CN114196741A - 一体式微液滴芯片的数字pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，包括：控制加样腔与气液接口之间形成第一压力差、油液接口与气液接口之间形成第二压力差，以分别驱动加样腔中的样本和油液接口的生成油进入微液滴生成结构，生成的微液滴存储于反应腔；将反应腔置于加热模块中加热扩增；控制外部压力驱动检测推动油从气液接口进入反应腔，使得反应腔中的微液滴从反应腔中流出至微液滴生成结构，外部压力驱动检测分隔油从油液接口进入微液滴生成结构，检测分隔油将从反应腔中流出至微液滴生成结构中的微液滴分隔形成队列，进入荧光检测区。本发明通过对微液滴生成结构的分时复用，将液滴生成、扩增和检测都集成在一张芯片当中，实现全集成、全封闭的数字PCR流程。

Description

一体式微液滴芯片的数字PCR方法

技术领域

本发明属于数字PCR分析仪技术领域，具体涉及一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法。

背景技术

液滴微流控(droplet-based microfluidics)是近年来在微流控芯片上发展起来的一种操控微小体积液体的技术平台，其原理为：将两种互不相溶的液体，示例性的，其中的一种为油相，另一种为水相，油相和水相同时进入微通道后，在微通道的作用下，水相以微小体积单元的形式分布于油相中，形成一系列离散的微液滴。每个液滴作为一个微反应器，完成一组化学或生物反应。

数字PCR技术被誉为第三代PCR技术，具有绝对定量和单分子检测灵敏度的优点，在分子诊断领域有着重要的应用前景。数字PCR技术一种主流的技术路线的采用液滴微流控芯片，将反应体系分割成数万乃至数百万尺寸均一的液滴，并完成生成、扩增和荧光检测，通过荧光检测结果利用数学模型计算出样本中目标分子的精确拷贝数。

在液滴数字PCR技术中，常常利用液滴生成芯片中的结构，完成液滴生成，然后将液滴转移至反应管中扩增，最后再利用液滴检测芯片中的结构，将液滴形成有一定间隔的液滴队列，每个液滴依次通过荧光检测区域，激发并检测液滴内的荧光信号。这种利用液滴微流控实现数字PCR的方法，具有液滴尺寸均一、液滴数量不易受限制、荧光检测信噪比高等优点，但同时也存在芯片结构复杂，生成和检测在不同芯片中完成，集成度低，难以自动化等不足。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，以克服现有技术中液滴生成与检测在不同液滴芯片中完成，集成度及自动化程度低的不足。

为了解决上述问题，本发明提供一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，所述一体式微液滴芯片包括芯片本体，所述芯片本体上具有反应腔及加样腔，所述芯片本体内构造有微液滴生成结构、油液接口、气液接口和荧光检测区，所述气液接口与所述反应腔连通，所述加样腔与所述微液滴生成结构连通，所述油液接口与所述微液滴生成结构连通，

所述数字PCR方法包括如下步骤：

微液滴生成步骤，控制所述加样腔与所述气液接口之间形成第一压力差、所述油液接口与所述气液接口之间形成第二压力差，以使所述第一压力差和所述第二压力差分别驱动所述加样腔中的样本和所述油液接口的生成油进入所述微液滴生成结构，生成的微液滴进入并存储于所述反应腔中；

扩增反应步骤，将所述反应腔置于加热模块中按照预设循环加热扩增；

微液滴检测步骤，控制外部压力驱动检测推动油从所述气液接口进入所述反应腔，使得所述反应腔中的微液滴从所述反应腔中流出至所述微液滴生成结构，外部压力驱动检测分隔油从所述油液接口进入所述微液滴生成结构，所述检测分隔油将所述从反应腔中流出至所述微液滴生成结构中的微液滴分隔形成队列，进入所述荧光检测区。

在一些实施方式中，以所述芯片本体的第一侧面处于水平方位为参照，所述反应腔与所述加样腔处于所述第一侧面上，在所述扩增反应步骤之前，在微液滴生成步骤之后还包括：芯片翻转步骤，控制所述芯片本体上下翻转180°。

在一些实施方式中，所述微液滴生成结构包括油液管道以及连通管道，所述油液管道与所述连通管道成十字交叉，所述连通管道包括处于十字交叉点的第一侧且与所述反应腔连通的第一管道以及处于所述十字交叉点的第二侧且与所述加样腔连通的第二管道，所述油液接口与油液管道连通。

在一些实施方式中，所述反应腔与所述芯片本体的所述第一侧面的连接接口向上延伸，且成下小上大的喇叭口。

在一些实施方式中，所述反应腔内还构造有自下而上延伸的气液管道，所述气液管道的下口与所述气液接口连通，所述气液管道的上口高于所述连接接口的上口。

在一些实施方式中，所述第一管道与所述连接接口之间具有微液滴观测区。

在一些实施方式中，所述荧光检测区处于所述第二管道上。

在一些实施方式中，所述加样腔包括开口腔以及密封连接于所述开口腔的开口处的密封盖。

在一些实施方式中，在所述微液滴进入所述反应腔内之前，所述反应腔内预置轻油。

本发明提供的一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，通过对所述微液滴生成结构的分时复用，将液滴生成、扩增和检测都集成在一张芯片当中，实现全集成、全封闭的数字PCR流程。

附图说明

图1为本发明实施例的一体式微液滴芯片的立体结构示意图；

图2为本发明实施例的一体式微液滴芯片中的微液滴生成结构的结构示意图；

图3为本发明实施例的一体式微液滴芯片中的反应腔的内部结构示意图；

图4为微液滴生成过程示意；

图5为微液滴生成后存储于反应腔内的示意；

图6为一体式微液滴芯片翻转180°后反应腔内的状态示意；

图7为图6状态下向反应腔内通入油液后的状态示意；

图8为微液滴从反应腔内迫出后的状态示意(图中箭头示出微液滴及油液流向)；

图9为本发明另一实施例的一体式微液滴芯片的立体结构示意图。

附图标记表示为：

1、芯片本体；11、反应腔；111、连接接口；112、气液管道；12、加样腔；121、开口腔；122、密封盖；21、油液管道；22、第一管道；23、第二管道；31、油液接口；32、气液接口；33、荧光检测区；34、微液滴观测区；4、微液滴；5、检测推动油。

具体实施方式

结合参见图1至图9所示，根据本发明的实施例，提供一种一体式微液滴芯片，包括芯片本体1，所述芯片本体1上具有反应腔11及加样腔12，所述芯片本体1内构造有微液滴生成结构、油液接口31、气液接口32和荧光检测区33，所述气液接口32与所述反应腔11连通，所述加样腔12与所述微液滴生成结构连通，所述油液接口31与所述微液滴生成结构连通；

液滴生成时，所述加样腔12与所述气液接口32之间形成第一压力差，所述油液接口31与所述气液接口32之间形成第二压力差，所述第一压力差和所述第二压力差分别驱动所述加样腔12中的样本和所述油液接口31的生成油进入所述微液滴生成结构，生成的微液滴4进入并存储于所述反应腔11中；

液滴检测时，外部压力驱动检测推动油5从所述气液接口32进入所述反应腔11，使得所述反应腔11中的微液滴4从所述反应腔11中流出至所述微液滴生成结构，外部压力驱动检测分隔油从所述油液接口31进入所述微液滴生成结构，所述检测分隔油将所述从反应腔11中流出至所述微液滴生成结构中的微液滴4分隔形成队列，进入所述荧光检测区33。

该技术方案中，所述芯片本体1上集成具有加样腔12、反应腔11、微液滴生成结构以及荧光检测区33，从而使所述微液滴的生成、检测集成于同一个芯片上完成，集成度以及自动化程度都能够得到提高；更为重要的，通过对所述微液滴生成结构的分时复用(以所述一体式微液滴芯片的翻转前后为分时界限)，将液滴生成、扩增和检测都集成在一张芯片当中，实现全集成、全封闭的数字PCR流程，不仅继承了液滴尺寸均一、液滴数量不易受限制、荧光检测信噪比高等优点，还克服了原有的芯片结构复杂，生成和检测在不同芯片中完成，集成度低，难以自动化等困难，是数字PCR领域的一个重要的技术突破。

作为所述微液滴生成结构的一种具体的实现方式，所述微液滴生成结构包括油液管道21以及连通管道，所述油液管道21与所述连通管道成十字交叉，所述连通管道包括处于十字交叉点的第一侧且与所述反应腔11连通的第一管道22以及处于所述十字交叉点的第二侧且与所述加样腔12连通的第二管道23，所述油液接口31与油液管道21连通。

一体式微液滴芯片在一些实施方式中，参见图1所示，以所述芯片本体1的所述第一侧面处于水平方位为参照，所述反应腔11与所述加样腔12处于所述第一侧面上，所述反应腔11与所述芯片本体1的所述第一侧面的连接接口111向上延伸，且成下小上大的喇叭口，成喇叭口的连接接口111能够利于微液滴4由第一管道22的进入所述反应腔11，也利于所述微液滴4从所述反应腔11中进入所述第一管道22中，防止微液滴4的羁留。需要说明的是，此时的所述反应腔11及加样腔12皆处于所述芯片本体1的第一侧面(具体为顶面)，进入所述反应腔11内的微液滴4皆集聚于所述连接接口111处，在进行PCR扩增时，需要将所述芯片本体1整体倒置也即翻转180°，使微液滴4能够处于所述反应腔11的反应区内。

在一些实施方式中，所述反应腔11内还构造有自下而上延伸的气液管道112，所述气液管道112的下口与所述气液接口32连通，所述气液管道112的上口高于所述连接接口111的上口，这样能够防止在所述反应腔11内为负压时，所述微液滴生成结构生成的微液滴4在进入所述反应腔11后进一步从所述气液管道112流出。

在一些实施方式中，所述第一管道22与所述连接接口111之间具有微液滴观测区34，所述微液滴观测区34的通流面积远大于所述第一管道22的流通面积，也即所述微液滴观测区34为一个在所述第一管道22上扩大的区域(宽度变大)，以使进入该区域的微液滴4的流速降低，可方便外部相机成像，记录液滴形态，判断液滴生成过程的状态是否正常。

作为一种具体的实现方式，所述加样腔12包括开口腔121以及密封连接于所述开口腔121的开口处的密封盖122，以便于操作人员向所述加样腔12内加入样本。进一步的，所述加样腔12设置有滤膜或者排气孔，当加样腔12变成废液池的时候(也即在液滴芯片翻转倒置时)，排除一定的空气，防止所述加样腔12内积累压力。

在一个实施方式中，所述荧光检测区33处于所述第二管道23上，在所述第二管道23上，所述反应腔11内流出的微液滴4在通过十字交叉点时能够在所述油液管道21内的检测油的作用下被分隔成有合适间距的液滴队列，从而在外部系统的作用下完成荧光检测。

如图9所示，给出了所述一体式微液滴芯片的另一种实现方式，其与图1所示的一体式微液滴芯片的不同之处在于，所述反应腔11与所述加样腔12分别处于了所述芯片本体1的两个相对侧面上，具体的，所述加样腔12处于所述第一侧面上，所述反应腔11处于第二侧面上，所述第二侧面与所述第一侧面为所述芯片本体1的相对两侧，此时，一体式微液滴芯片工作原理和流程与前文的一体式微液滴芯片基本一致，不同的地方是，在液滴生成过程中，由于所述的反应腔11位于所述芯片本体1的底侧(加样腔12处于顶侧)，所述微液滴4进入到所述反应腔11之处时会直接下落至反应腔11底部的反应区，并在反应区中收集，也因此，一体式微液滴芯片在液滴生成结束后，不需要进行180°的翻转，直接进入后续的扩增环节即可。

在一些实施方式中，在所述微液滴4进入所述反应腔11内之前，所述反应腔11内预置轻油(也即密度较小的油液)，保证所述轻油能够始终处于所述反应腔11内的微液滴4的顶部，解决扩增时微液滴蒸发的问题，实现免热盖PCR。

根据本发明的实施例，还提供一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，所述一体式微液滴芯片如上所述，包括芯片本体1，所述芯片本体1上具有反应腔11及加样腔12，所述芯片本体1内构造有微液滴生成结构、油液接口31、气液接口32和荧光检测区33，所述气液接口32与所述反应腔11连通，所述加样腔12与所述微液滴生成结构连通，所述油液接口31与所述微液滴生成结构连通，

所述数字PCR方法包括如下步骤：

微液滴生成步骤，控制所述加样腔12与所述气液接口32之间形成第一压力差、所述油液接口31与所述气液接口32之间形成第二压力差，以使所述第一压力差和所述第二压力差分别驱动所述加样腔12中的样本和所述油液接口31的生成油进入所述微液滴生成结构，生成的微液滴4进入并存储于所述反应腔11中，具体的，向所述油液接口31提供油液，向所述气液接口32提供负压，在所述负压的作用下，所述加样腔12中的样本以及所述油液接口31处的油液被驱动分别沿着所述第二管道23、油液管道21汇聚于所述微液滴生成结构的十字交叉口处，所述样本在油液流体剪切力与表面张力的作用下，形成尺寸均一的微液滴4(油包水液滴)，并最终在所述负压的作用下，所述微液滴4经由所述第一管道22最终进入所述反应腔11内存储，需要说明的是，微液滴在进入所述微液滴观测区34中时，微液滴4的流速，形成密集的液滴群落，方便相机成像记录；

扩增反应步骤，将所述反应腔11置于加热模块(图中未示出)中按照预设循环加热扩增，所述加热模块采用现有的加热模块即可；

微液滴检测步骤，控制外部压力驱动检测推动油5从所述气液接口32进入所述反应腔11，使得所述反应腔11中的微液滴4从所述反应腔11中流出至所述微液滴生成结构，外部压力驱动检测分隔油从所述油液接口31进入所述微液滴生成结构，所述检测分隔油将所述从反应腔11中流出至所述微液滴生成结构中的微液滴4分隔形成队列，进入所述荧光检测区33，完成荧光检测，具体的，向所述气液接口32提供油液(也即检测推动油5，也称上浮油)，通过所述油液的浮力将所述反应腔11内的扩增反应后的微液滴4浮起，并能够在所述油液的浮力作用下，所述微液滴4通过所述连接接口111流出所述反应腔11而进入所述第一管道22，并流经所述微液滴观测区34进入所述十字交叉口，并进入所述第二管道23处，在荧光检测区33进行检测，之后最终进入所述加样腔12内，此时，所述加样腔12为废液池。

该技术方案中，通过对所述微液滴生成结构的分时复用(以所述一体式微液滴芯片的翻转前后为分时界限)，将液滴生成、扩增和检测都集成在一张芯片当中，实现全集成、全封闭的数字PCR流程，不仅继承了液滴尺寸均一、液滴数量不易受限制、荧光检测信噪比高等优点，还克服了原有的芯片结构复杂，生成和检测在不同芯片中完成，集成度低，难以自动化等困难，是数字PCR领域的一个重要的技术突破。

在一些实施方式中，以所述芯片本体1的第一侧面处于水平方位为参照，所述反应腔11与所述加样腔12处于所述第一侧面上，在所述扩增反应步骤之前，在微液滴生成步骤之后还包括：芯片翻转步骤，控制所述芯片本体1上下翻转180°，此时，所述反应腔11内的微液滴4由接近所述连接接口111一侧翻置到远离所述连接接口111的一侧，此时所述微液滴4所对应的反应腔11的位置即为反应腔11的反应区，所述反应区与所述加热模块接触调温实现样本的温度调节反应。

以下结合图1至图8对本发明的采用所述一体式微液滴芯片的作业流程进一步阐述：

首先，将30微升的体系(也即前述样本)加到加样腔12中，30微升的PCR体系包含10微升的Bio-Rad公司的ddPCR Supermix for Probes，GJB2基因上下游引物试剂5微升和含有1ng基因组DNA的模板5微升。芯片整体如图1所示，一张芯片包含了8个平行独立的液滴芯片结构，每个结构都包含有加样腔12、油液接口31、气液接口32、微液滴生成结构、反应腔11。

然后，将密封盖122盖紧或粘接，使加样腔12密封，加样腔12中最好有带滤膜或者口径小的排气孔。

然后，向油液接口31提供液滴生成所需的生成油Bio-Rad Generation Oil，生成油液中含有能使液滴稳定的表面活性剂；向气液接口32提供负压，压力大小为-200mBar，使得与加样腔12和油液接口31形成压力差。其中，加样腔12与微液滴生成结构中的第二管道23相连，油液接口31与微液滴生成结构中的油液管道21相连，第一管道22和气液接口32均与反应腔11相连，其中第一管道22与连接接口111相连，气液接口32与气液管道112相连。微液滴生成结构的各个部分如图2所示，油液管道21有两条分支，分别位于第二管道23和第一管道22两侧，且均与油液接口31相连。第一管道22中可包含微液滴观测区34，观测区管道变宽，液滴进入后流速降低，可方便外部相机成像，记录液滴形态，判断液滴生成过程的状态是否正常。

在压力差的驱动下，反应体系进入第二管道23中，生成油进入油液管道21中，并在十字结构处(也即前述十字交叉口)交汇，在流体剪切力与表面张力的作用下，形成尺寸均一的油包水微液滴4。十字处管道深度约为70微米，宽度为80微米，液滴尺寸约为100微米。微液滴4进入第一管道22，并在进入微液滴观测区34后降低流速，形成密集的液滴群落，方便相机成像记录，液滴生成过程原理图如图4所示。

生成的液滴流经第一管道22后到达反应腔11的连接接口111。连接接口111的底部有斜坡结构(也即前述的喇叭口)，斜坡底部与第一管道22相连通。液滴生成流程结束时，撤掉施加在芯片接口处的压力差，此时液滴应仍位于气液管道112下方。

之后，将芯片上下翻转，使液滴从连接接口111转移至反应区(也即远离所述连接接口111)，如图5所示。反应区的结构应采取热传递效率高的设计，比如采用深度高、厚度薄的扁平设计，让外部系统(也即加热模块)从左右两侧给反应区进行加热和制冷，不仅保证温度传导的距离短，还保证较大的接触面积，从而实现高效的热传递。在本实施例中，温度循环流程为先进行一个95℃10分钟的预变性，然后是40个温度循环，每个循环中95℃5秒，60℃15秒，最后4℃保温。为了减少蒸发，可在反应腔11内提前放置30微升低密度的防挥发试剂。

在温度循环结束后，包含有模板的液滴内的扩增反应也相应完成了，需要进入液滴荧光检测环节。向气液接口32中注入检测油(也即上述的检测推动油5)，不断充满反应腔11。在这个过程中，液滴液面不断上升，然后经过连接接口111的斜坡引导，进入第一管道22中。这个过程如图7所示。

液滴经过第一管道22中的观测区时，也可利用相机对液滴进行明场成像，从而对扩增反应后的液滴状态进行评估。同时，向油液接口31中注入检测油，检测油经由油液管道21，在十字管道处与液滴队列汇合，并将紧密排列的液滴分隔成有合适间距的液滴队列。液滴队列依次通过位于第二管道23的荧光检测区33，如图8所示。荧光检测区33对应的位置，是外部系统的荧光检测焦点。外部系统将激发光，如波长为488nm和532nm的激光或LED窄带光，聚焦到检测焦点。液滴在依次通过检测焦点的过程中，液滴内激发出的荧光，同样会被外部系统的采集光路接收，从而获取每个液滴的荧光信息。利用液滴的荧光信息，划定信号阈值，对液滴的阴阳性进行区分，并利用泊松分布模型，计算出样本中目标分子的拷贝数。

最后完成荧光检测的液滴进入加样腔12中，由于加样腔12已经被密封盖122密封，因此不会与芯片外的环境接触，杜绝了气溶胶污染的可能，实现了全封闭的数字PCR流程。

在这个实施例中，开创性的采用了对微液滴生成结构进行分时复用的方法。在液滴生成时，利用微液滴生成结构实现液滴生成。而在液滴荧光检测时，微液滴生成结构完成了对液滴队列的分隔，保证了液滴荧光信号检测。采用这种分时复用的方法，在类流式的数字PCR技术路线上首次实现了一张芯片完成液滴生成，扩增，检测全集成和全封闭的数字PCR流程，是数字PCR领域的一个重要的技术突破。

在另一种实施例中，在液滴经过第一管道22中的观测区时，利用相机对液滴进行荧光成像，并对成像照片进行分析，获取照片内各个液滴的荧光强度信息，完成液滴荧光信号检测。

本领域的技术人员容易理解的是，在不冲突的前提下，上述各有利方式可以自由地组合、叠加。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种一体式微液滴芯片的数字PCR方法，其特征在于，

所述一体式微液滴芯片包括芯片本体(1)，所述芯片本体(1)上具有反应腔(11)及加样腔(12)，所述芯片本体(1)内构造有微液滴生成结构、油液接口(31)、气液接口(32)和荧光检测区(33)，所述气液接口(32)与所述反应腔(11)连通，所述加样腔(12)与所述微液滴生成结构连通，所述油液接口(31)与所述微液滴生成结构连通，

所述数字PCR方法包括如下步骤：

微液滴生成步骤，控制所述加样腔(12)与所述气液接口(32)之间形成第一压力差、所述油液接口(31)与所述气液接口(32)之间形成第二压力差，以使所述第一压力差和所述第二压力差分别驱动所述加样腔(12)中的样本和所述油液接口(31)的生成油进入所述微液滴生成结构，生成的微液滴(4)进入并存储于所述反应腔(11)中；

扩增反应步骤，将所述反应腔(11)置于加热模块中按照预设循环加热扩增；

微液滴检测步骤，控制外部压力驱动检测推动油(5)从所述气液接口(32)进入所述反应腔(11)，使得所述反应腔(11)中的微液滴(4)从所述反应腔(11)中流出至所述微液滴生成结构，外部压力驱动检测分隔油从所述油液接口(31)进入所述微液滴生成结构，所述检测分隔油将所述从反应腔(11)中流出至所述微液滴生成结构中的微液滴(4)分隔形成队列，进入所述荧光检测区(33)。

2.根据权利要求1所述的数字PCR方法，其特征在于，

以所述芯片本体(1)的第一侧面处于水平方位为参照，所述反应腔(11)与所述加样腔(12)处于所述第一侧面上，在所述扩增反应步骤之前，在微液滴生成步骤之后还包括：

芯片翻转步骤，控制所述芯片本体(1)上下翻转180°。

3.根据权利要求2所述的数字PCR方法，其特征在于，所述微液滴生成结构包括油液管道(21)以及连通管道，所述油液管道(21)与所述连通管道成十字交叉，所述连通管道包括处于十字交叉点的第一侧且与所述反应腔(11)连通的第一管道(22)以及处于所述十字交叉点的第二侧且与所述加样腔(12)连通的第二管道(23)，所述油液接口(31)与油液管道(21)连通。

4.根据权利要求3所述的数字PCR方法，其特征在于，所述反应腔(11)与所述芯片本体(1)的所述第一侧面的连接接口(111)向上延伸，且成下小上大的喇叭口。

5.根据权利要求4所述的数字PCR方法，其特征在于，所述反应腔(11)内还构造有自下而上延伸的气液管道(112)，所述气液管道(112)的下口与所述气液接口(32)连通，所述气液管道(112)的上口高于所述连接接口(111)的上口。

6.根据权利要求5所述的数字PCR方法，其特征在于，所述第一管道(22)与所述连接接口(111)之间具有微液滴观测区(34)。

7.根据权利要求3所述的数字PCR方法，其特征在于，所述荧光检测区(33)处于所述第二管道(23)上。

8.根据权利要求1所述的数字PCR方法，其特征在于，所述加样腔(12)包括开口腔(121)以及密封连接于所述开口腔(121)的开口处的密封盖(122)。

9.根据权利要求1所述的数字PCR方法，其特征在于，在所述微液滴(4)进入所述反应腔(11)内之前，所述反应腔(11)内预置轻油。

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