CN114209839B - 一种药物组合物在治疗胶质瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种药物组合物在治疗胶质瘤中的应用，具体的，本发明公开了藤黄酰胺和蛋白酶体抑制剂对胶质瘤具有协同治疗作用。本发明提供了一种新的治疗胶质瘤的方法。

Description

一种药物组合物在治疗胶质瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种药物组合物在治疗胶质瘤中的应用。

背景技术

癌症是一个世界性的公共健康问题，随着社会的发展，由于生活环境的恶化、生活方式的改变以及生存压力的增大等各方面的综合因素，全世界范围内癌症的发病率在逐年增加。世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究中心(IARC)2016年发布的最新统计数据(GLOBOCAN2012)显示，全球脑部肿瘤的发病率为3.6/100 000，位居所有肿瘤发病率的第18位；其死亡率为2.7/100 000，位居第13位。近些年来，随着国内外科学家对肿瘤的研究深入，多种外周肿瘤的治疗已取得显著性进展，而脑肿瘤因其病灶部位的特殊性以及复杂性，至今仍是诸多肿瘤治疗中最为棘手且最具挑战性的课题之一，具有病情发展快、控制难、预后差的特点。

胶质瘤(Glioma)属于神经上皮源性肿瘤，起源于胶质细胞，是成人脑部最常见的一类原发性肿瘤，占脑部原发性恶性肿瘤的70％。其发生机制尚不清楚，可能受多种因素影响，包括物理、化学、遗传和生物学等因素。胶质瘤的主要病理表现是胶质细胞的异常增殖，肿瘤细胞按指数方式增长，主要生长方式为扩张性生长、浸润性生长和弥漫性(或多灶性)生长。临床表现主要为颅内压增高和神经局灶症状。在我国，胶质瘤的发病率居颅内肿瘤之首，是预后较差的肿瘤之一，病死率高。近年来随着诊疗技术的提高，对其它系统恶性肿瘤的治疗取得了较大进展，而对脑胶质瘤的治疗却无明显改善，患者5年生存率不足5％，病理分级I-Ⅱ级的脑胶质瘤患者中位生存期只有26-52周。胶质瘤复发是困扰临床医生最大的难题，目前这些状况表明脑胶质瘤是神经科最难治疗的疾病之一。因此，探索新的、有效的脑胶质瘤治疗手段是当前医学研究的重点和难点之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗胶质瘤的药物组合物。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明一方面提供了一种治疗胶质瘤的药物组合物，所述的药物组合物包括藤黄酰胺、蛋白酶体抑制剂。

根据本发明，术语“蛋白酶体抑制剂”指阻止蛋白酶体活性的药剂。

进一步，所述的蛋白酶体抑制剂包括卡非佐米、伊沙佐米、奥普佐米、地兰佐米、硼替佐米、马里佐米或MG132。

进一步，所述的蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米、马里佐米或MG132。

进一步，所述的蛋白酶体抑制剂为马里佐米。

进一步，藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.1～3；或藤黄酰胺与硼替佐米的浓度比为1：0.02～0.24；或藤黄酰胺与MG132的浓度比为1：0.3～4。更为优选的，藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.33～0.6。

进一步，所述的药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。

进一步，所述的缓冲液包括Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES，

进一步，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂，

进一步，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。

本发明的药物组合物包括适用于经口、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、经直肠、经阴道和/或胃肠外给予的药物组合物。组合物可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过制药领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的宿主以及特定的给予方式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的蛋白酶体抑制剂或藤黄酰胺的量。通常，在100％中，该量的范围将为约1％至约90％的活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。制备这些组合物的方法包括将蛋白酶体抑制剂或藤黄酰胺与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，药物组合物可通过将蛋白酶体抑制剂和藤黄酰胺与液体载体或细分固体载体或两者均匀紧密结合，然后在必要时成型产品而制备。适合于口服给予的药物组合物可以是胶囊剂、扁囊剂、香囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基料，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂、或水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或水包油或油包水液体乳剂、或酏剂或糖浆剂、或含片剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口等形式，每种形式均含有预定量的蛋白酶体抑制剂和藤黄酰胺作为活性成分。蛋白酶体抑制剂和藤黄酰胺也可以以蜜丸剂、冲剂或糊剂的形式给予。

药物组合物会以药学有效剂量对患者施用。“药学有效剂量”意指就其施用所针对的状况而言足以产生期望的效果的剂量。精确的剂量取决于化合物的活性、施用方式、病症的性质和严重性、患者的年龄和体重，可能需要不同剂量。可以通过以个别剂量单位(否则，几个更小的剂量单位)形式的单次施用和还通过特定时间间隔的细分剂量的多次施用来实施剂量施用。

本发明另一方面提供了一种非治疗目的的降低胶质瘤干细胞生存率的方法，所述的方法包括向胶质瘤干细胞施用权利要求1-6所述的药物组合物。

进一步，所述的胶质瘤干细胞包括T2-4、T12-1、GSC2、U87MG-SLC。

本发明另一方面提供了如下任一项应用：

(1)前面所述的药物组合物在制备预防或治疗胶质瘤的药物中的应用；

(2)前面所述的药物组合物在制备促进胶质瘤干细胞细胞凋亡的药物中应用。

术语“预防”包含药物的使用，当在紊乱或病况的发作之前被施用时，在统计样本中，相对于未处理的对照样品，所述药物降低经处理的样品中紊乱或病况的出现，或相对于未处理的对照样品，所述药物延迟紊乱或病况的一个或更多个症状的发作，或降低紊乱或病况的一个或更多个症状的严重度。

术语“治疗(treatment)”、“减轻”和“改善”在本文中可互换地使用。这些术语指用于获得有益的或期望的结果的方法，所述有益的或期望的结果包含，但不限于，治疗益处和/或预防益处。治疗益处意为正在治疗的潜在紊乱的根除或改善。此外，用与潜在紊乱有关的生理症状中的一种或更多种的根除或改善实现治疗益处，使得尽管患者仍可能患有潜在紊乱，但是在患者中观察到改善。为了预防益处，可以将药物和/或组合物施用至处于发展特定疾病的风险中的患者，或施用至报告疾病的生理症状中的一种或更多种的患者，即使此疾病的诊断可能还未完成。

进一步，藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.1～3；或藤黄酰胺与硼替佐米的浓度比为1:0.02～0.24；或藤黄酰胺与MG132的浓度比为1:0.3～4。

进一步，藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.33～0.6。

进一步，所述的胶质瘤干细胞包括T2-4、T12-1、GSC2、U87MG-SLC。

本文所使用的术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”在本文中可互换地使用，且均是开放式的，允许存在多于所叙述的含义，只要所叙述的含义的基本或新颖特征不会因存在多余所叙述的含义改变。

本文提供的范围被理解为范围内的所有值的简略的表达方式。例如，1～50的范围应理解为包含来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任何数字、数字的组合或子范围。

除非特别声明或从上下文显而易见，否则本文提供的所有数值均由术语约修饰。术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非另有说明，说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质(如分子量、反应条件等)的所有数字应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。相应地，除非有相反说明，在以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可以根据本发明要求获得的期望的性质而变化。至少，而不是试图限制等同原则对权利要求书范围的应用，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并且通过应用普通舍入技术解释。

附图说明

图1是藤黄酰胺的化学式图；

图2是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的细胞存活率统计热图；

图3是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计表；

图4是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计图；

图5是藤黄酰胺与硼替佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的细胞存活率统计热图；

图6是藤黄酰胺与硼替佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计表；

图7是藤黄酰胺与硼替佐米共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计图；

图8是藤黄酰胺与MG132共同处理胶质瘤干细胞T2-4的细胞存活率统计热图；

图9是藤黄酰胺与MG132共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计表；

图10是藤黄酰胺与MG132共同处理胶质瘤干细胞T2-4的CI值统计图；

图11是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T12-1的细胞存活率统计热图；

图12是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T12-1的CI值统计表；

图13是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞T12-1的CI值统计图；

图14是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞GSC2的细胞存活率统计热图；

图15是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞GSC2的CI值统计表；

图16是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞GSC2的CI值统计图；

图17是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞U87MG-SLC的细胞存活率统计热图；

图18是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞U87MG-SLC的CI值统计表；

图19是藤黄酰胺与马里佐米共同处理胶质瘤干细胞U87MG-SLC的CI值统计图；

图20是流式分析各处理组内细胞的凋亡情况实验图，其中，图A是对照组，图B是0.1μM藤黄酰胺单独作用组，图C是0.3μM藤黄酰胺单独作用组，图D是0.01μM马里佐米单独作用组，图E是0.1μM马里佐米单独作用组，图F是0.1μM藤黄酰胺与0.01μM马里佐米共同作用组，图G是0.1μM藤黄酰胺与0.1μM马里佐米共同作用组，图H是0.3μM藤黄酰胺与0.01μM马里佐米共同作用组，图I是0.3μM藤黄酰胺与0.1μM马里佐米共同作用组；

图21是流式分析各处理组内细胞的凋亡情况的统计图；

图22是Western Blot检测藤黄酰胺联合马里佐米处理细胞的总蛋白泛素化水平结果图；

图23是Western Blot检测藤黄酰胺联合马里佐米处理细胞的ATF4/CHOP表达水平结果图；

图24是Western Blot检测藤黄酰胺联合马里佐米处理细胞的ATF4/CHOP的细胞核积聚情况结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 MTS法检测细胞存活率

一、实验材料

本发明中，U87MG-SLC细胞是由悬浮培养的U87MG细胞培养得到；GSC2、T2-4、T12-1细胞都是从Ⅳ级的胶质母细胞瘤病人的组织分离得到，其中T12-1、T2-4细胞是天坛医院江涛课题组赠予。

二、、实验方法

(1)按照产品说明书配制以下溶液：

a、DPBS：依次加入0.2g KCl，8.0g NaCl，0.2g KH₂PO4，1.15g Na₂HPO₄至1L，调pH至7.35，之后加入0.1g MgCl₂·6H₂O，充分混匀至溶液清澈后，加入0.133g CaCl₂·2H₂O后，在此充分混匀至溶液清澈。用0.2μM滤器过滤除菌两次后，分装保存在4℃。

b、PMS溶液的配制：使用DPBS配制0.92mg/mL的PMS溶液，用0.2μM滤器过滤除菌两次后，分装于用锡泊纸包裹好的EP管中，避光保存-20℃。

c、MTS溶液的配制：按照1mg MTS粉末用0.5mLDPBS来溶解的比例配制，轻轻混匀，约15min，至MTS完全溶解。测量pH，使其保存在6.0—6.5之间。用0.2μM滤器过滤除菌两次后，分装于用锡泊纸包裹好的EP管中，避光保存-20℃。

d、MTS/PMS工作液的配制：分别融化已配好的MTS和PMS溶液，而后按照MTS:PMS体积比为20:1的比例混合成MTS/PMS工作液。

(2)藤黄酰胺与蛋白酶体抑制剂联合对胶质瘤干细胞细胞活性的影响检测

对于能贴壁生长的胶质瘤干细胞(T2-4/T12-1/GSC2)，96孔细胞培养板每孔加60μL 1:100稀释的Matrigel溶液，置于37℃孵箱包被1h。随后将细胞消化重悬为单细胞悬液，细胞计数，将包被好的matrigel吸出，将细胞铺于96孔板内(T2-4(15000个/孔)、T12-1(15000个/孔)、GSC2(15000个/孔))过夜生长。次日将藤黄酰胺(购自SantaCruzBio，sc-221655A，USA，其化学式如图1所示，其化学分子式为(C₃₈H₄₅NO₇)，其结构简式为CC(＝CCCC1(C＝CC2＝C(O1)C(＝C3C(＝C2O)C(＝O)C4＝CC5CC6C4(O3)C(C5＝O)(OC6(C)C)CC＝C(C)C(＝O)N)CC＝C(C)C)C)C)和蛋白酶体抑制剂((马里佐米，Marizomib，购自Selleck，S7504，USA)、(硼替佐米，Bortezomib，购自Selleck，S1013,USA)、(MG132,购自Sellcek，S2619,USA))，以T2-4细胞系藤黄酰胺与马里佐米联用为例，藤黄酰胺设置以下浓度梯度0μM、0.05μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.3μM，马里佐米设置以下浓度梯度0μM、0.015μM、0.03μM、0.06μM、0.12μM、0.24μM。在配制相应浓度的药物时浓度均加倍。配好加倍浓度药液后，吸除96孔板内培养基，根据浓度，每孔先后各加入100μl加倍浓度的藤黄酰胺和蛋白酶体抑制剂，加好之后轻敲晃动培养板以混匀藤黄酰胺与蛋白酶体抑制剂，每个药物组合浓度均有3个复孔，而后将培养板置于37℃孵箱处理48h(T12-1,GSC2,U87MG-SLC)，72h(T2-4)。对于不能贴壁的胶质瘤干细胞(U87MG-SLC)，则以每孔加入50μL细胞悬液，而后分别各加入25μL体积的4倍浓度配制的藤黄酰胺及蛋白酶体抑制剂，而后将培养板置于37℃孵箱处理48h。

(3)药物组合作用48或72小时后，根据需要配制相应体积的MTS/PMS工作液，然后按照工作液：培养基＝1:5的比例加入相应的MTS/PMS工作液使最终每孔体系120μL，随后37℃，5％CO₂孵育2小时，根据MTS还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱，在吸收峰490nm读取数据，并减去630nm所读取的数据，用以减去细胞碎片等造成的噪音值，以及其它非特异性吸光度值。

(4)根据吸光值A计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组A/对照组)×100％。将三个复孔的生存率取均值，然后通过Graphpad软件绘制相对生存率热图。(5)根据细胞存活率来计算出药物抑制率，抑制率＝1-细胞存活率。通过Compusyn软件来计算两药的联合指数(combination index，CI)，首先将单药藤黄酰胺及马里佐米不同浓度的抑制率输入Compusyn软件，随后将不同药物组合的抑制率输入Compusyn，以生成计算出两药的CI值，CI值小于1认为两药具有协同作用，CI值大于1认为两药具有拮抗作用，CI值＝1认为两药是相加作用。

三、实验结果

在胶质瘤干细胞T2-4中，藤黄酰胺与马里佐米(图2-4)、硼替佐米(图5-7)、MG132(图8-10)3种蛋白酶体抑制剂均有显著协同作用。

如图11-19所示，藤黄酰胺与蛋白酶体抑制剂马里佐米协同显著杀伤多种胶质瘤干细胞。

实施例2 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡

一、实验方法

(1)藤黄酰胺单药(0.1μM、0.3μM)、马里佐米单药(0.01μM、0.1μM)二者联用(藤黄酰胺0.1μM+马里佐米0.01μM、0.1μM+0.1μM、0.3μM+0.01μM、0.3μM+0.1μM)处理T12-1细胞系8小时；

(2)收集细胞，生理盐水洗两遍；

(3)取100uL1*结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞，使细胞密度约为1*10⁶个/mL；

(4)加入1μL FTIC Annexin V和1μL PI；

(5)避光情况下，室温孵育15min；

(6)各处理管分别过细胞筛，并进行流式细胞仪分析；

所用Annexin V/PI双染试剂盒购自凯基生物，产品批号为KGA108。

二、实验结果

结果见图20、21，藤黄酰胺与马里佐米协同促进胶质瘤干细胞细胞凋亡。

实施例3蛋白质印记(Western Blotting)检测ATF4/CHOP的表达水平

一、实验方法

0.01μM浓度的马里佐米联合0.3μM浓度藤黄酰胺处理2h、4h、8h，或与0.1μM、0.3μM、1μM浓度藤黄酰胺联合处理4h后提取细胞总蛋白。

用10％分离胶进行SDS-PAGE电泳，然后将凝胶小心转移至电转缓冲液中转硝酸纤维素膜，用牛奶封闭非特异性结合位点后加入一抗抗体(ATF4/CHOP/Ubiquitin)，抗体购自Proteintech公司，货号分别为10835-1-AP，15204-1-AP，10201-2-AP。4℃孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔抗体(购自中山金桥)室温结合1-2h。然后用ECL法进行显色。

二、实验结果

结果见图23，藤黄酰胺与马里佐米联用协同上调了ATF4/CHOP的表达。

实施例4 Western Blotting检测蛋白泛素化水平

一、实验方法

不同浓度的藤黄酰胺联合0.01μM浓度的马里佐米处理相应的时间后提取总蛋白做Western Blot。

二、实验结果

如图22所示，藤黄酰胺联合马里佐米显著协同上调了细胞总蛋白泛素化水平。

实施例5蛋白核质分离

一、实验方法

1、细胞用accutase消化成单细胞后收集到15mL离心管中，800g离心5min。

2、去除上清，用PBS或生理盐水清洗细胞，将细胞转移到1.5mL离心，800g离心5分钟收集细胞，然后小心吸出并弃去上清，让细胞尽可能保持干燥。

3、重复第二步。

4、根据细胞量并参考表1将冰上预冷的CER I加入到细胞中，剧烈涡旋细胞15秒，使其完全悬浮，然后将离心管放在冰上孵育10min。

表1反应体系

5、加入冰上预冷的CER II,剧烈涡旋细胞5秒，然后冰上静置1min。

6、再次涡旋细胞混合液5秒，16000g离心5min。

7、立即将上清液(胞浆提取液)转移到新的1.5mL预冷离心管中。将提取液置于冰上加入适量体积的6x protein Loading经煮沸变性后于-20℃冰箱保存。

8、再次离心1min，弃净上清。

9、用预冷的NER重悬沉淀，剧烈涡旋沉淀15秒，将样品置于冰上孵育，每10min涡旋15秒，共孵育40分钟。

10、16000g离心10min，取上清至新的1.5mL预冷离心管中，放于冰上加入适量体积的6x protein Loading经煮沸变性后于-20℃冰箱保存。

所用试剂盒购买自Thermo Scientific NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒(78835)。

二、实验结果

分离的核质蛋白经Western Blot进行检测，结果见图24，藤黄酰胺联合马里佐米显著促进了ATF4/CHOP的细胞核积聚。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种治疗胶质瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括藤黄酰胺、蛋白酶体抑制剂；

所述蛋白酶体抑制剂为马里佐米、硼替佐米或MG132；

所述藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.1~3；

所述藤黄酰胺与硼替佐米的浓度比为1：0.02~0.24；

所述藤黄酰胺与MG132的浓度比为1：0.3~4。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述藤黄酰胺与马里佐米的浓度比为1：0.33~0.6。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲液选自Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO或TES。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自等渗试剂、抗氧化剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。

6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述赋形剂选自碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。

7.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。

8.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物在制备用于促进胶质瘤干细胞细胞凋亡的药物中应用。

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