CN114259479B - 一种微针、微针贴片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微针、微针贴片及其制备方法，属于药妆品技术领域。该微针中含有活性药物，活性药物包括二氢杨梅素和橙皮素，该微针的成分来源于天然产物，与人工合成化合物相比，具有更好的生物相容性和低的长期毒性；该给药方式增强了药物的透皮递送，无痛微创，增加了患者的顺应性，并且给药量相对稳定可控，生物利用度高。上述微针可发挥良好的美白和抗衰作用，将其制成微针贴片，可以持续方式透皮递送双药，并具备有效的抗黑色素生成和预防糖化引起皮肤衰老的作用，是改善皮肤综合状态的有潜力的平台，可为具有多重护肤功效的美容产品的开发提供参考。上述物质的制备方法简单，易操作，可工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药妆品技术领域，具体而言，涉及一种微针、微针贴片及其制备方法。
背景技术
皮肤易受多种外源性刺激(例如空气污染、紫外线、病原体)和内源性刺激(例如脂质氧化、糖化、毒素和遗传因素)影响，导致色素过度沉积，皮肤弹性下降、松弛和皱纹加深等现象。随着经济发展和人们审美水平的提高，具有美白或抗衰功效的新兴药妆产品与日剧增，深受消费者青睐，具备广阔的市场潜力。
然而，当前市售的美容产品效果不甚理想，存在以下问题：(1)常规使用的化妆品成分，例如经典的皮肤美白剂曲酸和熊果苷，可能引起严重的副作用：曲酸在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中被列为3类致癌物；熊果苷容易水解释放对苯二酚，通过上调软骨调节素-I蛋白导致严重的骨髓毒性；(2)以水、乳、膏、霜为代表的美容产品制剂受角质层的屏障作用影响导致经皮给药渗透效果不佳，从而使效果受限；(3)单一功能的美容产品难以满足消费者诸如美白、抗衰等方面的多重需求。例如，长期暴露于紫外线下的人不仅困扰于皮肤中黑色素的过度沉积，而且受活性自由基的过度产生和非酶糖化反应引起的胶原蛋白流失影响，急需综合美容功效产品予以解决。
因此，筛选新型安全高效的美容活性成分，设计高透皮渗透性能及功能集成化的给药剂型是推动现代化美容产品开发的重要方向。
为了进一步提高美容活性成分的实际治疗功效，需要克服角质层为代表的皮肤生物屏障以提高药物透皮递送。许多化学手段(包括表面活性剂、纳米凝胶、转移体等化学渗透促进剂)和物理技术(包括超声促渗、离子电渗以及细胞电穿孔)已被广泛研究以增强药物渗透。然而上述化学和物理渗透促进方法并非完全令人满意。化学渗透促进剂受限于稳定性和批次间均匀性等方面的问题，而物理技术常常是侵入性、昂贵且有源的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种微针，其一方面增强了药物的透皮递送，无痛微创，增加了患者的顺应性，并且给药量相对稳定可控，生物利用度高；另一方面能够发挥良好的美白和抗衰作用。
本发明的目的之二在于提供一种上述微针的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种含有上述微针的微针贴片。
本发明的目的之四在于提供一种上述微针贴片的制备方法。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种微针，微针中含有活性药物，活性药物包括二氢杨梅素和橙皮素。
在可选的实施方式中，按重量百分数计，活性药物包括0.1-0.5％的二氢杨梅素以及0.1-0.5％的橙皮素。
在可选的实施方式中，微针中还含有用于承载活性药物的活性载体。
在可选的实施方式中，活性载体的主要成分为壳聚糖。
第二方面，本申请提供如前述实施方式的微针的制备方法，包括以下步骤：制备活性药物。
在可选的实施方式中，再将活性药物负载于活性载体上。
在可选的实施方式中，负载过程包括：将二氢杨梅素溶液、橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶混合，得到混合溶液。
在可选的实施方式中，二氢杨梅素溶液的浓度为8-12mg/mL，二氢杨梅素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比为10:160-200。
在可选的实施方式中，橙皮素溶液的浓度为8-12mg/mL，橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比为10:160-200。
在可选的实施方式中，壳聚糖预凝胶由壳聚糖粉末溶于醋酸溶液后得到。
在可选的实施方式中，醋酸溶液的浓度为1.5-2.5％。
在可选的实施方式中，壳聚糖预凝胶的浓度为4.5-5.5％。
在可选的实施方式中，二氢杨梅素溶液、橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶是于超声条件下进行混合。
在可选的实施方式中，还包括：将混合溶液浇注至微针模具直至混合溶液浇注至微针模具的针尖部分，去除针尖腔室外的凝胶溶液，干燥。
在可选的实施方式中，混合溶液浇注至微针模具的针尖部分是于2500-3500rpm的转速离心条件下进行至少30min。
在可选的实施方式中，干燥是于35-40℃的条件下进行20-28h。
第三方面，本申请提供一种微针贴片，包括基底和与基底配合的如前述实施方式的微针。
在可选的实施方式中，基底的原料包括聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物的溶液。
第四方面，本申请提供如前述实施方式的微针贴片的制备方法，包括以下步骤：将微针与基底的原料混合，随后干燥。
在可选的实施方式中，制备微针的二氢杨梅素溶液与基底的原料的体积比为1:80-120。
在可选的实施方式中，基底原料中聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物的溶液浓度为45-55wt％。
本申请的有益效果包括：
本申请提供的微针的成分来源于天然产物，与人工合成化合物相比，具有更好的生物相容性和低的长期毒性。该给药方式增强了药物的透皮递送，无痛微创，增加了患者的顺应性，并且给药量相对稳定可控，生物利用度高。上述微针可发挥良好的美白和抗衰作用，将其制成微针贴片，可以持续方式透皮递送双药，并具备有效的抗黑色素生成和预防糖化引起皮肤衰老的作用，是改善皮肤综合状态的有潜力的平台，可为具有多重护肤功效的美容产品的开发提供参考。上述微针及微针贴片的制备方法简单，易操作，可工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中中药多酚类活性成分的抗氧化能力的测试结果图；
图2为实施例1中中药多酚类活性成分对酪氨酸酶的抑制能力的测试结果图；
图3为实施例1中中药多酚类活性成分对HaCaT细胞(A)和B16F10细胞(B)的细胞毒性的测试结果图；
图4为实施例1中二氢杨梅素(A)、白藜芦醇(B)和姜黄素(C)对B16F10细胞黑色素生成的抑制能力的测试结果图；
图5为实施例1中二氢杨梅素(A)、白藜芦醇(B)和姜黄素(C)对B16F10细胞酪氨酸酶的活性抑制能力的测试结果图；
图6为实施例1中中药多酚类活性成分美白相关性质的热图分析；
图7为实施例2中中药抗衰成分对高级糖化终末产物的抑制作用的测试结果图；
图8为实施例2中中药抗衰成分对HaCaT细胞的细胞毒性的测试结果图；
图9为实施例3中不同浓度的壳聚糖对B16F10细胞的黑色素生成抑制作用的测试结果图；
图10为实施例3中壳聚糖在干燥脱水过程中的溶液-凝胶转变的照片；
图11为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs的制备流程图示意图：(A)PDMS微针阴模的制备流程；(B)双载中药活性成分的壳聚糖微针的制备步骤；
图12为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs的数码图片(A)，显微镜明场(B)，荧光图像(C)，三维重构共聚焦图像(D)和不同尺度下的SEM图像(E)；
图13为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs的应力和位移距离关系图；
图14为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs中二氢杨梅素和橙皮素16天内的释放曲线图；
图15为实施例4中荧光标记壳聚糖微针透皮实验结果图：(A)罗丹明B标记微针刺破猪的皮肤；(B)荧光显微镜检查猪的皮肤上的罗丹明B荧光亮度和荧光信号；
图16为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs对胞内黑色素的联合抑制效果的测试结果图；
图17为实施例4中活性微针DMY/HES@CS MNs抑制高级糖化终末产物的测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的微针、微针贴片及其制备方法进行具体说明。
本申请提出一种微针，该微针中含有活性药物，活性药物包括二氢杨梅素和橙皮素。
其中，二氢杨梅素可通过多种机制减少黑色素在皮肤基底层的沉积发挥美白作用。例如，可通过降低细胞内活性氧并抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素(如B16F10细胞中的黑色素)合成，或可通过表现出抗氧化特性来防止活性氧(ROS)在黑色素细胞增殖和黑色素生成，从而引起皮肤美白效果。
橙皮素可通过抑制蛋白质非酶糖化反应起到抗衰作用。
上述活性药物成分的确定：通过发明人根据抗氧化活性、酪氨酸酶抑制活性、黑色素生成抑制以及对人永生化角质形成细胞的细胞毒性等指标在热图中进行定量和归一化分析，从具有潜在美白活性的中药多酚成分中综合确定二氢杨梅素作为发挥美白作用的模型负载药物，并根据抑制高级糖化终末产物产生效果和细胞毒性，从潜在的抗糖化中药成分中综合确定橙皮素作为发挥抗衰作用的模型负载药物。
在可选的实施方式中，按重量百分数计，活性药物包括0.1-0.5％(如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％)的二氢杨梅素以及0.1-0.5％(如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％)的橙皮素。
进一步地，上述微针中还含有用于承载活性药物的活性载体。
本申请中，活性载体的主要成分为壳聚糖，此外，也不排除还可以含有其他可作为活性载体的成分。
本申请中，壳聚糖与二氢杨梅素介导的联合黑色素生成抑制以及与橙皮素介导的抗糖化，可有效应对内源和外源性皮肤刺激，实现较为完备的皮肤护理。
承上，本申请提供的微针方式作为一种经皮给药手段，可增强药物的透皮递送，无痛微创，易于使用，增加了患者的顺应性，可实现患者自我给药；并且其给药量相对稳定可控，生物利用度高。其具体的作用机理可参照：利用微米级的针头穿透人体皮肤的角质层和表皮层，并在表面产生微通道，使药物能通过微通道顺利渗透入皮肤深层，因此显著提高药物的渗透效率。
具体的，本申请以壳聚糖(CS)作为活性载体，微针作为储库，在插入位点通过壳聚糖的溶胀和逐渐降解实现的药物(二氢杨梅素和橙皮素)的缓慢与长期释放。上述活性载体与活性药物均来源于天然产物，相比人工合成化合物，具有更好的生物相容性和低的长期毒性。
相应地，本申请还提供了上述微针的制备方法，例如可包括以下步骤：制备活性药物。进一步地，再将活性药物负载于活性载体上。
可参考地，制备活性药物可指制备溶液形式的二氢杨梅素(即二氢杨梅素溶液)和溶液形式的橙皮素(即橙皮素溶液)。
负载过程可包括：将二氢杨梅素溶液、橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶混合，得到混合溶液。
其中，二氢杨梅素溶液的浓度可以为8-12mg/mL，如8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL或12mg/mL等，也可以为8-12mg/mL范围内的其它任意值。优选的，二氢杨梅素溶液的浓度为10mg/mL。
二氢杨梅素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比可以为10:160-200，如10:160、10:170、10:180、10:190或10:200等，也可以为10:160-200范围内的其它任意值。优选的，二氢杨梅素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比为10:180。
橙皮素溶液的浓度可以为8-12mg/mL，如8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL或12mg/mL等，也可以为8-12mg/mL范围内的其它任意值。优选的，橙皮素溶液的浓度为10mg/mL。
橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比可以为10:160-200，如10:160、10:170、10:180、10:190或10:200等，也可以为10:160-200范围内的其它任意值。优选的，橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶的体积比为10:180。
本申请中所称的壳聚糖预凝胶由壳聚糖粉末溶于醋酸溶液后得到。
其中，醋酸溶液的浓度可以为1.5-2.5％，如1.5％、2％或2.5％等，也可以为1.5-2.5％范围内的其它任意值。优选的，醋酸溶液的浓度为2％。
壳聚糖预凝胶的浓度可以为4.5-5.5％，如4.5％、5％或5.5％等，也可以为4.5-5.5％范围内的其它任意值。优选的，壳聚糖预凝胶的浓度为5％。
在一些优选的实施方式中，二氢杨梅素溶液、橙皮素溶液与壳聚糖预凝胶于超声条件下进行混合。超声时间示例性地可以为2h。通过超声方式，可使得混合溶液中各成分均匀混合。
进一步地，将混合溶液浇注至微针模具直至混合溶液浇注至微针模具的针尖部分，去除针尖腔室外的凝胶溶液，干燥。干燥后可直接脱模，也可与其它物质制成其它形式(如贴片形式等)的微针。
其中，混合溶液浇注至微针模具的针尖部分可以是于2500-3500rpm(如3000rpm)的转速离心条件下进行至少30min。
干燥可以于35-40℃(如37℃)的条件下进行20-28h(如24h)。
可参考地，上述微针模具示例性地可通过以下方式制得：基于光刻技术预先制备SU-8模具，然后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)液体及其交联剂按10:1的比例进行充分混合并通过离心除去混合物中的气泡，将混合物浇铸到SU-8模具中，于高温烘箱60℃交联固化24小时后脱模，得到具有一组微米级针状结构凹槽的PDMS固体模具。
此外，本申请还提供了一种微针贴片，其包括基底和与基底配合的上述微针。
可参考地，基底的原料可包括聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物(简称PVA/PVP)的溶液。
该基于天然产物的“全活性”微针贴片可以持续方式透皮递送双药，并具备有效的抗黑色素生成和预防糖化引起皮肤衰老的作用，是改善皮肤综合状态的有潜力的平台，可为具有多重护肤功效的美容产品的开发提供参考。
相应地，本申请还提供了上述微针贴片的制备方法，例如可包括以下步骤：将微针与基底的原料混合，随后干燥。
可参考地，制备微针的二氢杨梅素溶液与基底的原料的体积比可以为1:80-120，如1:80、1:90、1:100、1:110或1:120等，也可以为1:80-120范围内的其它任意值。优选的，制备微针的二氢杨梅素溶液与基底的原料的体积比为1:100。
聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物的溶液浓度可以为45-55wt％，如45wt％、50wt％或55wt％等，也可以为45-55wt％范围内的其它任意值。优选的，聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物的溶液浓度为50wt％。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
美白活性成分的筛选
1.1中药多酚活性成分的体外抗氧化能力评价
中药多酚活性的抗氧化能力通过DPPH自由基清除率来评价，具体实验步骤如下：吸取100μL不同浓度的二氢杨梅素(DMY)、白藜芦醇(RES)、姜黄素(CUR)溶液和100μL的DPPH乙醇溶液(40μg/mL)至96孔板中，同时设立阴性对照组(100μL DPPH溶液中加入100μL乙醇)和空白对照组(等量乙醇代替DPPH溶液)。在37℃下孵育30分钟使之反应完全，利用酶标仪在517nm处测量混合物的吸光度。
DPPH清除率计算公式为：
DPPH清除率＝[阴性对照组吸光度-(测试样品吸光度-空白组吸光度)]/阴性对照组吸光度×100％。
DPPH自由基清除率被广泛地应用于化合物抗氧化活性的评价中。中药多酚活性成分在不同浓度下的DPPH自由基清除率如图1所示。结果表明，相同浓度下(1,5,10,25,50,100μM)，三种中药多酚成分的DPPH自由基清除率顺序依次为：二氢杨梅素＞姜黄素＞白藜芦醇，表明二氢杨梅素在给定浓度中具有最强的体外抗氧化能力。
1.2中药多酚活性成分的体外酪氨酸酶抑制活性评价
采用修改自文献1(Liu,Q.；Kim,C.；Jo,Y.H.；Kim,S.B.；Hwang,B.Y.；Lee,M.K.Synthesis and Biological Evaluation of Resveratrol Derivatives asMelanogenesis Inhibitors.Molecules.2015,20,16933-16945.)的酪氨酸酶活性测定方法来评估中药多酚美白活性成分的美白效果。简而言之，将蘑菇来源的酪氨酸酶溶解于PBS(pH 6.5,25U/mL)，在96孔板中加入40μL酪氨酸酶溶液，10μL梯度待测化合物(终浓度分别为1,5,10,25,50,100μM)。混合物在37℃下孵育20分钟，然后加入50μL底物酪氨酸溶液(1mM)，酶反应在37℃下进行30分钟。使用酶标仪测量490nm处的吸光度值来监测反应混合物中的多巴色素的产生量。相对酪氨酸酶活性的计算公式为：
相对酪氨酸酶活性＝(OD1-OD2)/(OD3)×100％；
其中，OD1为加入待测化合物、酪氨酸酶和酪氨酸的溶液的吸光度；OD2为仅含待测化合物的吸光度；OD3为含有酪氨酸酶和底物溶液的吸光度。
三种中药多酚活性成分的相对酪氨酸酶活性如图2所示，结果表明对酪氨酸酶的抑制能力顺序依次为：二氢杨梅素＞姜黄素＞白藜芦醇。
1.3中药多酚活性成分的细胞毒性
中药多酚活性成分的体外细胞毒性通过MTT进行评估。将HaCaT和B16F10细胞分别以1×104/孔种植于96孔板中，培养过夜。细胞分别用DMY、RES、CUR以20,40,60,80和100μM的浓度处理24小时。24小时后，去除样品，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，同时加入新鲜培养基，避光孵育4小时。之后吸出培养基，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，利用酶标仪检测溶液在570nm处的吸光度值，根据公式细胞活力(％)＝A样品组/A对照组×100％，计算每组细胞相应得到存活率，其中A样品组和A对照组分别为样品处理组细胞和未经样品处理组细胞的吸光度值。
三种中药多酚活性成分对HaCaT细胞(A)和B16F10细胞(B)的细胞毒性如图3所示，结果表明二氢杨梅素的细胞毒性最弱。
1.4中药多酚活性成分的胞内酪氨酸酶活性抑制
将B16F10细胞在12孔板中以1×105细胞/孔的密度种板后培养24小时。将细胞分别用DMY、RES、CUR以5，10和20μM处理48小时。收集细胞，将细胞溶解于PBS(pH 6.5)，其中含有1％Triton X-100和0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。样品在-80℃下孵育30分钟以冻融裂解的细胞，然后在室温下放置20分钟。所得样品以12000×g离心30分钟。取上清液，然后加入1mM酪氨酸，并将裂解物在37℃下孵育30分钟，然后使用酶标仪在490nm处测量吸光度。
三种中药多酚活性成分对B16F10细胞黑色素生成的抑制能力如图4所示，其中A为二氢杨梅素，B为白藜芦醇，和C为姜黄素，结果表明浓度在20μM下对胞内酪氨酸酶活性的抑制作用顺序依次为姜黄素＞二氢杨梅素＞白藜芦醇。
1.5中药多酚活性成分对B16F10细胞的黑色素生成抑制
将B16F10细胞在12孔板中以1×105细胞/孔的密度种板后培养24小时。将细胞分别用DMY、RES、CUR以5,10和20μM处理48小时。消化并收集细胞，将细胞沉淀溶解在含有1％DMSO的1M NaOH溶液中，在80℃下保持1小时。将细胞裂解物转移到96孔板中，黑色素含量通过使用酶标仪在490nm处测量吸光度来确定。
三种中药多酚活性成分对B16F10细胞酪氨酸酶的活性抑制能力如图5所示，其中A为二氢杨梅素，B为白藜芦醇，和C为姜黄素，结果表明浓度在20μM下对黑色素生成的抑制作用顺序依次为姜黄素＞二氢杨梅素＞白藜芦醇。
1.6热图分析确定中药美白活性成分
为了筛选出最佳的中药美白活性成分，根据抗氧化活性、蘑菇来源酪氨酸酶抑制活性、胞内酪氨酸酶活性抑制、黑色素生成抑制以及对人永生化角质形成细胞的细胞毒性等指标在热图中进行归一化和定量比较。
三种中药多酚活性成分的美白相关性质的热图分析评价如图6所示，二氢杨梅素在抗氧化活性、蘑菇来源酪氨酸酶抑制活性、胞内酪氨酸酶抑制活性，黑色素生成抑制以及对人永生化角质形成细胞的细胞毒性等方面表现出令人满意的美白和安全性质，因此被选为模型美白活性成分。
实施例2
抗糖化中药活性成分的筛选
2.1抗糖化中药活性成分对晚期糖基化终产物的抑制作用
采用修改自文献2(Li,D.；Mitsuhashi,S.；Ubukata,M.Protective effects ofhesperidin derivatives and their stereoisomers against advanced glycationend-products formation.Pharmaceutical biology.2012,50,1531-1535.)的体外美拉德反应抑制实验来评估中药多酚美白活性成分的抗糖化效果。BSA-葡萄糖反应体系用于模拟体外蛋白非酶糖基化过程中荧光性高级糖化终末产物(AGEs)。简而言之，制备200μL反应混合物，其中含有0.8mg/mL BSA、100mM葡萄糖，并使反应混合物在60℃下进行反应24小时。使用荧光酶标仪测量基于AGEs形成的荧光强度(ex.360nm，em.465nm)，中药活性成分的抑制活性由下式计算：
糖化抑制率(％)＝[1-(F1-F3)/(F2/F3)]×100％；
其中，F1为含有AGEs与中药活性成分的荧光强度，F2为不含抑制剂的AGEs的荧光强度，F3为BSA空白对照组的荧光强度。
三种中药抗衰成分对高级糖化终末产物的抑制作用如图7所示，其中，HES代表橙皮素，QUR代表槲皮素，GA代表没食子酸，结果表明对高级糖化终末产物的抑制能力顺序依次为：橙皮素>槲皮素>没食子酸。
2.2抗糖化中药活性成分的细胞毒性
参照1.3的实验步骤，通过MTT实验评估抗糖化中药活性成分的体外细胞毒性。
三种中药抗衰成分对HaCaT细胞的细胞毒性如图8所示，结果表明对HaCaT细胞的细胞毒性强弱顺序依次为：槲皮素>橙皮素>没食子酸。
实施例3
微针针尖基质壳聚糖的特性
3.1壳聚糖的细胞毒性和黑色素抑制效果
参照1.3的实验步骤，通过MTT实验评估壳聚糖的体外细胞毒性。参照1.5的实验步骤考察壳聚糖的黑色素抑制效果。
不同浓度的壳聚糖对B16F10细胞的黑色素生成抑制作用如图9所示，结果表明壳聚糖是具有美白活性的药用辅料。
3.2壳聚糖的凝胶形成特性
将质量分数为5％的壳聚糖溶液，在37℃下干燥48小时，模拟针尖液在模具中干燥形成凝胶微针的过程。壳聚糖在干燥脱水过程中的溶液-凝胶转变如图10所示，结果表明壳聚糖溶液可以在不添加任何交联剂的情况下可通过升温干燥凝胶化。
实施例4
微针贴片的制备及表征
本实施例中以二氢杨梅素和橙皮素作为活性药物，壳聚糖作为活性载体，聚乙烯醇与聚乙烯吡咯烷酮的共混物作为基底的微针贴片以DMY/HES@CS MNs表示。
4.1活性微针DMY/HES@CS MNs的制备
如图11所示，活性微针DMY/HES@CS MNs的制备包括以下步骤：
步骤1：PDMS微针模具的制备：基于光刻技术预先制备SU-8模具，然后将PDMS液体及其交联剂按10:1的比例进行充分混合并通过离心除去混合物中的气泡，将混合物浇铸到SU-8模具中，于高温烘箱60℃交联固化24小时后脱模，得到具有一组微米级针状结构凹槽的PDMS固体模具。
步骤2：双载中药活性成分的壳聚糖微针的制备：通过超声处理将壳聚糖粉末预溶于2％醋酸溶液中，得到5％壳聚糖预凝胶。将10mg/ml的二氢杨梅素和橙皮素乙醇溶液各吸取10μL加入到180μL壳聚糖预凝胶中，超声2小时使混合溶液均匀溶解。将混合溶液浇注至微针模具，以3000rpm的转速离心30分钟使混合液充分浇铸到模具针尖部分中，去除针尖腔室外的过量凝胶溶液，37℃干燥24小时后，加入1ml PVA/PVP溶液(50wt％)后继续干燥24小时，脱模得到活性微针DMY/HES@CS MNs。
4.2活性微针DMY/HES@CS MNs的形貌表征
微针形貌通过数码相机、光学显微镜，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜和扫描电子显微镜(SEM)进行表征。如图12所示，A是活性微针DMY/HES@CS MNs的数码图片，B是显微镜明场，C是荧光图像，D是三维重构共聚焦图像，E是不同尺度下的SEM图像。
4.3活性微针DMY/HES@CS MNs的机械强度
使用万能试验机进行机械压缩试验，将微针阵列放置在不锈钢基板的平坦刚性表面上。轴向力由移动传感器的支架施加，垂直于微针阵列的轴，以10毫米/分钟的恒定速度施加。从微针阵列尖端到支架的初始距离设置为1cm。当移动传感器接触微针阵列的最高点时测量力。测试机随后记录了移动支架所需的力作为微针位移的函数。
活性微针DMY/HES@CS MNs的应力和位移距离关系图如图13所示，结果表明DMY/HES@CS MNs的临界断裂力为7.82N，具备足够的机械强度以插入皮肤。
4.4活性微针DMY/HES@CS MNs的药物缓释作用
将含有0.5mg DMY和HES的DMY/HES@CS MNs置于具有2kDa MWCO的透析管中，并用40mL含有0.5％Tween 80的PBS(pH 7.4)透析，在32oC恒温培养箱中以100rpm的转速振荡，在预定的时间间隔内，对1mL透析介质进行取样并替换为1mL预热的新鲜介质。样品经0.22μm膜过滤后通过HPLC测量释放的DMY和HES,以确定药物释放曲线。DMY和HES由Waters e2695HPLC测定，使用反相C18柱(250×4.6mm，5μm)。对于DMY，流动相为乙腈-水(20：80，v/v)，流动相用冰醋酸调节pH至4，检测波长为290nm。对于HES，流动相为甲醇-水(65：35，v/v)，检测波长为288nm。
活性微针DMY/HES@CS MNs的药物缓释作用如图14所示，DMY/HES@CS MNs持续缓慢释放二氢杨梅素和橙皮素至少8天以上，8天累积释放量分别高达77.14±3.99％和78.44±3.47％。
4.5活性微针DMY/HES@CS MNs的透皮实验
将罗丹明B替代模型药物制备荧光标记的壳聚糖微针。荧光标记微针施打在猪皮上15分钟，然后撤去背衬，并在荧光显微镜下捕获猪皮的荧光信号。
荧光标记壳聚糖微针的透皮实验结果如图15所示，结果表明荧光标记微针可以有效渗透到皮下空间。
4.6活性微针DMY/HES@CS MNs对胞内黑色素的联合抑制效果
参照1.5的实验步骤，评估DMY/HES@CS MNs对B16F10细胞胞内黑色素生成的联合抑制效果。
活性微针对胞内黑色素的联合抑制效果如图16所示，结果表明二氢杨梅素和壳聚糖的联合处理使黑色素生成量下降至36.85±3.77％，显著提高了单一治疗组分的抑制作用(p＜0.05)。
4.7活性微针DMY/HES@CS MNs的体外抗糖化作用
参照2.1的实验步骤考察活性微针DMY/HES@CS MNs的体外抗糖化作用。
活性微针对高级糖基化终末产物生成的抑制作用效果如图17所示，结果表明壳聚糖和二氢杨梅素的参与不会影响橙皮素的抗糖化作用。
综上所述，本申请提供的基于天然产物的用于美白抗衰的全活性智能微针贴片至少具有以下优势：
(1)微针增强了药物的透皮递送，无痛微创，增加了患者的顺应性；并且给药量相对稳定可控，生物利用度高。
(2)活性载体与活性药物均来源于天然产物，相比人工合成化合物，具有更好的生物相容性和低的长期毒性；
(3)壳聚糖微针可作为储库，在插入位点通过壳聚糖的溶胀和逐渐降解实现的药物的缓慢与长期释放；
(4)壳聚糖与二氢杨梅素介导的联合黑色素生成抑制与橙皮素介导的抗糖化，有效应对内源和外源性皮肤刺激，实现更加完备的皮肤护理；
(5)本申请的基于天然产物的“全活性”微针已被证明以持续方式透皮递送双药，并具备有效的抗黑色素生成和预防糖化引起皮肤衰老的作用，是改善皮肤综合状态的有潜力的平台，可为具有多重护肤功效的美容产品的开发提供参考。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种微针，其特征在于，所述微针的制备方法如下：
步骤1、PDMS微针模具的制备：
基于光刻技术预先制备SU-8模具，然后将PDMS液体及其交联剂按10:1的比例进行充分混合并通过离心除去混合物中的气泡，将混合物浇铸到SU-8模具中，于高温烘箱60℃交联固化24小时后脱模，得到具有一组微米级针状结构凹槽的PDMS固体模具；
步骤2、双载中药活性成分的壳聚糖微针的制备：
通过超声处理将壳聚糖粉末预溶于2％醋酸溶液中，得到5％壳聚糖预凝胶；将10mg/ml的二氢杨梅素和橙皮素乙醇溶液各吸取10μL加入到180μL壳聚糖预凝胶中，超声2小时使混合溶液均匀溶解；将混合溶液浇注至微针模具，以3000rpm的转速离心30分钟使混合液充分浇铸到模具针尖部分中，去除针尖腔室外的过量凝胶溶液，37℃干燥24小时后，加入1ml浓度为50wt％的PVA/PVP溶液后继续干燥24小时，脱模得到活性微针。
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