KR102636652B1 - 경피 약물 전달을 위한 펙틴 나노젤 및 이의 제조방법 - Google Patents

경피 약물 전달을 위한 펙틴 나노젤 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

경피 약물 전달을 위한 펙틴 나노젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 펙틴 나노젤은 펙틴을 개질하여 나노젤 형태로 제조한 것으로, 피부 투과 성능이 뛰어나 경피 약물 전달 용도로 사용할 수 있다. 상기 펙틴 나노젤은 제조방법이 매우 간단하면서도 광가교 방식을 통해 수 분 내로 빠르게 제조될 수 있고, 여러 종류의 약물이나 항원을 담지할 수 있으며, 약물 방출 거동이 용이해 의료기기, 화장품 및 의약품 분야에서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

경피 약물 전달을 위한 펙틴 나노젤 및 이의 제조방법{Pectin nanogel for transdermal delivery and preparation method thereof}
경피 약물 전달을 위한 펙틴 나노젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
약물 전달 기술의 종류 중 경피 약물 전달은 편리하면서도 환자에게 고통을 거의 가하지 않고, 경구투약이나 정맥주사와 같은 방법과는 달리 위장관 및 간, 신장, 비장의 약물 효능 저하 기작을 피할 수 있어 효능이 높다. 그러나, 피부의 각질층(stratum corneum)으로 인해 약물 전달 효과가 극히 제한적이다.
이에, 각질층 투과 효율을 높이기 위해 지질이나 소수성 고분자를 이용한 리포솜, 마이셀, 고형 입자가 주종을 이루는 다양한 전달체가 개발되었다. 그러나, 이들 전달체에 담지할 수 있는 약물은 일반적으로 저분자의 소수성 약물인 경우가 많으며, 리포좀의 한계를 극복하기 위해 개발된 수용성 코어 주변을 활성화제와 인지질 이중층이 둘러싼 구조의 트랜스퍼로솜(transferosome) 또한, 수용성 약물 위주로만 담지할 수 있다는 한계점을 갖는다. 뿐만 아니라, 종래 경피 투과용 약물 전달체는 약물 담지 효율과 방출 거동이 좋지 않다는 한계점이 존재하였다. 최근 히알루론산 또는 이를 이용하여 제조된 나노입자 또는 나노젤이 단백질 약물이나 항원을 진피층까지 전달할 수 있음이 보고된 바 있으나, 히알루론산을 이용한 나노젤 제조 공정은 그 과정이 복잡하고 특정 세포로의 전달 효율이 떨어지는 문제가 있다. 이에, 종래 경피 약물 전달체의 한계점을 극복하는 새로운 경피 약물 전달체의 개발이 요구되는 실정이다.
한편, 펙틴(Pectin)은 고등 식물의 세포벽에 존재하는 복잡한 구조의 다당류로서 식품산업에서 젤화제(gelling agent) 및 증점제(thickening agent)로 오랫동안 사용되어온 천연 고분자이다. 아직까지 펙틴의 피부 투과 가능성 또는 펙틴을 소재로 활용한 경피 약물 전달체에 대하여는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 펙틴을 화학적으로 개질한 후 약물을 담지시켜 광가교 및 초음파 공정의 상대적으로 간단한 방법으로 펙틴 나노젤을 제조하였으며, 상기 펙틴 나노젤은 세포 독성이 적고, 피부 투과능이 뛰어나며, 다양한 약물의 담지가 가능해 경피 전달 용도로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 광가교결합 가능한 작용기가 도입되어 개질된 펙틴을 포함하는 펙틴 나노젤을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 펙틴 나노젤을 포함하는 경피 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 펙틴에 광가교결합 가능한 작용기를 도입하는 단계를 포함하는 펙틴 나노젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 광가교결합 가능한 작용기가 도입되어 개질된 펙틴을 포함하는 펙틴 나노젤을 제공한다.
상기 펙틴은 카르복시기 말단에 광가교결합(photo-crosslinking) 가능한 작용기 또는 관능기가 도입된 것일 수 있다.
상기 광가교결합 가능한 작용기 또는 관능기는 이에 제한되는 것은 아니나, 노보닌(norbornene)일 수 있다.
상기 나노젤은 광가교결합 가능한 작용기를 통해 약물 또는 생리활성물질을 젤 내부에 고정시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 약물 또는 생리활성물질은 바람직하게는 티올기(-SH)가 도입된 것일 수 있고, 상기 티올기를 통해 펙틴의 광가교결합 가능한 작용기와 공유결합을 형성하여 젤 내부에 고정될 수 있다.
일 실시예에서는, 노보닌기를 도입하여 개질시킨 펙틴 및 티올기를 도입한 약물 또는 생리활성물질을 가교제 및 광개시제와 혼합하여 전구 용액을 제조한 뒤, 자외선을 조사하여 티올-노보닌 광클릭(thiol-norbornene photo-click) 반응에 따라 약물 또는 생리활성물질이 담지된 펙틴-노보닌 하이드로젤을 제조하였다.
본 명세서에서, 용어 "약물"은 생리활성을 가지며 치료용으로 사용될 수 있는 유기 또는 무기 화합물이나 물질을 의미한다. 상기 약물에는 임의의 희석제, 방출 지연제, 결합제 등의 당 기술분야에서 사용되는 다양한 부형제가 선택적으로 혼합될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "생리활성물질"은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질을 의미하고, 특정 물질이나 분류에 제한되지 않으며, 투여된 후 투여된 대상에게 물리적으로, 생리적으로, 정신적으로, 생화학적으로, 생물학적으로 또는 다른 신체 기능에 양성적 또는 음성적인 방식으로 영향을 줄 수 있는 것이면 어떠한 약제라도 포함하는 넓은 의미로서 사용된다. 용어 "약물"도 상기 생리활성물질에 포함될 수 있다.
상기 약물은 소수성 약물, 친수성 약물 및 단백질 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어 항균제, 항생제, 항염증제, 항암제, 진통제, 항바이러스제, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생리활성물질은 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 항원, 항균제, 항생제, 항염증제, 항암제, 진통제, 항바이러스제, 당류, 지질, 탄수화물, 스테로이드 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 약물 또는 생리활성물질은 소수성 약물, 친수성 약물, 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 항원, 항균제, 항생제, 항염증제, 항암제, 당류, 지질 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 항체, 항체 단편, 항원, 세포표면항원, 성장인자, 전사조절인자, 신호전달 단백질, 구조 단백질 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약물 또는 생리활성물질은 티올기가 도입된 것을 특징으로 한다.
일 실시예에 따르면, 상기 약물 또는 생리활성물질은 간단한 티올화를 통해 펙틴과 공유결합을 형성하여 안정적으로 나노젤 내에 고정될 수 있고, 젤의 가교 밀도나 약물 또는 생리활성물질의 담지 정도를 조절하여 나노젤 내 고정되는 양 및 방출 거동을 보다 정밀하게 제어할 수 있다.
상기 나노젤은 평균 직경이 10 내지 1000 nm일 수 있고, 예를 들어 50 내지 450 nm, 100 내지 400 nm, 150 내지 350 nm, 200 내지 300 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
피부 각질세포 사이에 존재하는 인지질층을 효과적으로 통과하기 위해서는 일반적으로 500 nm의 지름을 갖는 입자, 특히 300 nm 이하의 지름을 갖는 입자가 효율적인 것으로 알려져 있으므로, 일 양상에 따른 펙틴 나노젤은 각질층 투과 효율이 현저히 우수하여 경피 전달 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 펙틴 나노젤을 포함하는 경피 전달용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에서는, 상기 펙틴 나노젤은 피부에 처리 시 모든 농도에서 우수한 피부 투과도를 나타내어 경피 전달 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 경피 전달용 조성물은 젤의 가교 밀도나 약물 또는 생리활성물질의 담지 정도를 조절하여 나노젤 내 고정되는 양 및 방출 거동을 보다 정밀하게 제어할 수 있어, 목적에 따라서 약물 또는 생리활성물질의 전달 속도 등이 조절될 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 조성물 또는 의약외품 조성물일 수 있다.
상기 조성물이 약학적 조성물인 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결보호제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 개별적인 투약의 최적량 및 투약 간격은 치료되고 있는 병의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 그리고 치료되고 있는 특정 환자의 나이와 건강상태에 의해 결정될 것이고, 의사가 궁극적으로 사용될 적절한 투약을 결정할 것이라는 것은 당업자가 알 수 있다. 이러한 투약은 적절할 정도로 자주 반복될 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 진료에 따라서 투여량 및 빈도를 변경하거나 또는 감소시킬 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 출원의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 조성물은 약물 또는 생리활성물질을 표적 부위로 이동시킬 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 립밤, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하게 선택할 수 있다. 예컨대, 상기 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
상기 조성물이 의약외품 조성물인 경우, 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 펙틴에 광가교결합 가능한 작용기를 도입하는 단계를 포함하는 펙틴 나노젤을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 펙틴에 광가교결합 가능한 작용기를 도입하는 단계 이후에,
상기 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴을 약물 또는 생리활성물질과함께 가교제 및 광개시제와 혼합하여 전구 용액을 제조하는 단계;
상기 전구 용액에 자외선을 조사하여 펙틴 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
상기 펙틴 하이드로젤을 초음파 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것일 수 있다.
상기 가교제로는 이에 제한되지는 않으나, 디티오트레이톨(1,4-Dithiothreitol, DTT) 또는 디티올펩타이드(dithiol-peptide)를 사용할 수 있다.
상기 광개시제로는 이에 제한되지는 않으나, 리튬 아릴포스피네이트(lithium arylphosphinate, LAP), Irgacure 2959, VA-086, 에오신 Y(eosin Y) 또는 리보플라민을 사용할 수 있다.
상기 전구 용액을 제조하는 단계에서 개질된 펙틴 : 약물 또는 생리활성물질 : 가교제 및 광개시제의 중량비(또는 몰비)는 적절한 범위에서 혼합될 수 있다.
상기 방법은 상기 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴을 용매 대비 0.3~20중량% 첨가할 수 있다.
상기 약물 또는 생리활성물질의 함량은 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴 중량의 5~30%일 수 있다.
상기 자외선 조사 시간은 10초 내지 15분일 수 있다. 예를 들어, 자외선 조사 시간은 10초 내지 15분, 30초 내지 10분, 1분 내지 5분, 1분 내지 3분, 1분 20초 내지 2분 40초, 1분 30초 내지 2분 30초, 1분 40초 내지 2분 20초, 1분 45초 내지 2분 15초, 1분 50초 내지 2분 10초, 1분 55초 내지 2분 5초일 수 있으며, 바람직하게는 2분일 수 있다.
상기 자외선의 파장은 300 nm 내지 500 nm일 수 있다.
또한, 상기 초음파 처리 시간은 30초 내지 5분일 수 있다. 예를 들어, 초음파 처리 시간은 30초 내지 5분, 1분 내지 3분, 1분 20초 내지 2분 40초, 1분 30초 내지 2분 30초, 1분 40초 내지 2분 20초, 1분 45초 내지 2분 15초, 1분 50초 내지 2분 10초, 1분 55초 내지 2분 5초일 수 있으며, 바람직하게는 2분일 수 있다.
상기 초음파의 출력은 10 W 내지 120 W일 수 있으며, 예를 들어 10 W 내지 120 W, 10 W 내지 100 W, 15 W 내지 50 W, 20 W 내지 30 W일 수 있고, 바람직하게는 20 W, 21 W, 22 W, 23 W, 24 W, 25 W, 26 W, 27 W, 28 W, 29 W 또는 30 W일 수 있다.
상기 초음파의 주파수는 10 kHz 내지 40 kHz일 수 있다.
일 실시예에서는, 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴(Pec-NB)과 티올기가 도입된 약물(OVA-SH)을 가교제 및 광개시제가 포함된 PBS에 용해하여 전구 용액을 제조하고, 상기 전구 용액을 강하게 볼텍싱(vortexing)하면서 자외선(365 nm, 10 mW/cm2)을 2분간 조사하여 펙틴-노보닌 하이드로젤을 제조한 뒤, 상기 젤을 PBS에 분산시키고 26 W 출력에서 2분간 초음파 처리하여 펙틴-노보닌 나노젤을 제조하였다.
또한, 일 실시예에서는, 상기 제조방법으로 제조된 펙틴 나노젤이 약 200 내지 300 nm의 평균 직경을 가짐을 확인하였다. 즉, 상기 제조방법을 사용하면 피부에 잘 투과된다고 알려진 200 내지 300 nm의 크기 분포를 갖는 펙틴 나노젤을 안정적으로 얻을 수 있다.
나아가, 상기 방법은 펙틴에 광가교결합 가능한 작용기를 도입하는 단계;
상기 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴을 약물 또는 생리활성물질과함께 가교제 및 광개시제와 혼합하여 전구 용액을 제조하는 단계;
상기 전구 용액에 자외선을 조사하여 펙틴 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
상기 펙틴 하이드로젤을 초음파 처리하는 단계 이후에,
초음파 처리 후 젤을 분리하여 여과하는 단계를 추가로 수행하는 것일 수 있다.
상기 여과(filtration)는 당업계에 알려져 있는 여과 방법이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 실시예에서는, 초음파 처리 이후 별도의 여과 과정을 거치는 경우 나노젤의 크기를 보다 정밀하게 제어할 수 있어 목적과 필요에 맞는 나노젤을 제조할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 제조방법을 사용하면, 볼텍싱 및 자외선 조사만으로 편리하고 빠르게 펙틴 나노젤을 만들 수 있고, 볼텍싱 조건 및/또는 초음파 조사의 유무에 따라 마이크로젤 또는 나노젤을 목적에 맞게 제조하는 것이 가능하다. 또한, 상기 제조방법은 광가교법을 사용함에 따라 광조사 조건(파장, 강도, 시간)에 따라 가교도를 정밀하게 조절할 수 있어 하이드로젤 및 나노젤의 물성 조절에 유리하고, 다른 화학적 가교방법에 비해 독성 물질의 사용이 적어, 제조된 나노젤은 세포독성 없이 안전하게 생체 소재로 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 펙틴 나노젤은 펙틴을 개질하여 나노젤 형태로 제조한 것으로, 피부 투과 성능이 뛰어나 경피 약물 전달 용도로 사용할 수 있다. 상기 펙틴 나노젤은 제조방법이 매우 간단하면서도 광가교 방식을 통해 수 분 내로 빠르게 제조될 수 있고, 여러 종류의 약물이나 항원을 담지할 수 있으며, 약물 방출 거동이 용이해 의료기기, 화장품 및 의약품 분야에서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 노보닌으로 개질된 펙틴-노보닌(Pec-NB) 및 오브알부민(Ovalbumin, OVA)을 내부에 담지한 펙틴 나노젤의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 노보닌기 도입을 통한 펙틴 개질 전후의 1H NMR 분광분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 노보닌기 도입을 통한 펙틴 개질 전후의 FT-IR 분광분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 가교제 농도 및 펙틴-노보닌 하이드로젤의 농도에 따른 펙틴-노보닌 하이드로젤의 전단저장탄성률 값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5은 펙틴-노보닌 하이드로젤의 농도에 따른 팽윤도 및 젤 분율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 티올-오브알부민의 펙틴-노보닌 하이드로젤 담지 효율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 펙틴-노보닌 하이드로젤의 농도에 따른 하이드로젤의 가교 밀도(crosslinking density)와 티올-오브알부민(OVA-SH)의 내부 담지량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 펙틴-노보닌 나노젤의 동적 광산란(DLS) 및 나노입자 추적 분석(NTA) 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 펙틴-노보닌 나노젤의 초저온 투과전자현미경(Cryo-TEM) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 펙틴-노보닌 나노젤의 농도에 따른 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 펙틴-노보닌 나노젤의 농도에 따른 피부 투과 실험 결과를 나타낸 도이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 실시예 및 도면에 기재된 구성은 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하의 실시예에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
이하의 실시예에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
실시예 1. Pec-NB의 제조
광가교가 가능한 노보닌(norbornene) 관능기를 펙틴의 카르복시기에 도입하여 펙틴에 노보닌기를 고정시켰다. 구체적으로, 펙틴을 16 mg/mL 농도로 MES 버퍼에 용해시킨 후 pH를 6으로 유지하였다. 100 mL의 펙틴 용액에 1.376 g의 에틸카보다이미드 하이드로클로라이드(Ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)를 1시간 동안 처리하였다. 이후 2.208 g의 노보닌 메틸아민(5-Norbornene-2-methylamine)을 펙틴 용액에 처리한 뒤 18시간 동안 반응시켰다. 에틸카보다이미드 하이드로클로라이드와 노보닌 메틸아민의 경우 펙틴의 갈락투론산(Galacturonic acid) 기준으로 각각 1당량, 2당량을 계산하여 사용하였다. 해당 조건으로 합성한 펙틴-노보닌을 Pec-NB 2X로 명명하였다. 마찬가지로 에틸카보다이미드 하이드로클로라이드와 노보닌 메틸아민을 펙틴의 갈락투론산 기준으로 각각 0.5당량, 1당량 계산하여 합성한 것을 Pec-NB 1X, 2당량, 4당량 계산하여 합성한 것을 각각 Pec-NB 2X, Pec-NB 4X로 명명하였다. 반응이 끝난 용액은 셀룰로오스 아세테이트 투석막(MWCO 12,000-14,000 Da)에 담아 흐르는 증류수에서 3일간 투석한 후 동결건조시켜 노보닌으로 개질된 펙틴(Pec-NB)을 수득하였다.
실시예 2. 모델 약물의 준비
모델 약물로 오브알부민(ovalbumin)을 사용하였다. 오브알부민의 하이드로젤 내부 고정을 위해, 먼저 반응 버퍼인 인산염 완충 식염수(PBS)에 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)를 2mM 넣고 pH를 8로 맞추어 준비하였다(①). 상기 ①의 버퍼에 오브알부민을 10 mg/mL 농도로 녹여 준비하였다(②). 2-이미노사이올란(2-Iminothiolane)을 따로 ①의 버퍼에 2 mg/mL의 농도로 녹인 후, ②의 오브알부민 용액에 33.43 uL로 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 셀룰로오스 아세테이트 투석막(MWCO 12,000 내지14,000)에 담아 흐르는 증류수에서 3일간 투석한 후 동결건조하여 티올기가 도입된 오브알부민(OVA-SH)을 수득하였다.
이후 피부 투과 실험에서의 투과 정도를 알아보기 위해 형광 물질인 로다민(Rhodamine B-isothiocyanate)을 오브알부민에 표지하였다. 구체적으로, 0.5 M의 소듐카보네이트(Sodium Carbonate) 버퍼에 10 mg/mL의 농도로 오브알부민을 용해시켰다. DMSO에 로다민을 25 mg/mL의 농도로 용해시켜 준비하고, 상기 ②의 오브알부민 용액에 10 mg/mL 농도가 되도록 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 셀룰로오스 아세테이트 투석막(MWCO 12,000-14,000 Da)에 담아 흐르는 증류수에서 3일간 투석한 후 동결건조시켜 형광 물질이 추가로 도입된 티올-오브알부민(OVA-SH-RhoB)을 수득하였다.
실시예 3. 펙틴-노보닌 하이드로젤의 제조
실시예 1에서 제조한 노보닌이 도입된 펙틴(Pec-NB 2X)과 실시예 2에서 제조한 티올기가 도입된 모델 약물(OVA-SH)을, 가교제인 디티오트레이톨(1,4-Dithiothreitol, DTT) 및 광개시제인 리튬 아릴포스피네이트(lithium arylphosphinate, LAP)가 포함된 pH7.4 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 전구 용액을 제조하였다. 이때 Pec-NB 2X의 농도는 0.5%, 1%, 2%로 각각 다르게 조절하였고 각 용액의 노보닌기 0.5 당량에 해당하는 농도의 DTT를 투입하였다. 광개시제의 농도는 1 mM로 고정하였다. 상기 전구 용액에 자외선(365 nm, 10 mW/cm2)을 2분간 조사하여 펙틴-노보닌 하이드로젤을 제조하고, pH 7.4의 PBS에 하루간 팽윤하였다.
실시예 4. 펙틴-노보닌 하이드로젤의 물성 평가
4-1. 펙틴-노보닌 유도체의 1 H NMR 및 FT-IR 분광분석
실시예 3에서 제조한 펙틴-노보닌 광가교 하이드로젤을 1H NMR 분광기(Bruker avance 500 MHz) 및 FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy)로 분석하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 6.0-6.3 ppm의 피크 f 영역이 노보닌으로 개질 후 증가하였으며, 이는 펙틴에 대한 노보닌의 성공적인 도입을 나타낸다. 상기 결과를 통해, 개질하지 않은 펙틴에 비해 Pec-NB 1X, 2X, 4X 모두 노보닌이 잘 도입된 것을 알 수 있었다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 펙틴에 고정된 노보닌은 FT-IR 스펙트럼을 통해서도 명확하게 확인되었다. 노보닌 도입에 의해 약 1740 cm-1의 에스터기를 나타내는 피크가 감소하고 1610 cm-1, 1408 cm-1의 카복시기를 나타내는 피크는 증가하였다. Pec-NB 합성에 이용한 노보닌 메틸아민의 양이 많을수록 에스터기 대비 카복시기를 나타내는 피크의 비율이 증가하므로, 필요에 따라 노보닌 도입 비율을 조절할 수 있다.
4-2. 전단 저장탄성율, 팽윤도 및 젤 분율
실시예 3에서 제조한 펙틴-노보닌 광가교 하이드로젤을 생검 펀치를 이용해 직경 8mm의 원형으로 잘라 기계적 특성을 평가하였다. 먼저, 레오미터(HAAKE MARS Ⅲ, Thermo scientific)를 이용해 진동 모드(oscillatory mode)에서 변형률 0.1 내지 5%, 진동수 1 Hz 조건에서 전단 저장탄성율(storage modulus G')을 측정하였다. 이 때 직경 8 mm의 평행한 지오메트리를 이용하였고, 수직항력은 0.2-0.3 N로 설정하였으며 시료의 평균전단저장탄성률 값은 선형 점탄성 구간(Linear viscoelastic region, LVR)으로부터 도출하였다.
다음으로, 상기 펙틴-노보닌 광가교 하이드로젤의 팽윤도와 젤 분율(Gel fraction)을 측정하였다. 구체적으로, 하이드로젤의 습윤 중량(Wswollen)을 측정한 뒤, 다시 증류수에서 24시간 침지시켜 미반응 물질과 PBS의 염을 제거하였다. 그런 다음, 가교 반응에 참여한 부분의 건조 중량을 얻기 위해 하이드로젤을 충분히 진공 건조한 뒤 하이드로젤의 무게(Wdry)를 측정하였다. 측정한 습윤 중량(Wswollen) 및 건조 중량(Wdry)을 이용하여 무게 팽윤도(mass swelling ratio)를, 건조 중량 및 이론상의 젤의 중량(W0)을 이용하여 젤분율을 계산하였다. 팽윤도 및 젤분율 계산에 사용한 수식을 하기에 나타내었고, 측정 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.
Figure 112021039875728-pat00001
[식 2]
Figure 112021039875728-pat00002
도 4에 나타낸 바와 같이, 가교제(DTT)를 2.5 내지 9 mM의 농도로 처리하면서 각 진동 전단 측정으로부터 얻은 저장 탄성율 거동을 분석한 결과, Pec-NB 1.0% 하이드로젤에 비해 Pec-NB 2.0% 하이드로젤의 평균 저장 탄성율이 증가하여 펙틴-노보닌의 농도가 증가할수록 젤 강도가 높아짐을 확인하였다. 각 하이드로젤은 가교제를 3.5 mM과 7.0 mM을 처리했을 때 가장 높은 물성을 나타내는 것으로 보아, 화학양론적 균형을 맞출 수 있는 티올-노보닌 광클릭 반응이 성공적으로 일어남을 알 수 있다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 젤 팽윤도는 펙틴-노보닌의 농도가 증가할수록 감소함을 확인하였다. 젤 분율은 펙틴-노보닌의 농도가 증가할수록 증가하였다. Pec-NB의 농도를 조절함으로써 하이드로젤의 네트워크 구조를 조절할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 펙틴-노보닌 하이드로젤의 약물 방출 거동 평가
실시예 3에서 제조한 펙틴-노보닌 광가교 하이드로젤의 약물 방출 거동을 평가하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
티올기를 도입한 오브알부민(OVA-SH)을 0.1 mM 도입하여 실시예 3에서와 같은 방식으로 Pec-NB 하이드로젤을 제조하였다. 이후 pH 7.4의 PBS에 침지하고, 시간에 따라 고정되지 않고 빠져나오는 오브알부민의 양을 도 6에 나타내었다. Pec-NB의 농도에 관계없이 약 50%의 오브알부민이 하이드로젤 내부에 고정되어 있음을 알 수 있다. 또한 실시예 4에서 측정한 하이드로젤의 전단 저장 탄성률(G') 및 가교 밀도(ν), 기체 상수(R), 온도(T) 등을 이용해 하이드로젤의 가교 밀도를 계산하였고, 사용한 수식을 하기에 나타내었으며 측정 결과는 도 6에 나타내었다.
Figure 112021039875728-pat00003
도 6에 나타낸 바와 같이, Pec-NB의 농도에 따라 확연히 다른 가교 밀도를 나타내는 하이드로젤을 제조할 수 있다. 또한 오브알부민의 양을 0.2 mM 내지 0.4 mM으로 늘려 실시예 3에서와 같은 방식으로 제조한 하이드로젤을 PBS에 침지하고, 24시간 후에 빠져나오지 않고 고정된 오브알부민의 양을 나타내었다. 오브알부민을 0.1 mM 도입한 조건에서는 모든 Pec-NB 하이드로젤의 방출량이 비슷하지만, 오브알부민의 양을 늘렸을 때에는 Pec-NB 하이드로젤의 방출량이 달라졌다. 오브알부민의 양이나 Pec-NB의 양을 조절함에 따라 다양한 가교 밀도와 네트워크 구조를 갖는 하이드로젤을 제조할 수 있으며, 이를 통해 내부에 담지한 약물의 방출 거동을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 펙틴 나노젤의 제조
실시예 1에서 제조한 노보닌이 도입된 펙틴(Pec-NB)과 실시예 2에서 제조한 티올기가 도입된 모델 약물(OVA-SH)을, DTT와 LAP이 포함된 PBS에 용해시켜 전구 용액을 제조하였다. 강하게 볼텍싱(vortexing)을 하면서 전구 용액에 자외선(365 nm, 10 mW/cm2)을 2분간 조사하여 펙틴-노보닌 하이드로젤을 제조하였다. 그런 다음, 상기 하이드로젤을 PBS에 분산시키고 팁 소니케이터(VCX-130)를 이용하여 20 kHz, 26 W 출력 조건에서 2분 동안 초음파 처리를 하였다. 이 때, 30초마다 처리를 중단하고 충분히 냉각시켜, 제조하는 나노젤에 열의 영향이 최대한 가지 않도록 유의하였다. 그런 다음, 원심분리(12,000 rpm, 10 분)를 통해 고형 젤만 분리하고, PBS에 재분산시킨 뒤 0.45 um 시린지 필터로 여과하여 펙틴-노보닌 나노젤을 수득하였다.
실시예 7. 펙틴-노보닌 나노젤의 물성 평가
7-1. 동적 광산란(DLS) 및 나노입자 추적 분석(NTA)
실시예 6에서 제조한 펙틴-노보닌 나노젤의 초음파 처리 및 여과 전후의 동적 광산란 분석(Dynamic Light Scattering, DLS) 및 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)을 수행하였다. 구체적으로, 수득한 나노젤을 약 1 mL의 pH 7.4 PBS에 골고루 분산시킨 후 나노 입도 측정용 큐벳(cuvette)에 넣고, 제타사이저(Zetasizer Nano ZS90)를 이용하여 Z-평균 크기 분석을 실시하였다. 또 수득한 나노젤을 20 배 희석하여 1 mL의 PBS에 분산시킨 나노젤을 시린지에 담고, 나노입자 추적 분석기(Nanosight LM10)에 주입한 후 크기 분포 및 농도 측정을 실시하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 동적 광산란 분석을 통해 나노젤의 나노입자 사이즈 분포를 분석한 결과, 볼텍싱 없이 전구용액에 자외선을 처리하여 마이크로젤(bulk gel)을 제조하는 경우 약 4000 nm의 크기를 갖는 반면, 초음파 처리를 통해 나노젤로 만드는 경우 200 내지 300 nm 사이의 크기를 가짐을 확인하였다. 추가적으로, 0.45 um 시린지 필터로 여과 시 200 nm 크기를 갖는 나노젤을 수득할 수 있음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 나노젤의 제조방법을 사용하면 별도의 처리 없이 간단한 방법으로 원하는 크기의 나노젤을 얻을 수 있으며, 초음파 처리 시간 및 출력을 조절하여 필요로 하는 크기의 마이크로젤 또는 나노젤을 얻을 수 있고, 여과과정을 추가하여 보다 정밀한 크기 제어도 가능함을 확인하였다.
또한, 도 8의 우측 패널에 나타낸 바와 같이, 나노입자 추적 분석 결과, 누적 분율 그래프에서 모든 Pec-NB 농도의 나노젤이 200 nm 크기대에서 가장 큰 기울기를 나타냈다. 즉 Pec-NB 나노젤은 약 200 nm에서 아주 좁은 크기 분포를 가지고 있으므로, 목표 크기 범위의 나노젤을 높은 수율로 얻을 수 있음을 알 수 있다.
7-2. 초저온 투과전자현미경(Cryo-TEM) 분석
실시예 6에서 제조한 펙틴-노보닐 나노젤을 초저온 투과전자현미경(Cryo-TEM)으로 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 구체적으로, 친수성 표면으로 만든 격자에 4 uL의 나노젤 분산 용액을 추가하고, 1.5 초간 100% 습도와 4℃ 온도에서 블로팅하였다. 이후 액체 에탄에서 동결하여 120 kV에서 초저온 전자현미경(Talos L120C0)으로 나노젤의 이미지를 얻었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, Pec-NB 나노젤이 약 200 nm의 크기를 가짐을 알 수 있다. 이는 앞서 분석한 동적 광산란 및 나노입자 추적 분석 결과로 추정한 입자의 크기와 일치하는 것으로, 분산된 상태의 팽윤 나노젤이 피부에 투과하기에 적합한 크기를 가지는 것을 나타낸다.
실시예 8. 펙틴-노보닌 나노젤의 세포 독성 평가
실시예 6에서 제조한 펙틴-노보닌 나노젤의 세포 독성을 평가하였다. 구체적으로, 웰(well) 당 20,000 개의 단핵구(THP-1)를 10%의 소혈청, 1%의 Anti-2, 0.05mM의 베타머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 함유하는 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium, RPMI)에 첨가하여 하루 동안 배양한 뒤, 4 x 108 particles/mL의 나노젤 분산 용액을 하루 동안 처리하여 분산 용액을 처리하지 않은 대조군 대비 상대적 세포 생존률을 트리판블루 배제 검정법(Trypan Blue exclusion test)를 통해 측정하였다. 이 때, 펙틴-노보닌 나노젤의 자체적인 세포독성을 평가하기 위해 분산 용액은 2배율씩 단계적으로 희석하여 64배까지 희석하였다. 같은 방법으로, 웰 당 25,000 개의 섬유아세포(NIH3T3)를 10%의 소혈청을 함유하는 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM)에 배양한 후, 같은 농도의 나노젤 분산 용액을 하루 동안 처리하여 대사 활성(metabolic activity)을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 일 양상에 따른 펙틴-노보닌 나노젤은 모든 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았다. 뿐만 아니라, 모든 농도의 펙틴-노보닌 나노젤처리군에서 섬유아세포 대사활성의 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 펙틴-노보닌 나노젤은 세포 독성이 없어 생체적합성 소재로 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9. 펙틴-노보닌 나노젤의 피부 투과능 확인
실시예 2에서 제조한 로다민이 표지된 티올-오브알부민(OVA-SH-RhoB)을 PBS에 용해시켰다. 실시예 6에서 제조한 펙틴-노보닌 형광 나노젤을 4 x 109 particles/mL의 농도로 PBS에 분산시키고 저온에서 보관하였다. -80℃에서 보관한 돼지 피부를 32℃에서 10분간 해동하고, 약 2 x 2 cm2의 크기로 잘라 PBS로 가볍게 세척하였다. 피부투과장치인 프란츠 디퓨전 셀(Franz diffusion cell)을 내부가 32℃로 유지되도록 연결하고, 수용칸(receptor chamber)에 PBS를 채웠다. 공여칸(Donor chamber)과 수용칸 사이에 자른 돼지 피부를 끼우고, 윗부분에 오브알부민 용액과 나노젤 분산액을 100 uL로 로딩시킨 뒤 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 돼지 피부 위에 남아있는 잔여물을 가볍게 닦아내고 PBS로 세척한 뒤, 4% 포름알데히드(Formaldehyde) 용액에 60분간 처리하여 고정시켰다. 그런 다음, PBS로 다시 세척한 뒤 젤리형 포매제(OCT compound)에 침지시켜 -80℃에서 동결시켰다. 냉동 박편 제조기(Cryo-microtome)를 이용하여 상기 동결시킨 돼지 피부를 약 10 내지 15 um의 두께로 절단한 뒤, 제조된 시료 박편을 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 형광을 표지한 펙틴 용액 및 일 양상에 따른 펙틴 나노젤을 돼지 피부에 처리 시, 형광 표지한 모델 약물 처리군(OVA-RhoB)은 약물이 각질층을 거의 통과하지 못하였고, 펙틴 용액(Pectin solutions)은 표피층의 일부에 소량만 전달된 것을 확인하였다. 반면 펙틴 나노젤을 처리한 실험군은 모든 농도에서 우수한 피부 투과도를 나타내었으며, 전달된 양 역시 펙틴 용액보다 많은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 펙틴-노보닌 나노젤은 피부 투과능이 뛰어나 경피 전달 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 제조예 및 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 광가교결합 가능한 작용기가 도입되어 개질된 펙틴을 포함하는 펙틴 나노젤에 있어서,
    상기 광가교결합 가능한 작용기는 노보닌(norbornene)이고,
    상기 광가교결합 가능한 작용기를 통해 티올기가 도입된 약물 또는 생리활성물질이 젤 내부에 고정된 것인, 펙틴 나노젤.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펙틴은 카르복시기 말단에 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 것인, 펙틴 나노젤.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 약물 또는 생리활성물질은 소수성 약물, 친수성 약물, 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 항원, 항균제, 항생제, 항염증제, 항암제, 당류, 지질 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 펙틴 나노젤.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노젤은 평균 직경이 10 내지 1000 nm인 것을 특징으로 하는, 펙틴 나노젤.
  8. 청구항 1의 펙틴 나노젤을 포함하는 경피 전달용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는, 경피 전달용 조성물.
  10. 삭제
  11. 펙틴에 광가교결합 가능한 작용기를 도입하는 단계를 포함하는 펙틴 나노젤을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 광가교결합 가능한 작용기는 노보닌(norbornene)이고,
    상기 나노젤은 광가교결합 가능한 작용기를 통해 티올기가 도입된 약물 또는 생리활성물질이 젤 내부에 고정된 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 광가교결합 가능한 작용기가 도입된 펙틴을 약물 또는 생리활성물질과함께 가교제 및 광개시제와 혼합하여 전구 용액을 제조하는 단계;
    상기 전구 용액에 자외선을 조사하여 펙틴 하이드로젤을 제조하는 단계; 및
    상기 펙틴 하이드로젤을 초음파 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 자외선 조사 시간은 10초 내지 15분인 것인 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 자외선 파장은 300 nm 내지 500 nm인 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 초음파 처리 시간은 30초 내지 5분인 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  16. 청구항 12에 있어서,
    상기 초음파 출력은 10 W 내지 120 W인 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
  17. 청구항 12에 있어서,
    초음파 처리 후 젤을 분리하여 여과하는 단계를 추가로 수행하는 것인, 펙틴 나노젤을 제조하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Kumari, Leena, and Hemant Ramachandra Badwaik. "Polysaccharide-based nanogels for drug and gene delivery." Polysaccharide Carriers for Drug Delivery. Woodhead Publishing, 2019. 497-557(2019. 6. 21.)*
Pereira, Rúben F., et al. "Cell-instructive pectin hydrogels crosslinked via thiol-norbornene photo-click chemistry for skin tissue engineering." Acta biomaterialia 66 (2018): 282-293(2017. 11. 8.)*

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