CN114262321A - 一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂、制备方法及应用 - Google Patents
一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂、制备方法及应用，所述蛋白降解剂为以偶氮苯为母核的可逆的光调控开关化合物，可应用于PROTAC设计来实现蛋白降解过程的可逆调控，进而解决PROTAC这类事件驱动型分子不可调控的问题；并且通过优化分子的热半衰期与药代动力学性质，设计出了一个具有良好药代动力学性质的光调控降解分子，拓展了该技术在临床治疗上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂，还涉及其制备方法及应用。
背景技术
细胞内的生物过程存在一个复杂的生物网络，在这个生物网中，多种生物分子协同有序发挥作用。为了尽量减少传统分子和分子生物学工具在调节信号通路过程中非靶标分子产生影响，目前文献报道了多种大量不同种类的触发型和可逆型的调控模块，这些调控模块具有多样的调节方式和结构特点。
目前，已有多种触发型的光调控模块被应用于PROTAC分子的调控，这类光触发型PROTAC分子理论上能够实现PROTAC分子的局部触发，降低药物的毒副作用。作为双功能分子，PROTAC分子分子量大，生物利用度低且水溶性差，对其成药性有着不小的影响。另外，降解过程中的不可调控性是PROTAC策略中的一个重要问题，PROTAC分子事件驱动性的特点导致降解过程一旦发生就无法停止，加上降解过程快速且持续，这可能会导致功能性靶蛋白的长时间地过度降解，极大地增加了产生不良反应的风险，限制了PROTAC策略在治疗学上的应用。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中存在PROTAC分子降解的不可调控性的问题，提供了一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂，还提供了所述降解剂的制备方法及应用。
技术方案：本发明公开了一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂，所述降解剂的化学结构通式为：
其中，
为苯环或2,4-二甲基吡唑环；
n＝2-6。
优选的，所述降解剂的化学结构通式为：
本发明公开了所述降解剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取原料化合物A，进行重氮化偶氮反应，得到偶氮中间体化合物B；
(2)将步骤(1)所得偶氮中间体化合物B，通过侧链取代连接化合物C后得到中间体化合物D；
(3)在碱性条件下，中间体化合物D反应得到所述双稳态光调控小分子蛋白降解剂。
优选的，所述原料化合物A为对氨基苯甲酸甲酯、对氨基苯甲醇、4-氨基-N-Boc-苯乙胺或1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪中的一种。
优选的，所述化合物C为来那度胺、(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙酸、(S)-6-(2-溴乙基)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮卓或N-(3-((5-溴-2-氯嘧啶-4-基)氨基)丙基)-N-甲基环丁烷酰胺中的一种。
本发明还公开了所述降解剂的应用，用于在小分子光调控模块中的应用；进一步的可应用于制备分子生物活性的可逆调控的PROTAC或小分子抑制剂。
本发明将偶氮苯基团嵌入不同的PROTAC体系中，设计了DDO-A-0019～DDO-A-0023以及DDO-A—0027与DDO-A-0028；进一步的，针对Azo-PROTAC技术中存在的热异构化问题，发展双稳态光调控PROTAC，重点解决Azo-PROTAC在应用过程中需要频繁调节的问题，同时拓展该技术在临床治疗上的应用；偶氮苯两种构象的转化过程中，热弛豫时间是由两种构型的分子中氮氮双键间的能垒决定的；从结构上看，如图6所示，影响热弛豫时间的主要因素有：光调控模块的类型、光调控模块上取代基的空间效应和电子效应、与光调控模块相连时，连接基团的电子效应，光调控分子中的特殊基团。发明人在进一步的研究中，在苯环上增加不同的取代基，在偶氮苯基团中氮氮双键的邻位引入包括卤素和甲氧基在内不同的取代基后，激发态偶氮苯的热弛豫时间被控制在从毫秒级到数年的范围内，如图7所示能够有效延长偶氮苯热弛豫时间的是邻四氟偶氮苯片段。该片段的转化波长分别是410nm和500nm以上，室温条件下(25℃)的半衰期约2年，是较为理想的双稳态光调控基团。
更进一步，发明人想要解决两个问题：随着R基团的增大，偶氮苯的转化率会显著降低、偶氮苯基团上的氟原子稳定性差，极易被取代或水解。这不仅增加了合成的难度，同时影响了工具分子在体内的稳定性；因此，发明人进而重点探究了光调控模块的类型和连接基团的选择。通过用不同的含氮杂环替换偶氮苯中的一个苯环，合成新的光调控分子开关，并对这类开关的转化条件和热弛豫时间进行系统评价。在综合考虑稳定性、转化率和热弛豫时间后，最终发现了本发明所示的一系列以偶氮苯为母核的双稳态光调控小分子蛋白降解剂，其中3，5-二甲基吡唑偶氮苯结构的小分子蛋白降解剂能达到最佳的效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明所述的双稳态光调控小分子蛋白降解剂，一个可逆的光调控开关，并将其应用于PROTAC设计来实现蛋白降解过程的可逆调控，解决PROTAC这类事件驱动型分子不可调控的问题，优化了分子的热半衰期与药代动力学性质，明显改善了光调控PROTAC分子的热弛豫问题，并使血浆半衰期提高了389％；
(2)本发明所述的双稳态光调控小分子蛋白降解剂的应用，解决了PROTAC分子不可调控的问题，实现了PROTAC分子的可逆调控，并且解决了PROTAC分子难以成药的问题，本发明所述的蛋白降解剂分子量小、生物利用度高且水溶性好，易于成药。
附图说明
图1、DDO-A-0019～DDO-A-0023对ALK蛋白的浓度依赖性降解；
图2、DDO-A-0020对ALK蛋白的降解情况；
图3、DDO-A-0020与DDO-A-0023在紫外光与可见光下对ALK蛋白的调控；
图4、可见光下和紫外光下DDO-A-0027对TBK1的调控；
图5、可见光和紫外光下DDO-A-0028对BRD4的调控；
图6、影响偶氮苯基团热弛豫时间的因素示意图；
图7、邻四氟偶氮苯片段构型转化示意图；
图8、DDO-A-0054～DDO-A-0056激发光谱随照射波长的变化；
图9、激发态的DDO-A-0054～DDO-A-0056在25℃下吸收光谱随时间的变化；
图10、3,5-二甲基吡唑偶氮苯系列转化率随时间的变化；
图11、可见光和紫外光下DDO-A-0057对MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞内BRD4蛋白的调控；
图12、DDO-A-0057的血浆稳定性测试；
图13、DDO-A-0058的血浆稳定性测试；
图14、DDO-A-0060的血浆稳定性测试；
图15、DDO-A-0059的血浆稳定性测试；
图16、DDO-A-0057～DDO-A-0059的血浆稳定性的对比；
图17、DDO-A-0059在紫外与可见光下对BRD4的调控；
图18、DDO-A-0059的化学式。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
光调控ALK蛋白降解剂DDO-A-0019～DDO-A-0023的合成
4-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(3)的合成
将化合物2(11.54g，76.1mmol)溶于水(135ml)中，冷却至5℃，随后将HCl(15.8ml，190mmol)滴加入反应体系中。将亚硝酸钠(5.03g，79.8mmol)溶于水(35ml)中，冷却至5℃，滴加入反应体系中，并在5℃下搅拌，反应1h。将苯酚(7.52g，79.9mmol),K2CO3(15.0g，108.5mmol)溶于水(120ml)中，滴加入反应体系中，10min滴加完毕，转入室温下搅拌3h。TLC检测反应完全(PE:EA＝1:1)，加入稀醋酸调节至pH＝4.0。抽滤留滤饼，然后滤饼用水、甲醇洗涤，得到棕黄固体，烘干，得棕色固体15(15.6g，80.3％)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),8.18–8.09(m,2H),7.96–7.80(m,4H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(s,3H).
4-(((4-(n-氯烷氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯系列化合物(4a-e)的合成
将4-((4-羟苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(3)(2.56g，10mmol)，1-溴-n-氯代烷(12mmol，1.2eq)，K2CO3(4.14g，30mmol)溶于DMF(20mL)中，室温搅拌，反应20h。TLC检测反应完全(PE:EA＝1:1)，向反应液中加入200mL水并搅拌，有沉淀析出，抽滤留滤饼，用水(20ml)洗涤滤饼两次，在60℃烘干，得到黄色固体4a-e。
4-(((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4a)，产率为82.3％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.22–8.06(m,2H),7.98-7.81(m,4H),7.29–7.09(m,2H),4.38(t,J＝11.2Hz,2H),4.08–3.94(m,2H),3.90(s,3H).
4-(((4-(3-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4b)，产率为83.6％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.24-8.12(m,2H),8.01-7.86(m,4H),7.09-6.97(m,2H),4.21(t,J＝5.8Hz,2H),3.95(s,3H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),2.28(p,J＝6.0Hz,2H).
4-(((4-(4-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4c)，产率为84.5％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.17(d,J＝8.3Hz,2H),7.92(dd,J＝11.4,8.5Hz,4H),7.01(d,J＝8.5Hz,2H),4.09(d,J＝5.2Hz,2H),3.95(s,3H),3.63(d,J＝5.9Hz,2H),2.01(p,J＝2.9Hz,4H).
4-(((4-(5-氯戊氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4d)，产率为85.3％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.99-7.85(m,4H),7.06–6.96(m,2H,Ar-H),4.07(t,J＝6.3Hz,2H),3.95(s,3H,),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),1.95-1.80(m,4H),1.66(ddt,J＝14.5,9.7,5.7Hz,2H).
4-(((4-(6-氯己氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4e)，产率为82.5％。m.p.118-119℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.0Hz,2H),7.93(d,J＝8.2Hz,4H),7.15(d,J＝8.4Hz,2H),4.17-4.05(m,2H),3.90(s,3H),3.65(t,J＝5.8Hz,2H),1.84–1.66(m,4H),1.56–1.38(m,4H).
4-((4-(n-氯烷氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸中间体系列化合物(5a-e)合成
将中间体4a-e(5mmol)溶于THF(10mL)中，LiOH·H2O(600mg，25mmol)溶于H2O(10mL)中，将两种溶液混合，室温搅拌过夜。TLC检测反应完全(PE:EA＝1:1)，向反应液中加入200mL水，加入稀盐酸溶液调节pH至2，有沉淀析出。抽滤留滤饼，以20mL水洗涤滤饼两次，60℃烘干，得到橘黄色固体5a-e。
4-((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5a)，产率为92.5％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.40-12.80(s,1H),8.32–8.10(m,2H),8.06-7.81(m,4H,),7.29-7.09(m,2H),4.38(t,J＝10.8Hz,2H),4.12-3.92(m,2H).
4-((4-(3-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5b)，产率为94.4％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.1Hz,2H),7.90(d,J＝8.5Hz,2H),7.78(d,J＝8.1Hz,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),4.21(t,J＝6.1Hz,2H),3.82(t,J＝6.5Hz,2Hl),2.22(p,J＝6.4Hz,2H).
4-((4-(4-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5c)，产率为92.4％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.0Hz,2H),7.90(d,J＝8.6Hz,2H),7.78(d,J＝8.1Hz,2H),7.14(d,J＝8.5Hz,2H),4.13(d,J＝5.2Hz,2H),3.82(t,J＝6.5Hz,2H),1.97-1.77(m,4H).
4-((4-(5-氯戊氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5d)，产率为91.7％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.09(d,J＝8.0Hz,2H),7.86(dd,J＝25.2,8.2Hz,4H),7.13(d,J＝8.5Hz,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),3.68(d,J＝13.2Hz,2H),1.79(dq,J＝12.5,5.6Hz,4H),1.57(q,J＝7.9Hz,2H).
4-((4-(6-氯己氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5e)，产率为92.8％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝7.9Hz,2H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.77(d,J＝7.9Hz,2H),7.12(d,J＝8.5Hz,2H),4.07(d,J＝6.6Hz,2H),3.64(t,J＝6.7Hz,2H),1.88–1.62(m,4H),1.57–1.31(m,4H-).
4-((4-(n-氯烷氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺系列化合物(6a-e)的合成
将化合物5a-e(2.0mmol)溶于无水DCM(10mL)中，加入草酰氯(338μL,4.0mmol)，加入一滴DMF作为催化剂，室温搅拌30min。减压蒸馏除去溶剂，不经纯化得到混合物A,将混合物A溶于5ml无水THF中，来那度胺(518.52mg，2.0mmol)，DIEA(496μL，3.0mmol)溶于5ml无水THF中，将混合物A溶液滴加入上述反应体系中，室温搅拌过夜。TLC检测反应完全(DCM:MeOH＝50:1)，减压蒸馏除去溶剂，利用甲醇重结晶得橙黄色固体6a-e。
4-((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6a)，产率为84.3％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.96(s,1H,),10.48(s,1H),8.18(d,J＝8.2Hz,2H),7.96(dt,J＝8.9,4.2Hz,4H),7.76(d,J＝7.5Hz,1H),7.65–7.55(m,2H),7.26–7.14(m,2H),5.15(dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),4.47(d,J＝2.6Hz,2H),4.40(t,J＝5.1Hz,2H),4.00(t,J＝5.1Hz,2H),2.99–2.81(m,1H),2.67–2.54(m,1H),2.45–2.27(m,1H),2.07–1.93(m,1H).
4-((4-(3-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6b)，产率为83.6；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H),10.51(s,1H),8.19(d,J＝8.2Hz,2H),7.97(dd,J＝8.4,5.8Hz,4H),7.77(d,J＝7.5Hz,1H),7.60(dt,J＝15.2,7.5Hz,2H),7.19(d,J＝8.6Hz,2H),5.17(dd,J＝13.2,5.0Hz,1H),4.54–4.38(m,2H),4.23(t,J＝6.0Hz,2H),3.83(t,J＝6.5Hz,2H),2.99–2.82(m,1H),2.64–2.54(m,1H),2.45–2.34(m,1H),2.23(p,J＝6.5Hz,2H),2.04–1.97(m,1H).
4-((4-(4-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6c)，产率为82.7％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.01(s,1H),10.53(s,1H),8.15(dd,J＝18.7,8.2Hz,2H),7.94(dd,J＝11.3,8.3Hz,4H),7.77(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dt,J＝14.9,7.4Hz,2H),7.16(dd,J＝9.2,2.8Hz,2H),5.17(dd,J＝13.5,4.9Hz,1H),4.47(s,2H),4.15(s,2H),3.73(d,J＝6.5Hz,2H),2.99–2.85(m,1H),2.66–2.55(m,1H),2.48–2.33(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.96–1.79(m,4H).
4-((4-(5-氯戊氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6d)，产率为83.7％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.90(s,1H,),10.42(s,1H),8.09(d,J＝8.2Hz,2H),7.87(t,J＝7.9Hz,4H),7.67(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(dt,J＝15.1,7.5Hz,2H),7.07(d,J＝8.5Hz,2H),5.07(dd,J＝13.1,5.2Hz,1H),4.43–4.33(m,2H),4.03(t,J＝6.3Hz),3.59(t,J＝6.5Hz,2H),2.90–2.80(m,1H),2.62–2.48(m,1H),2.46–2.32(m,1H),1.99–1.87(m,1H),1.70(d,J＝9.7Hz,4H),1.47(t,J＝7.8Hz,2H).
4-((4-(6-氯己氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6e)，产率为82.6％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),10.52(s,1H),8.18(d,J＝8.3Hz,2H),7.95(t,J＝8.2Hz,4H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dt,J＝15.0,7.4Hz,2H),7.15(d,J＝8.6Hz,2H),5.16(dd,J＝13.1,5.1Hz,1H),4.54–4.40(m,2H),4.10(t,J＝6.5Hz,2H),3.65(t,J＝6.6Hz,2H),2.96–2.84(m,1H),2.68–2.52(m,1H),2.46–2.33(m,1H),2.04–1.98(m,1H),1.88–1.62(m,4H),1.47(d,J＝7.1Hz,4H).
2-异丙氧基-5-甲基-4-(哌啶-4-基)苯胺(8)的合成
将4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)吡啶(8)(2.0g，7.35mmol)溶于20mL HCl/IPA溶液中，加入催化量的PtO2，H2还原，常温下反应4h。TLC检测反应完全(纯EA)，抽滤除去催化剂，减压蒸馏除去溶剂，得到中间体8，直接投下一步。
5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-(2-异丙基磺酰基苯基)吡啶-2,4-二胺(10)的合成
将2,5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺(9)(2.54g，7.35mmol)与上一步反应产物8混合，溶于30mL IPA中，加热至回流16h。TLC检测反应完全(DCM:MeOH＝50:1)，减压蒸馏除去溶剂，利用柱层析(DCM:MeOH＝100:1)进行纯化，得到中间体10 2.6g，产率为63.4％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.48(d,J＝8.3Hz,1H),8.25(s,1H),8.08(s,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,1H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.54(s,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H),6.85(s,1H),4.57(dt,J＝12.0,6.0Hz,1H),3.52(dt,J＝13.5,6.7Hz,1H),3.06(d,J＝11.7Hz,2H),2.69(dt,J＝30.1,11.2Hz,3H),2.15(s,3H),1.69–1.45(m,4H),1.22(dd,J＝19.3,6.4Hz,12H).
4-((4-(n-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基烷氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺系列化合物(DDO-A-0019～DDO-A-0023)的合成
将中间体6a-e(0.11mmol)溶于丙酮(10ml)中，加入NaI(83mg，0.55mmol)，在N2保护下加热至回流，反应24小时。(DCM:MeOH＝25:1)，减压蒸馏除去丙酮。不经纯化，直接投下一步。将该混合物溶于DMF(1mL)中，加入10(56mg，0.10mmol)和DIEA(96μL，0.57mmol)，在N2保护下加热至80℃，反应16h。反应完成后，将反应液冷却至室温，减圧蒸馏除去溶剂，剩余固体经制备TLC纯化(展开剂为DCM:MeOH＝50:1),得到橙黄色固体11a-e。
4-((4-(2-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基乙氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺(DDO-A-0019)，产率为56.7％。m.p.173-175℃；HPLC(methanol)＝95.0％.；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.07(s,1H),10.59(s,1H),9.50(s,1H),8.54–8.47(m,1H),8.28(s,1H),8.22(d,J＝8.3Hz,2H),8.12(s,1H),8.03–7.98(m,4H),7.88(s,1H),7.83–7.77(m,1H),7.65(d,J＝6.1Hz,2H,),7.54(s,1H),7.42–7.36(m,1H),7.23(d,J＝8.7Hz,2H),6.89(s,2H),4.51(s,4H-),4.29(s,2H,3.50–3.45(m,1H),3.20–3.10(m,2H),2.97–2.79(m,3H),2.73–2.61(m,2H),2.35–2.20(m,3H),2.16(s,3H),2.08–2.00(m,1H),1.73(s,4H),1.24(d,J＝5.8Hz,6H),1.19(d,J＝6.7Hz,6H)；HRMS(ESI):found1067.3968(C56H59ClN10O8S,[M+H]+,requires 1067.3999)；HPLC(methanol):tR＝3.43min,95.0％.
4-((4-(3-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基丙氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺(DDO-A-0020)，产率为52.2％。m.p.178-179℃；)；HPLC(methanol)＝97.4％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.12–11.02(m,1H),10.67–10.51(m,1H),9.61–9.46(m,1H),8.60–8.43(m,1H),8.32–8.27(m,1H),8.26–8.15(m,3H),8.03(s,4H),7.92–7.86(m,1H),7.84–7.76(m,1H),7.66(s,4H),7.45–7.35(m,1H),7.30–7.17(m,2H),6.87–6.71(m,1H),4.61–4.43(m,3H),4.37–4.19(m,2H),3.74–3.68(m,1H),3.55–3.47(m,1H),3.36–3.12(m,4H),3.08–2.86(m,2H),2.71–2.59(m,1H),2.51–2.35(m,2H),2.34–2.23(m,2H),2.20(s,3H),2.13–1.80(m,6H),1.28(d,J＝4.6Hz,6H),1.19(d,J＝5.6Hz,6H,-)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ173.35,171.52,168.24,165.03,161.95,158.28,155.42,154.25,147.23,146.82,138.44,137.80,136.33,135.98,135.28,133.97,133.33,131.46,129.79,129.14,127.73,127.38,125.50,125.09,124.25,122.60,120.66,115.73,111.65,104.87,71.37,65.88,55.26,53.96,52.90,51.95,47.19,40.79,40.51,40.23,39.95,39.67,39.40,39.12,34.96,31.65,30.08,24.04,22.37,18.87,15.31；HRMS(ESI):found1081.4144(C57H61ClN10O8S,[M+H]+,requires 1081.4156.
4-((4-(4-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基丁氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺(DDO-A-0021)，产率为54.3％。m.p.187-188℃；HPLC(methanol)＝93.2％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.06(s,1H),10.58(s,1H),9.49(s,1H),8.49(d,J＝8.3Hz,1H),8.27(s,1H),8.21(d,J＝8.3Hz,2H),8.12(s,1H),7.98(d,J＝7.4Hz,4H),7.84(s,1H),7.79(d,J＝7.6Hz,1H),7.64(dd,J＝13.3,7.6Hz,4H),7.53(s,2H),7.39(d,J＝7.5Hz,1H),7.21(d,J＝8.8Hz,2H),6.85(s,1H),4.80(s,1H),4.56(dd,J＝18.3,12.1Hz,3H),4.18(s,2H),3.55(s,1H),3.10(s,2H),2.63(s,2H),2.44(d,J＝12.6Hz,2H),2.15(s,4H),1.84(s,3H,),1.72(s,8H),1.23(d,J＝5.9Hz,6H),1.18(d,J＝6.7Hz,6H)；HRMS(ESI):found 1095.4301(C58H64ClN10O8S,[M+H]+,requires 1095.4312).
4-((4-(5-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基戊氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺(DDO-A-0022)，产率为51.6％。m.p.197-199℃；HPLC(methanol)＝96.0％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.06(s,1H),10.58(s,1H),9.50(s,1H),8.50(d,J＝7.9Hz,1H),8.28(s,1H),8.21(d,J＝8.3Hz,2H),8.12(s,1H,8.02–7.97(m,4H),7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝7.3Hz,1H),7.64(d,J＝13.1Hz,3H),7.54(s,1H),7.38(t,J＝7.5Hz,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),6.85(s,1H),4.66–4.41(m,4H),4.15(s,2H),3.50–3.45(m,1H,),2.95(t,J＝13.5Hz,2H),2.61(d,J＝16.2Hz,2H),2.44(d,J＝11.9Hz,2H),2.15(s,4H),1.78(d,J＝28.1Hz,8H),1.57(d,J＝31.5Hz,5H),1.25(d,J＝5.5Hz,6H),1.18(d,J＝6.7Hz,6H)；HRMS(ESI):found 1109.4482(C59H65ClN10O8S,[M+H]+,requires1109.4469；.
4-((4-(6-(4-(4-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-异丙氧基-2-甲基苯基)哌啶-1-基己氧基)苯基二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基-苯甲酰胺(11e，DDO-A-0023)，产率为50.8％。m.p.205-207℃；HPLC(methanol＝94.4％；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.03(s,1H),10.62(s,1H),9.49(s,1H),8.49(d,J＝7.4Hz,1H),8.27(s,1H),8.23(d,J＝8.1Hz,2H),8.12(s,1H),8.02–7.96(m,4H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.80(d,J＝7.4Hz,1H),7.65(t,J＝8.1Hz,2H),7.54(s,1H),7.39(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H),7.20(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H),6.88(s,2H,Ar-H),4.57–4.46(m,3H),4.15(s,2H),4.05(d,J＝7.0Hz,1H),3.55(s,1H),2.94(s,2H),2.61(d,J＝16.0Hz,2H),2.49–2.30(m,2H),2.16(s,4H),2.01(s,3H),1.89–1.58(m,8H),1.52(s,2H),1.43(s,2H),1.25(d,J＝5.7Hz,6H),1.18(d,J＝6.6Hz,6H)；HRMS(ESI):found 1123.4612(C60H67ClN10O8S,[M+H]+,requires 1123.4625).
实施例2、光调控TBK1蛋白降解剂DDO-A-0027的合成与评价(E)-(4-((4-羟基苯基)二烯基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成(12)的合成
合成方法同4-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(3)，将对氨基苯甲酸甲酯替换为对氨基-boc-苄胺，产率87％；1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.67–7.61(m,1H),6.88–6.83(m,1H),4.22(s,1H),1.46(s,3H).
(E)-2-(4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)二氮烯基)苯氧基)乙酸甲酯(14)的合成
合成方法同4-(((4-(n-氯烷氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4a-e)，将1-溴-n-氯代烷替换为溴乙酸甲酯，产率85％；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.17(d,J＝8.5Hz,2H),7.96(d,J＝8.7Hz,4H),7.16(dd,J＝13.1,7.4Hz,3H),4.12(t,J＝5.5Hz,2H),3.92(s,3H),3.37(d,J＝6.6Hz,3H),1.42(s,9H).
甲基(E)-2-(4-((4-((5-溴-4-((3-(N-甲基环丁烷甲酰胺基)丙基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)二氮烯基)苯氧基)乙酸酯(15)的合成
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.73(s,1H),8.13(d,J＝5.2Hz,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,2H),7.87–7.82(m,4H),7.12(d,J＝9.0Hz,3H),4.12(t,J＝7.0Hz,4H),3.46–3.38(m,4H),3.30–3.23(m,1H),2.88(s,2H),2.80(s,1H),2.14(dd,J＝17.6,9.0Hz,4H),2.07–2.01(m,2H),2.00–1.93(m,1H),1.89(d,J＝9.2Hz,1H),1.82(dd,J＝13.1,6.1Hz,2H).
(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(4-((E)-(4-((5-bromo-4-((3-(N-甲基环丁烷甲酰胺)丙基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)二烯基)苯氧基)乙酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(DDO-A-0027)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.82(s,1H),9.02(s,1H),8.66(s,1H),8.15(d,J＝4.3Hz,1H),8.09–7.92(m,3H),7.86(d,J＝8.7Hz,4H),7.44(s,4H),7.36(s,1H),7.15(d,J＝8.5Hz,2H),4.79(s,2H),4.64(d,J＝9.2Hz,1H),4.55–4.35(m,3H),4.35–4.18(m,1H),3.68(s,3H),2.87(s,2H),2.80(s,1H),2.48(s,3H),2.30–2.01(m,5H),2.01–1.60(m,6H),0.98(s,9H).HRMS(ESI):found 1010.3536(C49H58BrN11O6S,[M+H]+,requires1010.3535)
实施例3、光调控BRD4蛋白降解剂DDO-A-0028的合成
4-((E)-(4-(2-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3]-a][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺基(乙氧基)苯基(二氮杂卓基)-N-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异喹啉-4-基)苯甲酰胺(DDO-A-0028)
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.46(s,1H),9.27(s,1H),8.11(s,2H),7.88(s,4H),7.75(s,1H),7.67(s,2H),7.38(d,J＝9.1Hz,2H),7.27(s,2H),6.93(s,2H),5.08(d,J＝25.6Hz,1H),4.67(s,1H),4.45(s,2H),4.12(s,2H),3.72(d,J＝22.5Hz,2H),3.63–3.31(m,2H),2.58(s,3H),2.40(s,3H),2.15(s,6H),1.54(s,1H).HRMS(ESI):found 909.26807(C47H41ClN10O6S,[M+H]+,requires 909.26925)
实施例4、3,5-二甲基吡唑偶氮苯的合成
(E)-1,3,5-三甲基-4-(苯基二氮基)-1H-吡唑(DDO-A-0054)的合成
于一100mL圆底烧瓶中加入亚硝基苯(2mmol，214mg)、1,3,5-三甲基-1H-吡唑-4-胺(2mmol，250mg)、冰醋酸(10mL)，室温下搅拌6h。反应完全后，将反应液缓慢滴入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，干燥，过滤，旋干后柱层析，得到黄色固体，产率56％；HPLC(MeOH:H2O＝1:1):99.92％；m.p.55.6℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.53(t,J＝7.4Hz,2H),7.45(d,J＝7.2Hz,1H),3.76(s,3H),2.57(s,3H),2.40(s,3H).HRMS(ESI):测得215.1296(C12H14N4,[M+H]+,理论215.1298)
(E)-N-甲基-4-((1,3,5-三甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯甲酰胺(DDO-A-0055)的合成
本品的合成方法同DDO-A-0054，将亚硝基苯替换成N-甲基-4-亚硝基苯甲酰胺，产率49％；HPLC(MeOH:H2O＝7：3)：96.89％；m.p.180.2℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.56(d,J＝4.7Hz,1H),8.03–7.95(m,2H),7.82–7.75(m,2H),3.77(s,3H),2.84(d,J＝4.5Hz,3H),2.58(s,3H),2.40(s,3H).HRMS(ESI):测得272.1507(C14H17N5O,[M+H]+,理论272.1513)
(E)N-(4-((1,3,5-三甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)乙酰胺(DD0-A-0056)的合成
本品的合成方法同DDO-A-0054，将亚硝基苯替换为N-(4-亚硝基苯基)乙酰胺，产率46％。HPLC(MeOH：H2O＝3:7)：99.6142；m.p.223.1℃1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),7.76(d,J＝9.3Hz,2H),7.72(d,J＝9.2Hz,2H),3.76(s,3H),2.57(s,3H),2.39(s,3H),2.11(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ166.50,154.88,141.01,140.74,135.21,128.63,121.63,36.44,26.79,14.30,9.95.HRMS(ESI):测得272.1507(C14H17N5O,[M+H]+,理论272.1513)
实施例5、光调控BRD4蛋白降解剂DDO-A-0057的合成
(E)-4-((3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯甲酸甲酯(20)的合成
对氨基苯甲酸甲酯(755mg，5mmol)溶解于1M HCl(125mL)中，并添加48％HBF4水溶液(5mL)。所有固体溶解后，在冰浴中加入2M NaNO2溶液(2.2mL)。搅拌1h后，将混合物滴入乙酰丙酮(612μL，6mmol)、NaHCO3(10g，119mmol)、Na2CO3(12.5g，117mmol)与甲醇(50mL)和水(125mL)的混合溶液中，搅拌1h。反应完成后，用饱和盐水稀释反应溶液，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取，干燥，过滤，旋转干燥，并通过柱色谱分离，得到915mg黄色固体。将所得黄色固体(915mg，3.5mmol)溶解在甲醇(50ml)中，添加水合肼(200μL，4.2mmol)，并将混合物回流7h。反应完成后，将其旋转干燥并用石油醚重结晶，获得橙黄色固体(901mg，70％)；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.01(s,1H),8.16–8.07(m,2H),7.89–7.78(m,2H),3.91(s,3H),2.50(s,6H).
(E)-4-((1-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯甲酸甲酯(21)的合成
将化合物21(900mg，3.5mmol)溶解于20mL DMF中，添加Cs2CO3(2.5g，7mmol)和N-boc-溴乙胺(936mg，4.2mmol)，并在室温下搅拌8h。反应完成后，用水稀释反应溶液，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，干燥，过滤，旋转干燥并通过柱色谱分离，得到橙色固体(954mg，68％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.01(s,1H),8.16–8.07(m,2H),7.89–7.78(m,2H),3.91(s,3H),2.50(s,6H).
(4)甲基(S，E)-4-((1-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙酰胺基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯甲酸酯(22)的合成
将化合物21(802mg，2mmol)溶解于DCM(20mL)中，添加5mL三氟乙酸，搅拌6h。反应完成后，旋转干燥反应溶液，使用油泵排空三氟乙酸，用DMF(20mL)溶解化合物，添加(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]重氮-6-基)乙酸(602mg，2mmol)和DIEA(410μL，3mmol)，滴加pybop(1.25g，在冰浴下，在DMF(10mL)溶液中加入2.4mmol)，反应6h。反应完成后，用水稀释反应溶液，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，干燥，过滤，旋转干燥并通过柱色谱分离，得到产物橙色固体(1.12g，82％)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.47(t,J＝5.7Hz,1H),8.14–8.08(m,2H),7.88–7.81(m,2H),7.49–7.38(m,4H),4.55(t,J＝6.9Hz,1H),4.19(q,J＝6.8Hz,2H),3.56(d,J＝7.3Hz,2H),3.27(d,J＝7.0Hz,2H),2.61(s,3H),2.59(s,3H),2.45(s,3H),2.43(s,3H),1.65(s,3H).
(5)(S，E)-4-((1-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙酰胺基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯甲酸(23)的合成
将化合物22(684mg，1mmol)溶解在40mL乙醇中，添加10mL NaOH(160mg，4mmol)溶液，搅拌12小时。反应完成后，用稀盐酸将pH值调节至7，用水稀释混合物并用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，干燥，过滤并旋转干燥以获得产物黄色固体(532mg，81％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.52(t,J＝5.5Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,2H),7.82(d,J＝8.2Hz,2H),7.46(q,J＝8.5Hz,4H),4.60(t,J＝6.9Hz,1H),4.20(q,J＝6.7Hz,2H),3.57(d,J＝7.0Hz,2H),3.29(d,J＝7.1Hz,2H),2.66(s,3H),2.60(s,3H),2.45(s,6H),1.66(s,3H).
(6)4-((E)-(1-(2-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙酰胺基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮腈基)-N-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异丙氨酸-4-基)苯甲酰胺(DDO-A-0057)的合成
将化合物23(134mg，0.2mmol)溶解在DCM中，加入1滴DMF，加入草酰氯(100μL，1mmol)，搅拌3h，确认反应完成，在干燥条件下旋转干燥反应溶液，并使用THF(5mL)溶解，然后逐滴添加THF(10mL)中的来那度胺(52mg，0.2mmol)和DIEA(137mL，1mmol)，搅拌3h，旋干，并通过柱色谱分离得到30mg黄色固体；HPLC(MeOH:H2O＝15:85):95.097％；m.p.224-225℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),10.51(s,1H),8.47(d,J＝6.1Hz,1H),8.17(d,J＝8.2Hz,2H),7.88(d,J＝8.1Hz,2H),7.79(d,J＝7.6Hz,1H),7.68–7.60(m,2H),7.50–7.41(m,4H),5.20(dd,J＝13.3,5.2Hz,1H),4.53(d,J＝16.6Hz,3H),4.25–4.14(m,2H),3.57(d,J＝6.3Hz,2H),3.28(d,J＝6.9Hz,2H),2.92(d,J＝14.3Hz,1H),2.47(s,3H),2.44(s,3H),2.29(d,J＝9.8Hz,1H),2.04(s,1H),1.66(s,3H),1.26(s,1H).；HRMS(ESI):found933.2770(C16H43N12O5S,[M+Na]+,requires 933.2780)
实施例6、光调控BRD4蛋白降解分子DDO-A-0058的合成
(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙烷-1-醇(25)的合成
将化合物24(912mg。2mmol)溶于THF(30ml)中，在-20℃下分批加入LiALH4(330mg，8mmol)，在室温下搅拌2h。将反应液加入冰水(600ml)中，用DCM多次萃取，旋干，得到粗品。粗品用柱层析分离(DCM：MeOH＝20：1)，得到淡黄色固体(529mg，68％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.48(d,J＝1.6Hz,4H),4.58(t,J＝5.3Hz,1H),4.21(t,J＝7.0Hz,1H),3.76(q,J＝5.8Hz,2H),2.60(s,3H),2.47(s,2H),2.40(s,3H),1.63(s,3H).
(S)-6-(2-溴乙基)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮卓(26)的合成
将化合物25(529mg，1.37mmol)溶于无水DCM中，加入PPh3(430mg，1.64mmol)，在冰浴下滴入液溴直到反应液恰好变黄，搅拌6h。旋干反应液，用EA重结晶，抽滤得到淡黄色固体(501mg，82％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.59–7.54(m,2H),7.44–7.39(m,2H),5.80(t,J＝7.0Hz,1H),3.77–3.65(m,2H),2.64(s,3H),2.69–2.52(m,2H),2.33(s,2H),2.30(s,2H).
(E)-(4-((3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)甲醇(28)的合成
将化合物27(490mg，4mmol)溶于稀盐酸(60ml)中，加入HBF4(4ml)，在冰浴下滴加NaNO2(304mg，4.4mmol)溶液2.2ml，搅拌30min，制成重氮盐溶液。将乙酰丙酮(400μL，4mmol)，NaHCO3(8.3g,98mmol)与Na2CO3(10.36g,98mmol)溶于100ml H2O与40ml MeOH中,将重氮盐在冰浴下滴入反应液中，反应10min。将反应液倒入饱和食盐水中，用EA(3×100mL)萃取，干燥，旋干，柱层析分离(PE：EA＝1:1)得到橙黄色产物(540mg，59％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.85–7.79(m,1H),7.32(dt,J＝7.5,1.1Hz,1H),4.61(dt,J＝6.4,1.0Hz,1H),4.09(t,J＝6.4Hz,0H),2.51(s,1H),2.39(s,1H).
(S，E)-(4-(2-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)甲醇(29)的合成
将化合物28(224mg，0.5mmol)，化合物5(115mg，0.5mmol)，溶于无水DMF(5ml)中，加入Cs2CO3(325mg，1mmol)，在45℃下搅拌24h。将反应液加入饱和食盐水中，用EA(5×100mL)萃取，旋干，柱层析分离(纯EA)，得到橙红色化合物(134mg，45％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.74–7.68(m,2H),7.61–7.56(m,2H),7.43–7.37(m,2H),7.34(dt,J＝7.5,0.9Hz,2H),5.90(t,J＝7.0Hz,1H),4.60(dq,J＝6.5,1.0Hz,2H),4.37(dt,J＝12.4,7.1Hz,1H),4.30(dt,J＝12.3,7.1Hz,1H),3.92(t,J＝6.4Hz,1H),2.65(s,3H),2.63(dt,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.60–2.53(m,1H),2.51(s,2H),2.35(s,2H),2.31(s,2H),2.26(s,2H).
(S，E)-6-(2-(4-(溴甲基)苯基)二氮基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)乙基)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮卓(30)的合成
将化合物29(60mg，0.1mmol)溶于无水DCM中，加入PPh3(39.3mg，0.15mmol)，在冰浴下滴入液溴直到反应液恰好变黄，搅拌6h。旋干反应液，用PE/EA重结晶，抽滤得到橙黄色固体(60mg，90％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.76–7.70(m,2H),7.62–7.56(m,2H),7.51–7.45(m,2H),7.25(dt,J＝7.4,1.0Hz,2H),5.90(t,J＝7.0Hz,1H),4.57(dt,J＝12.5,1.0Hz,1H),4.45–4.34(m,2H),4.30(dt,J＝12.3,7.1Hz,1H),2.65(s,3H),2.65–2.57(m,1H),2.59–2.50(m,1H),2.51(s,2H),2.35(s,2H),2.31(s,2H),2.26(s,2H).
2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(32)的合成
将32(400mg，2.42mmol)与3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(436mg，2.66mmol)与醋酸钾(474mg，4.84mmol)溶于冰醋酸(20ml)中，在60℃下搅拌12h。将反应液倒入饱和食盐水(500ml)中，用乙酸乙酯在萃取(3×100mL)，旋干，柱层析分离(纯DCM)。得到白色固体(351mg，53％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),8.03(dd,J＝8.3,4.5Hz,1H),7.87(dd,J＝7.5,2.3Hz,1H),7.74(td,J＝8.9,8.4,2.4Hz,1H),5.19(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.92(ddd,J＝17.4,14.0,5.5Hz,1H),2.62(ddt,J＝18.6,8.0,3.5Hz,2H),2.10(ddq,J＝10.8,5.7,3.2Hz,1H).
4-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异异喹啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(33)的合成
将32(276mg，1mmol)与N-boc-哌嗪盐酸盐(1.1g，5mmol)溶于DMSO中，加入DIEA(823μL，6mmol)，100℃反应2h。反应完全后，将反应液用水稀释，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，依次用柠檬酸、碳酸氢钠洗涤，干燥，旋干，得亮黄色固体(375mg,85％).1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.12(s,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,1H),7.45–7.19(m,2H),5.11(dd,J＝12.6,5.3Hz,1H),2.93(t,J＝16.0Hz,1H),2.62(d,J＝17.8Hz,2H),2.05(d,J＝12.2Hz,1H),1.46(s,9H).
(11)5-(4-(4-((E)-(1-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苄基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮
将化合物33(40mg，0.1mmol)溶于5mL DCM中，加入2mL三氟乙酸，室温下搅拌6h。旋干反应液后用无水乙腈溶解，加入化合物30(60mg，0.09mmol)与K2CO3(40mg，0.3mmol)，在室温下反应12h。反应完全后，旋干反应液，用EA溶解，柠檬酸洗涤，干燥，旋干后柱层析分离(DCM：MeOH＝100:1)，得到橙色固体(50mg，60％).HPLC(MeOH:H2O＝15:85):97.904％；m.p.201-202℃；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),7.71(dd,J＝8.3,5.8Hz,3H),7.49(q,J＝3.0Hz,6H),7.36(d,J＝2.1Hz,1H),7.27(d,J＝8.7Hz,1H),5.10(dd,J＝12.6,5.3Hz,1H),4.51(d,J＝5.8Hz,2H),4.17(dd,J＝8.5,5.0Hz,1H),3.61(s,2H),3.48(s,4H),3.00–2.68(m,4H),2.62(s,3H),2.60(s,4H),2.58(s,3H),2.41(s,3H),2.37(s,3H),1.65(s,3H),1.25(d,J＝5.9Hz,2H).HRMS(ESI):测得924.5016(C16H43N12O5S,[M+Na]+,理论924.5020)
实施例7、光调控片段DDO-A-0060的设计与合成
(E)-1-(4-((1-乙基-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)-4-甲基哌嗪(DDO-A-0060)的合成
将4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(382mg，2mmol)溶于1M盐酸(50ml)中，在冰浴下滴入2M亚硝酸钠(151.8mg，2.2mmol)，反应10min，制得重氮盐溶液。将乙酰丙酮溶于碳酸氢钠(5.5g)与碳酸钠(5g)的水(50mL)溶液中，将重氮盐溶液滴入混合物，在冰浴下搅拌30min。将混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，干燥，旋干，得到橙黄色固体。将固体溶于乙醇(30mL)中，加入水合肼(100μL,2mmol)，加热回流过夜。旋干反应液，用PE重结晶得到橙红色固体(E)-1-(4-((3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)-4-甲基哌嗪(520mg，87％)。将该化合物(520mg，1.74mmol)溶于DMF中，加入碳酸铯(1.13g，3.48mmol)，在搅拌下滴加溴乙烷(151μL,2.08mmol),反应4h。将反应液用水稀释，乙酸乙酯(50ml×3)萃取，旋干，干燥，柱层析分离(PE:EA＝5:1)，得到橙黄色固体(501mg，77％)。HPLC(MeOH:H2O＝15:85):95.097％；m.p.224-225℃；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.71–7.57(m,2H),7.08–6.98(m,2H),4.08(q,J＝7.2Hz,2H),3.28(t,J＝5.0Hz,4H),2.56(s,3H),2.48(t,J＝5.1Hz,4H),2.39(s,3H),2.25(s,3H),1.35(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(ESI):测得327.2296(C16H43N12O5S,[M+H]+,理论327.2299)
实施例8、BRD4光调控蛋白降解剂DDO-A-0059的合成
(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙烷-1-醇(25)的合成
将化合物1(912mg。2mmol)溶于THF(30ml)中，在-20℃下分批加入LiALH4(330mg，8mmol)，在室温下搅拌2h。将反应液加入冰水(600ml)中，用DCM多次萃取，旋干，得到粗品。粗品用柱层析分离(DCM：MeOH＝20：1)，得到淡黄色固体(529mg，68％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.48(d,J＝1.6Hz,4H),4.58(t,J＝5.3Hz,1H),4.21(t,J＝7.0Hz,1H),3.76(q,J＝5.8Hz,2H),2.60(s,3H),2.47(s,2H),2.40(s,3H),1.63(s,3H).
(S)-6-(2-溴乙基)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮卓(26)的合成
将化合物2(529mg，1.37mmol)溶于无水DCM中，加入PPh3(430mg，1.64mmol)，在冰浴下滴入液溴直到反应液恰好变黄，搅拌6h。旋干反应液，用EA重结晶，抽滤得到淡黄色固体(501mg，82％)1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.59–7.54(m,2H),7.44–7.39(m,2H),5.80(t,J＝7.0Hz,1H),3.77–3.65(m,2H),2.64(s,3H),2.69–2.52(m,2H),2.33(s,2H),2.30(s,2H).
2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(32)的合成
将4(400mg，2.42mmol)与3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(436mg，2.66mmol)与醋酸钾(474mg，4.84mmol)溶于冰醋酸(20ml)中，在60℃下搅拌12h。将反应液倒入饱和食盐水(500ml)中，用EA萃取(100ml*3)，旋干，柱层析分离(纯DCM)。得到白色固体(351mg，53％)1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),8.03(dd,J＝8.3,4.5Hz,1H),7.87(dd,J＝7.5,2.3Hz,1H),7.74(td,J＝8.9,8.4,2.4Hz,1H),5.19(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.92(ddd,J＝17.4,14.0,5.5Hz,1H),2.62(ddt,J＝18.6,8.0,3.5Hz,2H),2.10(ddq,J＝10.8,5.7,3.2Hz,1H).
4-(4-(2-(2,4-二氧戊环-3-亚乙基)肼基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(37)的合成
将化合物6(1.11g，4mmol)溶于稀盐酸(60mL)中，加入HBF4(4mL)，在冰浴下滴加NaNO2(304mg，4.4mmol)溶液2.2ml，搅拌30min，制成重氮盐溶液。将乙酰丙酮(400μL，4mmol)，NaHCO3(8.3g,98mmol)与Na2CO3(10.36g,98mmol)溶于100ml H2O与40ml MeOH中,将重氮盐在冰浴下滴入反应液中，反应10min。将反应液倒入饱和食盐水中，用EA(3×100mL)萃取，干燥，旋干，柱层析分离(PE：EA＝1:1)得到橙黄色产物(954mg，61％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ14.53(s,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),7.06(d,J＝8.7Hz,2H),3.49(t,J＝4.9Hz,4H),3.16(t,J＝5.1Hz,4H),2.45(s,6H),1.45(s,9H).
叔丁基(E)-4-(4-((3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(38)的合成
将化合物7(954mg，2.46mmol)溶于EtOH(20mL)中，加入水合肼(161μl，3.23mmol)，回流6h。旋干反应液，得到橙红色化合物(890mg，94.2％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.69(s,1H),7.70–7.60(m,2H),7.13–7.00(m,2H),3.50(t,J＝5.2Hz,4H),3.27(dd,J＝6.5,3.8Hz,4H),2.45(s,6H),1.46(s,9H).
叔丁基(S，E)-4-(4-(1-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮平-6-基)乙基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(39)的合成
将化合物3(224mg，0.5mmol)，化合物8(192mg，0.5mmol)，溶于无水DMF(5mL)中，加入Cs2CO3(325mg，1mmol)，在45℃下搅拌24h。将反应液加入饱和食盐水中，用EA(5×100mL)萃取，旋干，柱层析分离(纯EA)，得到橙红色化合物(193mg，51％)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.49(d,J＝2.3Hz,4H),7.05(d,J＝8.7Hz,2H),4.49(q,J＝6.2Hz,2H),4.13(dd,J＝8.5,5.0Hz,1H),3.56–3.45(m,5H),3.27(t,J＝5.0Hz,4H),2.84(dq,J＝15.0,7.8Hz,2H),2.62(s,3H),2.56(s,3H),2.40(s,3H),2.34(s,3H),1.65(s,4H),1.45(s,9H).
5-(4-(4-((E)-(1-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙基)-3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)二氮基)苯基)哌嗪-1-基)-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(DDO-A-0059)的合成
将化合物9(193mg，0.26mmol)溶于无水DCM(5mL)中，加入HCl-EA(1mL)，在室温下搅拌6h。将反应液旋干，用DMSO(5mL)溶解，加入化合物5(70.9mg，0.26mmol)，K2CO3(69mg，0.5mmol)，在100℃下搅拌24h。将反应液加入饱和食盐水(200ml)中，用EA(5×100mL)萃取，旋干，柱层析分离(纯乙酸乙酯)，得到橙红色化合物(98mg，41.5％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),7.77–7.72(m,1H),7.68(dd,J＝8.8,6.4Hz,2H),7.56–7.46(m,6H),7.10(d,J＝8.8Hz,2H),4.54–4.43(m,2H),4.14(dd,J＝8.7,5.0Hz,1H),3.69(s,4H),3.55(d,J＝4.6Hz,1H),3.53–3.44(m,4H),2.95–2.75(m,4H),2.62(s,3H),2.57(s,3H),2.41(s,3H),2.35(s,3H),1.65(s,3H),1.25(s,2H).MS(ESI):calcd for C47H45ClN12O4S 908.3096m/z:＝HRMS(ESI):测得931.2981(C16H43N12O5S,[M+H]+,理论931.2983)
实施例9
免疫印迹实验方法：将给药后的NCI-H2228细胞孵育24小时后进行处理，首先用1*PBS洗涤细胞，吸出，加入弱效RIPA裂解液(100μL)裂解细胞，裂解时间为40分钟，13000rpm、4℃离心15分钟，取80μL上清液并加入20μL上样缓冲液，并在100℃下加热8分钟，放在冰上冷却，上样10μL到10％的SDS-PAGE凝胶上，先用55V恒压跑直到将marker分开后转为115V跑至最底边。电泳后取下胶，按尺寸剪取合适大小的PVDF膜，白板到黑板的顺序依次为滤纸、PVDF膜、胶、滤纸和黑色纱网。采用湿法转膜，时间为2h，转移蛋白到PVDF膜(Perkin Elmer,Northwalk,CT,USA)。结束后，将PVDF膜浸入丽春红染色液中，染色2～5min，蒸馏水冲洗，剪下目标条带，用PBST洗去丽春红。用含5％w/v脱脂奶粉的1*TBST封闭缓冲液，37℃封闭1h。封闭完成后用15ml TBST洗涤三次，每次5分钟。将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于10ml一抗稀释缓冲液(含5％脱脂奶粉的1*TBST，要制备20ml，添加1.0g脱脂奶粉至20ml 1*TBST，然后充分混匀)中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动，完成后用15ml TBST洗涤三次，每次5分钟，然后使用10ml封闭缓冲液稀释Anti-rabbit IgG,HRP-linkedAntibody(#7074，按1:2000的比例)和anti-biotin，HRP-linkedAntibody(#7075，按1:1000-1:3000的比例)用以检测生物素化蛋白质标准品，将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育1小时，然后用15ml TBST洗涤三次，每次5分钟，接下来进行蛋白质检测，在TBST中清洗与膜结合的HRP(Antibody Conjugate)三次，持续5分钟，然后将显色液与膜一起孵育1分钟，倒掉多余溶液(膜保持湿润)并曝光。
实施例10
化合物吸收光谱的测定方法：将化合物配制成100μM浓度的DMSO溶液，按每孔100μL体积置于透明96孔板中。接着，将氙灯光源分别用365nm、380nm、400nm、420nm、450nm、475nm、500nm、520nm、550nm、600nm和650nm单波长滤光片过滤得到单色光，每种单色光照射10分钟后测试溶液在280～680nm范围内的紫外-可见吸收光谱，并以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制不同波长下化合物的吸收曲线。
实施例11
化合物热弛豫测试方法：将化合物配制成100μM浓度的DMSO溶液。取100μL置于透明96孔板中，并用365nm单波长紫外光激发10分钟后测定溶液的吸收曲线。避光静置24小时，在这期间，分别在15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、18小时和24小时的时间点避光测试溶液的吸收曲线。
实施例12
血浆稳定性测试方法：制备包含标准浓度(10μg/ml)的化合物样品，在将化合物加入小鼠血浆的规定时间后(t＝0,1,2,4,6,8,12,24小时)，从血浆中分离等份，通过LC-MS-MS进行分析。在所有过程中，温度保持37℃。
实施例13
吸收光谱的测定：将化合物DDO-A-0054～DDO-A-0056配制成100μM浓度的DMSO溶液，按每孔100μL体积置于透明96孔板中。接着，将氙灯光源分别用365nm、380nm、400nm、420nm、450nm、475nm、500nm、520nm、550nm、600nm和650nm单波长滤光片过滤得到单色光，每种单色光照射10分钟后测试溶液在280～680nm范围内的紫外-可见吸收光谱，并以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制不同波长下化合物的吸收曲线如下(为了突出特征吸收峰，横坐标范围选取为280～480nm，下同)，如图8所示，DDO-A-0054～DDO-A-0056具有良好的转化率，在365nm波长下转化最为完全；热弛豫时间的测定：首先，将这3个分子配制成100μM浓度的DMSO溶液。取100μL置于透明96孔板中，并用365nm单波长紫外光激发30min后测定溶液的吸收曲线。避光静置24小时，在这期间，分别在15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、18小时和24小时的时间点避光测试溶液的吸收曲线，如图9-10所示，在25℃下，在DDO-A-0054～DDO-A-0056系列中，AP-MF1的半衰期低于4小时，而苯环对位被取代后(AP-MF2和AP-MF3)的半衰期均长于48小时。
本发明中DDO-A-0019～DDO-A-0023的合成：以对氨基苯甲酸甲酯为原料通过重氮化偶氮反应得到中间体3，与不同链长的氯代溴烷烃反应(n＝2-6)，得到中间体4a-e，通过氢氧化锂脱甲酯后，与草酰氯反应得到酰氯中间体，之后在碱性条件下与来那度胺缩合得到关键中间体6a-e。将4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)吡啶用氢气还原后在碱性加热条件下与2,5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺反应，得到色瑞替尼。与6a-e在碱性、加热条件下反应得到化合物DDO-A-0019～DDO-A-0023。
DDO-A-0027的合成：以4-氨基-N-Boc-苯乙胺为原料，通过重氮化偶氮反应得到偶氮苯中间体12，接着通过侧链取代和脱保护得到中间体14；将光调控片段的一端通过亲核取代与已报道的TBK1配体相连，另一端通过成酰胺反应连接VHL配体VHL-α，最终得到了具有光调控活性的靶向TBK1小分子PROTAC系列化合物DDO-A-0027。
DDO-A-0028的合成：将光调控模块3经亲核取代反应得到了带侧链的片段17，片段18脱甲酯后与来那度胺通过酰胺键连接得到中间体23，中间体19脱保护后与BRD4配体JQ-1酸缩合得到产物DDO-A-0028。
DDO-A-0057的合成：将对氨基苯甲酸甲酯在酸性条件下通过重氮化偶氮反应与乙酰丙酮生成偶氮中间体，加入水合肼回流两小时后得到中间体20；中间体20在碱性条件下与N-BOC溴乙胺发生亲核取代反应得到中间体21；中间体21与BET抑制剂JQ-1酸通过缩合剂缩合得到中间体22，继续脱甲酯得到中间体23；中间体23在草酰氯中反应得到酰氯中间体，在三乙胺/四氢呋喃体系中与来那度胺反应得到终产物DDO-A-0057。
DDO-A-0058的合成：将对氨基苯甲醇通过重氮化反应得到偶氮中间体，之后在水合肼中回流得到化合物28，化合物28与BET抑制剂JQ-1通过还原溴代两步生成的中间体26在碱性条件下反应得到化合物29，化合物29通过三苯基膦、液溴条件溴代得到化合物30。4-氟酞酐与3-氨基-2,6-哌啶二酮盐酸盐在醋酸、醋酸钾存在下加热条件下反应得到化合物32，化合物32与N-Boc-哌嗪盐酸盐在碱性条件下加热反应得到化合物33.化合物33通过三氟乙酸脱Boc后，在碱性条件下与化合物30反应得到化合物DDO-A-0058。
DDO-A-0059的合成：将1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪通过重氮化反应得到偶氮中间体，之后在水合肼中回流得到化合物38，化合物38与中间体26在碱性条件下反应得到化合物39，化合物39通过三氟乙酸脱Boc后，在碱性、加热条件下与化合物32反应得到化合物DDO-A-0059。
如图1-3所示，DDO-A-0020与DDO-A-0023对ALK蛋白的浓度依赖性降解及在紫外光与可见光下对ALK蛋白的调控，化合物DDO-A-0019～DDO-A-0022均能够浓度依赖性地诱导靶蛋白EML4-ALK降解，且化合物DDO-A-0020降解活性最优，化合物DDO-A-0023诱导靶蛋白降解作用不明显。对降解活性最优的化合物DDO-A-0020对NCI-H2228细胞进行孵育，分别利用UV-C和VIS光源照射不同时间，并利用蛋白免疫印迹实验测定细胞内EML4-ALK融合蛋白水平。两组降解效果存在明显差异，VIS光源照射组降解效果显著优于UV-C光源照射组，表明DDO-A-0020-trans诱导靶蛋白降解的作用显著优于DDO-A-0020-cis。
如图4所示，可见光下和紫外光下DDO-A-0027对TBK1的调控，可见光组在250nM时可观察到TBK1被部分降解，500nM浓度下TBK1的降解达到最大水平，随着浓度继续升高，TBK1的降解逐渐减弱，是由于Hook效应造成的。在紫外光组，0～5uM浓度下，TBK1保持不变，10uM浓度可观察到轻微的下调，这可能是由于偶氮苯热弛豫产生的。
如图5所示可见光和紫外光下DDO-A-0028对BRD4的调控，可见光组的BRD4-Azo-A1在10nM浓度下基本完全降解了BRD4(DCmax＞95％)，紫外光组10nM浓度的BRD4-Azo-A1对BRD4蛋白没有明显降解效果，直至100nM才观察到BRD4被显著降解。该结果表明，BRD4-Azo-A1能有效降解BRD4蛋白，且紫外组和可见光组的降解活性有显著差异(＞100倍)。但是，在该结果中发明人观察到紫外光组的BRD4蛋白在100nM以上浓度中也出现了浓度依赖性降解的现象。这一结果证明了偶氮苯的热弛豫现象对调节PROTAC降解过程会带来不可忽略的影响。
如图11所示，可见光和紫外光下DDO-A-0057对MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞内BRD4蛋白的调控，BRD4-Azo-B1在可见光能够有效降解MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468三种三阴性乳腺癌细胞株中的BRD4蛋白，且降解效率较高(DC50＜10nM；DCmax＞90％)；在紫外光和可见光的照射下，对MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞中BRD4蛋白的降解能力有显著差异。
如图12-15所示，DDO-A-0057到DDO-A-0060的血浆稳定性测试，化合物DDO-A-0057在血浆中的半衰期为8.532h，消除速率常数为：0.08122；血浆清除率为：56.62mL/h；化合物DDO-A-0058在血浆中的半衰期为15.753h，消除速率常数为：0.04399；血浆清除率为：103.45mL/h；化合物DDO-A-0059在血浆中的半衰期为41.74h，消除速率常数为：0.01666；血浆清除率为：275.03mL/h；DDO-A-0060半衰期为67.3h，消除速率常数为：0.01037；血浆清除率为：448.99mL/h。
如图16所示，DDO-A-0057～DDO-A-0059的血浆稳定性的对比，与DDO-A-0057与DDO-A-0058相比，DDO-A-0059血浆稳定性有了显著的提升(较DDO-A-0057提升了389％)。
如图17所示，DDO-A-0059在紫外与可见光下对BRD4的调控，DDO-A-0059在可见光下能够浓度依赖性的降解BRD4，且在100nM浓度下，DDO-A-0059的最大降解率DCmax＞90％；而在紫外光下，DDO-A-0059基本完全失去了对BRD4的降解活性。并且在处于cis构型时没有明显的热弛豫现象，基本完全失去了对BRD4的降解活性。
本发明所述的双稳态光调控小分子蛋白降解剂，可作为可逆的光调控开关，并可将其应用于PROTAC设计来实现蛋白降解过程的可逆调控，解决PROTAC这类事件驱动型分子不可调控的问题，优化了分子的热半衰期与药代动力学性质，明显改善了光调控PROTAC分子的热弛豫问题，并使血浆半衰期提高了389％；解决了PROTAC分子难以成药的问题，本发明所述的蛋白降解剂分子量小、生物利用度高且水溶性好，易于成药。
Claims (7)
1.一种双稳态光调控小分子蛋白降解剂，其特征在于，所述降解剂的化学结构通式为：
其中，
为苯环或2,4-二甲基吡唑环；
n＝2-6。
2.根据权利要求1所述的降解剂，其特征在于，所述降解剂的化学结构通式为：
3.权利要求1所述的双稳态光调控小分子蛋白降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取原料化合物A，进行重氮化偶氮反应，得到偶氮中间体化合物B；
(2)将步骤(1)所得偶氮中间体化合物B，通过侧链取代连接化合物C后得到中间体化合物D；
(3)在碱性条件下，中间体化合物D反应得到所述双稳态光调控小分子蛋白降解剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述原料化合物A为对氨基苯甲酸甲酯、对氨基苯甲醇、4-氨基-N-Boc-苯乙胺或1-Boc-4-(4-氨基苯基)哌嗪中的一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化合物C为来那度胺、(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩[3,2-f][1,2,4]三唑基[4,3-a][1,4]二氮杂吡啶-6-基)乙酸、(S)-6-(2-溴乙基)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮卓或N-(3-((5-溴-2-氯嘧啶-4-基)氨基)丙基)-N-甲基环丁烷酰胺中的一种。
6.权利要求1所述的双稳态光调控小分子蛋白降解剂的应用，其特征在于，所述蛋白降解剂在小分子光调控模块中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白降解剂用于制备分子生物活性的可逆调控的PROTAC或小分子抑制剂。
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-
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