CN114250153A - 高耐硒灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200及其富硒发酵策略 - Google Patents

高耐硒灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200及其富硒发酵策略 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高耐硒灵芝Ganoderma lucidum JNUSE‑200及其富硒发酵策略，属于生物技术领域。本发明提供的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE‑200已于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心。硒耐受能力的提升对其富硒至关重要，而本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE‑200在整个液体发酵生长周期中，均能稳定耐受200ppm亚硒酸钠，菌丝体生长正常，菌丝细胞没有出现凋亡，且没有出现刺激性难闻气味，菌丝体富硒总量可以达到2000mg/kg，因此本菌株具有很广泛的应用前景。

Description

高耐硒灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200及其富硒发酵 策略
技术领域
本发明涉及高耐硒灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200及其富硒发酵策略，属于生物技术领域。
背景技术
硒(Se)是人体必需的微量营养素，主要通过饮食和/或营养补充剂获得。维持人体健康需要微量硒，硒元素参与多种细胞生理过程，如:甲状腺激素调节、氧化还原稳态、炎症反应和免疫反应、碳水化合物代谢、心血管和生殖健康、脑功能维持等。硒元素缺乏与许多人类疾病有关，其中克山病(病毒感染致死性心肌病)和大骨节病(慢性骨软骨病)是一些典型的与硒元素缺乏相关的疾病，它们经常发生在生活在硒贫乏地区的人口中。硒的人体生理需要量为40μg/d，最低需要量为17μg/d，最高摄入量为400μg/d，在一般情况下正常人摄入量以50～250μg/d比较适宜，超过800μg/d会导致中毒。全世界大约有40多个国家属缺硒地区。我国有72％的地区属于缺硒地区，硒的严重缺乏迫使人们去寻找有效的富集资源。
食用菌富含多糖、蛋白质和其他营养物质，还具有较强的微量元素富集能力，是一种很好的食物补硒来源。硒和代谢产物的积累与食用菌营养特性的提高密切相关，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫增强和肠道健康调节等特性；如：香菇富硒菌丝体提取物、富硒双孢蘑菇、富硒灵芝蛋白提取等都是很好的抗氧化剂。此外，有研究报道硒元素结合临床抗癌药物香菇多糖，抗肿瘤活性增强，不良反应减少。因此，富硒食用菌应用广泛，如在功能食品、饲料、复合纳米材料等领域具有良好的市场前景和商品化的潜力。
由于野生富硒食用菌的栽培成本高、栽培周期长，人工栽培方法已逐渐发展起来。不同种食用菌其富硒能力不同。目前，食用菌耐硒能力的提高对富硒培养意义重大，有很多研究致力于提高食用菌富硒能力。耐受力的提高对于提高食用菌的富集能力至关重要，其耐受力的提升往往是通过传统驯化培育或者紫外诱变培育等实现。因此，通过各种技术手段不断提高食用菌耐硒能力，或者获得天然高耐硒能力菌种资源尤为重要。
微生物能够对硒进行一系列的转化，包括还原、氧化、甲基化和去甲基化。作为一种解毒机制，硒的还原是好氧生物中的一般机制。通过硒还原为低或无毒的红色硒来降低无机硒对自身的毒性作用。该过程的一个显著特征是，在微生物的作用下，无机硒被还原为红色单质硒(无机硒)，发酵体系出现明显颜色变化，即出现橙色或者红色。培养体系产生橙色或者红色，说明微生物无法在此浓度下维持正常生长，会将无机硒代谢转化为无机态的红色单质硒。因此，我们可以通过发酵产物颜色(是否产生橙色及红色)来定性微生物是否可以耐受一定浓度的无机硒。
灵芝是一种优良的硒载体，不仅含有丰富的天然生物活性代谢物，而且具有将无机硒转化为有机硒的功效。在液体培养过程中，Na2SeO3的添加极大地改变了灵芝生长和生物活性代谢产物的合成代谢。但是，发明人课题组前期研究发现，50ppm Na2SeO3不影响灵芝生长，但200ppm Na2SeO3可对其菌丝生长和生物活性代谢产物产生毒性作用，尤其是在菌丝生长发育的第5～6天。
因此，将灵芝菌株接种至含有高浓度无机硒的环境中进行培养，虽然可以得到富硒灵芝，但是，由于高浓度无机硒的毒性作用，灵芝菌株自身的代谢途径会将无机硒代谢转化为无机态的红色单质硒，而此时的灵芝菌株也就无法继续正常生长，因此，如何得到一株能够长期耐受高浓度无机硒的灵芝菌株，成为研究的重点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200，所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211192，保藏日期为2021年09月17日。
所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200是在出发菌株Ganoderma lucidumCGMCC NO.5.26基础上，通过在PDA固体培养基平板(含有亚硒酸钠)和液体发酵培养基(含亚硒酸钠)中摇瓶中交替培养，不断提高亚硒酸钠筛选浓度，对出发菌株进行驯化培养所得，将选育到的灵芝菌株命名为灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200。
灵芝菌株Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26是灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200的出发菌株，其是一种优良的富硒载体，经过实验研究，结果如下：
(1)50ppm Na2SeO3处理的灵芝Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26的菌丝生长、超微结构、气味和颜色基本不变；而采用200ppm Na2SeO3处理的灵芝Ganoderma lucidumCGMCC NO.5.26，其生物量减少、菌丝细胞凋亡、颜色变红和气味难闻。
(2)50ppm Na2SeO3促进灵芝Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26多糖产量，而200ppm Na2SeO3则会抑制灵芝Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26多糖产量。
而本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200完全克服了其上述缺点，因此，本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200具有有益的性质。
将灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200在PDA固体培养基(培养基含有1000ppm亚硒酸钠)上，30℃培养7天，菌落直径4-5cm，6-7天菌落铺满整个培养皿，培养基表面以接种块为中心，呈放射状的形成一层较厚白膜，菌落边缘不平整，中间较厚，边缘较薄，整个菌落丝状交织紧密。菌丝体呈白色，气生菌丝旺盛，无色素分泌；生殖菌丝管状、透明，有明显的锁状联合。
在本发明的一种实施方式中，灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200具有高耐受亚硒酸钠能力的实验验证为：相较于出发菌株，在200ppm亚硒酸钠液体培养基中，其菌丝体在培养过程中正常生长，无明显颜色、气味及生物量变化；而出发菌株Ganodermalucidum CGMCC 5.26在200ppm亚硒酸钠液体培养过程中，从第5天开始，菌丝体颜色逐渐变红，发酵液散发难闻的气味，菌丝体细胞凋亡，生物量明显下降。
本发明的第二个目的是提供了一种富硒灵芝，所述灵芝为：将上述的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200子实体，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200孢子粉，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的菌丝体接种至含有无机硒的培养基中进行培养制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述无机硒为亚硒酸钠，浓度至少为200ppm。
本发明的第三个目的是提供了一种产品，所述产品中含有上述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的提取物，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的发酵液。
或，所述产品中，含有上述富硒灵芝子实体，和/或上述富硒灵芝孢子粉，和/或上述富硒灵芝的活性提取物，和/或上述富硒灵芝的菌丝体。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品、饲料或化妆品。
在本发明的一种实施方式中，所述提取物包括但不限于灵芝多糖、灵芝酸。
在本发明的一种实施方式中，所述提取物的制备方法为：将灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200子实体进行培养，制备得到的灵芝菌丝体，从制备得到的灵芝菌丝体中提取得到。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述富硒灵芝的总硒含量不低于2000mg/kg。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括但不限于：发酵乳、酸乳酪、冷冻酸乳酪、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调味品或饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳是指使乳发酵而得到的发酵乳，包含但不限于例如发酵乳、乳酸菌饮料、乳饮料；即利用乳酸菌或酵母使包含鲜乳、牛乳、羊乳、山羊乳、绵羊乳、配方牛乳、低脂牛乳、无脂牛乳、加工乳，或者与其同等以上的无脂乳固体成分在内的乳等进行发酵，并制成固态或液态而得到的物质；或者将它们冷冻而得到的物质。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为食品添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为膳食补充剂。
在本发明的一种实施方式中，所述膳食补充剂为，采用50～200ppm的亚硒酸钠对灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200进行培养后，制备得到的灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200菌丝体。
在本发明的一种实施方式中，所述保健品为：以灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200、和/或灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述保健品为：以上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述饲料为：在常规饲料中加入灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200、和/或灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物、水，混匀，置于发酵容器中，在25～30℃进行发酵5～7天，即得灵芝饲料。
在本发明的一种实施方式中，所述饲料为：在常规饲料中加入上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物、水，混匀，置于发酵容器中，在25～30℃进行发酵5～7天，即得灵芝饲料。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品为：以灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200、和/灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品为：以上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
本发明的第四个目的是提供了上述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200子实体，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200孢子粉，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的活性提取物，和/或所述灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200的菌丝体，和/或含有上述富硒灵芝子实体，和/或上述富硒灵芝孢子粉，和/或上述富硒灵芝的活性提取物，和/或上述富硒灵芝的菌丝体在制备灵芝产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述提取物包括但不限于灵芝多糖、灵芝酸。
在本发明的一种实施方式中，所述提取物的制备方法为：将灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200或上述富硒灵芝菌丝体进行培养，制备得到的灵芝子实体、菌丝体或灵芝发酵液，从制备得到的灵芝子实体、菌丝体或者发酵液中提取得到。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，富硒灵芝的总硒含量不低于2000mg/kg。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括但不限于：发酵乳、酸乳酪、冷冻酸乳酪、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调味品或饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳是指使乳发酵而得到的发酵乳，包含但不限于例如发酵乳、乳酸菌饮料、乳饮料；即利用乳酸菌或酵母使包含鲜乳、牛乳、羊乳、山羊乳、绵羊乳、配方牛乳、低脂牛乳、无脂牛乳、加工乳，或者与其同等以上的无脂乳固体成分在内的乳等进行发酵，并制成固态或液态而得到的物质；或者将它们冷冻而得到的物质。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为食品添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述保健品为：以灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200、和/灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述保健品为：以上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述饲料为：在常规饲料中加入灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200、和/灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物、水，混匀，置于发酵容器中，在25～30℃进行发酵5～7天，即得灵芝饲料。
在本发明的一种实施方式中，所述饲料为：在常规饲料中加入上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物、水，混匀，置于发酵容器中，在25～30℃进行发酵5～7天，即得灵芝饲料。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品为：以灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200、和/灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品为：以上述富硒灵芝、和/或富硒灵芝的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
本发明的第五个目的是提供了一种灵芝多糖的制备方法，所述方法为，从上述灵芝菌株JNUSE-200或上述富硒灵芝培养得到的灵芝菌丝体或发酵液中提取得到。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200发酵后离心获得发酵上清液，上清液加入四倍无水乙醇4℃沉淀过夜，Seveage法除蛋白，去离子水复溶后，冷冻干燥所得。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200发酵后离心获得菌丝体，沸水浴提取3h，离心获得多糖提取液，将提取液加入四倍无水乙醇4℃沉淀过夜，Seveage法除蛋白，去离子水复溶后冷冻干燥所得。
本发明第六个目的是提供了一种采用上述方法制备得到的灵芝多糖。
有益效果
(1)本发明驯化得到一株具有高耐硒能力的灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200，其在液体发酵过程中可以长期稳定耐受200ppm亚硒酸钠，菌丝体生长正常，菌丝颜色为白色，没有出现刺激性难闻气味。
(2)硒耐受能力的提升对其富硒至关重要，而实验证明，本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200在整个液体发酵生长周期中，均能耐受200ppm亚硒酸钠，菌丝体生长正常，富硒总量可以达到2000mg/kg，因此本菌株具有很广泛的应用前景。
(3)本发明所提供的灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200在200ppm亚硒酸钠的条件下不仅能够正常生长，还能够合成大量的生物活性物质灵芝多糖，实现同时富集有益元素硒和生产活性代谢产物的双重功效。
(4)由实验证实，本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200在200ppm亚硒酸钠的液体发酵培养条件下不仅能够正常生长，其挥发性物质检测结果表明，随着培养时间的增加，其并没有不良气味产生，能够保持其特有的香气。
(5)本发明所提供灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200，证明了食用菌是很好的富硒载体，有利于富硒食用菌产品的开发以及富硒产业的发展及广泛应用，本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200可广泛的应用于食品、保健品、饲料、化妆品等领域中。
生物材料保藏
一株灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200，分类学命名为灵芝JNUSE-200Ganoderma lucidum JNUSE-200，已于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211192，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200PDA平板生长情况。
图2：灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200液体发酵过程中生长情况。
图3：灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200液体发酵4～6天细胞超微结构形态。
图4：灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200在不同浓度亚硒酸钠液体培养基中发酵生长情况。
图5：出发灵芝菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26PDA平板生长情况。
图6：出发灵芝菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26液体发酵过程中生长情况。
图7：出发灵芝菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26液体发酵4～6天细胞超微结构形态。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的菌株Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26购自CGMCC。
本发明现提供以下术语和方法的解释，以更好地阐述本发明并引导所属领域技术人员实践本发明。
本文中所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的含义为“包含但不限于”、“包括但不限于”、“具有但不限于”、“含有但不限于”，并且可与相应的短语进行互换使用。
除非上下文另有明确说明，否则本文中所用术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。
除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。
定义：
本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。
本文所用的术语“驯化”是指微生物驯化，方法为，在细菌培养基中循序渐进的加入靶向环境的材料或基质，让细菌逐渐适应并依赖靶向环境的材料或基质，从而达到改善或改变环境中的有效成分。指经选择在特定的条件下生长来改善其在这些条件下生长并产生产物的能力的微生物。
本文所用术语“平板”是指平板培养基，是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为培养平板，或平板。
本文所用术语“菌丝体”是指是菌丝的集合体，纵横交错，形态各异，具有多样性。菌丝细胞的分裂多在每条菌丝的顶端进行，前端分枝。菌丝在基质中或培养基上蔓延伸展，反复分枝网状成菌丝群，通称菌丝体。
本文所用术语“培养基”是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源。
本文所用术语“培养”是指对所述微生物持续一段时期的培养直到达到一种希望的目标为止。
本文所用的单位ppm浓度(parts per million)是用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度，也称百万分比浓度。经常用于浓度非常小的场合下，与之相似的还有ppb(parts per billion)。对于气体，ppm一般指摩尔分数或体积分数，对于溶液，ppm一般指质量浓度。
本文所用术语“硒富集能力”是指：灵芝菌丝体在液体发酵生长过程中，培养基中所添加的无机硒亚硒酸钠转运到菌丝体内的能力，即菌丝体所吸收利用的元素硒含量。
本文所用术语“挥发性物质”解释如下：
挥发性物质对食药用真菌的风味至关重要。对食药用真菌气味成分的研究是至关重要的，挥发性硒化合物往往被忽视，因为它们在样品分析过程中很容易丢失。甲基化是一种在食药用真菌硒代谢中起重要作用的生物过程，产生挥发性硒化合物，如二甲基硒化物(DMSe)和二甲基二硒化物(DMDSe)，这将导致剧烈的气味变化。随着Na2SeO3浓度的增加，灵芝在液体培养中释放的挥发性硒化合物的种类和含量明显增加，最终产生强烈的刺激性气味。在灵芝中检测到多达十种挥发性硒化合物，包括二甲基硒化物和甲基二硒化物，它们也是植物挥发或硒生物甲基化产生的主要挥发性硒代谢物(参见Moreno-Martin,G.；Sanz-Landaluze,J.；León-Gonzalez,M.E.；Madrid,Y.In-vivo solid phase microextractionfor quantitative analysis of volatile organic selenium compounds inplants.Anal.Chim.Acta 2019,1081,72–80)。
挥发性硒化合物的产生是一种在高硒条件下发生的自我解毒机制，挥发性硒化合物的产生可以降低无机硒化合物的浓度和毒性(参见Radhika,B.；Gonzalo,A.P.；Rebecca,A.M.；Claudio,C.V.；Thomas,G.C.Production of dimethyl triselenide and dimethyldiselenenyl sulfide in the headspace of metalloid-resistant Bacillus speciesgrown in the presence of selenium oxyanions.Anal.Biochem.2010,396,217–222)。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
灵芝菌株斜面PDA固体培养基(g·L-1)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉20。
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
二级液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
下述实施例中所涉及的菌种培养如下：
将灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200菌株，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7～10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7～10天，制备得到灵芝液体种子液；
将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养10天。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
硒含量的检测：
准确称取菌丝体干粉50.00mg，加入3mL浓硝酸冷硝化过夜，之后放入微波消化系统(MARS6,美国)在250℃高温消化20分钟。消化液用超纯水定容到100mL体积，适当稀释后，用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS；ICAP TQ,Thermo Fisher scientific Inc.)测定硒浓度。硒的测量利用M-TQ-O2模式，流速3.5mL/min，m/z 80。以经过认证的标准物质(GSB-29，猪肝，中华人民共和国标准参考中心)在每批样品中以进行质量控制。GSB-29的回收率在89～111％之间。所有样本进行3次生物重复。
生物量测定：
将发酵产物12000rpm离心10分钟，收集沉淀菌丝体，用去离子水清洗3次除去表面培养基，冷冻干燥得到菌丝体，称重即为生物量。
多糖检测：
多糖提取：取100mL发酵液滤液，加4倍的无水乙醇，搅拌20min，于4℃静置过夜。溶液经10000r·min-1离心5min，去上清，沉淀加75％乙醇洗3次，10000r·min-1离心5min获得沉淀，加30mL蒸馏水振荡至完全溶解，10000r·min-1离心10min，清液即为水溶性多糖的溶液。
多糖测定：测定多糖的含量，采用苯酚硫酸法，测定体系为2mL的样品溶液，1mL的6％的苯酚，5mL的浓硫酸。冷却后在490nm的波长下测定OD值。
挥发性硒化合物的检测方法：
将上清液(3mL)精确取样于20mL顶空瓶中，密封，并放置在顶空固相微萃取气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS，TSQ8000，美国赛默飞世尔科技有限公司)的顶空采样器上，该采样器配备HP-5(60m×0.25mm×0.25μm)。萃取头在GC入口进行预处理，直到没有杂质峰，然后在55℃下萃取30分钟。吸附的挥发性化合物在250℃下解吸5分钟，然后注入GC。同时，该仪器用于收集数据。使用以下参数：萃取头：DVB/CAR/PMDS；载气，氦气，1.2ml/min；程序升温条件，40℃持续1分钟，4℃/min至120℃，10℃/min至240℃持续6分钟；离子源温度，300℃；离子势，70ev；电离模式，EI+；质量扫描范围m/z，33–350amu。通过使用保留时间指数和片段的m/z，将鉴定的质谱与NIST 2017进行比较，鉴定挥发性硒化合物。每种确定的挥发性硒化合物的相对含量表示为二甲基硒化物峰面积的相对百分位数(n＝3)(50ppm组第4天。
下述实施例中所涉及的Seveage法去除蛋白具体操作如下：
用Seveage结合法脱蛋白：多糖溶液以体积(5:1)加入Seveage试剂，混合物剧烈震荡30分钟，10000rpm离心5分钟，去掉有机相和水相之间的变相蛋白。反复进行至无蛋白层。得到粗多糖溶液，冻干待用。
Seveage试剂：正丁醇：氯仿(v:v)＝1:4或1:5。
下述实施例中所涉及的灵芝菌株液体发酵过程的生长情况的评价标准如下：
灵芝正常生长情况：在整个生长过程中，菌丝缠绕形成菌球，菌丝体颜色为白色；发酵液没有刺激性难闻气味；随着发酵的进行，生物量呈现增长趋势。
灵芝异常生长情况：在生长过程中，菌丝体有白色逐渐变为橙色或者红色；发酵液散发刺激性难闻气味；生物量出现出现明显下降趋势。
实施例1：菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的获得及形态学分析
1、灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200的获得
(1)配置液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC NO.5.26接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7～10天，待平板长满菌丝体。
(3)将步骤(2)得到的生长好的菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到步骤(1)得到的液体种子培养基中，30℃培养10天，待菌丝体生长缠绕形成菌球。
(4)在超净台中，用无菌水清洗菌球，将其转接到含有亚硒酸钠的PDA固体平板进行培养，亚硒酸钠浓度为200ppm。每个平板放置一个菌球，将平板密封转移至30℃培养箱中培养。观察上述平板生长情况，选择菌丝萌发正常的灵芝固态平板进行转接，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到含有200ppm亚硒酸钠的液体发酵培养基中，于30℃，150rpm摇床培养；待菌丝体萌发长出菌球，重复上一步操作。
在驯化过程中，不断提高亚硒酸钠浓度，依次为200ppm、500ppm、1000ppm。将每次驯化得到的菌种接到PDA固体培养基上，待斜面覆盖满菌丝后，置于4℃保存。
得到灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200。
2、灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200形态学分析：
采用PDA培养基、固体平板培养法培养菌株，光学显微镜对其进行形态学观察。
将灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200在PDA培养基(培养基含有1000ppm亚硒酸钠)上，30℃培养7天，菌落直径4～5cm，6～7天菌落铺满整个培养皿，培养基表面以接种块为中心，呈放射状的形成一层较厚白膜，菌落边缘不平整，中间较厚，边缘较薄，整个菌落丝状交织紧密。菌丝体呈白色，气生菌丝旺盛，有明显的爬壁性，无色素分泌；生殖菌丝管状、透明，有明显的锁状联合。灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在PDA固体平板生长情况如图1所示。
实施例2：驯化灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的富硒液体发酵培养
具体步骤如下：
(1)将灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200菌株，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养7～10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7～10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养10天。
二级液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
对其液体发酵过程的生长情况进行评估，并测定菌丝体生物量和主要代谢产物多糖产量，及检测挥发性硒化合物；结果显示，灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200液体发酵生长情况如表1及图2～图3所示。
表1灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200生物量及胞外多糖产量
Figure BDA0003412979580000111
由表1及图2可知，在液体发酵过程中，菌丝体正常生长，菌丝颜色为白色。在此过程中，没有出现刺激性难闻气味，也没有检测到挥发性硒化合物。
在200ppm亚硒酸钠培养过程中，随着发酵的进行，灵芝菌株Ganoderma lucidumJNUSE-200生物量呈现先增长后略微降低的趋势，在第8天达到最大值9.2g/L；
由图3可知，在200ppm亚硒酸钠培养过程中灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的生长状况，同其在未添加亚硒酸钠的培养基中的生长状况一致，因此，本发明的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200具有高耐硒能力。
随着培养时间的增加，主要活性代谢物胞外多糖产量也不断增长，到第8天达到最大值0.75mg/L。
实施例3：灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200硒富集能力测定
具体实施方式同实施例2，在发酵过程中，对发酵液中的菌丝体富硒能力(总硒含量)进行测定，具体测定方法如下：
(1)制备菌丝体干粉：
分别取发酵第3d，4d，5d，6d，7d，8d，9d，10d制备得到的发酵液，在12000rpm离心10分钟，留沉淀物(菌丝体)；用去离子水冲洗菌丝体3次，将所得菌丝体冷冻干燥，分别得到菌丝体干粉。
(2)分别将步骤(1)制备得到的菌丝体干粉进行硒元素含量的检测，结果如表2所示。
表2灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200富集硒总量
Figure BDA0003412979580000121
结果显示，经测定，灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200在发酵过程中，富集量逐渐增加，在第9天达到最大值2290.06mg/kg。
实施例4：灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200在不同浓度无机硒存在条件下的生长情况
具体步骤如下：
(1)将灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7～10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7-10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)制备二级液体发酵培养基：
按照葡萄糖20g·L-1，胰蛋白胨5g·L-1，无氨基酵母(YNB)5g·L-1，七水硫酸镁2g·L-1，磷酸二氢钾4.5g·L-1的配比进行配置得到溶液1，
分别将亚硒酸钠按照200ppm，250ppm，300ppm，400ppm，500ppm的添加量(即：亚硒酸钠按照0.2g·L-1，0.25g·L-1，0.3g·L-1，0.4g·L-1，0.5g·L-1)添加至溶液1中，分别得到二级液体发酵培养基1～5。
(3)将步骤(1)制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)1～5中，分别于30℃，150rpm摇床培养6-8天，对其液体发酵过程的生长表现情况进行评估，结果如图4所示。
结果显示，在含有200ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在整个生长周期中均能正常生长，菌丝体为白色；也没有检测的难闻刺激性气味的挥发性硒化合物的产生，由此可见该菌株可以长期耐受200ppm亚硒酸钠。
而亚硒酸钠浓度高于200ppm培养时，菌丝体均出现生长异常情况；且随着添加浓度的提高，菌丝体颜色由白色逐渐变为橙色或者红色，且变色的时间随着外源添加硒浓度的提高而提前。
如图4所示，发酵开始1～4天，在含有200ppm，250ppm，300ppm，400ppm，500ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基1～5中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在整个生长周期中均能正常生长，菌丝体为白色，没有难闻刺激性气味产生；
发酵第5天，在含有200ppm，250ppm，300ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在整个生长周期中均能正常生长，菌丝体为白色，没有难闻刺激性气味产生；而在含有400ppm，500ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体无法正常生长；
发酵第6天，在含有200ppm，250ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在整个生长周期中均能正常生长，菌丝体为白色，没有难闻刺激性气味产生；而在含有300ppm，400ppm，500ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体无法正常生长；
发酵第7～11天，只有在含有200ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体在整个生长周期中均能正常生长，菌丝体为白色，没有难闻刺激性气味产生；而在含有250ppm，300ppm，400ppm，500ppm亚硒酸钠二级液体发酵培养基中培养的灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌丝体无法正常生长；
并且，随着时间的延长，依旧还是这种情况，证明本发明的灵芝菌株Ganodermalucidum JNUSE-200菌丝体可以在含有200ppm亚硒酸钠的液体发酵培养基中稳定的生长。
对比例1：灵芝出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26平板耐受性实验
具体步骤如下：
(1)将出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养7～10天，待平板长满菌丝体。用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到液体种子培养基中，30℃培养6-8天，待菌丝体生长缠绕形成菌球。
液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)在超净台中，用无菌水清洗菌球，将其转接到含有亚硒酸钠的PDA固体平板进行培养，亚硒酸钠浓度为1000ppm。每个平板放置一个菌球，将平板转移至30℃培养箱培养。并标记平板。
结果显示，出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26PDA固体平板生长情况如图5所示：菌丝体颜色由白色变为橙色或者红色，无法正常生长。
对比例2：灵芝出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26液体发酵过程耐受性
具体步骤如下：
(1)将出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养7～10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7～10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将一级种子液接种到二级发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养6～8天。
二级发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
对其液体发酵过程的生长情况进行评估，并测定菌丝体生物量级胞外多糖产量，结果如表3和图6所示。
表3出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26生物量及胞外多糖产量
Figure BDA0003412979580000141
结果显示：由出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26液体发酵生长情况可以看出，第2～4天菌丝体颜色为白色，并且生物量在逐步的减少，第5～8天菌丝体颜色由白色逐渐变为橙色及红色，且伴随着具有刺激性难闻气味的挥发性硒化合物的产生(如表4所示)，并且其生物量急剧降低。
表4 Ganoderma lucidum CGMCC 5.26挥发性硒化合物分析
Figure BDA0003412979580000142
Figure BDA0003412979580000151
可见，在200ppm亚硒酸钠培养出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26的过程中，随着发酵的进行，生物量呈现先增长后迅速下降趋势；菌丝体生物量下降表明菌体细胞开始凋亡(如图7所示)，生长不正常；此外，在该过程中，随着菌体生物量下降，胞外多糖产量显著下降。
对比例3：灵芝出发菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26硒富集能力测定
具体实施方式同对比例2，在发酵过程中，对灵芝Ganoderma lucidum CGMCC 5.26发酵液中的菌丝体富硒能力(总硒含量)进行测定，具体测定方法如下：
(1)制备菌丝体干粉：将灵芝Ganoderma lucidum CGMCC 5.26发酵液，于12000rpm离心10分钟，留沉淀物(菌丝体)；用去离子水冲洗菌丝体3次，将所得菌丝体冷冻干燥，即为菌丝体干粉。
(2)将步骤(1)制备得到的菌丝体干粉进行硒元素含量的检测。由于发酵第5天开始，灵芝无法正常生长，菌丝体颜色变红，仅对正常生长的菌丝体(即第3-4天)进行富集量测定。结果为：经测定，灵芝菌株Ganoderma lucidum CGMCC 5.26在第3、4天的硒富集量分别为1227.208mg/kg、1398.41mg/kg。
实施例5：采用灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200制备灵芝多糖
发酵液的具体实施方式同实施例2，在发酵过程中，对发酵液中的胞外多糖进行提取，具体方法如下：
(1)将灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200菌株，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7～10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7-10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养8天。
二级液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
(3)多糖提取制备：取发酵液离心后上清100mL，加4倍体积无水乙醇，4℃醇沉过夜，12000rpm离心10min。沉淀复溶到去离子水中。用Seveage结合法脱蛋白：多糖溶液以体积(5:1)加入Seveage试剂，混合物剧烈震荡30min，10000rpm离心5min，去掉有机相和水相之间的变相蛋白。反复进行至无蛋白层。所得水相即为得多糖溶液，待用。
实施例6：含有灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的饲料的制备
(1)将灵芝菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200菌株，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7-10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7-10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养8天，得到发酵液。
二级液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
(3)将步骤(2)制备得到的发酵液与无菌发酵底料(玉米粉：麸皮：豆粕＝1:1:1)混合均匀，调节水分至50％左右，接种量10％(v/v)，接种完成后，30℃发酵培养5～7天即可。
实施例7：含有灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的保健品的制备
(1)将灵芝Ganoderma lucidum JNUSE-200菌株，接种到PDA固体培养基上，于30℃培养箱培养约7-10天，待平板长满菌丝体，用接种针取1.0cm2的小块，切碎转接到一级液体种子培养基中，于30℃，150rpm摇床培养7-10天，制备得到灵芝液体种子液；
一级液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5。
(2)将制备得到的灵芝液体种子液匀浆，按照接种量为300mg/150mL，将种子液接种到二级液体发酵培养(150mL/500mL)，于30℃，150rpm摇床培养8天，得到发酵物。
二级液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾4.5，亚硒酸钠0.2。
(3)将发酵物(包括菌丝体和上清液)进行均质匀浆，喷雾干燥，得到均一的富硒灵芝菌粉。
实施例8：含有灵芝多糖的化妆品的制备
按照实施例5的方法提取制备灵芝多糖溶液5g，将其与角鲨烷10g，赛比克305 2g，蒸馏水70g，甘油5g，防腐剂1g混合均匀，搅拌至完全乳化，制备成保湿霜。
经检测，制备得到的保湿霜具有很好的保湿功效，使用者肌肤变得柔软光滑。
实施例9：含有灵芝驯化菌株Ganoderma lucidum JNUSE-200的食品
按照实施例5的方法提取制备灵芝多糖溶液，将其与蜂蜜以体积比(95:5)混匀，按照口服溶液的国家标准制备得到灵芝多糖口服溶液。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200，其特征在于，所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211192，保藏日期为2021年9月17日。
2.一种富硒灵芝，其特征在于，所述灵芝为：将权利要求1所述的灵芝菌株(Ganodermalucidum)JNUSE-200子实体，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200孢子粉，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的菌丝体接种至含有无机硒的培养基中进行培养制备得到。
3.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的灵芝菌株(Ganodermalucidum)JNUSE-200子实体，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200孢子粉，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的活性提取物，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的菌丝体；
或，所述产品中，含有权利要求2所述的富硒灵芝子实体，和/或权利要求2所述的富硒灵芝孢子粉，和/或权利要求2所述的富硒灵芝的活性提取物，和/或权利要求2所述的富硒灵芝的菌丝体。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品、保健品、饲料或化妆品。
5.如权利要求3或4所述的产品，其特征在于，所述提取物包括但不限于灵芝多糖、灵芝酸。
6.权利要求1所述的灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200子实体，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200孢子粉，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的活性提取物，和/或所述灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的菌丝体，和/或含有权利要求2所述的富硒灵芝子实体，和/或权利要求2所述的富硒灵芝孢子粉，和/或权利要求2所述的富硒灵芝的活性提取物，和/或权利要求2所述的富硒灵芝的菌丝体在制备灵芝产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品、保健品、饲料或化妆品。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述保健品以灵芝菌株(Ganodermalucidum)JNUSE-200、和/或灵芝菌株(Ganoderma lucidum)JNUSE-200的粉末，和/或其提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的；或，所述保健品以权利要求2所述的富硒灵芝、和/或权利要求2所述的富硒灵芝粉末，和/或权利要求2所述的富硒灵芝提取物为活性成分，加上可接受的辅料制备而成的。
9.一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于，从权利要求1所述的灵芝菌株(Ganodermalucidum)JNUSE-200或权利要求2所述的富硒灵芝培养得到的灵芝菌丝体或者发酵液中提取得到。
10.采用权利要求9所述的方法制备得到的灵芝多糖。
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