CN114196665A - 一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法，属于微生物领域。该发明以聚乳酸为基质并添加培养液和缓释碳源制备载体，促使嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌在载体表面形成生物膜，提高菌体细胞的耐冷性，使益生菌在4℃存放一周后仍有大量活性细胞存活。本发明提供的技术便于益生菌的冷藏与连续使用，克服冷冻菌株能耗大、活化次数多、难以连续使用的问题。

Description

一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法，属于微生物领域。
二、背景技术
菌体分泌出含胞外多糖、蛋白和胞外DNA等粘性胞外聚合物，并在这些胞外聚合物及其基质网包裹下进行生长繁殖，形成结构性细菌群落。这种结构性细菌群落便称之为生物膜。生物膜是菌株为了适应环境而形成的一种生存形式。与细菌浮游细胞相比，生物膜中的细菌具有以下几个优势特性：(1)耐药性增强，对抗菌剂的耐受性增加；(2)对环境变化的适应性增强，抗逆性大大提高；(3)不受宿主免疫系统的攻击。生物膜的研究主要集中在致病菌生物膜的形成和去除方面，而益生菌生物膜的研究较少。
益生菌可在人体肠道中生长、繁殖，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌的功能，被广泛应用于健康食品，保健产品及医药产品中。在工业化生产和应用中，菌种的保存是一项重要而艰巨的工作。目前工业中广泛应用的益生菌的保存方法是冷冻干燥法，但该技术存在着耗能大、细胞活力不高、易退化、保护剂复杂、不能用于连续操作等不足。针对新鲜细胞的保藏方法缺失。
生物膜形成的第一步就是找到合适的载体表面进行黏附。载体对于生物膜形成的诱导性与调控性至关重要。聚乳酸作为一种新兴材料，具有可降解性，生物吸收性好，无毒无害的优点，有利于微生物在固体表面的粘附性并形成生物膜，可用于微生物固相化载体。一直以来生物膜载体开发多集中于污水处理生物反应器方面，而对食源性益生菌载体的开发和应用研究较少。开发一种适用于益生菌形成生物膜的载体，利用生物膜的强抗逆特性，提高益生菌对环境的适应性和抗性，提高菌种的稳定和活性，使新鲜菌体细胞能够在冷藏条件下存放，便于益生菌新鲜菌体细胞连续加工过程中的使用，有利于开拓益生菌生物膜的应用范围。
三、发明内容
技术问题：
本发明的目的是提供一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法。本发明中的载体以聚乳酸为基体，加入培养基和缓释碳源，为益生菌提供营养和附着空间，促进菌体的定植及生物膜形成，提高菌体细胞的低温抗性，解决新鲜菌体细胞在冷藏条件难以存放、不便于菌种连续使用、冷冻菌株活化次数多的问题。
技术方案：
本发明提供一种用于益生菌生物膜冷藏的载体的制备方法，该方法的步骤如下：
(1)水相制备：在水系培养液中添加1％-4％的缓释碳源，加热助溶，冷却至室温后备用。
(2)有机相制备：聚乳酸颗粒溶解于二氯甲烷中，配成0.1g/mL的聚合物有机溶液备用。
(3)混合乳化：将水相和有机相1∶9混合，加入至一个干燥洁净的玻璃杯中，高速分散乳化20-30min。
(4)挥发成膜：将乳化好的混合液倒入玻璃平皿，要求完全覆盖皿底，厚度5-10mm，通风环境下放置12-24h，待有机溶剂完全挥发后形成薄膜。
(5)洗涤烘干：将薄膜用水反复清洗去除残留的有机试剂，40-60℃恒温干燥8-12h。
(6)灭菌：将薄膜置于玻璃容器中，121℃高压蒸汽灭菌15min后备用。
上述益生菌生物膜载体的制备方法中以聚乳酸为基质，添加培养液和缓释碳源。
上述益生菌生物膜载体的制备方法中优选的缓释碳源为淀粉。
利用上述载体制备益生菌生物膜，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将益生菌接种于培养液中，适温培养至稳定期后从中抽取2mL菌液接种于新鲜培养液，活化3次后5000-8000r/min离心5-15min取菌体，用无菌水清洗两次后调节菌液浓度至OD600nm为1.0-2.0。
(2)生物膜形成：将菌液接种于含新鲜的液体培养基的锥形瓶中，将生物膜载体浸入培养液底部，在35-42℃静置培养，每隔12-24h将培养液倒出，补充新鲜的培养液，培养3-7d，在载体表面形成生物膜。
按上述方法制备益生菌生物膜，使用的益生菌为嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌。
按上述方法制备益生菌生物膜，嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌在载体上的生物膜量达到14Log cfu/cm2以上。
根据上述方法得到的益生菌生物膜进行冷藏，要求益生菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h，在4℃冰箱冷藏保存一周。
按上述生物膜冷藏方法，益生菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h。
按上述生物膜冷藏方法，含有益生菌生物膜的载体在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上的活菌数仍达到6Log cfu/cm2以上。
本发明获得以下有益效果：
与现有技术相比，本发明提供了一种用于益生菌生物膜冷藏的载体及其制备方法，有以下优点：
(1)本发明中制备的益生菌生物膜载体使用的基质是聚乳酸，具有安全无毒、可生物降解、耐热、耐菌、阻燃、抗紫外线和价格低的优点，对保护环境和载体应用非常有利。聚乳酸基质载体目前主要应用于污水反应器中，在益生菌生物膜中的应用较少。
(2)益生菌在聚乳酸表明的附着能力有限，形成的生物膜较少。本发明中制备的益生菌生物膜载体添加了培养基和缓释碳源，为菌种提供营养，提高益生菌在载体表面形成生物膜的能力。
(3)本发明中制备的益生菌生物膜载体可用于嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌生物膜的制备，且生物膜上的活菌数量能够达到一般食品发酵的接种量。
(4)益生菌生物膜在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上仍有大量的活菌，方便菌种4℃冷藏后直接使用。与菌种冷冻相比该方法可减少菌种活化的次数和时间，方便菌种的连续使用。
四、附图说明
图1为载体表面电镜形貌图；
图2为载体上嗜热链球菌生物膜的电镜图；
图3为载体上乳酸乳球菌生物膜的电镜图；
图4为载体上保加利亚乳杆菌生物膜的电镜图。
五、具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但本发明不受实施案例限制。
以下实施案例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种用于嗜热链球菌生物膜冷藏的载体及其制备方法，通过以下步骤得到：
载体制备：在MRS培养液中添加2％的淀粉，微波炉中火加热1min，冷却至室温后作为水相备用。将聚乳酸颗粒溶解于二氯甲烷中，配成0.1g/mL的聚合物有机溶液，作为有机相备用。将水相和有机相1∶9混合，加入至一个干燥洁净的玻璃杯中，使用磁力搅拌器1000r/min分散乳化30min。将乳化好的混合液倒入9cm直径的玻璃平皿中，要求完全覆盖皿底，厚度10mm，通风环境下放置12h，待有机溶剂完全挥发后形成薄膜。将薄膜用水反复清洗去除残留的有机试剂，60℃恒温干燥12h后置于玻璃容器中，121℃高压蒸汽灭菌15min。得到的载体表面较光滑，为益生菌提供附着空间(图1)。
生物膜制备：取0.5mL冷冻保存的嗜热链球菌接种于200mL MRS培养液中，在温度42℃转速200r/min的条件下培养18h后，取2mL菌液接种于新鲜200mL MRS培养液，活化3次。菌液5000r/min离心10min后，用无菌水清洗两次后调节菌液浓度至OD600nm为1.5。抽取2mL菌液接种于含30mL新鲜的MRS液体培养基的锥形瓶中，将生物膜载体浸入培养液底部，在42℃静置培养，每隔16h将培养液倒出，补充30mL新鲜的MRS培养液，培养7d，在载体表面形成嗜热链球菌生物膜(图2)。活菌数达到15.15Log cfu/cm2。
冷却保存：嗜热链球菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h，在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上的活菌数仍达到7.52Log cfu/cm2。
实施例2
一种用于乳酸乳球菌生物膜冷藏的的载体及其制备方法，通过以下步骤得到
载体制备：在MRS培养液中添加2％的淀粉，煮沸加热，冷却至室温后作为水相备用。将聚乳酸颗粒溶解于二氯甲烷中，配成0.1g/mL的聚合物有机溶液，作为有机相备用。将水相和有机相1∶9混合，加入至一个干燥洁净的玻璃杯中，使用高速分散器5000r/min分散乳化20min。将乳化好的混合液倒入9cm直径的玻璃平皿中，要求完全覆盖皿底，厚度10mm，通风环境下放置12h，待有机溶剂完全挥发后形成薄膜。将薄膜用水反复清洗去除残留的有机试剂，60℃恒温干燥12h后置于玻璃容器中，121℃高压蒸汽灭菌15min，得到的载体表面较光滑。
生物膜制备：取0.5mL冷冻保存的乳酸乳球菌接种于200mL MRS培养液中，在温度37℃转速200r/min的条件下培养18h后，取2mL菌液接种于新鲜200mL MRS培养液，活化3次。菌液5000r/min离心10min后，用无菌水清洗两次后调节菌液浓度至OD600nm为1.5。抽取2mL菌液接种于含30mL新鲜的MRS液体培养基的锥形瓶中，将生物膜载体浸入培养液底部，在37℃静置培养，每隔16h将培养液倒出，补充30mL新鲜的MRS培养液，培养5-7d，在载体表面形成乳酸乳球菌生物膜(图3)。活菌数可达到17.26Log cfu/cm2。
冷却保存：乳酸乳球菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h，在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上的活菌数仍达到7.38Log cfu/cm2。
实施例3
一种用于保加利亚乳杆菌生物膜冷藏的的载体及其制备方法，通过以下步骤得到：
载体制备：参照实例1或实例2进行益生菌生物膜载体制备。
生物膜制备：参照实例2进行生物膜制备，保加利亚乳杆菌在载体表面形成生物膜(图4)。活菌数可达到16.08Log cfu/cm2。
冷却保存：保加利亚乳杆菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h，在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上的活菌数仍达到7.34Log cfu/cm2。

Claims (9)

1.一种用于益生菌生物膜冷藏的载体的制备方法，其特征在于：具体包含以下步骤：
(1)水相制备：在水系培养液中添加1％-4％的缓释碳源，加热助溶，冷却至室温后备用。
(2)有机相制备：聚乳酸颗粒溶解于二氯甲烷中，配成0.1g/mL的聚合物有机溶液备用。
(3)混合乳化：将水相和有机相1∶9混合，加入至一个干燥洁净的玻璃杯中，高速分散乳化20-30min。
(4)挥发成膜：将乳化好的混合液倒入玻璃平皿，要求完全覆盖皿底，厚度5-10mm，通风环境下放置12-24h，待有机溶剂完全挥发后形成薄膜。
(5)洗涤烘干：将薄膜用水反复清洗去除残留的有机试剂，40-60℃恒温干燥8-12h。
(6)灭菌：将薄膜置于玻璃容器中，121℃高压蒸汽灭菌15min后备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：益生菌生物膜载体的制备方法中以聚乳酸为基质，添加培养液和缓释碳源。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：益生菌生物膜载体的制备中优选的缓释碳源为淀粉。
4.利用权利要求1-3所述的载体制备益生菌生物膜，其特征在于：包含以下步骤：
(1)菌种活化：将益生菌接种于培养液中，适温培养至稳定期后从中抽取2mL菌液接种于新鲜培养液，活化3次后5000-8000r/min离心5-15min取菌体，用无菌水清洗两次后调节菌液浓度至OD600nm为1.0-2.0。
(2)生物膜形成：抽取三代菌液接种于含新鲜的液体培养基的锥形瓶中，在35-42℃培养，每隔12-24h将培养液倒出，补充新鲜的培养液，培养4-7d，在载体表面形成生物膜。
5.按照权利要求4所述的益生菌生物膜，其特征在于：使用的益生菌为嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌。
6.按照权利要求4所述的益生菌生物膜，其特征在于：嗜热链球菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌在载体上的生物膜量可达到14Log cfu/cm2以上。
7.按照权利要求4所述的方法得到的益生菌生物膜进行冷藏，其特征在于：益生菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h，在4℃冰箱冷藏保存一周。
8.按照权利要求7所述的生物膜冷藏，其特征在于：益生菌在载体上形成生物膜后，室温无菌条件晾干4h。
9.按照权利要求7所述的生物膜冷藏，其特征在于：含有益生菌生物膜的载体在4℃冰箱冷藏保存一周后，载体上的活菌数仍达到6Log cfu/cm2以上。
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