CN114230683B - 一种两性离子聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种两性离子聚合物及其制备方法与应用。该两性离子聚合物的制备方法包括以下步骤：1)在碱性条件下，将含有羟基的聚合物与卤代环氧烃反应后形成含有环氧基团的聚合物；2)将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中，混合后反应得到所述两性离子聚合物。该两性离子聚合物作为电极的涂层材料，能够防止非特异性蛋白质的粘附，减少异物反应的发生，避免严重的免疫反应；此外，具有超强的粘附性，不易从电极表面脱落。

Description

一种两性离子聚合物及其制备方法与应用

技术领域

本申请涉及一种两性离子聚合物及其制备方法与应用，属于电化学生物传感器技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，它会导致患者机体内的胰腺无法分泌足够的胰岛素，或机体内的细胞对胰岛素反应不佳。长期处于高血糖状态可引起多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官出现慢性病变、功能衰退及衰竭。病情严重时可发生急性严重代谢紊乱，如酮症酸中毒、高渗高血糖综合征。随着社会的发展，人类患糖尿病的风险在逐年增加。据国际糖尿病联合会(IDF)估计，预计在2045年，全球成年糖尿病患者数将增加48％，由4.25亿(2017年)增长至6.25亿。糖尿病已成为人类迫切需要共同面对和解决的全球性公共卫生问题。目前，糖尿病患者的临床治疗方法是每天数次测量手指扎取的血液中的血糖水平，然后注射胰岛素使血糖回到正常范围。但这种治疗方式对糖尿病患者餐后出现的高血糖以及夜间的低血糖事件难以做到较为精准的控制，因为患者需要依靠血糖水平的实时数据才能及时调整胰岛素注射剂量。这些缺陷加上重复刺指试验带来的疼痛，使得该方法对患者和医生都极为不便。

在过去的几十年里，更复杂的植入式血糖追踪设备，如连续血糖监测仪(CGM)已经被开发出来。CGM的电极植入人体后引起的异物反应会引起检测到的血糖水平波动，因此，异物反应包括炎症反应是目前植入式传感器发展面临的主要障碍，非特异蛋白在植入式传感器界面的粘附是出现异物反应的主要因素。

发明内容

为了解决上述问题，提供了一种两性离子聚合物及其制备方法与应用，该两性离子聚合物作为电极的涂层材料，能够防止非特异性蛋白质的粘附，减少异物反应的发生，避免严重的免疫反应；此外，具有超强的粘附性，不易从电极表面脱落。

根据本申请的一个方面，提供了一种两性离子聚合物的制备方法，其包括以下步骤：

1)在碱性条件下，将含有羟基的聚合物与卤代环氧烃反应后形成含有环氧基团的聚合物；

2)将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中，混合后反应得到所述两性离子聚合物。

可选地，步骤1)中，将含有羟基的聚合物与卤代环氧烃混合后，加入强碱，使得所述强碱在反应体系中的浓度为0.2-1.5mol/L，混合后在0-40℃下，反应至少10min；

优选的，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。

可选地，步骤2)中，将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中混合，在非活性气体氛围下，50-90℃下，反应至少3h；

优选的，将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中混合得到反应体系，将所述反应体系的pH调节至8-10，在非活性气体氛围下，50-90℃下反应3-24h，反应结束后，将所述反应体系的pH调节至4.5-5.5，用去离子水透析后，干燥得到所述两性离子聚合物。

可选地，步骤1)中，所述含有羟基的聚合物中的重复结构单元与所述卤代环氧烃的摩尔比为1:0.5-5，优选为1：1.5；和/或

步骤2)中，所述含有环氧基团的聚合物中的环氧基团、多巴胺类衍生物及氨基酸的摩尔比为8-12：0.8-1.2：7-11，优选为10：1：9。通过控制不同原料之间的配比，保证环氧基团反应完全。少量的多巴胺接枝上聚合物以保证该两性离子聚合物与葡萄糖限制膜结合，提高与限制膜的结合能力；较多的氨基酸接枝上聚合物从而产生较多的两性离子结构，水合能力更强，进一步增强抗蛋白黏附能力和抗细胞黏附性能。

可选地，所述含有羟基的聚合物选自天然多糖或合成聚合物，

其中，所述天然多糖选自葡聚糖、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯糖、水溶性淀粉、肝素和琼脂糖中的至少一种，所述合成聚合物选自聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟丙酯、聚N-(2-羟乙基)丙烯酰胺、聚N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺中的至少一种；

优选的，所述含有羟基的聚合物为葡聚糖。通过选择该聚合物，能够提高生物相容性，且能够提高电极的抗蛋白黏附和抗细胞黏附能力。

可选地，所述卤代环氧烃选自环氧氯丙烷或环氧溴丙烷，优选为环氧氯丙烷。

可选地，所述多巴胺类衍生物选自选自盐酸多巴胺、溴氢酸多巴胺、5-羟基多巴胺盐酸盐、6-羟基多巴胺和去甲肾上腺素中的至少一种，优选为盐酸多巴胺；和/或

所述氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸中的至少一种，优选为L-天门冬氨酸。

根据本申请的另一个方面，提供了一种由上述任一项所述的制备方法制得的两性离子聚合物。

根据本申请的再一个方面，提供了一种用于葡萄糖传感器的工作电极，其包括：电极本体，所述电极本体上至少依次叠加有酶层和聚合物层，所述酶层包括葡萄糖氧化酶，所述聚合物层由上述任一项所述的制备方法制得的两性离子聚合物或上述的两性离子聚合物制备得到；

优选的，所述酶层和聚合物之间还设置有限制膜，所述限制膜的材质包括聚氨酯、环氧树脂聚合物、聚氯乙烯、全氟磺酸树脂、丙烯酸树酯聚合物、乙烯基吡啶类共聚物和乙烯基咪唑类共聚物中的至少一种，优选为聚氨酯。

可选地，所述酶层的厚度为1μm-10μm，优选为3μm；所述限制膜的厚度为20μm-60μm，优选为30μm；所述聚合物层的厚度为10μm-30μm，优选为15μm。通过控制酶层厚度能保证有适量的酶来催化葡萄糖氧化生成电子产生电流，且保证酶层不会因为厚度太厚而开裂；限制膜厚度的设置保证对葡萄糖渗透具有合适的通量，提高检测的线性范围；两性离子聚合物层的厚度的设置能保证电极插入体内后能形成较厚的水化层，提高电极的生物相容性、抗蛋白黏附性、抗细胞黏附性，从而提高电极测试的准确性和使用寿命。

可选地，所述聚合物层的制备步骤为：将所述两性离子聚合物加入至缓冲溶液，形成聚合物溶液；

在避光条件下，将至少依次叠加有酶层的工作电极浸泡至所述聚合物溶液中反应，清洗后得到所述工作电极。

优选的，所述缓冲溶液为Tris缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH为8-11。

优选的，所述聚合物溶液的浓度为1-100mg/mL，优选为20mg/mL。该设置方式能够在较短时间内在电极表面涂附合适厚度的两性聚合物层，进而优化了涂附工艺。

优选地，在避光条件下，将至少依次叠加有酶层的工作电极浸泡至所述聚合物溶液中，20-40℃下反应3-24h，清洗后得到所述工作电极。

根据本申请的又一个方面，提供了一种葡萄糖传感器，其包括对电极和上述所述的工作电极。

本申请的有益效果包括但不限于：

1.根据本申请的两性离子聚合物，在强碱条件下，含有羟基的聚合物与卤代环氧烃发生反应，生成含有环氧基团的聚合物，该聚合物中的环氧基团部分与多巴胺类衍生物中的氨基反应后开环形成可自粘附的邻位二酚羟基结构，部分与氨基酸中的氨基发生反应后开环形成两性离子结构。该两性离子聚合物作为电极的涂层材料，可以通过离子-偶极作用形成致密、稳定的水化层，该水化层能够防止非特异性蛋白质的粘附，减少异物反应的发生，避免严重的免疫反应；多巴胺类衍生物中的酚羟基能够与电极的限制膜层形成共价键或非共价键，从而具有超强的粘附性，不易从电极表面脱落。

2.根据本申请的用于葡萄糖传感器的工作电极，先形成两性离子聚合物，然后将聚合物接枝到聚合物表面，保证接枝前的聚合物充分透析去除了毒性小分子，确保了该工作电极具有良好的生物相容性，进一步减少异物反应的发生。

3.根据本申请的用于葡萄糖传感器的工作电极，聚合物层与限制膜层之间的结合能力强，不易发生脱落，可以克服电极被取出时该聚合物层脱落留在人体内的问题；此外，能够降低信号噪声，准确记录人体内血糖水平，且不需要重新校准。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请实施例1涉及的工作电极1#接触角测试图。

图2为本申请实施例1涉及的工作电极1#荧光测试图。

图3为本申请实施例1涉及的工作电极1#生物相容性测试图。

图4为本申请实施例1涉及的工作电极1#H&E染色切片测试图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

实施例1工作电极1#

工作电极1#的制备方法包括以下步骤：

1)将葡聚糖水溶液(20％,w/v；50mL)与7.5mL环氧氯丙烷混合，加入20mL浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液，室温搅拌20min至溶液不产生相分离，加入500mL乙醇产生沉淀，并用乙醇洗涤沉淀得到含有环氧基团的聚合物；

2)将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、1mL浓度为1mmol/L的盐酸多巴胺溶液及9mL浓度为1mmol/L的L-天门冬氨酸溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到两性离子聚合物；

3)将步骤2)得到的两性离子聚合物溶于pH＝9的Tris缓冲溶液中，形成1mg/mL的聚合物溶液；

4)在电极本体表面涂覆葡萄糖氧化酶，固化后形成厚度为3μm的酶层，在酶层表面继续刮涂聚氨酯，固化后在酶层表面形成厚度为30μm的限制膜层，将附着有酶层及限制膜层的电极在避光条件、25℃下，浸泡在步骤3)中的聚合物溶液中反应12h，反应完后使用去离子水清洗，并在室温下真空干燥得到工作电极1#。

实施例2工作电极2#

工作电极2#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤1)中，将海藻酸钠水溶液(2％,w/v；100mL)与1.5mL环氧氯丙烷混合，加入5mL浓度为5M的氢氧化钠溶液，室温搅拌20min至溶液不产生相分离，加入1L乙醇产生沉淀，并用乙醇洗涤沉淀得到含有环氧基团的聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例3工作电极3#

工作电极3#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤1)中，将聚甲基丙烯酸羟乙酯的四氢呋喃溶液(2.6％,w/v；100mL)与2.5mL环氧氯丙烷混合，加入5mL浓度为5M的氢氧化钠溶液，室温搅拌20min至溶液不产生相分离，加入800mL乙醚产生沉淀，并用去离子水洗涤沉淀得到含有环氧基团的聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例4工作电极4#

工作电极4#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤1)中，将葡聚糖水溶液(20％,w/v；50mL)与7.5mL环氧氯丙烷混合，加入10mL浓度为5M的氢氧化钠溶液，室温搅拌20min至溶液不产生相分离，加入500mL乙醇产生沉淀，并用乙醇洗涤沉淀得到含有环氧基团的聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例5工作电极5#

工作电极5#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、5mL浓度为1mmol/L的盐酸多巴胺溶液及5mL浓度为1mmol/L的L-天门冬氨酸溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到两性离子聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例6工作电极6#

工作电极6#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、0.1mL浓度为1mmol/L的盐酸多巴胺溶液及9.9mL浓度为1mmol/L的L-天门冬氨酸溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到两性离子聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例7工作电极7#

工作电极7#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、1mL浓度为1mmol/L的盐酸多巴胺溶液及9mL浓度为1mmol/L的L-谷氨酸溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到两性离子聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实施例8工作电极8#

工作电极8#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，在电极本体表面涂覆葡萄糖氧化酶，固化后形成厚度为3μm的酶层，在酶层表面继续刮涂聚氨酯，固化后在酶层表面形成厚度为30μm的限制膜层，将附着有酶层及限制膜层的电极在避光条件、25℃下，浸泡在步骤3)中的聚合物溶液中反应8h，反应完后使用去离子水清洗，并在室温下真空干燥得到工作电极1#，其余步骤与实施例1相同。

对比例1工作电极D1#

工作电极D1#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、10mL浓度为1mmol/L的L-天门冬氨酸溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到两性离子聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

对比例2工作电极D2#

工作电极D2#的制备步骤与实施例1的不同之处在于：步骤2)中，将50mL含有2g步骤1)得到的含有环氧基团的聚合物水溶液、10mL浓度为1mmol/L的盐酸多巴胺溶液混合后，调节pH＝10，在氮气氛围下，50℃反应24h，反应完全后，调节pH＝5，用去离子水透析三天并冷冻干燥得到聚合物；

其余步骤与实施例1相同。

实验例

对实施例1-8、对比例1-2得到的两性离子聚合物附着在限制膜层表面，(附着的方法如实施例1所述，分别记为复合膜1#-8#及D1#-D2#，其中复合膜8#中的两性离子聚合物与限制膜的反应时间为8h，其余实施例与对比例的反应时间为12h)进行测试，分别测试其接触角和生物相容性，测试结果如表1所示，测试方法如下：

接触角：将涂有两性离子聚合物的限制膜材料制成直径1cm的规格，样品表面平整光滑。在25℃条件下，以水为流动相。每次滴下25μL的水珠到材料的表面。等水珠滴到材料表面立即使用接触角软件拍照并自动计算接触角大小。

生物相容性：L929成纤维细胞使用DMEM培养基(含有10％FBS+1％青链霉素混合液)在含有5％CO₂大气氛围37℃环境下培养。将L929细胞种植在96孔板中，并培养24h，种植密度为2×103个/孔。对于直接接触法，将灭菌后的涂有两性离子聚合物的限制膜材料慢慢地放在细胞的顶部，并继续培养24h。然后移除水凝胶并用MTT法测细胞存活率。对于提取液法，将灭菌后的涂有两性离子聚合物的限制膜材料(1cm×1cm×1mm)与15mL DMEM培养基在37℃培养24h制备提取液。在96孔板种植的细胞继续用提取液培养24h，用MTT法测细胞存活率。表1列出了采用直接接触法测试的生物相容性数据。

表1

编号	接触角/°	生物相容性
			复合膜1#	25	110％
复合膜2#	28	100％
			复合膜3#	32	97％
复合膜4#	33	102％
			复合膜5#	35	120％
复合膜6#	18	95％
			复合膜7#	31	111％
复合膜8#	30	97％
			复合膜D1#	85	82％
复合膜D2#	43	122％

由表1可以看出，复合膜1#的接触角小，即抗蛋白吸附及抗细菌吸附能力强，且具有优异的生物相容性；复合膜D1#中的两性离子聚合物中未加入多巴胺类衍生物，因此与限制膜没有结合力，无法与限制膜相结合；复合膜D2#中的两性离子聚合物中未加入氨基酸，因此抗亲水性差，抗蛋白吸附及细菌黏附的性能差。

另外，对未经两性离子聚合物修饰的限制膜与经两性离子聚合物修饰的复合膜1#进行接触角测试，测试结果如图1所示，其中，图1(a)为未经两性离子聚合物修饰的限制膜的水接触角，为88°，图1(b)为经两性离子聚合物修饰的复合膜1#的水接触角，为25°，说明该两性离子聚合物形成的修饰膜为超亲水材料，能够抗蛋白吸附。

如图2所示，对未经两性离子聚合物修饰的限制膜1#与经两性离子聚合物修饰的复合膜1#进行荧光测试，分别将二者与BSA溶液共培养24h后，得到FITC标记的荧光照片，其中，图2a为未经两性离子聚合物修饰的限制膜1#的荧光照片，图2b为经两性离子聚合物修饰的复合膜1#的荧光照片，从图中可以看出，经两性离子聚合物修饰的复合膜1#增强了抗蛋白粘附性。

如图3所示，对空白96孔板(记为对照组)、未经两性离子聚合物修饰的限制膜(记为聚氨酯组)与经两性离子聚合物修饰的复合膜1#(记为两性离子聚氨酯组)进行生物相容性测试，可以看出，经两性离子聚合物修饰的复合膜1#的生物相容性良好。

如图4所示，将未经两性离子聚合物修饰的限制膜与经两性离子聚合物修饰的复合膜1#分别埋入大鼠皮下一周后，得到大鼠皮下组织H&E染色切片，其中，图4a为未经两性离子聚合物修饰的限制膜的染色切片，可以看出具有较多的炎症细胞，图4b为经两性离子聚合物修饰的复合膜1#的染色切片，可以看出炎症细胞少，即炎症反应较轻。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种两性离子聚合物的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

1）将含有羟基的聚合物与卤代环氧烃混合后，加入强碱，使得所述强碱在反应体系中的浓度为0.2-1.5mol/L，混合后在0-40℃下，反应至少10min，形成含有环氧基团的聚合物，所述含有羟基的聚合物中的重复结构单元与所述卤代环氧烃的摩尔比为1:0.5-5；

2）将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中混合，在非活性气体氛围下，50-90℃下，反应至少3h，得到所述两性离子聚合物，所述含有环氧基团的聚合物中的环氧基团、多巴胺类衍生物及氨基酸的摩尔比为8-12：0.8-1.2：7-11；

所述含有羟基的聚合物选自天然多糖或合成聚合物，其中，所述天然多糖选自葡聚糖、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯糖、水溶性淀粉、肝素和琼脂糖中的至少一种，所述合成聚合物选自聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟丙酯、聚N-(2-羟乙基)丙烯酰胺、聚N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺中的至少一种，所述卤代环氧烃选自环氧氯丙烷或环氧溴丙烷。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，将所述含有环氧基团的聚合物、多巴胺类衍生物及氨基酸加入至溶剂中混合得到反应体系，将所述反应体系的pH调节至8-10，在非活性气体氛围下，50-90℃下反应3-24h，反应结束后，将所述反应体系的pH调节至4.5-5.5，用去离子水透析后，干燥得到所述两性离子聚合物。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述含有羟基的聚合物中的重复结构单元与所述卤代环氧烃的摩尔比为1：1.5；和/或

步骤2）中，所述含有环氧基团的聚合物中的环氧基团、多巴胺类衍生物及氨基酸的摩尔比为10：1：9。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有羟基的聚合物为葡聚糖；和/或

所述卤代环氧烃为环氧氯丙烷。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多巴胺类衍生物选自选自盐酸多巴胺、溴氢酸多巴胺、5-羟基多巴胺盐酸盐、6-羟基多巴胺和去甲肾上腺素中的至少一种；和/或

所述氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述多巴胺类衍生物为盐酸多巴胺；和/或

所述氨基酸为L-天门冬氨酸。

8.一种由权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的两性离子聚合物。

9.一种用于葡萄糖传感器的工作电极，其特征在于，其包括：电极本体，所述电极本体上至少依次叠加有酶层和聚合物层，所述酶层包括葡萄糖氧化酶，所述聚合物层由权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的两性离子聚合物或权利要求8中的两性离子聚合物制备得到。

10.根据权利要求9所述的工作电极，其特征在于，所述酶层和聚合物之间还设置有限制膜，所述限制膜的材质包括聚氨酯、环氧树脂聚合物、聚氯乙烯、全氟磺酸树脂、丙烯酸树脂聚合物、乙烯基吡啶类共聚物和乙烯基咪唑类共聚物中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的工作电极，其特征在于，所述聚合物层的制备步骤为：将所述两性离子聚合物加入至缓冲溶液，形成聚合物溶液；

在避光条件下，将至少依次叠加有酶层的工作电极浸泡至所述聚合物溶液中反应，清洗后得到所述工作电极。

12.一种葡萄糖传感器，其特征在于，其包括对电极和权利要求10或11所述的工作电极。

Images