CN114184713A - 一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，在色谱柱为Eclipse XDB‑C18分离柱（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温为35℃，进样量为20μL，流速的选择0.8 mL/min，流动相为0.1%甲酸‑水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B），DAD检测器的波长为360 nm，高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B，5min：10% B，10 min：20% B，20 min：30% B，30 min：40% B，35 min：100% B的条件下，针对乌饭树叶水提液、叶水提物干燥品、果水提液、果水提物干燥品，运行高效液相色谱，基于HPLC指纹图谱的特征峰可有效的鉴定水提物（水提液或干燥品）是否含有乌饭树叶或果，并能初步判定其含量多寡，为乌饭树产业化发展提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于天然植物原料及产品的鉴定技术，具体涉及一种乌饭树水提液的鉴定技术及应用。
背景技术
乌饭树（Vaccinium bracteatum Thunb.），又名南烛、乌米饭，为杜鹃花科（Ericaceae）植物，在我国长江以南地区广泛分布，是酸性土壤的指示植物。果实、枝叶药用，具有益肾固精、强筋明目、治久泄久痢的作用。时至今日，我国江南、闽东北一带在农历三四月份仍喜食用其嫩叶浸渍糯米煮成的乌米饭，这一方面与传说相关；另外，由于农历三四月份新叶数量多且红色鲜艳，浸泡的乌米饭色泽乌黑亮丽，并具有龙眼香气，能刺激食欲，有健脾益肾之功。
按照传统食用习惯，乌饭树的一般是新鲜叶片搅碎加入水搅拌、浸渍、过滤后直接用于米饭或其他食品的制备。目前为了常年供应乌饭树叶提取物，通常采用制备乌饭树干叶或冰冻冷藏乌饭树新鲜叶，或将乌饭树叶提取物冷藏或浓缩干燥。乌饭树叶水提物制备应用较普遍，如今也有提取制备并应用乌饭树叶醇提物的研究。乌饭树叶水提物、醇提物已经被应用于染发剂，应用于制备防治糖尿病视网膜病变药物或食品等。通过市场调研，市场上乌饭树水提液即乌饭树叶汁也存在作假的行为，通过伪劣乌饭树水提液制备的食品也很黑，但缺少了乌饭树原有的香气。这主要由于并未所有的乌饭树叶提取物染黑效果都很好，乌饭树叶的来源、批次较重要。另外水提物浓度较低时，其染色效果也会欠佳。染黑效果欠佳时商家为了保证观感将添加其他成分。本发明基于高效液相色谱检测特征峰，提出了一种鉴定乌饭树叶、果水提物的方法，能够有效的鉴定水提物（水提液或干燥品）是否含有乌饭树叶或果，能初步判定其含量多寡，为乌饭树产业化发展提供科学依据。
发明内容
本发明为了有效鉴定乌饭树水提物，本发明旨在于提供一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，并对其开展应用研究。
本发明所采取的技术方案是一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，该方法包括以下步骤：
（1）乌饭树水提物的准备：包括乌饭树叶水提液、乌饭树叶水提物干燥品、乌饭树果水提液、乌饭树果水提物干燥品。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提液经滤膜过滤后直接使用，干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解至1-4 mg/mL，经滤膜过滤后使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱：不同批次乌饭树水提物具有十分相似的HPLC指纹图谱。
进一步，所述步骤（4）中HPLC指纹图谱，不同批次乌饭树叶水提物具有6个共有特征峰，相对保留时间分别位于11.773±0.199 min（1号），13.906±0.192 min（2号），15.763±0.176 min（3号），16.460±0.190 min（4号），18.508±0.133 min（5号），18.900±0.147min（6号）。
优选的，1号、3号、4号、6号特征峰为乌饭树叶水提物主要成分特征峰，4个主要特征峰之间时间间隔分别为3.990±0.046 min，0.696±0.034 min，2.440±0.060 min。
进一步，所述步骤（4）中HPLC指纹图谱，不同批次乌饭树果水提物具有5个共有特征峰，相对保留时间分别位于11.799±0.127 min（7号），13.684±0.143 min（8号），13.944±0.161 min（9号），16.135±0.131 min（10号）18.262±0.172 min（11号）。
优选的，9号、10号特征峰为乌饭树果水提物主要成分特征峰，2个主要特征峰之间时间间隔分别为2.192±0.022 min。
（5）比较HPLC指纹图谱，乌饭树水提物峰面积（mAU*s）与其浓度正相关，可基于HPLC峰面积判定水提物中活性成分的含量多寡。
本发明的有益效果是：（1）提供了乌饭树叶、果水提物的鉴定方法；（2）不仅能鉴定乌饭树水提液，还能鉴定水提物干燥品；（3）本发明检测相对时间较短，35 min-40 min就能检测一个样品；（4）技术成熟，检测数据可靠；（5）为乌饭树产业化发展提供科学依据。
附图说明
附图1 不同批次乌饭树叶水提液HPLC指纹图谱
附图2 不同批次乌饭树叶水提物干燥品HPLC指纹图谱
附图3 不同批次乌饭树叶水提液和水提物干燥品HPLC指纹图谱
附图4 乌饭树叶水提物干燥品不同浓度样本HPLC指纹图谱
附图5 乌饭树叶水提物干燥品不同浓度样本峰面积
附图6 乌饭树叶水提液不同浓度样本HPLC指纹图谱
附图7 乌饭树叶水提液不同浓度样本峰面积
附图8 用乌饭树叶水提液制作的乌米饭
附图9 乌饭树果水提液和水提物干燥品HPLC指纹图谱
具体实施方式
为了使本领域的技术人员进一步了解本发明的特征、技术手段及所达到的具体目的，下面结合具体生产实例介绍本发明的应用效果。
一般不同批次乌饭树叶水提液、叶水提物干燥品、果水提液、果水提物干燥品均是若干棵乌饭树叶、果混合的样本。
实施例1
本发明实施中，为了验证不同批次乌饭树叶水提液检测效果，对4个批次乌饭树叶片进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树水提液的准备：选择a、b、c、d不同批次乌饭树新鲜叶片，a批次叶片加3倍水用破壁机粉碎、过滤；b批次叶片用榨汁机粉粹后加3倍水工作频率40 KHz下超声提取40 min，过滤；c批次叶片用破壁机粉粹后加3倍水工作频率40 KHz下超声提取40 min，过滤；d批次叶片用传统手工搅碎后加入3倍水搅拌、浸渍、过滤。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提液经滤膜过滤后直接使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图1所示：不同批次乌饭树水提液具有十分相似的HPLC指纹图谱，a、b、c、d不同批次的水提液出峰相对保留时间不同，但经过RSD（%）计算可判定6个特征峰为共有的特征峰，其中1号、3号、4号、6号特征峰为主要成分特征峰。由于乌饭树叶为不同批次，每种乌饭树叶水提液选择的制备方式不同，因此HPLC指纹图谱呈现峰高（mAU）和峰面积（mAU*s）的差异，a、b、c、d水提液峰面积（mAU*s）分别为8955.38，24832.10，49124.30，9516.59。b水提液在20.888有一个特征峰，d水提液在19.848、20.852有2个特征峰，而a、c水提液在相应时间没有明显的特征峰。
试验结果表明6个共有特征峰、4个主要成分特征峰可鉴定乌饭树水提液。
实施例2
本发明实施中，为了验证不同批次乌饭树叶水提物干燥品检测效果，对3个批次乌饭树叶片进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树叶水提物干燥品的准备：选择e、f、g不同批次乌饭树叶水提物干燥品，e批次为购置的叶水提物干燥品，f批次为加4倍水用破壁机粉碎、过滤、浓缩、冷冻干燥所得，f批次为加5倍水用破壁机粉碎、过滤、浓缩、冷冻干燥所得。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提物干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解至2mg/mL，经滤膜过滤后使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图2所示：不同批次乌饭树叶水提物干燥品具有十分相似的HPLC指纹图谱，e、f、g不同批次的水提液出峰相对保留时间不同，但经过RSD（%）计算可判定6个特征峰为共有的特征峰，其中1号、3号、4号、6号特征峰为主要成分特征峰。由于乌饭树叶水提物干燥品为不同批次，因此HPLC指纹图谱呈现峰高（mAU）和峰面积（mAU*s）的差异，e、f、g水提液峰面积（mAU*s）分别为2729.48，9082.40，8856.66。g水提液在20.913有一个特征峰，而e、f水提液在相应时间没有明显的特征峰。
试验结果表明6个共有特征峰、4个主要成分特征峰可鉴定乌饭树叶水提物干燥品。
实施例3
本发明实施中，为了验证不同批次乌饭树叶水提液、水提物干燥品检测效果，对4个批次乌饭树叶片进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树叶水提物的准备：h、i为不同批次乌饭树叶水提液，j、k为不同批次乌饭树叶水提物干燥品。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提液经滤膜过滤后直接使用，水提物干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解至3 mg/mL，经滤膜过滤后使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图3所示：不同批次乌饭树叶水提液、水提物干燥品具有十分相似的HPLC指纹图谱，h、i、j、k不同批次的水提物出峰相对保留时间不同，但经过RSD（%）计算可判定6个特征峰为共有的特征峰，其中1号、3号、4号、6号特征峰为主要成分特征峰。由于乌饭树叶水提物为不同批次，因此HPLC指纹图谱呈现峰高（mAU）和峰面积（mAU*s）的差异。
试验结果表明6个共有特征峰、4个主要成分特征峰可同时鉴定乌饭树叶水提液和水提物干燥品。
实施例4
本发明实施中，为了验证同一批次乌饭树叶水提物干燥品不同浓度的检测效果，对同一批次乌饭树叶片进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树叶水提物干燥品的准备：m-1、m-2、m-3为同一批次乌饭树叶水提物干燥品。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提物干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解，m-1、m-2、m-3分别溶解至2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL，经滤膜过滤后使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图4所示：同一批次乌饭树叶水提物干燥品浓度不同，但HPLC指纹图谱相同，6个特征峰与11批次样品（a-k）仍为共有的特征峰，其中1号、3号、4号、6号特征峰为主要成分特征峰。由于浓度不同，m-1、m-2、m-3的 HPLC指纹图谱呈现峰高（mAU）和峰面积（mAU*s）的差异，三个图谱的峰面积（mAU*s）分别为5200.20、2868.98、1074.82。如附图5所示，峰面积与样本浓度曾线性关系。
试验结果表明6个共有特征峰、4个主要成分特征峰可鉴定乌饭树叶水提物干燥品，可用于样本浓度的判定。
实施例5
本发明实施中，为了验证同一批次乌饭树叶水提液不同浓度的检测效果，对4个批次乌饭树叶片进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树叶水提液的准备：乌饭树叶加3倍水用破壁机粉碎、过滤。
（2）HPLC检测材料制备：同一批次乌饭树叶水提液经滤膜过滤，n-1为水提液原液，n-2为n-1水提液稀释一倍的样本，n-3为n-2水提液稀释一倍的样本。n-1、n-2、n-3之间浓度成梯度关系。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图6所示：同一批次乌饭树叶水提液浓度不同，但HPLC指纹图谱相同，6个特征峰与11批次样品（a-k）仍为共有的特征峰，其中1号、3号、4号、6号特征峰为主要成分特征峰。由于浓度不同，n-1、n-2、n-3的 HPLC指纹图谱呈现峰高（mAU）和峰面积（mAU*s）的差异，三个图谱的峰面积（mAU*s）分别为21912.80、11556.40、3018.14。如附图7所示，峰面积与样本浓度曾线性关系。如附图8所示，用3倍水用破壁机粉碎、过滤的乌饭树叶水提液制作的乌米饭特别的黑，味道特别香。
试验结果表明6个共有特征峰、4个主要成分特征峰可鉴定乌饭树叶水提液，可用于样本浓度的判定。
实施例6
本发明实施中，为了验证确定6个共有特征峰及4个主要成分特征峰，对比分析了实施例1-5中HPLC指纹图谱数据。
对a-k、m-1、m-2、m-3、n-1、n-2、n-3共计17批样本HPLC数据进行统计分析，包括了不同批次的叶片，同一批次叶片水提物的不同形态，同一样本的不同浓度，及同一样本不同时间的重复试验等类型。6个特征峰RSD（%）均小于1.00，依据统计分析判定这6个特征峰为共有特征峰，6个共有特征峰相对保留时间的平均值及标准偏差分别为11.773±0.199 min（1号），13.906±0.192 min（2号），15.763±0.176 min（3号），16.460±0.190 min（4号），18.508±0.133 min（5号），18.900±0.147 min（6号）。1号、3号、4号、6号特征峰为乌饭树叶水提物主要成分特征峰，4个主要特征峰之间时间间隔分别为3.990±0.046 min，0.696±0.034 min，2.440±0.060 min。参照该相对保留时间的数据及主要特征峰时间间隔的数据，其他样本在相同HPLC条件下主要特征峰相对保留时间与参考数据一致，即可有效判定鉴定乌饭树叶水提液和水提物干燥品。
实施例7
本发明实施中，为了验证不同批次乌饭树果水提液、水提物干燥品检测效果，对2个批次乌饭树的果进行试验，具体步骤如下：
（1）乌饭树果水提物的准备：p为乌饭树果加4倍水用破壁机粉碎、过滤所得乌饭树果水提液，q为乌饭树果加8倍水用破壁机粉碎、工作频率40 KHz下超声提取40 min、过滤、浓缩、冷冻干燥所得乌饭树果水提物干燥品。
（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中果水提液经滤膜过滤后直接使用，果水提物干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解至2 mg/mL，经滤膜过滤后使用。
（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品；
进一步，所述步骤（3）中进样量为20 μL；
进一步，所述步骤（3）中流速的选择0.8 mL/min；
进一步，所述步骤（3）中柱温为35℃；
进一步，所述步骤（3）中色谱柱为Eclipse XDB-C18分离柱（4.6 mm × 250 mm，5μm）；
进一步，所述步骤（3）中流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；
进一步，所述步骤（3）中DAD检测器的波长为360 nm；
进一步，所述步骤（3）中高效液相色谱洗脱条件为0 min：5% B；5min：10% B；10min：20% B；20 min：30% B；30 min：40% B；35 min：100% B。
（4）运行HPLC程序，比较HPLC指纹图谱。
试验结果如附图9所示：不同批次乌饭树果水提液、果水提物干燥品具有十分相似的HPLC指纹图谱，p、q果水提物出峰相对保留时间不同，但经过RSD（%）计算可判定5个特征峰为共有的特征峰，5个共有特征峰相对保留时间的平均值及标准偏差分别为11.799±0.127 min（7号），13.684±0.143 min（8号），13.944±0.161 min（9号），16.135±0.131min（10号）18.262±0.172 min（11号）。9号、10号特征峰为乌饭树果水提物主要成分特征峰，2个主要特征峰之间时间间隔分别为2.192±0.022 min。参照该相对保留时间的数据及主要特征峰时间间隔的数据，其他样本在相同HPLC条件下主要特征峰相对保留时间与参考数据一致，即可有效判定鉴定乌饭树果水提液和果水提物干燥品。
试验结果表明5个共有特征峰、2个主要成分特征峰可鉴定乌饭树果水提液和果水提物干燥品。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变化、修改、替换和变型，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，该技术方法包括以下步骤：（1）乌饭树水提物的准备：包括乌饭树叶水提液、乌饭树叶水提物干燥品、乌饭树果水提液、乌饭树果水提物干燥品；（2）HPLC检测材料制备：所述步骤（1）中水提液经滤膜过滤后直接使用，干燥品用0.1%甲酸-水溶液溶解至1-4 mg/mL，经滤膜过滤后使用；（3）利用高效液相色谱仪分析备检样品：进样20 μL，流速0.8 mL/min，柱温35℃，色谱柱Eclipse XDB-C18分离柱，流动相为0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B），洗脱条件为min：5% B、5min：10% B、10 min：20% B、20 min：30% B、30 min：40% B、35 min：100% B，DAD检测器的波长为360 nm；（4）运行HPLC程序，基于HPLC指纹图谱的共有特征峰鉴定是否含有乌饭树：乌饭树叶水提物具有6个共有特征峰（1号-6号），乌饭树果水提物具有5个共有特征峰（7号-11号）。
2.如权利要求1所述的一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，其特征在于：乌饭树叶水提物具有6个共有特征峰，相对保留时间分别位于11.773±0.199 min（1号），13.906±0.192 min（2号），15.763±0.176 min（3号），16.460±0.190 min（4号），18.508±0.133min（5号），18.900±0.147 min（6号）。
3.如权利要求1所述的一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，其特征在于：1号、3号、4号、6号特征峰为乌饭树叶水提物主要成分特征峰，4个主要特征峰之间时间间隔分别为3.990±0.046 min，0.696±0.034 min，2.440±0.060 min。
4.如权利要求1所述的一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，其特征在于：乌饭树果水提物具有5个共有特征峰，相对保留时间分别位于11.799±0.127 min（7号），13.684±0.143 min（8号），13.944±0.161 min（9号），16.135±0.131 min（10号）18.262±0.172min（11号）。
5.如权利要求1所述的一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，其特征在于：9号、10号特征峰为乌饭树果水提物主要成分特征峰，2个主要特征峰之间时间间隔分别为2.192±0.022 min。
6.如权利要求1所述的一种乌饭树水提物的鉴定技术及应用，其特征在于：乌饭树水提物峰面积（mAU*s）与其浓度正相关，可基于HPLC峰面积判定水提物中活性成分的含量多寡。
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