/或保持在更靠近靶标的位置来增强试剂的作用，使得它可对此靶标产生其期望的效果。
在其他方面，本发明的特征在于通过使用合适的定位锚将它们与其靶标共定位或锚定来增强基于核酸的治疗剂在体内的作用的方法。
A.乙氧二羟丁酮衍生物锚
乙氧二羟丁酮衍生物锚能够使试剂共价连接到其结合靶标或附近的另一个实体。“点击”化学可通过光来控制，从而实现在活细胞中的位点特异性修饰。
如本文所述，N3-乙氧二羟丁酮(乙氧二羟丁酮衍生物的代表)显示出与单链DNA和RNA上的鸟嘌呤选择性反应。这些反应在温和的正常细胞培养条件下非常有效，可直接应用于组织。可使用本文所述的方法将任何化学部分安装在乙氧二羟丁酮衍生物上。根据本发明的一些方面，特别地使用的是点击化学柄。点击化学柄是提供可参与点击化学反应的反应性基团的化学部分。点击化学反应和用于点击化学反应的合适化学基团是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于末端炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。例如，在一些实施方案中，在点击化学反应中使用叠氮化物和炔烃。在某些方面，“点击化学可相容的”化合物或点击化学柄包括末端叠氮化物官能团(例如，式I)。
Figure BDA0003481847720000191
在某些方面，化合物具有式I和式II的通用式，其中E选自反应性基团、点击化学部分、结合基团或治疗剂；D是任选地接头或直接键；R是连接元件或基团；A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分；G是二羰基定义基团。
在某些方面，R可选自经取代或未取代的碳、氮、芳基、烷芳基或杂环基团。
在某些方面，A可由一个或多于一个H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基或其组合取代(单取代、二取代等)。在某些方面，A可由接头单取代或二取代。在某些方面，A可由反应性基团例如点击化学部分、治疗剂或结合部分单取代或双取代。
在某些方面，D是接头，其选自酯、酰胺、四嗪、四唑、三嗪、三唑、芳基基团、杂环、磺酰胺，经取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团。在某些情况下，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个上述接头的串联体(包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个接头)。
Figure BDA0003481847720000201
在一些方面，D可由反应性基团例如点击化学部分取代。在某些方面，在某些方面，D可以是E和连接A的碳原子之间的直接键。在某些方面，D可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，包括烷氧基、醚、羰基、芳基、吸电子基团或给电子基团、亲电中心或亲核中心，或H键受体。
在某些方面，G可独立地选自H、CF3、CF2H、CFH2、CH3或烷基基团。
在某些方面，E可选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、烯烃、双吖丙啶。在某些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在某些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。在某些方面，E是点击化学可相容的反应性基团，其选自受保护的硫醇、烯烃(包括反式环辛烯[TCO])和四嗪逆需求Diels-Alder、四唑光点击反应、乙烯基硫醚炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、双吖丙啶、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。在某些方面，E还可连接至试剂或结合部分。在某些方面，试剂或结合部分在体内、离体或体外直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。在某些方面，试剂或结合部分在体内直接或间接连接靶标(蛋白质或核酸)。
在某些实施方案中，乙氧二羟丁酮衍生物可连接至结合和抑制特异性RNA的多种核酸和/或小分子(形成乙氧二羟丁酮复合物)，或连接至结合或靶向RNA或DNA的DNA或RNA试剂(例如CRISPR的反义或导向RNA)。乙氧二羟丁酮组分可用于共价锁定核酸或小分子复合物。相同方法可应用于靶标蛋白质-RNA或蛋白质-ssDNA相互作用。肽或小分子可结合蛋白质、RNA结合蛋白或结合到RNA-蛋白质相互作用的界面上，且乙氧二羟丁酮衍生物可共价锁定抑制。
Figure BDA0003481847720000211
在某些方面，式III或式IV或式V的N3-乙氧二羟丁酮或乙氧二羟丁酮衍生物可并入被开发用于靶向RNA或蛋白质-RNA界面的试剂(例如小分子)以能够实现共价抑制。式III的乙氧二羟丁酮组分可与单链核酸中的鸟嘌呤反应形成共价键。在某些方面，式III上的G和/或A取代基可独立变化以调节乙氧二羟丁酮组分的各种性质。在某些方面，A或G可独立地选自H、F、CF3、CF2H、CFH2或烷基基团。例如，氟化物取代可用于调节反应性。在某些方面，A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。经修饰的乙氧二羟丁酮组分可反应性更小并且更具特异性。它也可以是可逆的。在某些方面，式I、式III、式IV、式V中的A可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，其选自烷氧基、醚、羰基、芳基、吸电子或给电子基团或H键受体。式III、式IV或式V的A和/或E取代可以是可与靶向RNA的分子连接的接头。在某些方面，接头可以是调节所形成产物的稳定性的取代基，其选自烷氧基、醚、羰基、芳基、吸电子或给电子基团或H键受体。乙氧二羟丁酮衍生物可作为弹头(warhead)共价锁定靶向RNA的分子的抑制作用。“弹头部分”或“弹头”是指可逆或不可逆地参与供体例如蛋白质与底物的反应的抑制剂的部分。例如，弹头可以与供体形成共价键，或者可产生稳定过渡态，或者是可逆或不可逆的烷化剂。例如，弹头部分可以是抑制剂上可以参与成键反应的官能团，其中弹头的一部分与供体例如蛋白质的氨基酸残基之间形成新的共价键。在实施方案中，弹头是亲电体并且“供体”是亲核体，例如半胱氨酸残基的侧链。当A或E是接头时，它可以连接或共价连接到连接RNA结合蛋白或结合蛋白-RNA相互作用界面的小分子。式III或式IV或式V的化合物用于共价连接至靶标(例如，RNA或蛋白质)并且锁定对RNA、蛋白质或蛋白质/RNA复合物的抑制。A和E可连接到其他DNA、RNA或序列特异性识别RNA或ssDNA的分子，实例是CRISPR导向RNA或任何针对靶标RNA开发的反义的。
Figure BDA0003481847720000221
式IV是包含在式III中的分子的实例。N3的存在使式IV成为连接到携带炔烃的片段文库的候选。式IV可共价靶向ssRNA，N3-炔烃点击化学可用于将靶向RNA或蛋白质的小分子与式IV连接。点击化学可以是任何化学官能团。接头可以是任意的，长度可改变或调整。乙氧二羟丁酮可并入被开发用于靶向ssDNA或蛋白质-ssDNA界面的小分子中，以实现共价抑制。在某些方面，A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。
Figure BDA0003481847720000231
式V是乙氧二羟丁酮衍生物的实例，通过用-SO2-取代CH2基团以降低反应性并具有潜在的可逆性，它可变得更富电子和更低的反应性。在某些方面，A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。
Figure BDA0003481847720000232
在某些方面，乙氧二羟丁酮衍生物可具有式VI的通式，其中A可以是氢或甲基；D是任选的接头或直接键；E可以是反应性官能团。在某些方面，A是取代基或与第一E部分独立地选择的第二E部分。在一些方面，D可以是取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。在一些方面，D可由反应性基团例如点击化学部分取代。在一些方面，D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团。在某些情况下，接头可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个上述接头的串联体(包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个接头)。
Figure BDA0003481847720000241
在一些方面，D可以是E和连接A的碳原子之间的直接键。在一些方面，E可以是经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基。在一些方面，E可以是点击化学部分。在一些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。
在某些情况下，乙氧二羟丁酮衍生物在水溶液中水合。
Figure BDA0003481847720000242
上述所有衍生物也可以是水合形式。
在式I-VII的某些情况下，D、A或A和D可以是稳定化调节取代基。最具体地，当乙氧二羟丁酮衍生物与鸟嘌呤反应时，可将H键受体基团添加至D或A以使其与鸟嘌呤上的胺-氢形成氢键。关于A，氟和类似基团可用于影响可逆性。
与治疗性配体稠合或进一步连接的乙氧二羟丁酮衍生物，例如乙氧二羟丁酮缀合物，以式IX表示。
Figure BDA0003481847720000251
其中A、D和E如上定义。在某些方面，Z是治疗剂。在一些方面，E或Z还可以是任何治疗性大分子，例如肽、蛋白质、抗体或被治疗性生物分子识别的配体等；或递送载体，例如纳米颗粒、受体、水凝胶等。乙氧二羟丁酮缀合物的实例如图5所示。
下面更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本发明的目的，化学元素根据元素周期表CAS版，化学和物理手册第75版、封面内页进行确定，并且具体的官能团通常如其中所述定义。此外，有机化学的一般原理以及特定的官能部分和反应性描述于：Organic Chemistry，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito，1999；Smith and March March′s Advanced Organic Chemistry，5th Edition，John Wiley&Sons，Inc.，New York，2001；Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers，Inc.，New York，1989；Carruthers，Some Modern Methods of OrganicSynthesis，3rd Edition，Cambridge University Press，Cambridge，1987。
如本文所用，术语“脂族”包括饱和的和不饱和的、非芳族、直链(即，不带支链)、带支链、无环和环状(即，碳环形的)的烃，其任选地由一个或多于一个官能团取代。如本领域技术人员将理解的，“脂族”在本文中旨在包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，如本文所用，术语“烷基”包括直链的、带支链的和环状的烷基。类似惯例适用于其他通用术语，例如“烯基”、“炔基”等。此外，如本文所用，术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等包括取代和未取代的基团。在某些实施方案中，如本文所用，“脂族”用于表示具有1-20个碳原子(C1-20脂族)的那些脂族基团(环状、无环、经取代、未取代、带支链或不带支链)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-10个碳原子(C1-10脂族)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-6个碳原子(Cl-6脂族)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-5个碳原子(C1-5脂族)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-4个碳原子(C1-4脂族)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-3个碳原子(Cl-3脂族)。在某些实施方案中，脂族基团具有1-2个碳原子(C1-2脂族)。脂族基团取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“烷基”是指通过去除单个氢原子而源自含有1至20个碳原子的烃部分的饱和、直链或带支链的烃基。在一些实施方案中，本发明中使用的烷基含有1-20个碳原子(C1-20烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-15个碳原子(C1-15烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-10个碳原子(C1-10烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-8个碳原子(C1-8烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-6个碳原子(C1-6烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-5个碳原子(C1-5烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-4个碳原子(C1-4烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-3个碳原子(C1-3烷基)。在另一个实施方案中，使用的烷基含有1-2个碳原子(C1-2烷基)。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等，其可携带一个或多于一个取代基。烷基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
术语“烷芳基”是指包含脂族和芳族结构的基团，芳基直接与烷基键合。
如本文所用，术语“亚烷基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的烷基的双基。亚烷基基团可以是环状或无环的、带支链的或不带支链的、经取代或未取代的。亚烷基基团包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“烯基”表示通过去除单个氢原子而源自具有至少一个碳-碳双键的直链或带支链的烃部分的单价基团。在某些实施方案中，本发明中使用的烯基含有2-20个碳原子(C2-20烯基)。在一些实施方案中，本发明中使用的烯基含有2-15个碳原子(C2-15烯基)。在另一个实施方案中，使用的烯基含有2-10个碳原子(C2-10烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2-8个碳原子(C2-8烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2-6个碳(C2-6烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2-5个碳(C2-5烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2-4个碳(C2-4烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2-3个碳(C2-3烯基)。还在其他实施方案中，烯基含有2个碳(C2烯基)。烯基包括例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等，其可携带有一个或多于一个取代基。烯基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。如本文所用，术语“亚烯基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的烯基的双基。亚烯基可以是环状或无环的、带支链的或不带支链的、经取代或未取代的。亚烯基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“炔基”是指通过去除单个氢原子而源自具有至少一个碳-碳三键的直链或带支链的烃的单价基团。在某些实施方案中，本发明中使用的炔基含有2-20个碳原子(C2-20炔基)。在一些实施方案中，本发明中使用的炔基含有2-15个碳原子(C2-15炔基)。在另一个实施方案中，使用的炔基含有2-10个碳原子(C2-10炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2-8个碳原子(C2-8炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2-6个碳原子(C2-6炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2-5个碳原子(C2-5炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2-4个碳原子(C2-4炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2-3个碳原子(C2-3炔基)。还在其他实施方案中，炔基含有2个碳原子(C2炔基)。代表性的炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等，其可携带一个或多于一个取代基。炔基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。如本文所用，术语“亚炔基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文定义的亚炔基的双基。亚炔基可以是环状或无环的、带支链的或不带支链的、经取代或未取代的。亚炔基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“碳环”或“碳环基”是指如本文所用，是指含有3-10个碳环原子的环状脂族基团(C3-10碳环)。碳环基团取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“杂脂族”是指如本文所定义的脂族部分，其包括饱和的和不饱和的、非芳族、直链的(即，不带支链的)、带支链的、无环的、环状的(即，杂环的)或多环的烃，其任选地由一个或多于一个官能团取代，并且在碳原子之间进一步包含一个或多于一个杂原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些实施方案中，杂脂族部分通过用一个或多于一个取代基独立替换其上的一个或多个氢原子而被取代。如本领域技术人员将理解的，“杂脂族”在本文中旨在包括但不限于杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基和杂环炔基部分。因此，术语“杂脂族”包括术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等。此外，如本文所用，术语“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”等包括经取代和未取代的基团。在某些实施方案中，如本文所用，“杂脂族”用于表示具有1-20个碳原子和1-6个杂原子的(环状、无环、经取代、未取代、带支链或不带支链的)杂脂族基团(C1-20杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-10个碳原子和1-4个杂原子(C1-10杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-6个碳原子和1-3个杂原子(C1-6杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-5个碳原子和1-3个杂原子(Cl-5杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-4个碳原子和1-2个杂原子(C1-4杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-3个碳原子和1个杂原子(C1-3杂脂族)。在某些实施方案中，杂脂族基团包含1-2个碳原子和1个杂原子(Cl-2杂脂族)。杂脂族基团取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“杂烷基”是指如本文所定义的烷基部分，其在碳原子之间含有一个或多于一个杂原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-20个碳原子和1-6个杂原子(C1-20杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-10个碳原子和1-4个杂原子(C1-10杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-6个碳原子和1-3个杂原子(C1-6杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-5个碳原子和1-3个杂原子(C1-5杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-4个碳原子和1-2个杂原子(C1-4杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-3个碳原子和1个杂原子(C1-3杂烷基)。在某些实施方案中，杂烷基含有1-2个碳原子和1个杂原子(C1-2杂烷基)。如本文所用，术语“亚杂烷基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的杂烷基的双基。亚杂烷基可以是环状或无环的、带支链或不带支链的、经取代或未取代的。亚杂烷基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“杂烯基”是指如本文所定义的烯基部分，其在碳原子之间进一步包含一个或多于一个杂原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些实施方案中，杂烯基含有2-20个碳原子和1-6个杂原子(C2-20杂烯基)。在某些实施方案中，杂烯基含有2-10个碳原子和1-4个杂原子(C2-10杂烯基)。
在某些实施方案中，杂烯基含有2-6个碳原子和1-3个杂原子(C2-6杂烯基)。
在某些实施方案中，杂烯基含有2-5个碳原子和1-3个杂原子(C2-5杂烯基)。在某些实施方案中，杂烯基含有2-4个碳原子和1-2个杂原子(C2-4杂烯基)。在某些实施方案中，杂烯基含有2-3个碳原子和1个杂原子(C2-3杂烯基)。如本文所用，术语“亚杂烯基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的杂烯基的二基团。亚杂烯基可以是环状或无环的、带支链或不带支链的、经取代或未取代的。
如本文所用，术语“杂炔基”是指如本文所定义的炔基部分，其在碳原子之间进一步包含一个或多于一个杂原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-20个碳原子和1-6个杂原子(C2-20杂炔基)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-10个碳原子和1-4个杂原子(C2-10杂炔基)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-6个碳原子和1-3个杂原子(C2-6杂炔基)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-5个碳原子和1-3个杂原子(C2-5杂炔基)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-4个碳原子和1-2个杂原子(C2-4杂炔基)。在某些实施方案中，杂炔基含有2-3个碳原子和1个杂原子(C2-3杂炔基)。如本文所用，术语“亚杂炔基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的杂炔基的双基。亚杂炔基可以是环状或无环的、带支链或不带支链的、经取代或未取代的。
如本文所用，术语“杂环的”、“杂环”或“杂环基”是指环状杂脂族基团。杂环基团是指非芳族的、部分不饱和或完全饱和的3至10元环体系，其包括大小为3至8个原子的单环，以及双环和三环体系，其可包括与非芳族环稠合的芳族五元或六元芳基或杂芳基基团。这些杂环包括具有独立地选自氧、硫和氮的1个至3个杂原子，其中氮和硫杂原子可任选地被氧化并且氮杂原子可以任选地季铵化。在某些实施方案中，术语杂环是指非芳族5-、6-或7-元环或多环基团，其中至少一个环原子是选自O、S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可任选地被氧化)，并且剩余的环原子是碳，基团通过任意环原子连接到分子的其余部分。杂环基包括但不限于双环或三环基团，其包含稠合的五元、六元或七元环，具有一至三个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，其中(i)每个5元环具有0到2个双键，每个6元环具有0到2个双键，每个7元环具有0到3个双键，(ii)氮和硫杂原子可任选地被氧化，(iii)氮杂原子可任选地季铵化，和(iv)任何上述杂环可稠合到芳基或杂芳基环上。示例性杂环包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、1，3-二氮杂环丁烷基(1，3-diazatidinYl)、哌啶基、哌嗪基、氮杂环辛基(azocanyl)、硫杂环丙烷基(thiaranyl)、硫杂环丁烷基(thietanyl)、四氢噻吩基、二硫杂环戊基、硫杂环己基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基(tetrahydropuranyl)、二噁烷基(dioxanyl)、氧硫杂环戊基(oxathiolanyl)、吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、四氢萘基等，其可携带一个或多于一个取代基。取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“芳基”是指具有3-20个环原子的芳族单环或多环体系，其中所有环原子都是碳，并且可以经取代或未取代。在本发明的某些实施方案中，“芳基”是指具有一个、两个或三个芳环的单、双或三环C4-C20芳环体系，其包括但不限于苯基、联苯基、萘基等，其可携带一个或多于一个取代基。芳基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。如本文所用，术语“亚芳基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文定义的芳基的二价芳基。亚芳基基团可以经取代或未取代。亚芳基取代基包括但不限于本文所述的导致形成稳定部分的任何取代基。此外，亚芳基可作为连接基团并入如本文所定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基基团中。
如本文所用，术语“杂芳基”是指具有3-20个环原子的芳族单环或多环体系，其中一个环原子选自S、O和N；零个、一个或两个环原子是独立地选自S、O和N的另外的杂原子；其余的环原子是碳，基团通过任意环原子连接到分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基(pyyrolizinyl)、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹嗪基(quinolizinyl)、噌啉基(cinnolinyl)、喹唑啉基(quinazolynyl)、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、噻吩基、硫茚基(thianaphthenyl)、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、噻唑基(thiazolynyl)、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁二唑基等，其可携带一个或多于一个取代基。杂芳基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。如本文所用，术语“亚杂芳基”是指通过去除两个氢原子而源自如本文所定义的二价杂芳基。亚杂芳基可以经取代或未取代。此外，亚杂芳基基团可作为连接基团并入本文定义的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基中。亚杂芳基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“酰基”是经取代的烷基的子集，并且是指具有如下通式的基团：-C(＝O)RA、-C(＝O)ORA、-C(＝O)-O-C(＝O)RA、-C(＝O)SRA、-C(＝O)N(RA)2、-C(＝S)RA、-C(＝S)N(RA)2、-C(＝S)S(RA)、-C(＝NRA)RA、-C(＝NRA)ORA、-C(＝NRA)SRA和-C(＝NRA)N(RA)2，其中RA是氢；卤素；经取代或未取代的羟基；经取代或未取代的硫醇；经取代或未取代的氨基；酰基；任选经取代的脂族；任选经取代的杂脂族；任选经取代的烷基；任选经取代的烯基；任选经取代的炔基；任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫氧基、杂芳基硫氧基、单-脂族氨基或二-脂族氨基、单-杂脂族氨基或二-杂脂族氨基、单-烷基氨基或二-烷基氨基、单-杂烷基氨基或二-杂烷基氨基、单-芳基氨基或二-芳基氨基、或单-杂芳基氨基或二-杂芳基氨基；或两个RA基团一起形成5至6元杂环。示例性酰基包括醛(-CHO)、羧酸(-CO2H)、酮、酰基卤化物、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“亚酰基”是经取代的亚烷基、经取代的亚烯基、经取代的亚炔基、经取代的亚杂烷基、经取代的亚杂烯基或经取代的亚杂炔基的子集，并且是指具有如下通式的酰基：-R0-(C＝X1)-R0-、-R-X2(C＝X1)-R0-或-R0-X2(C＝X1)X3-R0-，其中X1、X2和X3独立地是氧、硫或NRr，其中Rr是氢或任选经取代的脂族基团，并且R0是如本文所定义是任选经取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基基团。其中R0是亚烷基的示例性亚酰基包括-(CH2)T-O(C＝O)-(CH2)T-；-(CH2)T-NRr(C＝O)-(CH2)T-；-(CH2)T-O(C＝NRr)-(CH2)T-；-(CH2)T-NRr(C＝NRr)-(CH2)T-；-(CH2)T-(C＝O)-(CH2)T-；-(CH2)T-(C＝NRr)-(CH2)T-；-(CH2)T-S(C＝S)-(CH2)T-；-(CH2)T-NRr(C＝S)-(CH2)-；-(CH2)T-S(C＝NRr)-(CH2)T-；-(CH2)T-O(C＝S)-(CH2)T-；-(CH2)T-(C＝S)-(CH2)T-；或-(CH2)T-S(C＝O)-(CH2)T-等，其可携带一个或多于一个取代基；并且其中T的每个实例独立地是0至20之间的整数。亚酰基取代基包括但不限于导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基。
如本文所用，术语“氨基”是指式(-NH2)的基团。“经取代的氨基”是指单取代的氨基(-NHRh)或双取代的氨基(-NRh2)，其中Rh取代基是导致形成稳定部分的如本文所述的任何取代基(例如，氨基保护基团；脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氨基、硝基、羟基、硫醇、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷芳基、芳烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫氧基、杂脂族硫氧基、烷基硫氧基、杂烷基硫氧基、芳基硫氧基、杂芳基硫氧基、酰氧基等，它们中的每一个可以或可以不进一步经取代)。在某些实施方案中，二取代的氨基(-NRh2)的Rh取代基形成5-至6-元杂环。
如本文所用，术语“羟基”是指式(-OH)的基团。“经取代的羟基”是指式(-ORi)的基团，其中Ri可以是产生稳定部分的任何取代基(例如，羟基保护基团；脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、硝基、烷芳基、芳烷基等，它们中的每一个可以或可以不进一步取代)。
如本文所用，术语“硫代”或“硫醇”是指式(-SH)的基团。“经取代的硫醇”是指式(-SRr)的基团，其中Rr可以是导致形成稳定部分的任何取代基(例如硫醇保护基团；脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、亚磺酰基、磺酰基、氰基、硝基、烷芳基、芳烷基等，它们中的每一个可以或可以不进一步取代)。
如本文所用，术语“亚氨基”是指式(＝NRr)的基团，其中Rr对应于氢或导致形成稳定部分的本文所述的任何取代基(例如，氨基保护基团；脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氨基、羟基、烷芳基、芳烷基等，它们中的每一个可以或可以不进一步取代)。
如本文所用，术语“叠氮化物”或“叠氮基”是指式(-N3)的基团。
如本文所用，术语“卤代”和“卤素”是指选自如下的原子：氟(氟代，-F)、氯(氯代，-C1)、溴(溴代，-Br)和碘(碘代，-I)。
B.乙氧二羟丁酮衍生物的合成
自二十世纪五十年代首次报道了乙氧二羟丁酮及其类似物与RNA病毒反应并且使其失活(Staehelin，Biochimca Biophysica Acta 31：448-54，1959)。乙氧二羟丁酮的1，2-二羰基基团对鸟嘌呤显示出高度的特异性，这使其在RNA二级结构的探测中非常有用。此外，其他乙氧二羟丁酮衍生物，例如乙氧二羟丁酮双(缩氨硫脲)(KTS)(Booth andSartorelli，Nature 210：104-5，1966)显示出有前途的抗癌活性，二乙氧二羟丁酮(Brewer等人，Biochemistry 22：4303-9，1983)证明在完整核糖体30S和50S亚基内交联RNA和蛋白质的能力。然而，出人意料的是，很少报道乙氧二羟丁酮及其衍生物的合成。文献综述表明，乙氧二羟丁酮的制备主要基于真空蒸馏纯化后二氧化硒的氧化(Brewer等人，Biochemistry 22：4303-9，1983；Tiffany等人，Journal of the American ChemicalSociety 79：1682-87，1957；Lo等人，Journal of Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals 44：S654-S656，2001)。该方法有几个限制。首先，金属氧化反应总是会产生副产物。其次，过量的硒难以去除。第三，很难合成具有其他官能团的乙氧二羟丁酮衍生物，因为具有官能团的试剂在回流条件下可能无法与二氧化硒一起保留。例如，研究表明叠氮化物和硫醇改性的乙氧二羟丁酮不可能通过二氧化硒的氧化制备。最后，真空蒸馏纯化不适用于高分子量的乙氧二羟丁酮衍生物。
乙二醛及其类似物对空气敏感，因此无法通过层析纯化(Jiang等人，OrganicLetters 3：4011-13，2001)。用新制备的二甲基二环氧乙烷(DMD)对重氮酮进行温和氧化，可以定量地产生乙二醛官能团(Jiang等人，Organic Letters 3：4011-13，2001)。在这项研究中，叠氮基-乙氧二羟丁酮是通过三步合成(方案S1)后的新型合成策略制备的。该合成工艺的优点是操作简单且收率高。此外，该策略也方便其他具有各种官能团的乙氧二羟丁酮衍生物的制备。
Figure BDA0003481847720000331
方案S1-由多种官能团(R基团)合成乙氧二羟丁酮衍生物
N3-乙氧二羟丁酮与单链DNA和RNA中的鸟嘌呤反应。已知乙氧二羟丁酮(1，1-二羟基-3-乙氧基-2-丁酮)在沃森-克里克界面的N1和N2位置与鸟嘌呤发生特异性反应(Shapiro等人，Biochemistry 8：238-45，1969)。由于合成方面的挑战，乙氧二羟丁酮之前没有被进一步官能化和广泛应用于核酸标记。本文描述的是N3-乙氧二羟丁酮(图1a)的开发，它不仅继承其母体分子对鸟嘌呤的反应性，而且还包含叠氮基，其用作生物正交手柄以通过“点击”化学进一步官能化。MALDI-TOF分析表明，N3-乙氧二羟丁酮有效地标记RNA上的鸟嘌呤，而在其他碱基上没有观察到反应性。通过使用凝胶电泳进一步证明N3-乙氧二羟丁酮对单链DNA/RNA的选择性。与N3-乙氧二羟丁酮孵育后，在凝胶上观察到单链RNA的变化，表明形成RNA-乙氧二羟丁酮复合物，而双链RNA没有检测到这种变化。还表明N3-乙氧二羟丁酮具有高度的细胞渗透性，可在5分钟内标记活细胞中的DNA和RNA，这使其适用于进一步的应用。
C.单链DNA绘制(ssDNA-测序)
本发明的乙氧二羟丁酮衍生物能够进行全基因组范围单链DNA绘制(ssDNA-测序)。利用乙氧二羟丁酮衍生物对单链核酸的敏感性和选择性，乙氧二羟丁酮衍生物首先应用于绘制基因组的单链区域，这是以前从未实现的。ssDNA绘制的一种程序可以包括以下步骤中的一个或多于一个。第一步可以是通过向细胞培养基中添加乙氧二羟丁酮衍生物来制备标记培养基。在所需的温度、所需的条件下，将细胞在标记培养基中孵育所需的时间。转录抑制研究可通过在孵育之前在含有乙氧二羟丁酮衍生物的培养基中用DRB或雷公藤内酯或等效试剂处理细胞来进行。孵育后，收获细胞，并且从细胞中分离总DNA。DNA可悬浮在FhO中，在DBCO-PEG4-生物素(DMSO溶液)的存在下，在适当温度下孵育适当的时间，例如在37℃下孵育2小时。可将RNase A添加到反应混合物中，并将混合物在适当度下孵育适当时间，例如在37℃下孵育15分钟。7.可将DNA从反应混合物中回收并且用于构建文库。可使用各种商业文库构建试剂盒构建文库，例如Accel-NGS Methyl-seq DNA文库试剂盒(Swift)或KapaHyper Plus试剂盒(Kapa Biosystems)。下一步可包括测序文库，例如在Nextseq SR80模式下并且执行下游分析。
D.乙氧二羟丁酮辅助的RNA-RNA相互作用(KARRI)绘制
考虑到乙氧二羟丁酮衍生物对RNA的反应性，基于乙氧二羟丁酮衍生物标记和相互作用的RNA-RNA的树枝状大分子交联，开发了乙氧二羟丁酮辅助的RNA-RNA相互作用绘制(KARRI)。为了说明KARRI作图，将经甲醛固定的小鼠胚胎干细胞(mESC)用乙氧二羟丁酮衍生物处理，然后与PAMAM树枝状大分子一起孵育(Esfand和Tomalia，(2001)DrugDiscov.Today 6：427-36)，表面修饰有两个二苯并环辛炔(DBCO)分子和一个生物素分子。每个PAMAM树枝状大分子通过“点击”反应与两个邻近的乙氧二羟丁酮衍生物标记的鸟嘌呤化学交联，并且通过其上的生物素部分提供用于富集的手柄。交联后，将RNA分离、破碎并且通过链霉亲和素珠进行免疫沉淀。然后在珠上进行邻近连接，并且将产物RNA用于文库构建。测序读段仅与用于RNA-RNA相互作用分析的嵌合读段对齐。
乙氧二羟丁酮辅助的RNA-RNA相互作用(KARRI)的程序。KARRI方法可包括以下步骤中的一个或多于一个。细胞可悬浮在固定剂例如甲醛溶液中，并且在室温下在轻轻旋转下孵育反应。可以例如通过添加甘氨酸来淬灭。对于翻译抑制剂处理，将细胞用环己酰亚胺或三尖杉酯碱处理。收集细胞并且等分。乙氧二羟丁酮衍生物可使用适当溶剂例如DMSO按1∶5稀释，并且并入标记缓冲液(乙氧二羟丁酮衍生物、裂解缓冲液(10mMTris-HClpH8.0、10mM NaCl、0.2IGEPAL CA630)和蛋白酶抑制剂混合物中)。细胞可悬浮在标记缓冲液中，细胞在孵育后收集。收集的细胞可在冰冷裂解缓冲液中清洗1、2、3次或多于3次。细胞团块可悬浮在含有交联剂的MeOH中，然后收集细胞。RNA可提取和纯化。RNA团块可悬浮在含有DNaseI缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.4、25mM MgCl2、1mM CaCl2)、DNaseI、RNase抑制剂的H2O中，在轻轻摇动下孵育。然后将混合物暴露于蛋白酶K。将RNA用苯酚-氯仿提取，并且通过EtOH沉淀来纯化RNA。RNA团块悬浮在H2O和含有RNase抑制剂的片段化缓冲液中并且孵育。通过另外的片段化终止缓冲液终止片段化，并且将样品置于冰上以淬灭反应。通过使用预洗过的链霉亲和素珠来使交联的RNA富集。将珠与DNA混合，并且将混合物在室温下在轻轻旋转下孵育。孵育后，将珠洗涤。将洗涤的珠悬浮在含有PNK缓冲液和T4PNK、RNase抑制剂的H2O中，并且摇动第一孵育期，然后加入另一等份T4 PNK和ATP并且摇动第二孵育期。将珠洗涤并且悬浮在连接酶溶液中。在连接酶溶液中孵育后，将珠洗涤。将RNA通过加热洗脱并且回收RNA。一半回收的RNA用于文库构建。对文库进行测序并且进行下游分析。
实施例
包括以下实施例和附图以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，实施例或附图中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。
实施例1
乙氧二羟丁酮衍生物的合成
N3-乙氧二羟丁酮的合成路线。
Figure BDA0003481847720000361
2-(2-叠氮基乙氧基)丙酸2：将氢化钠(60％的矿物油分散液，6g，0.15mol)加入到250mL的双颈烧瓶中，然后在N2条件下加入50mL无水THF。将悬浮液剧烈搅拌并且冷却至0℃。在20分钟内逐滴加入在20mL无水THF中的2-叠氮基乙醇(8.7g，0.1mol)。将溶液在环境温度下搅拌15分钟，然后再次冷却至0℃。逐滴加入10mL THF中的2-溴丙酸乙酯(27.15g，0.15mol)。将反应混合物升温至室温并且在N2气氛下搅拌过夜。用100mL水淬灭反应，将所得混合物用乙醚洗涤3次(3×100mL)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。将粗产物溶解在50ml THF中并且加入到LiOH水溶液(40ml，1M)中。混合物在室温下搅拌16小时。除去THF，加入HCl(2M)至pH为2。然后，将THF用乙醚萃取3次(3×100ml)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。在浓缩和硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)后，收集无色油状物的产物2(6.67g，26％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝4.09(q，J＝6.9Hz，1H)，3.85(ddd，J＝9.8，5.9，3.4Hz，1H)，3.66-3.58(m，1H)，3.55-3.46(m，1H)，3.42-3.33(m，1H)，1.49(t，J＝9.4Hz，3H).13CNMR(101MHz，CDCl3)：δ＝178.48，74.98，69.13，50.65，18.47.HRMS C3H9N3O3 +[M+H]+计算值160.07167，实测值160.07091.
Figure BDA0003481847720000371
3-(2-叠氮基乙氧基)-1-重氮基戊烷-2-酮3：在N2条件下，将2(1.59g，10mmol)溶解在15mL无水CH2Cl2和一滴DMF中。向溶液中加入草酰氯(926μL，15mmol)并且在室温下搅拌2小时。之后，除去溶剂和过量的草酰氯。将剩余物溶解在无水CH3CN 50mL中，冷却至0℃，并且逐滴加入2M(三甲基硅烷基)重氮甲烷的乙醚溶液(4mL，10mmol)。将反应混合物在0℃搅拌过夜。蒸发溶剂并且进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)以得到黄色油状物的产物3(620mg，33.8％)。
1H NMR(400MHz，
CDCl3)：δ＝5.82(s，1H)，4.00-3.85(m，1H)，3.72-3.60(m，2H)，3.48-3.35(m，2H)，1.38(d，J＝6.8Hz，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝196.94，80.89，68.73，52.30，50.88，18.58.HRMS C6H9N5O2 +[M+H]+计算值184.0829，实测值184.0822.
Figure BDA0003481847720000372
叠氮基-乙氧二羟丁酮1(N3-乙氧二羟丁酮)或3-(2-叠氮基乙氧基)-1，1-二羟基丁烷-2-酮(4)：根据Adam的程序，制备二甲基二环氧乙烷(DMD)的丙酮溶液。向化合物3(183mg，1mmol)中分几次加入11mL DMD-丙酮。观察到明显的气体逸出。将反应混合物在室温下搅拌直至在TLC监测下反应完成以得到叠氮基-乙氧二羟丁酮1及其黄色油状物的水合物4。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝[9.5(m)+5.5(m)，1H]，4.55-4.40(m，1H)，3.75(m，2H)，3.50-3.25(m，2H)，1.50-1.20(m，3H).HRMS C6H9N3O3 +[M+Na]+计算值194.0536，实测值194.0555.
一般化学品和生物材料。N3-乙氧二羟丁酮合成的所有化学试剂均购自商业来源。RNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies，Inc.(IDT)和Takara BiomedicalTechnology Co.，Ltd.。用于N3-乙氧二羟丁酮合成的缓冲盐和化学试剂购自商业来源。Superscript III，
Figure BDA0003481847720000382
MyOneTM Streptavidin C1购自Life Technologies。T4PNK、T4 RNL2tr K227Q、5’-脱腺苷酶、RecJf购自New England Biolabs。CircLigaseII购自epicenter company。DBCO-生物素购自Click Chemistry Tools LLC(A116-10)。所有不含RNase的溶液均由DEPC处理的MilliQ水制备。
碳-乙氧二羟丁酮(5-叠氮基-2-氧代戊醛)的合成方案：
Figure BDA0003481847720000381
碳-乙氧二羟丁酮(5-叠氮基-2-氧代戊醛)的合成路线。4-叠氮基丁酸乙酯：将在18ml丙酮中的4-溴丁酸乙酯(7.802g，40mmol)、NaN3(3.900g，60mmol，15当量)和6ml水的溶液回流5小时。反应完成后，真空除去丙酮，剩余物在Et2O(200m1)和水(100m1)之间分配。分离有机层，水层用200mL Et2O萃取两次。将合并的有机层用水洗涤，然后用无水Na2SO4干燥。过滤和蒸发溶剂后，进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶50)，得到无色油状物的4-叠氮基丁酸乙酯(6.21g，定量)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ4.05(q，J＝7.2Hz，2H)，3.39(t，J＝6.5Hz，2H)，2.40(t，J＝7.2Hz，2H)，2.08(p，J＝6.7Hz，2H)，1.18(t，J＝7.2Hz，3H).
4-叠氮基丁酸：将上述产物4-叠氮基丁酸乙酯(2.583g，20mmol)悬浮于在水中的LiOH·H2O(2.520g，60mmol，3.0当量)(30mL)和THF(10mL)的混合物中。将混合物在50℃搅拌12小时。除去THF，加入HCl(2M)调节pH至2。然后，THF用乙醚萃取3次(3×100ml)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。浓缩和硅胶层析(丙酮∶石油醚＝1∶10至1∶2)后，收集无色油状物的产物4-叠氮基丁酸(2.011g，78％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.19(s，1H)，3.36(t，J＝6.7Hz，2H)，2.46(t，J＝7.2Hz，2H)，1.90(p，J＝6.9Hz，2H).
5-叠氮基-1-重氮基戊烷-2-酮：在惰性条件(N2)下，将上述产物4叠氮基丁酸(646mg，5mmol)溶于15mL无水CH2Cl2中，并且在0℃冷却。将DMF和草酰氯(650μL，7.5mmol)逐滴加入溶液中。将反应混合物升温至室温后，搅拌2小时。之后，除去溶剂和过量的草酰氯。将剩余物溶于25mL无水CH2Cl2，冷却至0℃，加入CaO(308mg，5.5mmol，1.1当量)。向其中滴加2M TMSCHN2乙醚溶液(2.5mL，5mmol)。将反应混合物在0℃搅拌过夜。蒸发溶剂，进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)，以得到黄色油状物的产物5-叠氮基-1-重氮戊烷-2-酮(680mg，89％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.30(s，1H)，3.35(t，J＝6.6Hz，2H)，2.42(s，2H)，1.92(p，J＝6.9Hz，2H).
碳乙氧二羟丁酮(5-叠氮基-2-氧代戊醛)：根据Adam的程序，制备二甲基二环氧乙烷(DMD)的丙酮溶液。向5-叠氮基-1-重氮基戊烷-2-酮(39mg，0.28mmol)中加入5mL DMD-丙酮，观察到有气体逸出。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(在TLC监测下)以形成碳乙氧二羟丁酮及其黄色油状物的水合物(定量)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝[9.23(m)+5.24(m)，1H]，3.41-3.31(m，2H)，3.01-2.46(m，2H)，1.96-1.80(m，2H).
单氟乙氧二羟丁酮(3-(2-叠氮基乙氧基)-3-氟-2-氧代丙醛)的合成方案：
Figure BDA0003481847720000391
单氟乙氧二羟丁酮(3-(2-叠氮基乙氧基)-3-氟-2-氧代丙醛)的合成路线：2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸乙酯：将氢化钠(4.4g)加入到无水THF中。将悬浮液剧烈搅拌并且冷却至0℃。逐滴加入20mL无水THF中的2-叠氮基乙醇(6.416g)。将溶液在室温搅拌15分钟，然后再次冷却至0℃。逐滴加入在10mL THF中的2-溴丙酸乙酯(14.868g)。将反应混合物升温至室温并且搅拌过夜。用水淬灭反应，然后用乙醚萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。过滤和蒸发溶剂后，进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶50至1∶30)，得到无色油状物的2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸乙酯(8.832g，64％)。
2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸：将上述产物2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸乙酯(7.5g)悬浮在水中的LiOH·H2O(4.93g)与THF的混合物中。将混合物在50℃搅拌3小时。除去THF并且加入HCl(2M)以将混合物调节至pH为2。接着用乙醚萃取THF。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥。浓缩和硅胶层析(丙酮∶石油醚＝1∶10至1∶5)后，收集无色油状物的产物2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸(3.80g，60％)。
1-(2-叠氮基乙氧基)-3-重氮基-1-氟丙烷-2-酮：在惰性条件(N2)下，将上述产物2-(2-叠氮基乙氧基)-2-氟乙酸(200mg)溶于无水CH2Cl2中，并且冷却至0℃。将DMF和草酰氯(158μL)逐滴加入溶液中。将反应混合物升温至室温后，搅拌2小时。除去溶剂和过量草酰氯。将剩余物溶解在无水CH2Cl2中，冷却至0℃，加入CaO(76mg)。将2M TMSCHN2乙醚溶液(0.31mL)滴加到混合物中并且在0℃下搅拌过夜。蒸发溶剂并进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶20至1∶5)以得到黄色油状物的产物1-(2-叠氮基乙氧基)-3-重氮基-1-氟丙烷-2-酮(180mg，79％)。
单氟乙氧二羟丁酮(3-(2-叠氮基乙氧基)-3-氟-2-氧代丙醛)：根据Adam的程序，制备二甲基二环氧乙烷(DMD)的丙酮溶液。向1-(2-叠氮基乙氧基)-3-重氮基1-氟丙烷-2-酮(47mg)中加入DMD-丙酮，观察到明显气体逸出。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完全(用TLC监测)，生成单氟乙氧二羟丁酮及其黄色油状物的水合物(定量)。
苯基-乙氧二羟丁酮(3，5-二甲氧基苯基乙二醛)的合成方案：
Figure BDA0003481847720000401
苯基-乙氧二羟丁酮(3，5-二甲氧基苯基乙二醛)的合成路线：2-重氮基-1-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙酮：将3，5-二甲氧基苯甲酸(182mg)和SOCl2(1.0mL)的混合物在100℃下回流加热1.5小时。通过真空除去过量SOCl2以提供粗产物。将剩余物溶于无水CH2Cl2，冷却至0℃，加入CaO(61mg)。然后，滴加2MTMSCHN2的乙醚溶液(0.5mL)。将反应混合物在0℃下搅拌过夜。蒸发溶剂并且进行硅胶层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10至1∶3)以得到黄色固体的产物2-重氮基-1-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙酮(102mg，50％)。
苯基-乙氧二羟丁酮或3，5-二甲氧基苯基乙二醛：根据Adam的程序，制备二甲基二环氧乙烷(DMD)的丙酮溶液。向2-重氮基-1-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙酮(12mg)中加入DMD-丙酮，观察到气体逸出。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完成(用TLC监测)，得到苯基-乙氧二羟丁酮及其黄色油状物的水合物(定量)。
实施例2
N3-乙氧二羟丁酮与鸟嘌呤反应的验证
N3-乙氧二羟丁酮和鸟嘌呤的反应得到验证。将鸟嘌呤(100μM，2μL)、N3-乙氧二羟丁酮(1M，在DMSO中，1μL)、二甲胂酸钠缓冲液(0.1M，pH＝7.0，1μL)和6μL ddH2O在37℃下一起加入1.5mL微量离心管中10分钟。HRMS C11H14N8O4 +[M+H]+计算值323.1216，实测值323.1203。
Figure BDA0003481847720000411
实施例3
N3-乙氧二羟丁酮与RNA的反应
N3-乙氧二羟丁酮和RNA的反应通常按照以下方案进行：100pmol RNA寡核苷酸和1μmol N3-乙氧二羟丁酮于在PBS缓冲液中的总共10μL的溶液中孵育10分钟。将经修饰的RNA通过Micro Bio-SpinTMP-6凝胶柱(Biorad，7326222)纯化以去除残留的化学物质。经纯化的经标记的RNA可用于进一步研究，如质谱、凝胶电泳和与生物素-DBCO的无铜点击反应。
从N3-乙氧二羟丁酮标记的RNA中去除N3-乙氧二羟丁酮修饰。擦除N3-乙氧二羟丁酮修饰的详细方案如在keth-seq方案中的“去除N3-乙氧二羟丁酮的样品的制备”中所述。通常，经纯化的N3-乙氧二羟丁酮修饰的RNA与高浓度GTP(反应溶液的1/2体积，终浓度50mM)在37℃下孵育6小时或在95℃下孵育10分钟。较高温度有益于去除N3-乙氧二羟丁酮修饰。
RNA中N3-乙氧二羟丁酮修饰的固定。RNA中不稳定的N3-乙氧二羟丁酮修饰可在硼酸盐缓冲液存在下固定。将N3-乙氧二羟丁酮标记的RNA的溶液与1/10体积的硼酸储备缓冲液混合(终浓度：50mM；硼酸储备缓冲液：500mM硼酸钾，pH 7.0，在向500mM硼酸溶液中加入氢氧化钾颗粒的同时监测pH值)。硼酸盐缓冲液固定用于keth-seq方案的各个步骤中，参见下文。
N3-乙氧二羟丁酮标记的RNA寡核苷酸的MALDI-TOF-MS分析。将N3-乙氧二羟丁酮标记的RNA通过Micro Bio-SpinTMP-6凝胶柱纯化。同时，缓冲液从PBS缓冲液更换为tris缓冲液，其可直接用于MALDI-TOF-MS实验而无需另外的脱盐步骤。将一微升产物溶液与一微升基质混合，其包括8∶1体积比的2′4′6′-三羟基苯乙酮(THAP，10mg/mL，在50％CH3CN/H2O中)：柠檬酸铵(50mg/mL，在水中)。然后将混合物点在MALDI样品板上，干燥并且通过BrukerUltraflextreme MALDI-TOF-TOF质谱仪分析。
实施例4
苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮
为了测试苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮的标记活性，将两种化合物分别与含有四个鸟嘌呤碱基的12聚体合成RNA寡核苷酸一起孵育。10分钟后，将反应物清除并且通过MALDI-TOF进行分析。苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮均可有效标记寡核苷酸，所有寡核苷酸分子上的所有四个鸟嘌呤都被修饰，参见图3。
Figure BDA0003481847720000431
进行第二组测试以测试苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮的细胞渗透性以及标记是否增强自由基介导的生物素化。将细胞分别用苯酚-乙氧二羟丁酮和二苯酚-乙氧二羟丁酮处理10分钟，并从经处理的细胞中分离出RNA。通过将这些乙氧二羟丁酮衍生物标记的RNA与生物素-苯酚、辣根过氧化物酶(HRP)和H2O混合来进行体外生物素化反应，参见图4。HRP是模拟APEX的酶，在体外具有较高的自由基生成活性。将生物素化的RNA纯化并且进行斑点印迹分析。与对照样品相比，苯酚-乙氧二羟丁酮修饰的RNA和二苯酚-乙氧二羟丁酮修饰的RNA都显示出较强的生物素信号，表明(二)苯酚-乙氧二羟丁酮可增强自由基介导的生物素化，并且显示出在活细胞中进行高效APEX介导的邻近标记的潜力。
实施例5
单链DNA(SSDNA)绘制的实验程序
ssDNA如下进行：(1)对每个10em培养皿，通过将5μL纯乙氧二羟丁酮衍生物(例如N3-乙氧二羟丁酮)添加到5mL预热的细胞培养基中以制备标记培养基。(2)在37℃、5％CO2条件下，在标记培养基中孵育细胞10分钟。(3)对于转录抑制实验，于在含有乙氧二羟丁酮衍生物的培养基中孵育之前，将细胞在100μM DRB或1μM雷公藤内酯下处理2小时。(4)孵育10分钟后收获细胞，根据制造商的方案，通过PureLink基因组DNA迷你试剂盒从细胞中分离总DNA。(5)将5μg总DNA悬浮在85μL H2O中，然后加入10μL 10x PBS和5μL 20mM DBCO-PEG4-生物素(DMSO溶液)，将混合物在37℃下孵育2小时。(6)向反应混合物中加入5μL RNase A，将混合物在37℃下孵育另外15分钟。(7)根据制造商的方案，通过DNA Clean&Concentrator试剂盒从反应混合物中回收DNA。
文库由不同的商业文库构建试剂盒构建并得到相似结果。两个实例包括：
(8a)Accel-NGS Methyl-seq DNA文库试剂盒(Swift)的使用：(i)通过超声处理在30s-开启/30s-关闭的设定下进行30个循环，使从步骤7中回收的2μg DNA片段化。(ii)根据稍微修改的制造商方案，保存5％的片段化DNA用于输入，使用其余的95％通过10μL预洗涤的链霉亲和素Cl珠来富集生物素标记的DNA。将珠在含有0.05％吐温-20的lx结合和洗涤缓冲液中洗涤3次，然后重新悬浮在含有0.1％吐温-20的95μL 2x结合和洗涤缓冲液中。将珠与DNA混合，并且将混合物在室温下在轻轻旋转下孵育15分钟。孵育后，将珠用含有0.05％吐温-20的lx结合和洗涤缓冲液洗涤5次。(iii)通过在30μL H2O中在95℃下加热珠10分钟来洗脱富集的DNA。同时在95℃下处理保存的输入10分钟。立即将输入和IP样本放在冰上。(iv)根据Accel-NGS Methyl-seq DNA文库试剂盒的方案进行文库构建。
(8b)Kapa Hyper Plus试剂盒(Kapa Biosystems)的使用：(i)将1μg总DNA悬浮在35μL H2O中，加入5μL Kapa片段化缓冲液和10μL Kapa片段化酶。将混合物在37℃下孵育30分钟。(ii)根据制造商的方案，通过DNA Clean&Concentrator试剂盒回收碎片DNA。(iii)根据Kapa Hyper Plus试剂盒的方案，执行A-尾部和接头连接。(iv)保存5％的DNA用于输入，其余的95％根据稍微修改的制造商方案通过10μL预洗涤的链霉亲和素Cl珠来富集生物素标记的DNA。将珠在含有0.05％吐温-20的lx结合和洗涤缓冲液中洗涤3次，然后重新悬浮在含有0.1％吐温-20的95μL 2x结合和洗涤缓冲液中。将珠与DNA混合，并且将混合物在室温下在轻轻旋转下孵育15分钟。孵育后，将珠用含有0.05％吐温-20的1x结合和洗涤缓冲液洗涤5次。(v)通过在25μL H2O中在95℃下加热珠10分钟来洗脱富集的DNA。(vi)根据KapaHyper Plus试剂盒的方案，PCR扩增输入和IP样本的文库。(9)在Nextseq SR80模式下对文库测序并执行下游分析。
实施例6
乙氧二羟丁酮辅助RNA-RNA相互作用(KARRI)的实验程序
KRRI如下进行：(1)将活细胞以1x106/mL悬浮在1％甲醛溶液中，并且在室温下在轻轻旋转下孵育10分钟。然后通过添加甘氨酸至终浓度为125mM来终止该反应，并且在室温下旋转混合物5分钟。对于翻译抑制剂处理，将细胞在37℃下用100μg/mL环己酰亚胺或3μg/mL三尖杉酯碱处理10分钟。(2)收集并且取出2x106个细胞。使用DMSO按1∶5稀释乙氧二羟丁酮衍生物(例如N3-乙氧二羟丁酮)。将10μL乙氧二羟丁酮衍生物加入290μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM NaCl、0.2IGEPAL CA630)和3μL 100x蛋白酶抑制剂混合物中以制成标记缓冲液。(3)将细胞悬浮在标记缓冲液中，在室温旋转30分钟，然后在4℃下以2500g离心5分钟以收集细胞。(4)用500μL冰冷裂解缓冲液洗涤细胞团块3次。(5)将团块悬浮在含有10mM树枝状大分子的500μL MeOH中，在37℃下旋转1小时。然后在4℃下以2500g离心5分钟以收集细胞。(6)用500μL冰冷裂解缓冲液洗涤细胞团块两次。(7)将细胞重新悬浮在385μL裂解缓冲液中，加入50μL 10％SDS、30μL蛋白酶K、10μL RNase抑制剂、25μL 500mMK3BO3，在65℃下摇动2小时。(8)加入500μL苯酚-氯仿以提取RNA，并且通过EtOH沉淀来纯化RNA。(9)将RNA团块悬浮在104μL H2O中，加入12μL 10x DNase I缓冲液(100mM Tris-HClpH 7.4、25mM MgCl2、1mM CaCl2)、2μL DNase I(Thermo)、2μL RNase抑制剂，并且在37℃下在轻轻摇动下孵育30分钟。(10)加入130μL 2x蛋白酶K缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5、200mM NaCl、2mM EDTA、1％SDS)、10μL蛋白酶K至反应中，在65℃下摇动孵育30分钟。(11)用300μL苯酚-氯仿提取RNA，通过EtOH沉淀来纯化RNA。(12)将RNA团块悬浮在61μL H2O中，加入7μL 10x片段化缓冲液(Thermo)、2μL RNase抑制剂，在70℃下孵育15分钟，然后加入8μL片段化终止缓冲液(Thermo)并且将样品立即放在冰上以淬灭反应。(13)根据稍微修改的制造商方案，通过使用30μL预洗涤的链霉亲和素Cl珠来富集经交联的RNA。将珠在含有0.05％吐温-20的1x结合和洗涤缓冲液中洗涤3次，然后重新悬浮在含有0.1％吐温-20的80μL 2x结合和洗涤缓冲液中。将珠与DNA混合，并且将混合物在室温下在轻轻旋转下孵育30分钟。孵育后，将珠用含有0.05％吐温-20的1x结合和洗涤缓冲液洗涤3次，并用1x PNK缓冲液(NEB)洗涤一次。(14)将珠悬浮在41μL H2O、5μL 10x PNK缓冲液(NEB)、3μL T4 PNK(NEB)、1μL RNase抑制剂中，并且在37℃下摇动30分钟，然后加入另外3μL T4 PNK和6μL 10mM ATP，在37℃下摇动另外30分钟。(15)将珠用含有0.05％吐温-20的1x结合和洗涤缓冲液洗涤两次，用1x连接缓冲液(NEB)洗涤一次。(16)将珠悬浮在668μL H2O、100μL 10x连接酶缓冲液(NEB)、10μL RNase抑制剂、2μL 10mM ATP、20μL T4 RNA连接酶2(高浓度)(NEB)、200μL50％PEG 8000中，在16℃下旋转16小时。(17)将珠用含有0.05％吐温-20的1x结合和洗涤缓冲液洗涤两次，用H2O洗涤一次。然后将珠通过30μL H2O中加热并且在95℃下摇动珠10分钟来洗脱RNA。(18)按照制造商的方案，取出一半回收的RNA使用SMARTer Stranded TotalRNA-测序试剂盒v2-Pico Input(Takara)进行文库构建。(19)文库在Novaseq PE150模式下测序并且执行下游分析。
实施例7
代表性乙氧二羟丁酮衍生物的活性
乙氧二羟丁酮衍生物的反应性和可逆性调节。乙氧二羟丁酮衍生物的反应性和可逆性可通过在乙二醛部分上增加一系列官能团来调节。在此，我们研究反应pH、给电子/吸电子基团和空间对乙氧二羟丁酮衍生物的反应性和可逆性的影响。我们观察到反应性和可逆性是pH依赖性的。酮的α-位的氢键受体通过与鸟苷的胺的质子的H键合来稳定形成的加合物而大幅提高反应性。虽然大多数测试的乙氧二羟丁酮衍生物作为GTP竞争者表现出可逆性，但反应性较低的分子通常更具有可逆性。这些研究加深我们对这些分子化学性质的理解，因此提供理论结构-活性指导，并且验证将这些分子应用于基因组研究(例如ssDNA和RNA标记应用)和基于乙氧二羟丁酮的治疗目的的可行性。
Figure BDA0003481847720000471
1.乙氧二羟丁酮衍生物在碱性条件下与鸟苷的反应性更强。不同pH条件下鸟苷的转化率示于表1中。以下所示为苯基取代的乙氧二羟丁酮衍生物的实例。在下面反应的图像中，鸟苷表示为S1，乙氧二羟丁酮衍生物表示为S2。
Figure BDA0003481847720000491
表1.pH值对反应性的影响。
Figure BDA0003481847720000501
2.电子和空间效应可调节乙氧二羟丁酮衍生物的反应性。表2A和2B中显示在pH7.8下鸟苷与不同乙氧二羟丁酮衍生物的转化率。在下面反应的图像中，鸟苷表示为S1，乙氧二羟丁酮衍生物表示为S2。
Figure BDA0003481847720000511
表2A.不同乙氧二羟丁酮衍生物在pH＝7.8时的反应性。
Figure BDA0003481847720000521
表2B.不同乙氧二羟丁酮衍生物在pH＝7.8时的反应性(续)。
Figure BDA0003481847720000531
3.反应pH值对乙氧二羟丁酮反应性有不同影响，其取决于乙氧二羟丁酮衍生物上的取代基。表3A和3B中显示在pH 7.0下鸟苷与不同乙氧二羟丁酮衍生物的转化率。
Figure BDA0003481847720000541
表3A.不同乙氧二羟丁酮衍生物在pH＝7.0时的反应性。
Figure BDA0003481847720000551
表3B.不同乙氧二羟丁酮衍生物在pH＝7.0时的反应性(续)。
Figure BDA0003481847720000561
4.通过氢键提高产物稳定性。当鸟苷与乙氧二羟丁酮衍生物反应时，鸟苷的胺上的质子能够参与氢键的形成。因此，具有接受氢键的取代基的乙氧二羟丁酮衍生物稳定所形成的产物并且促进反应。相反，不具有H键合取代基的衍生物的反应性可能相对较低。图像中显示的是N3-乙氧二羟丁酮，其具有含醚的D接头(基于式I)；该H键接受部分使产物稳定。
Figure BDA0003481847720000571
5.通过调节pH来测试乙氧二羟丁酮衍生物的可逆性。由于大多数乙氧二羟丁酮衍生物在碱性条件下的反应性较高，我们首先应用高pH(pH＝10.1)将乙氧二羟丁酮衍生物转化为乙氧二羟丁酮-鸟苷加合物。然后我们将pH调整到
5.8并且测量产物的解离度。乙氧二羟丁酮衍生物和鸟苷以1∶1的比例混合。结果示于表4中(数字显示鸟苷的转化率)。
表4.乙氧二羟丁酮衍生物的可逆性
Figure BDA0003481847720000581
Figure BDA0003481847720000591
6.通过使用GTP进行竞争来测试乙氧二羟丁酮衍生物的可逆性。我们首先将乙氧二羟丁酮衍生物和鸟苷混合以形成鸟苷-乙氧二羟丁酮加合物。将乙氧二羟丁酮衍生物和鸟苷以1∶1的比例混合。10分钟后，我们添加过量的鸟苷5′-三磷酸(GTP)作为竞争者。预计过量的GTP与乙氧二羟丁酮衍生物进行竞争性反应，导致游离鸟苷增加。游离鸟苷通过LCMS检测并且用于确定由乙氧二羟丁酮衍生物上的取代基提供的相对可逆性(参见反应图像和LCMS图像)。
结果示于表5中(数字表示鸟苷的转化率)，下图显示示例性LCMS图像。
乙氧二羟丁酮衍生物与鸟苷反应以形成乙氧二羟丁酮-鸟苷加合物。
Figure BDA0003481847720000601
表5.竞争条件下乙氧二羟丁酮衍生物的可逆性
Figure BDA0003481847720000611
Figure BDA0003481847720000621

Claims (32)

1.一种乙氧二羟丁酮复合物，其包含与具有式I的通式的乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂：
Figure FDA0003481847710000011
其中E是反应性官能团，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃；
D是任选的接头或直接键；
R是连接基团；
A是选自H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3、烷基基团或其组合的一个或两个取代基，或A是与第一E部分独立地选择的第二E部分；和
G是H、F、CF3、CF2H、CFH2、CH3或烷基基团。
2.根据权利要求1所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中E选自经取代的烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、杂芳基或经取代的杂烷基；在一些方面，E可以是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代的或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的取代的烯烃。
3.根据权利要求1或2所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中D是选自以下基团中的一种或多于一种的接头：酯；酰胺；四嗪；四唑；三嗪；三唑；芳基基团；杂环；磺酰胺；经取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；D可以是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或
Figure FDA0003481847710000021
4.根据权利要求3所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中接头是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个接头的串联体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中R选自经取代或未取代的碳、氮、芳基、烷芳基或杂环。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中G是H，R是C，A是CH3，D是-OCH2CH2-三唑-吡啶-芳基-酰胺-CH2CH2，E是N3(叠氮化物)；(ii)G是H，R是C，A是F，D是-OCH2CH2-三唑-酰胺-苯并咪唑-苯基-NHCO-CH2CH2，E是炔烃；(iii)G是H，R是C，A是R的二氟取代基，D是-OCH2CH2-三唑-CH2-吡啶-苯并咪唑-NHCO-CH2CH2CH2-，E是N3(叠氮化物)；(iv)G是H，R是C，A是甲基，D是-OCH2CH2-三唑-，E是苯酚或二苯酚。
7.根据权利要求1所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述乙氧二羟丁酮复合物选自3-叠氮基-2-氧代丙醛、3-叠氮基-2-氧代丁醛、3-叠氮基-3-氟-2-氧代丙醛、2-氧代-6-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)己醛、2-((1S，4S)-二环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-2-氧代乙醛、2-氧代-2-苯乙醛、2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-氧代乙醛、2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙醛、N-(2，3-二氧丙基)-N-甲基-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺、N-((1-(2-((3，4-二氧丁烷-2-基)氧基)乙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺、2-氧代-3-(丙-2-炔-1-基氧基)丁醛、(E)-3-(2-(环辛-4-烯-1-基氨基)乙氧基)-2-氧代丁醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丙醛、3，4-二氧丁烷-2-基2-叠氮基乙酸酯、3-(2-叠氮基乙氧基)-3-甲基-2-氧代丁醛、5-叠氮基-2-氧代戊醛、2-叠氮基-N-(3，4-二氧丁烷-2-基)-N-甲基乙酰胺、3-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丁醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-3-氟-2-氧代丙醛、3-(2-叠氮基乙氧基)-3，3-二氟-2-氧代丙醛、4-(2-叠氮基乙氧基)-2-氧代丁醛或3-(((1S，4S)-二环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)甲氧基)-2-氧代丁醛。
8.一种乙氧二羟丁酮复合物，其包含与具有式III的通式的乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂：
Figure FDA0003481847710000031
其中E是点击化学部分，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃；A和G独立地选自H、CF3、CF2H、CFH2或CH3。
9.一种乙氧二羟丁酮复合物，其包含与具有式IV的通式的乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂：
Figure FDA0003481847710000032
其中A是选自H、F、CF3、CF2H、CFH2或CH3的取代基或者是接头。
10.一种乙氧二羟丁酮复合物，其包含与具有下式的乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂：
Figure FDA0003481847710000041
其中E是点击化学部分，其选自炔烃、叠氮化物、有张力的炔烃、二烯、亲二烯体、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃；A独立地选自H、F、CF3、CF2H、CFH2或CH3。
11.一种乙氧二羟丁酮复合物，其包含与具有下式的乙氧二羟丁酮衍生物连接的试剂：
Figure FDA0003481847710000042
其中A是氢或甲基；D是接头；E是反应性官能团。
12.根据权利要求11所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中D是取代或未取代的-(CH2)n-，其中n是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-O(CH2)m-，其中m是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基；-NR5-，其中R5是H或烷基例如甲基；-NR6CO(CH2)j-，其中j是1-10，并且具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是H或烷基例如甲基；或-O(CH2)kR6-，其中k是1-10，并具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个甲基取代基，R6是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂烷基、取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
13.根据权利要求11所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中D由反应性基团取代。
14.根据权利要求13所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述反应性基团是点击化学部分。
15.根据权利要求11所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中D是-N(CH3)-、-OCH2-、-N(CH3)COCH2-或具有式VII的化学式的基团，
Figure FDA0003481847710000051
16.根据权利要求1至15中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述试剂在体内、离体和/或体外直接或间接连接核酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述试剂是治疗剂、诊断剂或功能剂。
18.根据权利要求17所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述治疗剂是小分子。
19.根据权利要求18所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述小分子与蛋白质或核酸连接。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述试剂是治疗性核酸。
21.根据权利要求20所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述治疗性核酸是抑制性核酸。
22.根据权利要求20所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述抑制性核酸是siRNA。
23.根据权利要求1所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述乙氧二羟丁酮衍生物是N3-乙氧二羟丁酮。
24.一种将试剂定位于核酸的方法，其包括将细胞或细胞外核酸与根据权利要求1至23中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述试剂是治疗剂。
26.一种在细胞中定位治疗剂的方法，其包括：
(i)使目标细胞与根据权利要求1至16中任一项所述的乙氧二羟丁酮复合物接触以形成经处理的细胞；和
(ii)将治疗剂通过与乙氧二羟丁酮衍生物连接的鸟嘌呤碱基连接到核酸上。
27.一种式VI的乙氧二羟丁酮衍生物，
Figure FDA0003481847710000061
其中A是H或甲基，D是接头或直接键；和
其中E是经取代或未取代的苯酚、经取代或未取代的苯硫酚、经取代或未取代的苯胺、经取代或未取代的四唑、经取代或未取代的四嗪、经取代或未取代的SPh、经取代或未取代的双吖丙啶、经取代或未取代的二苯甲酮、经取代或未取代的硝酮、经取代或未取代的氧化腈、经取代或未取代的降冰片烯、经取代或未取代的腈、经取代或未取代的异氰化物、经取代或未取代的四环烷、经取代或未取代的炔烃、经取代或未取代的叠氮化物、经取代或未取代的有张力的炔烃、经取代或未取代的二烯、经取代或未取代的亲二烯体、经取代或未取代的烷氧基胺、经取代或未取代的羰基、经取代或未取代的膦、经取代或未取代的酰肼、经取代或未取代的硫醇或经取代或未取代的烯烃。
28.根据权利要求27所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中D是-(CR5H)n-，其中n是1-10并且R5是H或烷基例如甲基；-O(CR6H)m-，其中m是1-10并且R6是H或烷基例如甲基；-NR7-，其中R7是H或烷基例如甲基；-NR8CO(CR9H)j-，其中j是1-10，R8和R9独立地是H或烷基例如甲基；或-O(CR10H)kR11-，其中k是1-10，R10是H或烷基例如甲基，R11是烷基、经取代的烷基、环烷基、经取代的环烷基、杂烷基、经取代的杂烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基。
29.根据权利要求27所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中E还包含可检测的标记。
30.根据权利要求29所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述可检测的标记是药物、毒素、肽、多肽、表位标签、特异性结合对的成员、荧光团、固体载体、核酸(DNA/RNA)、脂质或碳水化合物。
31.根据权利要求27所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中E还包括亲和基团。
32.根据权利要求31所述的乙氧二羟丁酮复合物，其中所述亲和基团是生物素。
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