CN1565433A

CN1565433A - 竹红菌素水溶性纳米粒及用途

Info

Publication number: CN1565433A
Application number: CNA031481477A
Authority: CN
Inventors: 赵井泉; 赵宝忠; 谢杰; 顾瑛; 刘凡光
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Institute of Chemistry CAS; Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2005-01-19

Abstract

本发明涉及一类竹红菌素水溶性纳米粒及用途，其特征在于：利用天然生物蛋白、多糖类大分子以及可生物降解的高分子聚合物为包封材料，将脂溶性竹红菌素药物进行包封制成适合于静脉注射的水溶性的粒径为20～200nm的超微粒。本发明具有原料廉价易得、制备方法简单、易操作、不需特别设备、制备工艺成本低；所得到的竹红菌素纳米粒具有稳定性高，靶向性及生物可降解性好，同时保持了竹红菌素类光敏剂强光动力功能的特点；可以溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液，此类制剂可作为竹红菌素光动力药物的静脉注射针剂。

Description

竹红菌素水溶性纳米粒及用途

技术领域

本发明涉及一种竹红菌素与蛋白或多糖生物材料或高分子材料制成的水溶性纳米粒和作为光动力药物静脉注射针剂的用途。

背景技术

竹红菌素，包括竹红菌甲素(HA)和竹红菌乙素(HB)，是从特产于我国云南箭竹上的一种寄生真菌—竹红菌(Hypocrella bambusae(B.et Br.)Sacc.)中提取的一类天然光敏色素。具有单线态氧量子产率高、结构明确、化学修饰性好、暗毒性低、体内代谢快等理想光敏剂的特征，公认是一种最有前景的新型光动力光敏剂。民间曾用竹红菌素治疗胃痛和关节炎，皮肤疾病；现已证明在光动力抗艾滋病毒、抗肿瘤和微血管类疾病有潜在用途。

众所周知，光对人体组织的穿透深度和光波长成正比，所以通常把肿瘤的光动力医疗窗口规定为600nm-900nm的波长范围，此波长范围的光对组织的穿透深度约为几毫米到1厘米以上。竹红菌素类光敏剂的主吸收波长在500nm附近，此波长范围光对组织的穿透深度约1毫米左右，不能满足实体肿瘤光动力治疗的要求；而以600nm以上的红光激发竹红菌素，则由于光吸收值低而大大降低其光动力效率。然而，微血管类疾病通常的病灶深度不超过1毫米，恰好与竹红菌素类光敏剂主吸收光穿透深度相符；而对这种浅表类型的疾病，以长波光照射反而可能会增加对深层正常组织的伤害。因此，竹红菌素短波长吸收的特性对于光动力医疗实体肿瘤是其劣势；而对医疗浅表肿瘤和微血管类疾病则成为其独特的优势。

竹红菌素本身是一类脂溶性有机分子，在极性溶剂和血液中会自发聚集而形成毛细血管栓塞；而通过化学修饰获得的水溶性衍生物在体内细胞摄取率低而大大降低甚至丧失竹红菌素特有的强光动力功能。因此，微血管疾病光动力药物必须满足在血液中的有效传输和在病灶上选择吸附的双重要求。由于竹红菌素母体具有很高光敏化效率，而且其光物理性质能很好的满足微血管类疾病的光动力医疗的要求，因此可以直接采用具有两亲性质的生物相容性材料与脂溶性竹红菌素分子组装来改善药物的物理化学性质，从而满足临床光动力药物的要求。为了达到这一目标，竹红菌素-胶束、脂质体体系已经进行了大量的研究，取得了重要的进展。但是也存在着不少问题，如胶束体系可以具有较高的稳定性，但却有缺少对靶体细胞选择性和双亲材料生物相容性等问题；脂质体具有很高的靶向性和药物释放特性，但属于半流体的脂质体制剂稳定性差，泄漏快，易变质。药物纳米粒具有很好的靶向性并且有很好的稳定性和生物相容性，因此选用作为脂溶性竹红菌素类光敏剂水溶性改造的一种新方法，力图提供更好的新剂型。

纳米粒为固态胶体颗粒，其尺寸分布可以在10～1000nm之间，可由生物大分子、聚合物等作为药物载体。纳米粒优于其他微粒制剂之处在于：其粒子极细(粒子的尺寸可以用制备工艺调控)，能很快分散于水中成透明的胶体分散体系，适宜配制注射针剂供静脉注射；所用材料便于进一步表面修饰，以实现主动靶向性；成品稳定性较好，尺寸适当，可以使用超过滤法加工除菌，因此，药物颗粒的粒径应该小于500纳米；可制成缓释型延长疗效；对所包含的药物有保护作用，可防止氧、介质和体内酶对药物的破坏；选用适当的材料(明胶和血清白蛋白等)可达到生物相容，毒副作用小并能在体内生物降解等。故自1976年Birrenback首次提出以来引起了各国科学家的广泛注意。

用于制备纳米粒的包封材料有天然生物蛋白、多糖大分子以及可生物降解的高分子聚合物等。制备纳米粒的方法主要有大分子聚合物分散法和散单体的聚合法。对于天然生物蛋白和多糖大分子聚合物主要采取前者，而高分子聚合物纳米材料主要采取后者。天然生物蛋白可以通过高温固化法或析出固化法来制得。

Scheffel等人(Scheffel.et al.J.Nucl.Med.，3，1972：498-503)通过对白蛋白W/O乳剂的加热变性来完成的，即白蛋白水溶液室温下在棉籽油中乳化和乳匀，将乳剂倾入热油中使大分子物质变性，制备方法简便，但需用大量的油，余油用少量的有机溶剂多次洗涤除去，为微粒的纯化带来了困难。另外加热变性对不稳定性药物可能不利。Widder等(Widder，et al.Proceed.Soc.Exp.Bio.Med.，58，1978：141-146)用甲醛或2，3-丁二酮在室温下对大分子物质进行化学交联来代替加热变性。Marty，Oppenheim和Speiser等(Marty J.J.，et al.，Pharm Acta Helv，53，1978：17-23；Oppenheim，et al.，Austr.J.Pharm.Sci.，7，1978：113-117；Australian Patent：459261，1978)根据天然大分子物质的去溶剂化作用设计了析出固化法来制备，从而简化了纯化操作。此法是将大分子物质溶于水，再加入硫酸钠、乙二醇或硫酸铵使其去溶剂化，再用戊二醛交联。该法已用在明胶和白蛋白纳米粒的制备上。Vauthier等人(Vauthier，et al.，Proc.Int.Symp.Contr.Rel.Biaoact.Mater.，18，1991：367-368)通过向海藻酸钠水溶液中加入适量氯化钙后形成微胶来制备纳米粒。壳聚糖纳米粒可以由壳聚糖醋酸溶液加凝聚剂多聚磷酸钠制得(Chandy T，et al.Biomaterials，17(1)，1996：61-66；袁弘等，中国药学杂志，37(5)，2002：349-352)。

可生物降解的高分子聚合物通过以下方法来聚合制得：①胶束聚合法(Micell polymerization method，Kreuter J.et al.Pharm Acta Helv 1978，53(2)：33)系将聚合物水溶性单体及药物溶解于水中，于表面活性剂存在下经搅拌分散至大量疏水介质中(如正己烷)，然后加入引发剂或在γ-射线、X-射线、紫外光或可见光照射下发生聚合而得。②乳化聚合法(Emulsionpolymerization method，Courreur P.et al.US Patent 1982，4：329332)系将含有葡聚糖或表面活性剂的酸性溶液中，在机械搅拌下加入水不溶性单体如氰基丙烯酸烷烃酯而制得，其聚合机理是水中的羟基与氰基丙烯酸烷烃酯发生亲核反应而聚合。③界面聚合法(Interfacial polymerization method，AlkhouriFallouh N.et al.Int J Pharm 1986，28：125)系将药物与氰基丙烯酸烷烃酯溶于乙醇中，在搅拌下慢慢滴入含有表面活性剂的水溶液中而制得。

发明内容

本发明目的在于提供一类新型的水溶性竹红菌素纳米粒，以满足光动力药物在血液中顺利传输和在细胞表面吸附的双重要求，发展一种新剂型和提供制备上述水溶性纳米粒的新方法，解决竹红菌素类光敏剂作为光动力药物的实用化问题；同时采用本发明制成的纳米粒具有稳定性高，靶向性及生物可降解性好，同时保持了竹红菌素类光敏剂强光动力功能的特点，可以溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液，可以方便地配制成竹红菌素药物的静脉注射针剂。

本发明的技术特征是利用天然生物蛋白、多糖类生物大分子或可生物降解的高分子聚合物为包封材料，在助溶剂和分散剂存在下对脂溶性竹红菌素药物包封，制成适合于静脉注射的粒径为20～200nm的竹红菌素光动力药物的水溶性纳米粒子。

本发明中所涉及的竹红菌素包括竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)以及两种母体的脂溶性衍生物，均属于4，9-二羟基-3，10-醌衍生物，HA和HB分子式分别为C₃₀H₂₆O₁₀、C₃₀H₂₄O₉，分子量分别为546、528，其结构式如下所示：

本发明所涉及的纳米粒，包封材料中所用的天然生物蛋白选自药用明胶、阿拉伯胶、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白；多糖类生物大分子选自海藻酸钠、壳聚糖；高分子聚合材料选自聚丙稀酰胺、聚甲基丙烯酸烷烃酯、聚氰基丙烯酸烷烃酯。

本发明中所述的助溶剂选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司盘-60、司盘-65、司盘-80、司盘-85、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯，其浓度为0.5％～3.0％(重量体积百分比)；所述的分散剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、胆固醇、葡聚糖、右旋糖酐，其浓度为0.1～5％(重量体积百分比)。

水溶性纳米粒的制备方法已有许多公开报道，如：天然生物蛋白一般通过加入高浓度硫酸盐水溶液作为凝聚剂析出固化法制备水溶性纳米粒，其中天然生物蛋白的浓度为1％～5％(重量体积比)，硫酸盐凝聚剂选自：硫酸钠或硫酸铵，固化剂可选自：戊二醛、甲醛；亦可通过其乳化液热固化制得。海藻酸钠可以通过加入氯化钙溶液制得纳米粒子，其中海藻酸钠溶液的浓度为0.01％～2％(重量体积比)，氯化钙溶液的浓度为0.1％～0.5％(重量体积比)；壳聚糖纳米粒可以由壳聚糖醋酸溶液加凝聚剂多聚磷酸钠制得，其中壳聚糖的浓度为0.1％～0.3％(重量体积比)，醋酸溶液的浓度为0.5％～2％(重量体积比)，多聚磷酸钠的浓度为0.05％～0.3％(重量体积比)。高分子聚合物可以通过乳化聚合法或界面聚合法聚合而得，其中聚合单体浓度为0.5～5％(重量体积百分比)。但是，由于竹红菌素药物的特殊性质，如果按照报道方法采用高浓度的硫酸钠盐作为凝聚剂制备竹红菌素明胶纳米粒，在这种高离子性溶液中，脂溶性竹红菌素药物会发生自发聚集沉淀而不能被包封。因此在本发明中对报道方法进行了改进，不采用高浓度硫酸盐而采用醇类作为凝聚剂，并结合改变温度调控明胶的凝聚。

本发明所制得的水溶性竹红菌素纳米粒具有以下优点：

1.利用天然生物蛋白、多糖类大分子以及可生物降解的高分子聚合物为包封材料，将脂溶性竹红菌素药物进行包封制成适合于静脉注射的水溶性的粒径为20～200nm的超微粒，原料廉价易得、制备方法简单、易操作、不需特别设备、制备工艺成本低；

2.所得到的竹红菌素纳米粒具有稳定性高，靶向性及生物可降解性好，同时保持了竹红菌素类光敏剂强光动力功能的特点；可以溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液，可以方便地配制成竹红菌素药物的静脉注射针剂。

附图说明

图1为本发明中竹红菌乙素纳米粒的吸收光谱；

图2为本发明中竹红菌乙素纳米粒的荧光发射光谱；

图3为本发明中采用天然生物蛋白中明胶制成的竹红菌素纳米粒(×26K)的透射电镜照片；

图4为本发明中采用多糖类大分子中的海藻酸盐制成的竹红菌素纳米粒(×100K)的透射电镜照片。

具体实施方式

在以下实施例中将进一步举例说明本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而对本发明没有限制。

实施例1

将1％～5％(重量体积百分比)药用明胶溶液5ml，加入0.5％～3.0％(重量体积百分比)的吐温-80，升温至30℃～60℃，强烈搅拌下徐徐加入1ml竹红菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹红菌素所用的溶剂选用二甲基亚砜DMSO)，并加入3ml无水乙醇，然后在低温下5℃～16℃下超声1～10分钟，溶液开始出现强烈的散射光，此时再进行搅拌，升温至30℃～60℃，散射光消失，如此可循环多次，然后一次性加入固化剂戊二醛0.4ml固化20～40分钟，透析除去乙醇和DMSO，冷冻干燥得竹红菌乙素明胶纳米粒，冰箱中4℃冷藏。

实施例2

将0.02％～0.5％(重量体积百分比)海藻酸钠水溶液5ml，强烈搅拌下徐徐加入0.5ml竹红菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹红菌素所用的溶剂选用二甲基亚砜DMSO)，加入0.22ml浓度为0.1～0.5％(重量/体积比，W/V)的氯化钙水溶液，继续搅拌20～40分钟，然后超声1～10分钟，最后透析除去DMSO小分子有机溶剂得竹红菌乙素海藻酸盐纳米粒，冰箱中4℃冷藏。

实施例3

壳聚糖溶于1％的醋酸溶液，配制成浓度为0.02～0.5％(重量体积百分比)的溶液，移取5.0ml，在强烈搅拌条件下，加入0.5ml竹红菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹红菌素所用的溶剂选用二甲基亚砜DMSO)，然后加入2ml浓度为0.1～0.5％的多聚磷酸钠溶液，继续搅拌20～30分钟，然后超声1～10分钟，最后透析除去DMSO小分子有机溶剂得竹红菌乙素壳聚糖纳米粒，冰箱中4℃冷藏。

实施例4

(乳化聚合法)5.0ml含有0.5～5％(重量体积百分比)氰丙烯酸正丁酯单体的溶液，加入0.1～5％的右旋糖酐为稳定剂，强烈搅拌下加入1ml竹红菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹红菌素所用的溶剂选用二甲基亚砜DMSO)，稀盐酸调PH值至1～3，继续搅拌至乳状液，室温下继续搅拌1～2小时后，用稀氢氧化钠调PH值至5～7，用G₃玻砂漏斗抽虑，即得乳白色纳米粒，冰箱中4℃冷藏。

实施例5

(界面聚合法)将0.05ml氰基丙烯酸正丁酯、0.4ml三甘油酯溶入10ml乙醇中，并加入1ml竹红菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹红菌素所用的溶剂选用二甲基亚砜DMSO)，强烈搅拌下缓缓滴加到20ml含0.1～5.0％葡聚糖和0.5～3.0％吐温-20(重量体积百分比)的水相溶液中，滴加完毕后再于室温下反应1～2小时，得乳白色悬浮液，于20℃真空旋转蒸发除去大量乙醇，最后透析除去DMSO小分子有机溶剂得竹红菌乙素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，冰箱中4℃冷藏。

竹红菌素纳米粒的表征：

本发明实施例中竹红菌乙素明胶及海藻酸盐纳米粒的光物理性质以吸收、荧光光谱和荧光量子产率表征；纳米粒的型貌以电子显微镜观测。

(1)光谱测定结果

在纳米粒中的竹红菌素的吸收光谱和荧光光谱与它们在脂质体、胶束、蛋白分子微环境中的相似，而与自由竹红菌素在有机溶剂中光谱有差别，反映了光敏剂分子与脂质、表面活性分子或蛋白微环境之间的弱相互作用特征；与溶解于有机溶剂中的自由竹红菌素分子相比，包封于脂质体、胶束和纳米粒中的竹红菌素在质子型溶剂(水)中的荧光量子产率有较大的降低(约为有机溶剂中自由竹红菌素的一半)，说明溶剂中水分子对竹红菌素荧光的猝灭作用。比较图1和图2中相同浓度的竹红菌乙素明胶纳米粒(HB-Gelatin-NP)和竹红菌乙素海藻酸盐纳米粒(HB-Alginate-NP)荧光发射光谱可以看出，在明胶纳米粒体系中的荧光量子产率要高于海藻酸盐纳米粒体系，可能是由于多糖分子结构的骨架型结构和多羟基特点，海藻酸盐纳米粒比明胶纳米粒更容易结合水分子，因此对包封其中的竹红菌素分子的荧光猝灭作用更强。

(2)竹红菌素纳米粒的电镜观察

将样品滴在喷碳铜网上，用醋酸双氧铀负染后以透射电镜观察纳米粒的大小及形貌，结果如图3、图4所示。透射电镜照片显示竹红菌素明胶纳米粒的粒径为20～200nm，竹红菌素海藻酸盐纳米粒的粒径为20～100nm。

竹红菌素纳米粒的光动力功能和用途：

一般而言，光动力药物的体内给药方法可以有多种，但是特别针对血管类疾病的光动力药物，药物的靶体是血管内壁细胞或血液中的硬化斑块，所以最适宜的给药方法是静脉注射。如前所述，脂溶性的竹红菌素分子在极性环境中自发聚集而造成血管栓塞；而水溶性的竹红菌素衍生物与靶体的亲和性低而丧失光动力活性。细胞实验表明：竹红菌素纳米粒既具有良好的水溶性，同时具有高的细胞摄取率和保持了竹红菌素固有的高光动力活性。本发明中所述的水溶性竹红菌素纳米粒可用于医疗血管类疾病(或其它需要由静脉注射给药的疾病)的光动力药物静脉注射针剂。如下的细胞实验结果证明本发明竹红菌素纳米粒的光动力功能和用途。

细胞试验测定结果：体外培养的鼠肺血管内皮细胞(EC)，按5.0×10⁴个/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板，孵育24小时后，加入光敏剂，选取的光敏剂孵育浓度为1μg/ml，继续孵育内皮细胞4小时后，采用铜蒸汽激光(波长为510.6nm和578.2nm)照射，激光照射的功率密度为20mw/cm²；照射时间为1000秒；能量密度为20J/cm²。其后采用MTT的方法，测定各孔的光密度值。受试的几种样品对细胞的杀伤率如下表所示。

内皮细胞OD值与HB对其杀伤率

样品1 样品2 样品3

0.116 0.101 0.113

0.101 0.084 0.136

各孔 0.106 0.081 0.074

OD值 0.113 0.105 0.096

0.096 0.111 0.110

0.107 0.087 0.099

0.110 0.101 0.097

OD平均值 0.107 0.0957 0.104

杀伤率 72.0％ 78.2％ 73.9％

其中样品1为竹红菌乙素-多糖纳米粒；样品2为竹红菌乙素-明胶纳米粒；样品3为竹红菌乙素脂质体。完全空白对照组OD值平均为0.238286，本底组OD值平均为0.056。

细胞杀伤率如下式得到：

细胞杀伤率(％)＝1-细胞存活率＝1-(实验组OD-本底组OD)/(完全空白组OD-本底组OD)×100％

在光敏剂浓度为1μg/ml的条件下，以7组样品平均计算，得到3组光敏剂样品对受试细胞的杀伤率基本相仿，均大于70％，证明在纳米粒中竹红菌素保持了其特有的强光动力功能。制备后立即使用的竹红菌乙素-脂质体体系已经成功用于微血管类疾病(鲜红斑痣、视网膜黄斑变性等)光动力医疗的研究(顾瑛等，专利申请号：02116879.2.)，以血管内壁细胞为受试细胞的对比实验证明：竹红菌素-脂质体对血管内壁细胞的杀伤率比血卟啉衍生物光敏剂高几十倍。由此可以得到结论：本发明中竹红菌素纳米粒保持了竹红菌素特有的光动力活性，光动力活性远高于现有光敏剂HpD，可以作为一种竹红菌素临床光动力药物的新剂型；由于纳米粒卓越的水溶性，可以用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等极性溶剂方便地配制成适当浓度的药液；本发明获得的纳米粒在20-200纳米之间，不会经超滤方法除菌法(滤掉＞500nm成分)滤掉，可以使用超滤除菌法除去细菌。因此本发明竹红菌素纳米粒可以用于血管类疾病(或需要通过静脉注射给药的疾病)临床光动力治疗的竹红菌素类药物静脉注射针剂。

Claims

1、竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：利用天然生物蛋白、多糖类生物大分子或可生物降解的高分子聚合物为包封材料，在助溶剂和分散剂存在下对脂溶性竹红菌素药物包封，制成适合于静脉注射的粒径为20～200nm的竹红菌素光动力药物的水溶性纳米粒子。

2、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的竹红菌素包括竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)以及HA和HB两种母体脂溶性衍生物。

3、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的天然生物蛋白材料选自药用明胶、阿拉伯胶、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。

4、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的多糖类生物大分子选自海藻酸钠、壳聚糖。

5、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的高分子聚合材料选自聚丙稀酰胺、聚甲基丙烯酸烷烃酯、聚氰基丙烯酸烷烃酯。

6、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的助溶剂选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司盘-60、司盘-65、司盘-80、司盘-85、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯，所述的助溶剂浓度为0.5～3％(重量体积百分比)。

7、根据权利要求1所述的竹红菌素水溶性纳米粒，其特征在于：所述的分散剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、胆固醇、葡聚糖、右旋糖酐，所述的分散剂浓度为0.1～5％(重量体积百分比)。

8、竹红菌素水溶性纳米粒用于微血管类疾病以及需要通过静脉注射给药的疾病的光动力医疗中的应用。