CN114258917B

CN114258917B - 丙酮酸的新用途及阻控土壤中病原菌耐药进化的方法

Info

Publication number: CN114258917B
Application number: CN202111503639.8A
Authority: CN
Inventors: 汪美贞; 张璟晗; 林达; 费政钧; 黄丹; 李娜; 沈东升
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114258917A

Abstract

本申请公开一种丙酮酸的新用途及阻控土壤中病原菌耐药进化的方法，本申请发现丙酮酸可以有效抑制土壤中铜绿假单胞菌的绿脓素分泌，通过对绿脓素分泌的抑制降低其ROS生成，从而减少土壤中病原菌的耐药性，阻控土壤病原菌耐药性的富集，可将丙酮酸配置成一定浓度的溶液后直接施加在土壤中，阻控土壤中耐药微生物的耐药进化或污染传播，是一种高效、广谱、绿色环保且价格相对低廉的土壤环境修复技术，具有广阔的应用前景。

Description

丙酮酸的新用途及阻控土壤中病原菌耐药进化的方法

技术领域

本申请属于微生物耐药性治理领域，具体涉及一种丙酮酸作为阻抗剂的新用途以及一种通过加入丙酮酸降低微生物耐药性的方法。

背景技术

在过去的近几十年里，在临床条件下、动物疾病治疗、畜牧生产甚至在蔬菜水果等农产品表面过度使用抗生素导致微生物耐药性的大流行。土壤作为地球上最多样化的微生物栖息地之一，耐药菌和抗生素抗性基因会通过各种途径进入到土壤中，土壤中土著微生物通过基因水平转移等途径获得抗生素抗性基因变成耐药菌，一些耐药菌会进化为临床环境下与人类和动物疾病相关的超级细菌或者新兴病原体。这些耐药菌会通过植物根部的自然伤口或线虫感染根部进入植物体内，进入食物链，容易被人体所吸收，对人类健康构成重大的威胁，在欧洲，每年大约有2.5万人死于耐药菌的感染，美国至少有200万人感染耐药菌，因此亟需关注越发严峻的土壤微生物耐药性问题。

目前阻控土壤耐药菌的方法主要有：1)筛选新的具有抑菌作用的药物，如中国专利申请号CN202010895132.0筛选了苄丝肼作为一种新的非抗生素抗菌药物，对多种耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和克雷伯氏菌属有良好的抑菌作用，在临床方面有较好的前途；2)重新提高细菌对抗生素的敏感性，利用某些化学物质与抗生素连用，提高微生物的敏感性，如中国专利申请号为CN202010781673.0公开了一种复方氨酸与抗生素连用，可以提高细菌对抗生素的敏感性，促进抗生素进入细菌细胞内，提高抗生素的杀菌效果，降低细菌生存率，可以治疗细菌侵染引起的疾病；3)利用光电等物理方法去除耐药菌，中国专利申请号CN202110326102.2公开了以硫化镍/二硫化钼复合纳米阵列将耐药菌株杀死的方法。

发明内容

本申请提供一种丙酮酸的新用途以及一种新的阻控土壤中病原菌耐药进化和传播的方法，通过丙酮酸阻控耐药病原菌的群感产物并促进耐药病原菌的三羧酸循环从而阻控细菌耐药进化。

本申请发现依靠丙酮酸溶液可以显著性降低土壤耐药菌株产生的ROS，同时，丙酮酸溶液还可以通过促进细菌体内的三羧酸循环来阻控土壤病原菌耐药性进化，是一种高效、广谱、绿色环保且价格相对低廉的土壤环境修复制剂，具有广阔的应用前景。

基于上述发现，本申请提供一种丙酮酸在制备阻抗病原菌耐药进化的药剂中的用途。

本申请还提供一种丙酮酸为阻抗剂在缓解或防治土壤病原菌耐药进化或传播中的用途。

可选的，所述病原菌为对β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和糖肽类一种或多种抗生素耐受的病原菌。

可选的，所述病原菌为能够分泌毒力因子绿脓素的铜绿假单胞菌；耐受抗生素为环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶或阿米卡星。

不管是湿地土壤、森林土壤、农田土壤还是草地，土壤中的优势菌株均为变形菌门，其中的优势菌纲为γ-变形菌纲，占细菌总数的30％-50％。铜绿假单胞菌作为医院内感染病人的主要病原菌之一，是γ-变形菌纲的一种代表菌株，在自然界中分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。铜绿假单胞菌对多种抗生素都表现出耐药性，包括氨基糖苷类、喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素。铜绿假单胞菌的群体感应系统涉及信号分子的细胞密度依赖性积累，在调节生物膜形成和调节毒力因子中起关键作用。形成生物膜是铜绿假单胞菌应对抗生素环境的一种对策，在生物膜内生长的细菌比游离的细菌对抗生素的敏感性低。群体感应对其毒力因子如鼠李糖脂、弹性蛋白酶和绿脓素等进行调控，绿脓素是铜绿假单胞菌产生的重要毒力因子，具有氧化还原活性，可产生活性氧(ROS)增加氧化还原应激。

可选的，所述铜绿假单胞菌耐药菌株为在不同浓度的抗生素环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶和阿米卡星胁迫下产生的铜绿假单胞菌耐药菌株；铜绿假单胞菌在抗生素胁迫下会分泌毒力因子介导ROS的生成从而产生抗生素耐药性。

可选的，所述铜绿假单胞菌耐药菌株分泌的毒力因子为绿脓素。

可选的，所述的抗生素胁迫浓度的选择方法如下：

首先，将土壤中的病原菌筛选出来，加入不同种类的抗生素(环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶和阿米卡星)进行胁迫，测定土壤病原菌对这四种抗生素的MIC。

其次，选择各个抗生素1/2MIC作为后续胁迫所需要的浓度。每四天测一次不同抗生素胁迫下土壤病原菌的MIC，判断耐药菌菌株是否生成；经过一段施加培养后，由环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶、阿米卡星这几种抗生素胁迫后土壤病原菌的MIC为土壤野生型菌株的特定倍数时，判断土壤病原菌耐药菌株培养成功。

最优选的，本申请提供一种丙酮酸在制备阻抗分泌绿脓素的铜绿假单胞菌耐环丙沙星药剂中的用途。

本申请还提供一种阻控土壤中病原菌耐药进化的方法，将丙酮酸配置成一定浓度的丙酮酸溶液，直接施加于土壤中可以达到阻控土壤中耐药菌株进化的效果。

可选的，所述配置丙酮酸所用的溶剂为水或葡萄糖溶液。

可选的，所述丙酮酸溶液中丙酮酸的浓度为10-100μg/L；所述丙酮酸溶液的施加量为100-200ml/m²或每株农作物施加40～60ml。

可选的，所述待处理土壤中施加一次所述丙酮酸溶液或每2.5～3.5个月施加一次所述丙酮酸溶液。

与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：

(1)本申请发现丙酮酸作为阻抗剂，对病原菌耐药进化抑制效果显著提高。

(2)本申请所选丙酮酸的分解产物不会对环境造成影响。

(3)本申请的方法在阻控土壤微生物耐药进化和传播风险具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中绿脓素添加对铜绿假单胞菌耐药菌株ROS的影响结果图。

图2为实施例3中丙酮酸的添加对铜绿假单胞菌ROS的影响图。

图3为实施例4中丙酮酸的添加对铜绿假单胞菌耐药进化的影响图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

实施例1 2种阻抗剂和绿脓素的制备

表1 2种阻抗剂和绿脓素的制备

编号	样品名	溶质(mg)	水(ml)
				1#	绿脓素	1.5	1000
2#	谷胱甘肽	6	100
				3#	丙酮酸	2	100

实施例2绿脓素促进铜绿假单胞菌ROS上升实验

首先，将实验室中野生型铜绿假单胞菌菌株培养到对数生长后期，加入绿脓素再培养30min后，利用ROS试剂盒测量ROS含量。

如图1所示，原本铜绿假单胞菌耐药菌株培养至指数生长后期的ROS含量约为909987.57±278,597.43，加入绿脓素(实施例1中配置)后，铜绿假单胞菌耐药菌株的ROS为为2,219,411.39±314,229.82，如图1所示，实验证明，铜绿假单胞菌耐药菌株分泌绿脓素后增加ROS。

实施例3丙酮酸阻控铜绿假单胞菌耐药菌株ROS生成实验

在实施例2绿脓素培养后的铜绿假单胞菌菌株的培养液中分别加入配置浓度为20mg/L、60mg/L的丙酮酸和谷胱甘肽(GSH)溶液(实施例1配置)，再培养30min。可以测得加入丙酮酸和谷胱甘肽(GSH)溶液后，ROS为1.2×10⁶，加入维生素C溶液后，ROS为1.6×10⁶，加入丙酮酸溶液后，ROS为9.5×10⁵，可以发现，丙酮酸可以显著降低细菌产生的ROS。

实施例4阻抗剂的添加抑制铜绿假单胞菌耐药进化实验

(1)将野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1(典型的模式菌株，可从商业渠道获得，也可从菌种保藏中心获得)培养到对数生长后期，加入环丙沙星抗生素溶液10μl进行胁迫，测定野生型铜绿假单胞菌对环丙沙星的MIC；选择环丙沙星1/2MIC作为后续胁迫所需要的浓度。每四天测一次环丙沙星抗生素胁迫下铜绿假单胞菌的MIC，37℃摇床条件下培养12h后，环丙沙星抗生素胁迫后铜绿假单胞菌的MIC达到铜绿假单胞菌野生型的16倍时，判断铜绿假单胞菌耐药菌株培养成功。

(2)将野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1培养到对数生长后期，加入阿奇霉素抗生素溶液10μl进行胁迫，测定野生型铜绿假单胞菌对环丙沙星的MIC；选择阿奇霉素1/2MIC作为后续胁迫所需要的浓度。每四天测一次阿奇霉素抗生素胁迫下铜绿假单胞菌的MIC，37℃摇床条件下培养12h后，阿奇霉素抗生素胁迫后铜绿假单胞菌的MIC达到铜绿假单胞菌野生型的32倍时，判断铜绿假单胞菌耐药菌株培养成功。

(3)将野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1培养到对数生长后期，加入头孢他啶抗生素溶液10μl进行胁迫，测定野生型铜绿假单胞菌对头孢他啶的MIC；选择头孢他啶1/2MIC作为后续胁迫所需要的浓度。每四天测一次头孢他啶抗生素胁迫下铜绿假单胞菌的MIC，37℃摇床条件下培养12h后，头孢他啶抗生素胁迫后铜绿假单胞菌的MIC达到铜绿假单胞菌野生型的128倍时，判断铜绿假单胞菌耐药菌株培养成功。

(4)将野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1培养到对数生长后期，加入阿米卡星抗生素溶液10μl进行胁迫，测定野生型铜绿假单胞菌对阿米卡星的MIC；选择阿米卡星1/2MIC作为后续胁迫所需要的浓度。每四天测一次阿米卡星抗生素胁迫下铜绿假单胞菌的MIC，37℃摇床条件下培养12h后，阿米卡星抗生素胁迫后铜绿假单胞菌的MIC达到铜绿假单胞菌野生型的128倍时，判断铜绿假单胞菌耐药菌株培养成功。

(5)向培养成功的四种耐药株中分别并添加60mg/L的谷胱氨酸12μl和20mg/L的丙酮酸4μl(实施例1配置)，在37℃摇床中培养12h，同时培养野生型铜绿假单胞菌作为对照。

(7)隔8天后分别测定实验组和对照组铜绿假单胞菌环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶和阿米卡星抗生素的MIC，随后每隔四天测量一次实验组和对照组铜绿假单胞菌环丙沙星抗生素的MIC，共测定24天。

环丙沙星胁迫菌株的测定结果如图3所示，对照组铜绿假单胞菌在完成24天进化以后MIC达到了32mg/L，添加了谷胱甘肽后进化后的实验组铜绿假单胞菌MIC降低到了16mg/L，而添加了丙酮酸后进化后的实验组铜绿假单胞菌MIC降低到了8mg/L。可以发现，丙酮酸的添加可以显著抑制铜绿假单胞菌耐药进化，相对谷胱甘肽其抑制效果显著增强。

实施例5在土壤中施加丙酮酸对土壤耐药菌抑制实验

根据实施例2、3的结果，在土壤中施加相应浓度的丙酮酸可以抑制土壤耐药菌的进化。在土壤实验中，不添加丙酮酸溶液的土壤病原菌24天后MIC为野生型土壤病原菌的12倍，以120ml/m²的施加量往土壤中加入的100μg/L的丙酮酸溶液后，土壤中病原菌24天后的MIC为野生型土壤病原菌的4倍，丙酮酸可以有效阻控土壤病原菌的耐药进化。丙酮酸溶液不仅通过减少土壤病原菌群体感应代谢产物ROS来达到阻控土壤病原菌耐药进化的目的，还通过增强土壤病原菌体内的丙酮酸脱氢酶的活性，施加丙酮酸溶液后，土壤中病原菌内丙酮酸脱氢酶的活性是未加丙酮酸溶液处理的2倍，同时，ATP酶的活性也是未加丙酮酸溶液处理组的4倍。可以发现，以120ml/m²的施加量往土壤中加入的100μg/L的丙酮酸溶液可以达到阻控土壤中病原菌耐药进化。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.丙酮酸在制备阻抗病原菌耐药进化药剂中的用途，所述病原菌为对β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和糖肽类一种或多种抗生素产生耐药性的病原菌。

2.丙酮酸作为阻抗剂在缓解或防治土壤病原菌耐药进化或传播中的用途，所述病原菌为对β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和糖肽类一种或多种抗生素产生耐药性的病原菌。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述病原菌为能够分泌毒力因子绿脓素的铜绿假单胞菌；耐受抗生素为环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶或阿米卡星。

4.一种阻控土壤中病原菌耐药进化的方法，其特征在于，将丙酮酸配置成一定浓度的丙酮酸溶液，直接施加于待处理土壤中；

所述配置丙酮酸所用的溶剂为水或葡萄糖溶液；

所述丙酮酸溶液中丙酮酸的浓度为10-100ppm；所述丙酮酸溶液的施加量为100-200ml/m²或每株农作物施加40～60ml；

所述病原菌为对β-内酰胺类、莫匹罗星类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和糖肽类一种或多种抗生素产生耐药性的病原菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待处理土壤中施加一次所述丙酮酸溶液或每2.5～3.5个月施加一次所述丙酮酸溶液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病原菌为能够分泌毒力因子绿脓素的铜绿假单胞菌。