CN114181201A - 作为针对各种神经退行性疾病的潜在治疗剂的新化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法，神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆(FTDP‑17)。本申请的方法还涉及细菌细胞的发酵方法和本申请化合物的互变异构化方法。

Description

作为针对各种神经退行性疾病的潜在治疗剂的新化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月15日提交的美国临时申请序列No.63/078,697的权益，该申请的包括任何表、图或附图在内的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法。本申请的方法还涉及细菌细胞的发酵方法和本申请化合物的互变异构化方法。
背景技术
神经退行性疾病是神经系统病症，其特征在于中枢神经系统或外周神经系统中神经元的进行性损失和神经元结构的变性，其具有多种表型。最常见的神经退行性疾病是阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(Chen,W.W.,Zhang,X.&Huang,W.J.Role of neuroinflammation in neurodegenerative diseases(Review).MolMed Rep 13,3391-3396(2016)；Scheltens,P.等人Alzheimer's disease.The Lancet388,505-517(2016)；Hardiman,O.等人Amyotrophic lateral sclerosis.Nat Rev DisPrimers 3,17071(2017)；Poewe,W.等人Parkinson disease.Nat Rev Dis Primers 3,17013(2017))。AD是具有复杂病理的异源神经系统病症。对于AD诊断，细胞外β-淀粉样蛋白斑的沉积和过度磷酸化tau的细胞内神经原纤维缠结是最公认的病理学标准(Long,J.M.&Holtzman,D.M.Alzheimer Disease:An Update on Pathobiology and TreatmentStrategies.Cell 179,312-339(2019))。PD的神经病理学标志是脑黑质区中的细胞内α-突触核蛋白聚集和多巴胺神经元损失，这导致动作迟缓和其他运动障碍(Poewe,W.等人Parkinson disease.Nat Rev Dis Primers 3,17013(2017))。ALS是一种运动神经元疾病，其特征在于上运动神经元和下运动神经元变性，从而导致神经肌肉虚弱和麻痹。约50％的ALS患者呈现认知障碍，并且13％的ALS患者发展为伴发额颞叶痴呆(FTD)(Hardiman,O.等人Amyotrophic lateral sclerosis.Nat Rev Dis Primers 3,17071(2017))。
衰老是这些神经退行性疾病以及神经元细胞死亡和神经元损失的主要风险因素。近几十年来，全世界人口的老龄化显著加快。随着全球人口的老龄化趋势，患者数量日益增加的神经退行性疾病已经严重威胁了人类的健康(Hou,Y.等人Ageing as a risk factorfor neurodegenerative disease.Nat Rev Neurol 15,565-581(2019))。据估计，世界上每三秒钟就会增加一个新的AD确诊患者。2018年有约5,000万AD患者，其中约3,000万是中国患者。到2050年，预计该数字将高达1.52亿，是目前患者人数的三倍。2018年，花费于AD的全球费用估计为1万亿美元，并且该费用在2030年将会翻倍(Eratne,D.等人Alzheimer'sdisease:clinical update on epidemiology,pathophysiology anddiagnosis.Australas Psychiatry 26,347-357(2018)；Lopez,O.L.&Kuller,L.H.Epidemiology of aging and associated cognitive disorders:Prevalence andincidence of Alzheimer's disease and other dementias.Handb Clin Neurol 167,139-148(2019)；Garre-Olmo,J.[Epidemiology of Alzheimer's disease and otherdementias].Rev Neurol 66,377-386(2018))。PD是第二大流行的神经退行性疾病，并且2020年的全球患者人数为约1,000万，其中有100万美国人和250万中国人(Tysnes,O.B.&Storstein,A.Epidemiology of Parkinson's disease.J Neural Transm(Vienna)124,901-905(2017)；Abbas,M.M.,Xu,Z.&Tan,L.C.S.Epidemiology of Parkinson's Disease-East Versus West.Mov Disord Clin Pract 5,14-28(2018))。ALS、癌症和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)被世界卫生组织视为三大不治之症。世界上每年诊断出的ALS新病例超过5,000例，到2040年可能会达到400,000例。
然而，目前几乎没有有效的药物，并且目前针对这些疾病的药物只能缓解症状，而对逆转神经元损伤或延缓疾病进展没有任何作用。现有的AD药物基于其作用机制可被分为以下几组：例如，用于改善中枢胆碱能系统的他克林和艾斯能(Rafii,M.S.&Aisen,P.S.Advances in Alzheimer's disease drug development.BMC Med 13,62(2015)；Hung,S.Y.&Fu,W.M.Drug candidates in clinical trials for Alzheimer's disease.JBiomed Sci 24,47(2017))；作为谷氨酸盐受体拮抗剂的美金刚(Witt,A.,Macdonald,N.&Kirkpatrick,P.Memantine hydrochloride.Nat Rev Drug Discov 3,109-110(2004)；Reisberg,B.等人Memantine in moderate-to-severe Alzheimer's disease.N Engl JMed 348,1333-1341(2003))；用于调节钙稳态的尼莫地平和氟桂利嗪(Popovic,M.,Caballero-Bleda,M.,Popovic,N.,Bokonjic,D.&Dobric,S.Neuroprotective effect ofchronic verapamil treatment on cognitive and noncognitive deficits in anexperimental Alzheimer's disease in rats.Int J Neurosci 92,79-93(1997))；作为抗氧化剂的维生素E和司来吉兰；靶向Aβ的抗体(Albarran,M.T.,Lopez-Burillo,S.,Pablos,M.I.,Reiter,R.J.&Agapito,M.T.Endogenous rhythms of melatonin,totalantioxidant status and superoxide dismutase activity in several tissues ofchick and their inhibition by light.J Pineal Res 30,227-233(2001))；抗炎类固醇药物；神经营养因子如NGF(Rafii,M.S.&Aisen,P.S.Advances in Alzheimer's diseasedrug development.BMC Med 13,62(2015)；Hung,S.Y.&Fu,W.M.Drug candidates inclinical trials for Alzheimer's disease.J Biomed Sci 24,47(2017))；用于促进神经元代谢奈非西坦；以及一些中药如石杉碱甲、儿茶素、人参皂甙等。所有这些药物仅能减轻AD相关症状，但不能抑制疾病的进展。对于PD治疗，L-多巴和多巴胺脱羧酶抑制剂(如卡比多巴)的组合已经使用了多年。L-多巴的应用可以弥补PD患者多巴胺信号的缺乏；然而，随着疾病的进展，效果会变弱(Charvin,D.,Medori,R.,Hauser,R.A.&Rascol,O.Therapeutic strategies for Parkinson disease:beyond dopaminergic drugs.NatRev Drug Discov 17,804-822(2018))。FDA批准了三种用于ALS的药物：利鲁唑、依达拉奉和氢溴酸右美沙芬/硫酸奎尼丁胶囊(Nuedexta)。利鲁唑是谷氨酸盐受体拮抗剂，而依达拉奉保护神经元免受自由基侵害。虽然这两种药物改善了患者的生活质量，但它们不能阻止ALS的进展。Nuedexta用于治疗伴随ALS的假性延髓病。
进一步显示，在过去20年间，由几家国际制药公司进行的超过300种候选药物在临床试验中失败了(Kuller,L.H.A new era for dementia epidemiology:Alzheimer'sdisease,hardening of arteries,or just old age？Eur J Epidemiol 33,613-616(2018))。这表明传统的单一靶点与化学全合成的组合难以成功地找到神经退行性疾病的有效药物。因此，需要开发有效治疗药物的新思路。在2019年末，中国将GV-971确立为AD疗法，通过减少神经元炎症和除去脑中的Aβ沉积和tau过度磷酸化而显示出显著的神经保护作用并改善了认知能力。GV-971分离自海洋褐藻。
由于海洋天然产物具有丰富的多样性、结构新颖性和高生物活性，因此，近年来越来越多的注意力集中到来自海洋天然产物的药物发现中。值得注意的是，各种海洋细菌在海洋生态系统中起着重要作用，由于独特的细菌代谢途径而实现新药先导化合物的发现，从而提供了用于新药发现的模型化合物的多样性数据库(Harvey,A.L.,Edrada-Ebel,R.&Quinn,R.J.The re-emergence of natural products for drug discovery in thegenomics era.Nat Rev Drug Discov 14,111-129(2015)；Haefner,B.Drugs from thedeep:marine natural products as drug candidates.Drug Discov Today 8,536-544(2003))。随着先进的深海作业、有效的分离和纯化、高通量筛选分析、基因工程和分子修饰技术的发展，来自海洋天然产物的药物发现正在复兴(Xiao,G.,Shao,X.,Zhu,D.&Yu,B.Chemical synthesis of marine saponins.Nat Prod Rep 36,769-787(2019)；He,W.,Zhang,Z.&Ma,D.A Scalable Total Synthesis of the Antitumor Agents Et-743 andLurbinectedin.Angew Chem Int Ed Engl 58,3972-3975(2019)；Yamada,Y.[Studies ondiscovery and synthesis of bioactive marine organic molecules].YakugakuZasshi 122,727-743(2002))。已经开始了海洋化合物的临床前测试和临床试验步骤，并且更多的国家正关注海洋“蓝色药物库”的投资(Pravin Shinde,P.B.,Anita MandhareMarine natural products as source of new drugs:a patent review(2015-2018).Expert Opinion on Therapeutic Patents 29,283-309(2019))。目前，有29种海洋来源活性化合物被批准上市或临床试验，涉及治疗多种疾病。
神经元中由过量的谷氨酸盐信号引起的兴奋性毒性是细胞死亡和多种神经变性疾病如AD、PD、ALS、亨廷顿病(HD)、多发性硬化症、癫痫、中风和酒精戒断症所共有的共同病理途径的公认原因(H.Blasco,S.M.,P.Corcia and P.H.Gordon.The GlutamateHypothesis in ALS-Pathophysiology and Drug Development.Current MedicinalChemistry 21,3551-3575(2014)；Mehta,A.,Prabhakar,M.,Kumar,P.,Deshmukh,R.&Sharma,P.L.Excitotoxicity:bridge to various triggers in neurodegenerativedisorders.Eur J Pharmacol 698,6-18(2013)；Dong,X.X.,Wang,Y.&Qin,Z.H.Molecularmechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis ofneurodegenerative diseases.Acta Pharmacol Sin 30,379-387(2009))。据报道，在C9orf72基因的第一个非编码区中形成G-四链体二级结构的GGGGCC(G4C2)六核苷酸重复扩增(HRE)是ALS和FTD的主要遗传原因。此外，独特的结构元件G-四链体(G4)在包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、ALS/FTD、脆性X综合征(FXS)和朊病毒病进行性肌阵挛癫痫I型(PME1)在内的多种神经疾病的发病机理中起到不同的作用(Wang,E.,Thombre,R.,Shah,Y.,Latanich,R.&Wang,J.G-Quadruplexes as pathogenic drivers inneurodegenerative disorders.Nucleic acids research(2021))。此外，过度磷酸化tau聚集是几种神经退行性疾病的最特有和最常见的生物标志物之一，包括AD、ALS、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病(PiD)、皮质基底变性(CBD)以及17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆(FTDP-17)(Mazanetz,M.P.&Fischer,P.M.Untangling tauhyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases.Nat RevDrug Discov 6,464-479(2007)；Julien,J.P.Amyotrophic lateral sclerosis:unfolding the toxicity of the misfolded.Cell 104,581-591(2001)；Schneider,A.&Mandelkow,E.Tau-based treatment strategies in neurodegenerativediseases.Neurotherapeutics 5,443-457(2008))。因此，针对谷氨酸盐引起的兴奋性毒性、DNA/RNA G4C2结合、tau聚集的药理学设计可以是用于此类疾病的可行的治疗组合策略(Mazanetz,M.P.&Fischer,P.M.Untangling tau hyperphosphorylation in drug designfor neurodegenerative diseases.Nat Rev Drug Discov 6,464-479(2007))。
已经假设ALS/FTD发病机理存在三种可能的潜在机制：C9orf72基因功能丧失、由RNA结合蛋白(RBP)募集至RNA G4C2重复序列所形成的毒性核酸聚点(RNA foci)、以及由重复相关的非ATG(RAN)翻译所产生的毒性二肽(Balendra,R.&Isaacs,A.M.C9orf72-mediated ALS and FTD:multiple pathways to disease.Nat Rev Neurol 14,544-558(2018)；Kumar,V.,Hasan,G.M.&Hassan,M.I.Unraveling the Role of RNA MediatedToxicity of C9orf72 Repeats in C9-FTD/ALS.Front Neurosci 11,711(2017))。除了致病机制外，持续的谷氨酸盐诱导的神经元兴奋性毒性在C9orf72 ALS/FTD的发病机理中起主要作用(Donnelly,C.J.等人RNA toxicity from the ALS/FTD C9ORF72 expansion ismitigated by antisense intervention.Neuron 80,415-428(2013)；Starr,A.&Sattler,R.Synaptic dysfunction and altered excitability in C9ORF72 ALS/FTD.Brain Res1693,98-108(2018)；Yuva-Aydemir,Y.,Almeida,S.&Gao,F.B.Insights into C9ORF72-Related ALS/FTD from Drosophila and iPSC Models.TrendsNeurosci 41,457-469(2018)；Selvaraj,B.T.,Livesey,M.R.&Chandran,S.Modeling the C9ORF72 repeatexpansion mutation using human induced pluripotent stem cells.Brain Pathol27,518-524(2017)；DeJesus-Hernandez,M.等人Expanded GGGGCC HexanucleotideRepeat in Noncoding Region of C9ORF72 Causes Chromosome 9p-Linked FTD andALS.Neuron 72,245-256(2011))。增加的谷氨酸盐信号引起兴奋性毒性并促进DPR形成，从而使神经元易受攻击(Westergard,T.等人Repeat-associated non-AUG translation inC9orf72-ALS/FTD is driven by neuronal excitation and stress.EMBO Mol Med 11(2019)；Xu,W.&Xu,J.C9orf72 Dipeptide Repeats Cause Selective Neurodegenerationand Cell-Autonomous Excitotoxicity in Drosophila Glutamatergic Neurons.JNeurosci 38,7741-7752(2018)；Donnelly,C.J.等人RNA toxicity from the ALS/FTDC9ORF72 expansion is mitigated by antisense intervention.Neuron 80,415-428(2013))。同时，先前的研究显示，在调节C9orf72 ALS/FTD的神经退行性病变方面，tau聚集和G4C2 HRE之间存在紧密的遗传相关性(Wen,X.等人Tau Accumulation via ReducedAutophagy Mediates GGGGCC Repeat Expansion-Induced Neurodegeneration inDrosophila Model of ALS.Neurosci Bull(2020)；He,H.等人Amyotrophic LateralSclerosis-associated GGGGCC repeat expansion promotes Tau phosphorylation andtoxicity.Neurobiol Dis 130,104493(2019))。G4C2 HRE通过抑制自噬体-溶酶体融合而显著提高了果蝇(Drosophila)中的异常tau聚集(Wen,X.等人Tau Accumulation viaReduced Autophagy Mediates GGGGCC Repeat Expansion-Induced Neurodegenerationin Drosophila Model of ALS.Neurosci Bull(2020)；He,H.等人Amyotrophic LateralSclerosis-associated GGGGCC repeat expansion promotes Tau phosphorylation andtoxicity.Neurobiol Dis 130,104493(2019))。因此，C9orf72 ALS/FTD的发作和进展受到上述几种相互关联的因子的协同影响(Dong,W.等人Ablation of C9orf72 together withexcitotoxicity induces ALS in rats.FEBS J 288,1712-1723(2021))。
尽管在开发这些神经变性疾病的疗法中已经取得了一些进展，但分子机制仍然难以捉摸。因此，需要发现新的生物标志物，并且需要更好地设计药物靶标。
发明内容
本申请涉及神经保护性化合物chrexanthomycin A(cA)及其五种类似物、以及潜在的结构相似分子，并涉及这些化合物的分离和纯化方法。本申请还涉及cA及其类似物与DNA/RNA G4C2 G-四链体(G4)的特异性结合、它们对神经元细胞免于谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性的神经保护生物活性、通过(例如)降低G4C2核酸聚点(RNAfoci)毒性、清除细胞活性氧(ROS)和降低tau聚集相关毒性来保护神经元细胞的分子机制、以及治疗ALS、AD和其他神经变性疾病的方法。
在某些实施方案中，化合物cA(chrexanthomycin A)和五种结构相似的类似物(chrexanthomycin B(cB)、chrexanthomycin C(cC)、chrexanthomycin D(cD)、chrexanthomycin E(cE)、chrexanthomycin F(cF))可以选择性地保护细胞免于兴奋性毒性所引起的细胞死亡。在某些实施方案中，互变异构化过程可以产生两种形式的cA、cB、cC、cD、cE或cF：开环形式和闭环形式。
在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以与DNA(G4C2)4G-四链体(G4)、RNA(G4C2)2 G4、RNA结合蛋白hnRNP H的RNA识别基序(RRM)结构域、或DNA结合蛋白hnRNP F和/或hOrc6产生物理相互作用。
在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以在细胞毒性作用的情况下进入真核细胞，挽救细胞免于谷氨酸盐兴奋性毒性并减少细胞的G4C2核酸聚点(RNA foci)。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以抑制异常tau聚集和/或减少或消除tau原纤维形成、tau寡聚体形成或tau初原纤维形成。
在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以穿透血脑屏障而不引起溶血作用，并挽救(G4C2)29重复序列所引起的动物眼部变性。
附图说明
图1A至图1K潜在组分的分离、细胞毒性试验和初步神经保护试验。图1A.产生经分离的组分的细菌菌株以及(图1B)经分离的组分的HPLC谱图。在分化的HT22细胞上以0、0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的剂量提供经分离的组分(F8(图1C)、F9(图1D)、F10(图1E)、F11(图1F)和F13(图1G))的细胞毒性试验(图1H)。通过MTT试验测定细胞存活率。图1I.剂量为0、1μg/mL和10μg/mL的经分离的级分在HEK293T细胞上的细胞毒性试验。通过MTT试验测定细胞存活率。在分化的Neuro2a细胞上进行高通量筛选建模(图1J)以及在这些模型上用组分10(F10)进行处理(图1K)。同时添加F10和不同处理浓度的模型药物：KU60019：1μM；VE822：0.2μM；依托泊苷：10μM；L-谷氨酸盐：5mM；F10：1μg/mL孵育24小时。通过MTT试验测定细胞存活率。n＝4批细胞培养物(重复四次)；通过非配对的双尾t检验确定p值。
图2A至图2F cA及其类似物的化学结构。图2A.chrexanthomycin A(cA)的化学结构的互变异构化。图2B.cA及其类似物chrexanthomycin(cB)的CD谱图。图2C.chrexanthomycin B(cB)、chrexanthomycin C(cC)、chrexanthomycin D(cD)、chrexanthomycin E(cE)和chrexanthomycin F(cF)的化学结构。图2D.cA、cB、cC和cF的关键HMBC、1H-1H-COSY和NOESY相关。图2E.开环(左上)和闭环(左下)的化合物cA以及cF(右上)的单晶X射线衍射结构。图2F.本申请的化合物的一般化学结构。式(I)、式(II)和式(III)如本文所定义。
式(I)
Figure BDA0003262702960000091
式(II)
Figure BDA0003262702960000101
式(III)
Figure BDA0003262702960000102
R1：OH；R2：OH；R3：OH，OCH3，OC2H5；
R4：式-II，式-III；R5：OH，OCH3，OC2H5；
R6：OH；R7：OH；R8：OH；R9：OH；
图3A至图3I cA、cB、cC和cF选择性结合至DNA(G4C2)4 G4和hnRNP H。图3A.DNA(G4C2)4 G4的示意性结构。图3B.DNA(G4C2)4 G4(表面视图)与化合物cA、cB和cC(棒状视图)之间的预计原子相互作用的模型。图3C.DNA(G4C2)4 G4的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区、以及用化合物cA、cB、cC和cF以1:1至1:10的不同比例滴定的DNA(G4C2)4 G4的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。图3D.RNA(G4C2)2 G4的预计示意性结构。图3E：RNA(G4C2)2 G4的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区、以及用化合物cA以1:3、1:5和1:10滴定的RNA(G4C2)2 G4的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。用化合物cA(图3F)、cB(图3G)、cC(图3H)和cF(图3I)以1:0、1:5和1:10的比例滴定的hnRNP H RRM结构域的重叠1H-15N HSQC谱图。
图4A至图4C hnRNP H和G4的预计相互作用模型和NMR滴定。图4A.DNA(G4C2)4 G4(带状视图)与cA(左，棒状视图)、cB(中，棒状视图)和cC(右，棒状视图)之间的预计原子相互作用的模型，用分子间氢键(虚线)示出。hnRNP H RRM及其与以1:0.5滴定的RNA(G4C2)2G4(图4B)或DNA(G4C2)4 G4(图4C)的重叠1H-15N HSQC谱图。
图5A至图5E cA也可结合至hnRNP F和hOrc6蛋白。hnRNP FRRM与以1:10滴定的cA(图5A)、以1:1滴定的DNA(G4C2)4 G4(图5B)、或以1:10:1滴定的cA和DNA(G4C2)4 G4(图5C)的重叠1H-15N HSQC谱图。图5D.人Orc6(aa94-207)及其与以1:12滴定的cA的重叠1H-15NHSQC谱图。图5E.人Orc6(aa94-207)对于cA的预计结合位点。
图6A至图6H化合物cA不与DNA(G4C2)2 G4、人端粒G4或鸡G4结合。图6A.DNA(G4C2)2G4的预计两种类型的示意性结构。图6B.用cA以1:1、1:5和1:10的比例进行滴定的DNA(G4C2)2 G4的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。人端粒变体htel21_T18d[(GGGTTA)2GGGTTTGGG]G4(图6C)和人端粒htel23d[TA(GGGTTA)3GGG]G4(图6D)的示意性结构。htel21_T18 G4(图6E)、htel23 G4(图6F)以及用cA以1:10的比例进行滴定的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。图6G.鸡DNA G-四链体的示意性结构。图6H.鸡DNA G-四链体以及用化合物cA以1:3的比例进行滴定的鸡DNA G-四链体的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。
图7A至图7E DB1246是所有类型的G4的通用配体。图7A.小分子DB1246的化学结构。用DB1246滴定的DNA(G4C2)4 G4(图7B)、RNA(G4C2)2 G4(图7C)、DNA(G4C2)2 G4(图7D)和人端粒htel21_T18 G4(图7E)的1D 1H-NMR谱图的亚氨基区。
图8A至图8F化合物cA和cC在体外和体内挽救G4C2 HRE相关病症。图8A.无化合物(左)或用cA(中)、cC(右)处理的经DNA(G4C2)29转染的标记有G4抗体的Neuro2a细胞的代表性图像。DAPI用作复染剂。图8B.用cA、cB和cC(1μg/mL)处理的经DNA(G4C2)29转染的Neuro2a细胞的细胞生存率。n＝8批细胞培养物；通过非配对的双尾t检验确定p值。图8C.经DNA(G4C2)29转染的Neuro2a细胞以及用cA或cC处理的经DNA(G4C2)29转染的Neuro2a细胞的代表性RNA荧光原位杂交(FISH)偶联hnRNP H免疫染色图像。用相应的荧光探针检测G4C2和CAGG重复序列的核酸聚点(RNA foci)。DAPI用作复染剂。图8D.用cA或cC处理的(G4C2)29表达细胞中每个细胞的G4C2和CAGG核酸聚点(RNA foci)数目的定量。n＝17至25个来自三批细胞培养物的盖玻片；通过单因素方差分析(图基多重比较试验)确定p值。图8E.在幼虫阶段用DMSO空白对照或化合物cA、cC饲养的WT野生型和GMR-GAL4-(G4C2)29果蝇在羽化后7天的代表性外眼图像。图8F.图8E中所示果蝇的眼部变性百分比的定量。n＝7至18只动物；通过单因素方差分析(图基多重比较试验)确定p值。所有数据均为平均值±s.e.m.。
图9A至图9C cA、cB和cC的安全性评价。图9A.美金刚、尼莫地平、DB1246、cA、cB和cC的渗透性(cm/s)。n＝5批细胞培养物；通过单因素方差分析(图基多重比较试验)确定p值。图9B.在HEK293T细胞上以0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的浓度测试cA、cB和cC的细胞毒性。n＝4批细胞培养物。图9C.以0、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL测试cA、cB和cC的溶血活性。PBS和TritonX-100分别作为阴性对照和阳性对照。n＝3个独立的制备物。所有数据均为平均值±s.e.m.。
图10A至图10K化合物cA和cC保护分化的HT22细胞免于谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性。在用5mM L-谷氨酸盐预处理的分化的HT22细胞培养物上测试美金刚(图10A)、尼莫地平(图10B)和DB1246(图10C)的剂量-反应曲线(x：log浓度，y：细胞存活率)。n＝3至8个独立的制备物；通过非线性回归(可变斜率)计算EC50值。图10D.经化合物cA、cB和cC(1μg/mL)处理的用5mM L-谷氨酸盐预处理的分化的HT22细胞的细胞存活率。n＝15至38个来自三批细胞培养物的孔；通过单因素方差分析(图基多重比较试验)确定p值。在用5mM L-谷氨酸盐预处理的分化的HT22细胞培养物上测试的cA(图10E)、cB(图10F)和cC(图10G)的剂量-反应曲线(x：log浓度，y：细胞存活率)。n＝3至8个独立的制备物；通过非线性回归(可变斜率)计算EC50值。图10H.经化合物cD、cE和cF(1μg/mL)处理的用5mM L-谷氨酸盐预处理的分化的HT22细胞的细胞存活率。n＝8至13个来自三批细胞培养物的孔；通过单因素方差分析(图基多重比较试验)确定p值。在用5mM L-谷氨酸盐预处理的分化的HT22细胞培养物上测试cD(图10I)、cE(图10J)和cF(图10K)的剂量-反应曲线(x：log浓度，y：细胞存活率)。n＝3至8个独立的制备物；通过非线性回归(可变斜率)计算EC50值。
图11A至图11M在体外，化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF均抑制了tau-R3聚集。具有指定浓度的化合物cA(图11A)、cB(图11C)和cC(图11E)的tau-R3聚集的荧光变化曲线。cA(图11B)、cB(图11D)和cC(图11F)的抑制率曲线，IC50分别为4.25μM、13.27μM和20.44μM。n＝3个独立的制备物；通过非线性回归(可变斜率)计算IC50值。图11G.tau-R3(左上)、具有cA的tau-R3(右上)、具有cB的tau-R3(左下)和具有cC的tau-R3(右下)的代表性TEM图像。标尺为1μm。所有数据均为平均值±s.e.m.。具有指定浓度的化合物cD(图11H)、cE(图11J)和cF(图11L)的tau-R3聚集的荧光变化曲线。cD(图11I)、cE(图11K)和cF(图11M)的抑制率曲线，IC50分别为3.102μg/mL、4.083μg/mL和2.179μM。n＝3个独立的制备物；通过非线性回归(可变斜率)计算IC50值。
图12图解说明。cA和cC通过靶向多个促进C9orf72 ALS/FTD病理的途径而起到神经保护作用，促进C9orf72 ALS/FTD病理的途径包括1)G4C2 DNA HRE介导的毒性、2)G4C2核酸聚点(RNA foci)引起的毒性、3)谷氨酸盐诱导的神经兴奋性毒性和4)异常tau聚集诱导的毒性。
图13化合物chrexanthomycin A(cA)的分离及其UV谱图。
图14 cA的正离子HRMS谱图(理论值：621.1239，实测值：621.1235)。
图15 cA的1H-NMR谱图(800MHz，CD3OD)。
图16 cA的13C-NMR谱图(200MHz，CD3OD)。
图17 cA的COSY谱图(800MHz，CD3OD)。
图18 cA的HSQC谱图(800MHz，CD3OD)。
图19 cA的HMBC谱图(800MHz，CD3OD)。
图20 cA的NOESY谱图(800MHz，CD3OD)。
图21化合物chrexanthomycin B(cB)的分离及其UV谱图。
图22 cB的正离子HRMS谱图(理论值：635.1395，实测值：635.1387)。
图23 cB的1H-NMR谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图24 cB的13C-NMR谱图(200MHz，DMSO-d6)。
图25 cB的COSY谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图26 cB的HSQC谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图27 cB的HMBC谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图28 cB的NOESY谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图29化合物chrexanthomycin C(cC)的分离及其UV谱图。
图30 cC的正离子HRMS谱图(理论值：639.1344，实测值：639.1332)。
图31 cC的1H-NMR谱图(800MHz，CD3OD)。
图32 cC的13C-NMR谱图(200MHz，CD3OD)。
图33 cC的COSY谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图34 cC的HSQC谱图(800MHz，CD3OD)。
图35 cC的HMBC谱图(800MHz，CD3OD)。
图36 cC的NOESY谱图(800MHz，CD3OD)。
图37化合物chrexanthomycin D(cD)的分离及其UV谱图。
图38 cD的正离子LCMS谱图(实测值：653.1784)。
图39 cD的1H-NMR谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图40 cD的HSQC谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图41 cD的HMBC谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图42化合物chrexanthomycin E(cE)的分离及其UV谱图。
图43 cE的正离子LCMS谱图(实测值：667.1959)。
图44 cE的1H-NMR谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图45 cE的HSQC谱图(800MHz，DMSO-d6)。
图46化合物chrexanthomycin F(cF)的分离及其UV谱图。
图47 cF的正离子HRMS谱图(理论值：621.1239，实测值：621.1232)。
图48 cF的1H-NMR谱图(800MHz，CD3OD)。
图49 cF的13C-NMR谱图(200MHz，DMSO-d6)。
图50 cF的COSY谱图(800MHz，CD3OD)。
图51 cF的HSQC谱图(800MHz，CD3OD)。
图52 cF的HMBC谱图(800MHz，CD3OD)。
图53 cF的NOESY谱图(800MHz，CD3OD)。
图54化合物cA可以进入细胞。
图55 cA的开环形式和闭环形式的单晶结构，图为40％几率的原子位移的椭球，具有标记的图。
具体实施方式
所选择的定义
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”旨在也包括复数形式。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”、“带有”或它们的变体而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式为包含性的。过渡术语/短语(以及它们的任何语法变体)“包含”、“包括”包括短语“基本上由……组成”和“由……组成”。
短语“基本上由……组成”表示权利要求包括这样的实施方案，该实施方案包括指定的材料或步骤以及对权利要求的基本特征和新颖特征没有实质影响的材料和步骤。
术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。在本申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假设术语“约”表示在特定值的可接受误差范围内。
在本公开中，以速记形式陈述范围，以避免必须详细陈述并描述该范围内的每个值和所有值。在适当的情况下，可以选择该范围内的任何合适的值作为该范围的上限值、下限值或端值。例如，1至10的范围表示1和10的端值、以及2、3、4、5、6、7、8、9的中间值、以及包括在1至10内的所有中间范围，例如2至5、2至8和7至10。此外，当在本文中使用范围时，旨在明确包括范围的组合和子组合(例如，在所公开的范围内的子范围)以及其中的具体实施方案。
在本申请的某些实施方案中，受试者为哺乳动物。可根据本申请的方法治疗的哺乳动物的非限制性实例包括小鼠、大鼠、狗、豚鼠、牛、马、猫、兔、猪、猴、猿、黑猩猩和人。可用本申请的方法治疗的哺乳动物的其他实例为本领域普通技术人员公知的，并且此类实施方案在本申请的范围内。
出于本申请的目的，术语“治疗(treatment、treating、treat)”或该术语的等同物是指治愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响患有诸如神经变性病症之类的疾病的受试者的病情或症状。待治疗的受试者可能患有该病症、或有罹患该病症的风险，所述病症例如为神经变性病症，包括(例如)阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)或与17号染色体连锁的伴有帕金森症的额颞叶痴呆(FTDP-17)，或有罹患AD、PD、ALS、HD、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、PSP、PiD、CBD或FTDP-17的风险。当以治疗方式提供时，可以在症状出现时(或出现后)提供本申请的化合物。该物质的治疗性施用有助于减轻任何实际症状。
出于本申请的目的，术语“预防、预防性、预防性的”或这些术语的等同物表示在任何疾病症状之前提供本申请的化合物，并且是本申请的一个单独的方面(即，不同于与术语“治疗”或该术语的等同物相关的方面的本申请的方面，术语“治疗”或该术语的等同物是指治愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响患有神经变性病症的受试者的病情或症状)。本申请的化合物的预防性施用有助于预防、降低可能性或减轻一种或多种随后的症状或疾病。
“治疗有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指当施用至受试者时，与未经治疗的受试者相比，本文公开的本申请的化合物的量减少了AD、PD、ALS、HD、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、PSP、PiD、CBD或FTDP-17的症状的数量或严重程度、或减少了症状的任何增加、或改善了疾病的临床病程。“阳性治疗反应”是指(例如)改善了AD、PD、ALS、HD、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、PSP、PiD、CBD或FTDP-17的症状中的至少一种症状的病情。
基于预期目标来确定治疗剂的有效量。术语“单位剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有经计算以产生与其施用(即，适当的途径和治疗方案)相关的期望反应的预定量的治疗组合物。根据治疗次数和单位剂量，待施用量取决于待治疗的受试者、受试者的状态和所需的保护。治疗组合物的精确量还取决于医师的判断，并且对于每个个体是独特的。通常，本申请的化合物的剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和先前的病史等因素而变化。在具体的实施方案中，可能需要在约1mg/kg至约50g/kg、优选约100mg/kg至约50g/kg、或更优选约1g/kg至约10g/kg的范围内施用本申请的化合物。
在本申请的一些实施方案中，该方法包括施用多剂量的本申请的化合物。该方法可包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个治疗有效剂量的包含如本文所述的本申请的化合物的组合物。在一些实施方案中，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或多于30天的过程中施用这些剂量。施用多剂量组合物的频率和持续时间是为了减少或预防AD、PD、ALS、HD、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、PSP、PiD、CBD或FTDP-17，从而治疗或预防神经变性病症。此外，用治疗有效量的本申请的化合物治疗受试者可以包括单次治疗或可以包括一系列治疗。还应当理解，用于治疗的化合物的有效剂量可在特定治疗过程中增加或减少。剂量的变化可由本领域已知的和本文所述的用于检测神经变性病症的诊断试验的结果所产生并变得明显。在本申请的一些实施方案中，该方法包括每天施用化合物若干次，包括但不限于每天2次、每天3次和每天4次。
化合物
在优选的实施方案中，根据本申请的组合物和方法利用了经分离的chrexanthomycin A(cA)及其类似物，包括chrexanthomycin B(cB)、chrexanthomycin C(cC)、chrexanthomycin D(cD)、chrexanthomycin E(cE)、chrexanthomycin F(cF)和/或含有化合物cA、cB、cC、cD、cE和/或cF的细菌培养提取物。化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF可为经纯化的形式或包括粗提取物在内的细菌代谢产物的混合物。化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF可以约0.0001重量％至约5重量％、优选约0.01重量％至约5重量％、更优选约0.1重量％至约1重量％的浓度添加到组合物中。在另一个实施方案中，经纯化的化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF可与可接受的载体进行组合，因为化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF可以约0.0001体积％至约5体积％、优选约0.01体积％至约5体积％、更优选约0.1体积％至约1体积％的浓度存在。
以下是cA(式(IV))、cB(式(V))、cC(式(VI))、cD(式(VII))、cE(式(VIII))和cF(式(IX))的化学式。
cA(式(IV))
Figure BDA0003262702960000181
cB(式(V))
Figure BDA0003262702960000191
cC(式(VI))
Figure BDA0003262702960000192
cD(式(VII))
Figure BDA0003262702960000193
cE(式(VIII))
Figure BDA0003262702960000201
cF(式(IX))
Figure BDA0003262702960000202
根据本申请使用的微生物可为天然的或基因修饰的微生物，特别是可以合成本申请的化合物的微生物。例如，微生物可用特定基因进行修饰转化以显示特定特征。微生物也可为所需菌株的突变体。如本文所使用的，“突变体”是指参照微生物的菌株、遗传变体或亚型，其中该突变体与参照微生物相比具有一种或多种遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、移码突变或重复扩增)。制备突变体的方法是微生物学领域公知的。例如，为此目的广泛使用UV诱变和亚硝基胍。
在某些实施方案中，微生物是产生化合物cA、cB、cC、cD、cE或cF的任何细菌。化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF和/或相关的细菌培养提取物可以由包括链霉菌属(Streptomycesspp)在内的细菌产生。在优选的实施方案中，化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF由冠霉素链霉菌(Streptomyces chrestomyceticus)BCC 24770或天青链霉菌(Streptomyces caelestis)Aw99c产生。
在一个实施方案中，用于微生物培养的方法在约5℃至约100℃、约15℃至约60℃、约20℃至约37℃、优选约20℃至约30℃、或更优选约23℃至约30℃时进行。在一个其他实施方案中，培养可在恒温下持续进行。在另一个实施方案中，培养可经历温度改变。
在一个实施方案中，用于该方法和培养过程的装置是无菌的。诸如反应器/容器之类的培养装置可与灭菌装置(例如高压灭菌器)分开，但与之相连。在某些实施方案中，可以对细菌进行发酵，所述发酵包括在160rpm至约200rpm的搅拌下，使细菌细胞与GYM培养基(每升蒸馏水4g酵母提取物、10g麦芽提取物和4g D-葡萄糖)或SPY培养基(10g/L淀粉、2g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物和20g/L海盐)和任选的约20至约100个玻璃珠(直径3mm)在约20℃至37℃、优选约23℃至约30℃接触7天至约14天、优选约7天至约10天。
在一个实施方案中，本申请的组合物包含根据本申请的方法产生的细菌培养物。
由目标微生物产生的微生物生长副产物可保留在微生物中或分泌到液体培养基中。在另一个实施方案中，用于产生微生物生长副产物的方法可进一步包括浓缩和纯化目标微生物生长副产物的步骤。在另一个实施方案中，液体培养基可包含使微生物生长副产物的活性稳定的化合物。
在某些实施方案中，用于产生本申请的化合物的细菌生长条件与所述细菌的天然生境中的生长条件显著不同。例如，海水温度通常低于20℃，但是培养温度为至少20℃，优选约30℃。此外，优选用于使合成本申请的化合物所用的细菌生长的GYM培养基不包含任何海盐，这使得盐度不同于天然生境。最后，与天然生境相比，培养基中添加的营养物(例如，酵母提取物、麦芽提取物和葡萄糖)在用于产生本申请的化合物的细菌生长条件中更加浓缩。
化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF以及它们的组合物的制备
本申请的一种基于cA、cB、cC、cD、cE和/或cF的产品仅仅是包含细菌和/或由细菌产生的cA、cB、cC、cD、cE和/或cF和/或任意残留营养物的细菌生长液。细菌生长的产物可直接使用而无需提取或纯化。如果需要，可以使用标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。
在优选的实施方案中，可以通过乙酸乙酯从细菌中提取cA、cB、cC、cD、cE和/或cF以获得粗提取物。可以通过反相C18柱层析并用20％、40％、60％、80％、100％乙腈/水溶液洗脱以获得不同的组分，从而对粗提取物进行分离。在UV波长210nm处监测，可以在60％洗脱液中获得化合物，并可以通过半制备型HPLC进一步纯化。可以将化合物收集，冷冻干燥，并溶解于二甲亚砜(DMSO)中以用于进一步的生物学评估。也可以将化合物储存于其他有机溶剂中，例如甲醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷和二甲基甲酰胺。典型的储存浓度范围可以为10μM至100mM。
在从生长容器中获得cA、cB、cC、cD、cE和/或cF组合物时，可以在将获得的产物置于容器和/或管道(或以其他方式运输以供使用)中时添加其他组分。添加剂可以是(例如)染料、颜料、pH调节剂、缓冲剂、盐、粘合促进剂、溶剂(例如异丙醇、乙醇)、灭微生物剂、其他微生物和其他专用于预期用途的成分。
在某些实施方案中，可以将cA、cB、cC、cD、cE和/或cF组合物添加到传统上用作治疗剂的现有组合物中。
在一个实施方案中，将本申请的组合物配制成口服食用产品，例如食品、胶囊、丸剂或可饮用液体。可口服递送的药物是通过在胃肠道中的初始吸收或进入口腔粘膜来递送的任何生理活性物质。还可以将本申请的组合物配制成溶液，该溶液可以通过(例如)注射施用，注射包括静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、鞘内注射、脑室内注射或皮下注射。在其他实施方案中，将本申请的组合物配制成通过贴剂经由皮肤施用或直接施用于皮肤上以用于局部或全身作用。组合物可以舌下施用、口腔施用、直肠施用或阴道施用。此外，可以将组合物喷雾到鼻中以通过鼻粘膜吸收、雾化、通过口或鼻吸入、或在眼或耳中施用。
根据本申请的口服食用产品为适合于食用、营养、口腔卫生或愉悦的任何制品或组合物，并且是旨在被引入人或动物口腔中、在那里保留一段时间、然后被吞咽(例如，准备食用的食物或丸剂)或再次从口腔中除去(例如，口香糖或口腔卫生产品或医用漱口水)的产品。尽管可口服递送的药物可以配制成口服食用产品，并且口服食用产品可以包含可口服递送的药物，但不意味着这两个术语在本文中可互换使用。
口服食用产品包括旨在由人或动物摄取的呈经加工、半加工或未加工状态的所有物质或产品。这还包括在其生产、处理或加工期间添加到口服食用产品(特别是食品和药品)中并旨在引入人或动物口腔中的物质。
口服食用产品还可以包括旨在以未改良、经制备或经加工状态被人或动物吞咽然后消化的物质；因此，根据本申请的口服食用产品还包括旨在与产品一起被吞咽或预期将被吞咽的外壳、包衣或其他包封物。
在一个实施方案中，口服食用产品为含有所需的可口服递送的物质的胶囊、丸剂、糖浆、乳液或液体悬浮液。在一个实施方案中，口服食用产品可以包含粉末形式的可口服递送的物质，其可以与水或另一种液体混合以产生可饮用的口服食用产品。
在一些实施方案中，根据本申请的口服食用产品可以包括一种或多种用于营养或愉悦的制品。这些制品特别包括焙烤制品(例如，面包、干饼干、蛋糕和其他糕点)、糖果(例如，巧克力、巧克力棒产品、其他棒产品、水果软糖、包衣片、硬糖、太妃糖以及口香糖)、酒精或非酒精饮料(例如，可可、咖啡、绿茶、红茶、富含绿茶或红茶提取物的红茶或绿茶饮料、南非博士茶、其他花草茶、含果实的柠檬水、等渗饮料、软饮料、果浆、水果和蔬菜汁、以及水果或蔬菜汁制品)、速溶饮料(例如，速溶可可饮料、速溶茶饮料、速溶咖啡饮料)、肉制品(例如，火腿、新鲜或生香肠制品、调味或腌制的鲜肉或腌肉制品)、蛋或蛋制品(例如，干的全蛋、蛋清和蛋黄)、谷类制品(例如，早餐谷物、谷物棒、预煮的速食米制品)、乳制品(例如，全脂或低脂或脱脂乳饮料、米布丁、酸奶、开菲尔(kefir)、奶油奶酪、软奶酪、硬奶酪、奶粉、乳清、黄油、酪乳、含有乳蛋白的部分水解或完全水解的制品)、大豆蛋白制品或其他大豆成分制品(例如，豆浆及由其制备的产品、含有经分离或经酶处理的大豆蛋白的饮料、含有大豆粉的饮料、含有大豆卵磷脂的制品、发酵制品如由其制备的豆腐或豆豉制品以及与水果制品和任选的调味物质的混合物)、水果制品(例如，果酱、水果冰淇淋、水果沙司和水果馅料)、蔬菜制品(例如，番茄酱、沙司、干蔬菜、速冻蔬菜、预煮蔬菜和煮熟蔬菜)、零食制品(例如，烤制或炸制的马铃薯片(脆片)或马铃薯面团制品、基于玉米或花生的加工品)、基于脂肪和油或其乳液的制品(例如，蛋黄酱、调味蛋黄酱和调味酱)、其他现成的膳食和汤(例如，干汤、速溶汤和预煮汤)、调味品(例如，可撒调味品)、甜味剂组合物(例如，片剂、香袋和用于增甜或增白的其他制品或其他食物)。本申请的组合物也可用作生产其他用于营养或愉悦的组合物的半成品。
本申请的组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂，并且可以被配制成(例如)固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”是指与药物组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。
根据本申请的载体和/或赋形剂可以包括任意和所有的溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如，中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水或任选的Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂)、水包油或油包水乳液、包含或不包含适合于(例如)静脉注射用有机助溶剂的水性组合物、增溶剂(例如聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80)、胶质物、分散介质、载体、填充剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘结剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂(例如卡波姆、明胶或藻酸钠)、包衣、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、聚季铵盐)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、张力控制剂、吸收延迟剂、佐剂、增容剂(例如乳糖、甘露醇)等。载体和/或赋形剂在药物和补充剂领域的应用是公知的。除了与目标健康促进物质或与组合物不相容的任何常规介质或试剂之外，可以考虑在本申请的组合物中使用载体或赋形剂。
在一个实施方案中，可以将本申请的组合物制成气雾制剂，使得(例如)其可被雾化或吸入。以气雾剂或喷雾剂形式施用的合适的药物制剂为(例如)粉剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。用于口或鼻的气雾施用或吸入施用的制剂也可与载体一起配制，载体包括(例如)盐水、聚乙二醇或乙二醇、DPPC、甲基纤维素、或与粉末分散剂或碳氟化合物的混合物。可以将气雾制剂置于加压推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。例如，递送可使用一次性递送装置、喷雾器、呼吸致动粉末吸入器、定量雾化吸入器(MDI)或本领域可用的许多喷雾器递送装置中的任何其他装置。此外，也可以使用雾化罩或通过气管内导管直接施用。
在一个实施方案中，可以对本申请的组合物进行配制以用于通过注射施用，例如，作为溶液剂或混悬剂。溶液剂或混悬剂可以包含合适的无毒、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如，甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液)、或合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂(例如，包括合成的单甘油酯或二甘油酯在内的无菌、无刺激性、不挥发性油以及包括油酸在内的脂肪酸)。静脉内使用的载体的一个说明性实例包括10％USP乙醇、40％USP丙二醇或聚乙二醇600以及余量的USP注射用水(WFI)的混合物。其他用于静脉内使用的说明性载体包括10％USP乙醇和USP WFI；0.01％至0.1％三乙醇胺的USP WFI溶液；或0.01％至0.2％的二棕榈酰基二磷脂酰胆碱的USP WFI溶液；以及1％至10％角鲨烯或胃肠外植物水包油乳液。水或盐水溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可优选用作载体，特别是用于可注射溶液。用于皮下或肌肉内使用的载体的说明性实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液、5％葡萄糖的WFI溶液以及0.01％至0.1％三乙醇胺的5％葡萄糖或0.9％氯化钠的USPWFI溶液、或1:2或1:4的10％USP乙醇、40％丙二醇的混合物并且余量为可接受的等渗溶液如5％葡萄糖或0.9％氯化钠；或0.01％至0.2％二棕榈酰基二磷脂酰胆碱的USP WFI溶液以及1％至10％角鲨烯或胃肠外植物水包油乳液。
在一个实施方案中，可以对本申请的组合物进行配制以用于通过局部应用而施用于皮肤上，例如，作为局部用组合物，其包括冲洗剂、喷雾剂或滴剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、泡沫剂、粉剂、固体剂、海绵、胶带、蒸汽、糊剂、酊剂、或使用透皮贴剂。除了任何药学上的活性载体之外，局部应用的合适制剂可以包含(例如)软化剂，例如巴西棕榈蜡、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、乳化蜡、含水羊毛脂、羊毛脂、羊毛脂醇、微晶蜡、石蜡、凡士林、聚乙二醇、硬脂酸、硬脂醇、白蜂蜡或黄蜂蜡。此外，组合物可包含诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇、山梨醇溶液和1,2,6-己三醇之类的湿润剂或诸如乙醇、异丙醇或油酸之类的渗透促进剂。
使用本申请的化合物的方法
在某些实施方案中，可以将化合物cA(chrexanthomycin A)和五种结构相似的类似物(chrexanthomycin B(cB)、chrexanthomycin C(cC)、chrexanthomycin D(cD)、chrexanthomycin E(cE)、chrexanthomycin F(cF))施用至受试者。在某些实施方案中，化合物cA、cB、cC、cD、cE或cF可以结合至DNA或RNA G4C2 G-四链体(G4)，可以具有保护神经元细胞免于谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性的神经保护性生物活性，并且可以用作诸如AD、PD、ALS、HD、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、PSP、PiD、CBD或FTDP-17之类的神经变性疾病的治疗方法。
在某些实施方案中，化合物cA、cB、cC、cD、cE或cF对任何类型的真核细胞，特别是神经元或HEK293T细胞可能没有细胞毒性。在某些实施方案中，cA或cC可以选择性地保护细胞(特别是分化的HT22细胞)免于兴奋性毒性所引起的细胞死亡。
在某些实施方案中，互变异构化过程可以产生两种形式的cA、cB、cC、cD、cE或cF：开环形式和闭环形式。
在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF、优选cA、cB或cC可以与G-四链体(G4)、优选DNA(G4C2)4 G-四链体(G4)产生物理相互作用。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF、优选cA可以结合至RNA(G4C2)2 G4。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF、优选cA、cB、cC或cF可以选择性地结合至RNA结合蛋白hnRNP H的RRM结构域。在某些实施方案中，hnRNP H的RRM结构域可以结合至RNA(G4C2)2 G4和DNA(G4C2)4 G4，这可以形成cA、cB、cC、cD、cE和/或cF、优选cA与hnRNP H、RNA(G4C2)2 G4和DNA(G4C2)4 G4的复合物。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF、优选cA不与其他G4结构体结合，例如DNA(G4C2)2 G4、人端粒G4和鸡G4。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF、特别是cA和cC可以抑制(G4C2)29所引起的细胞死亡，并可以减少(G4C2)29表达细胞、特别是Neuro2a细胞中的G4C2核酸聚点(RNAfoci)数目。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以挽救(G4C2)29所引起的动物眼部变性。在某些实施方案中，cA、cB、cC、cD、cE或cF可以用于通过阻断多个病理靶标和改善神经元存活来治疗C9orf72 ALS或FTD。
此外，cA、cB、cC、cD、cE和cF可以显著抑制异常tau聚集和/或减少或消除tau原纤维形成、tau寡聚体形成或tau初原纤维形成。
在某些实施方案中，本申请的化合物、特别是cA、cB、cC、cD、cE或cF可以穿透受试者的血脑屏障而没有溶血作用，并且还可以挽救(G4C2)29重复序列所引起的动物眼部变性。在某些实施方案中，本申请的化合物、特别是cA、cB、cC、cD、cE或cF可以在穿过血脑屏障后接触神经元细胞。
材料和方法
细菌菌株
冠霉素链霉菌BCC 24770菌株购自泰国生物资源研究中心。天青链霉菌Aw99c菌株分离自靠近吉达的鱼类市场的红海沿海水域(21029.622N 39009.617E)。通过BD Difco212168放线菌分离琼脂对培养物进行分离。
发酵、提取和分离
将冠霉素链霉菌BCC 24770菌株在两个125mL锥形烧瓶中在30℃以180rpm的搅拌培养三天，锥形烧瓶包含50ml GYM培养基(每升蒸馏水4g酵母提取物、10g麦芽提取物和4gD-葡萄糖)和20至30个玻璃珠(直径3mm)。然后将1％的种子肉汤转移到十个含有1L GYM培养基和约100个玻璃珠的锥形烧瓶中，以用于在30℃以180rpm的搅拌速度发酵10天。将天青链霉菌Aw99c菌株在37×1.0L体积的SPY培养基(10g/L淀粉、2g/L蛋白胨、4g/L酵母提取物和20g/L海盐)中在23℃培养7天。每个烧瓶包含约100个玻璃珠(直径3mm)。用8层粗棉布过滤用过的发酵培养物。
用等体积的乙酸乙酯萃取细菌培养物三次，以得到粗提取物。通过反相C18柱层析并用20％、40％、60％、80％和100％乙腈洗脱以获得不同的级分，从而对粗提取物进行分离。在UV波长210nm(Waters 2998光电二极管阵列检测器)处监测，在60％洗脱液中获得化合物，并通过半制备型HPLC(Waters 2695分离模块；美国米尔福德)进一步纯化，其中使用Phenomenex Luna C18柱，尺寸为250×10mm，并且粒度设计为5μm，用等度流动相以3mL/min的流速洗脱(溶液A：含有0.5‰三氟乙酸(TFA)的乙腈；溶液B：含有0.5‰TFA的Milli-Q水。乙腈/水的比率为30％)。在UV波长210nm(Waters 2998光电二极管阵列检测器)处监测洗脱液。将化合物收集，通过Labconco FreeZone 4.5升台式冷冻干燥系统进行冷冻干燥，并溶解于二甲亚砜(DMSO)中以用于进一步的生物学评估。
结构分析
从Bruker ultrafleXtreme超高分辨率TOF LC-MS系统和MALDI TOF/TOF质谱仪(Bruker Daltonics)记录MS数据。使用Jasco P-2000旋光计测定旋光度。分别在800MHz和200MHz Varian谱仪上进行1H-NMR和13C-NMR谱的测定。包括NOESY、HSQC、HMBC和COSY在内的所有标准2D NMR实验谱图均在25℃采集。由Chirascan圆二色性光谱仪测定圆二色性(CD)光谱。
结晶和X射线晶体学
通过乙腈-甲醇混合溶液持续几天的溶剂扩散法来实现cA的结晶。在Rigaku ODSupernova仪器(Cu-Ka辐射)上采集-173.15℃时的单晶X射线数据。将黄色薄片状晶体(0.2×0.08×0.02mm)浸入Paratone中，安置在Rigaku-Oxford Diffraction Supernova衍射仪上的低温环中，并在-173.15℃采集衍射数据。所得的单斜晶体结构成功地精修到常规R1＝5.98％，残余电子密度峰/谷为+0.26/-0.29
Figure BDA0003262702960000291
且Flack手性参数为0.1(3)。晶体衍射数据表明了cA骨架在一端具有4,5-脱氢-D-葡糖醛酸部分，(糖C2'＝R，C3'＝S)中心为氢醌-氧杂蒽酮单元，并且在另一端该化合物示出了半缩酮的开环形式和闭环环形式之间的无序排列，代表处于溶液平衡状态的异构体。由于相邻分子对中的基团的潜在重叠，晶体中存在50:50的无序。因此，开环形式与闭环形式紧密接触。两个无序分子片段的结构排列在几何学上明显地精修，而无需严格的限制。开环形式为α-羟基内酯，具有R-立体化学中心。表明与四链体形成超分子缔合的开环形式具有环外羧酸(-COOH)和丙酮基(-CH2-COMe)基团。该结构体包含若干水分子和甲醇分子，这些分子也由于主分子中的无序而部分地无序。
分子对接
通过Autodock4.2进行DNA(G4C2)4 G4-cA、DNA(G4C2)4 G4-cB和DNA(G4C2)4 G4-cC的对接、能量过滤、聚类和分级(G.M.Morris,D.S.G.,R.S.Halliday,R.Huey,W.E.Hart,R.K.Belew,A.J.Olson.Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithmand an Empirical Binding Free Energy Function.J.Comput.Chem.19,1639-1662(1998))。从蛋白质数据库(PDB)获得DNA(G4C2)4 G4(PDB代码：2N2D)的NMR结构。应用Lamarckian遗传算法，进行总共150个单独的对接，最大数量为1.75×106个能量评估。在对接过程中，DNA结构被认为是刚性的，而配体分子则被视为是柔性的。最后，选择具有最低结合自由能和最多簇成员的构象作为最可能的结合构象。将PyMOL用于分析从Autodock获得的最有利的构象的相互作用键的可能存在形式。
DNA/RNA G4样品制备
单链DNA/DNA购自Integrated DNA Technologies(IDT)和Takara。然后通过加热至95℃持续15分钟使100μM的单链DNA/RNA样品退火，并在退火缓冲液(70mM KCl，20mM磷酸钾(pH 7.0))中缓慢冷却至室温过夜。最终的NMR样品包含0.1mM DNA或RNA的70mM KCl和20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)溶液。
一维(1D)1H-NMR滴定实验
在25℃进行1D 1H-NMR谱。所有化合物以约50mM浓度溶解于同位素标记的DMSO-d6(Sigma-Aldrich)中，作为母液。为了避免由于添加DMSO-d6所引起的DNA/RNA G4的化学位移变化，将10μL DMSO-d6添加到500μL的0.1mM DNA/RNA G4的NMR缓冲液(20mM磷酸钾缓冲液和70mM KCl，pH 7.0，10％D2O)溶液中，然后记录1D 1H-NMR谱图作为参照。在将各化合物添加到DNA/RNA G4溶液的NMR滴定实验中，将DMSO-d6溶液中各化合物的最大体积10μL作为最终数据点。
hnRNP H/F的RRM结构域和人Orc6的表达和纯化
将hnRNP H/F的RRM结构域、或人Orc6的编码序列插入表达载体pET-28a(+)(Novagen)中。将蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中于37℃表达5小时。用镍-次氮基三乙酸树脂(Qiagen)对细胞裂解物进行亲和纯化，然后用蛋白酶3C酶切割六个组氨酸标签。在Superdex 75柱(GE Healthcare)上对产物进行进一步纯化。对于NMR研究，除了在含有富含100％15N的氯化铵(Cambridge Isotopes)和d-葡萄糖的M9培养基中生长的细胞外，如上所述对均匀标记有15N的蛋白进行表达和纯化。
用化合物或DNA/RNA G4进行hnRNP H/F的RRM结构域或hOrc6的NMR滴定
通过在25℃、在不同量的DNA/RNA或化合物的存在下，对均匀标记有15N的RRM结构域(～0.1mM)记录一系列2D 15N-HSQC谱图来进行滴定实验。蛋白样品和DNA/RNA母液都在20mM磷酸钾缓冲液和70mM KCl、pH 7.0、10％D2O中制备。将所有化合物以约50mM浓度溶解于同位素标记的DMSO-d6(Sigma-Aldrich)中，作为母液。为了避免由于添加DMSO-d6所引起的蛋白样品的化学位移变化，将10μL DMSO-d6添加到500μL的0.1mM蛋白的NMR缓冲液(20mM磷酸钾缓冲液和70mM KCl，pH 7.0，10％D2O)溶液中，然后记录2D HSQC作为参照。
平行人工膜渗透性试验
制备500μL的500μM测试化合物和每种测试化合物的200μM平衡标准物。将5μLDMSO+245μL PBS作为空白对照。首先，将300μL PBS添加到受体板的每个孔中。在供体板在其托盘中的情况下，将5μL 4％卵磷脂的十二烷溶液直接添加到供体板的孔膜中。将200μL各自为500μM的测试化合物添加到供体板的双份孔(duplicate wells)中。将供体板小心地置于受体板的孔中，并在37℃孵育18小时。然后收集受体板孔中的液体作为用于分析的受体溶液。以10nm间隔读取200nm至500nm的吸光度谱图，以确定测试化合物和空白对照的峰值吸光度。
溶血试验
用来自健康兔的2％新鲜红细胞测定溶血活性。获得血细胞，并用PBS缓冲液洗涤四至五次，并以1500rpm离心10分钟，直到上部相变澄清。用PBS将化合物稀释至终浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL，添加至相同体积的2％红细胞中，并在37℃孵育1小时。将样品以10,000rpm离心5分钟，并将上清液添加到96孔板中，并用Thermo ScientificMultiskan FC多平台光度计(Thermo ScientificTM，美国)在570nm处进行测定。将10％Triton X-100的等分试样用作阳性对照，并将溶解在PBS中的1％DMSO用作阴性对照。
细胞培养
在37℃、在具有5％CO2和95％空气的潮湿培养箱中，在具有10％胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，26140079)和青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific，15140163；10,000U/mL)的DMEM(Thermo Fisher Scientific，11965092)中培养HEK293T、Neuro2a和HT22细胞(Sigma-Aldrich，SCC129)。
MTT试验
通过MTT试验测试化合物的细胞毒性。细胞在具有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM(Gibco)中，在37℃和5％CO2的条件下生长。在96孔板的每个孔中接种5×103个左右的细胞并培养24小时。然后用溶解于DMSO中的不同浓度的化合物再处理细胞24小时。在每个孔中加入20μl MTT(5mg/mL)再37℃孵育四小时后，除去细胞培养基，添加100μl DMSO以溶解甲臜。使用MultiskanTM FC微板光度计测量570nm处的吸光度。用GraphPad Prism软件分析IC50数据。
转染
使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，11668019)将DNA构建体转染至神经元Neuro2a细胞系。转染后4小时至6小时，用新鲜培养基替换转染培养基，并将细胞再孵育48小时以允许回收和构建体表达。
RNA荧光原位杂交和免疫细胞化学
将培养在盖玻片上的Neuro2a细胞用pHR-Tre3G-29xGGGGCC-12xMS2质粒(#99149)进行转染，孵育2天至3天，然后用4％的多聚甲醛于室温固定15分钟。杂交前，用0.1％TritonX-100的PBS溶液将细胞渗透10分钟。将具有5′-Cy3的靶探针(GGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCC)和具有5′-Cy5的对照探针(CAGGCAGGCAGGCAGGCAGG)添加至杂交溶液(0.9M NaCl，0.02M Tris-HCl，0.01％SDS，20％甲酰胺)。然后将细胞于46℃在混合溶液中孵育3小时。将细胞于48℃在洗涤溶液(0.02M Tris-HCl，0.001％SDS，5mM EDTA)中洗涤三次，每次15分钟。然后，用1:500稀释的一抗(抗DNA G-四链体(G4)抗体(Cat.No.MABE1126)或抗hnRNP H抗体(ab10374))将细胞染色，并于4℃孵育过夜。第二天，将细胞用PBS洗涤三次(每次10分钟)，然后用1:500稀释的二抗(Alexa 488抗小鼠G4或Alex488抗兔hnRNP H)于室温孵育1小时。将多余的二抗用PBS洗掉三次(每次10分钟)。然后将细胞与1:5000稀释的DAPI一起孵育5分钟，并用PBS洗涤一次。最后，将载玻片上的细胞风干，固定在Hydromount培养基中，并通过共聚焦显微镜(Leica，SP8)进行分析。
果蝇饲养
使用在GMR-GAL4启动子(GMR-GAL4-(G4C2)29)控制下表达29个GGGGCC重复序列(29R)的蝇系。在室温(25℃)、在补充有干酵母的玉米粉培养基上饲养GMR-GAL4-(G4C2)29蝇和野生(WT)蝇。DMSO作为空白(vehicle)对照，分别添加工作浓度为100μM(62μg/mL和63.8μg/mL)的化合物cA和cC。将用于杂交的亲本蝇置于含有测试化合物的固体食物中，并对F1幼虫连续喂食直到羽化。羽化后，将F1蝇转移至不含化合物的正常食物容器中。
外眼试验
羽化后第7天，使用Olympus立体显微镜上的CCD相机在捕获GMR-GAL4-(G4C2)29成体蝇或WT成体蝇的眼部图像。比较不同治疗组中蝇类的眼部形态，以评价视网膜变性水平。通过ImageJ测量受影响的眼部面积和总眼部面积，以计算变性率。
谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性细胞模型
通过施加提供有0.5％FBS、10μM视黄酸(Sigma-Aldrich，R2625-50MG)和500μMcAMP(Sigma-Aldrich，A6885)的DEME培养基(分化培养基)对经培养的HT22细胞进行分化，并孵育48小时，然后添加其他处理。将5mM L-谷氨酸盐施加于初始分化培养基中再孵育24小时。通过上述MTT试验测定细胞存活率。
硫磺素T(ThT)荧光tau累积试验
tau-R3蛋白是合成的并且购自ChinaPeptides Co.,Ltd.。ThT(ab120751，1mM)溶液是在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中新鲜制备的，并在使用前通过孔径为0.45μm的过滤器以除去不溶性颗粒。在存在或不存在cA、cB和cC的条件下，将tau-R3(20μM)与20μM ThT和10μM肝素一起孵育。将200μL样品添加到96孔板中，并于37℃孵育24小时至48小时。使用具有440/480nm激发/发射滤光片的酶标仪记录不同的时间点的ThT荧光强度。进行非线性回归分析以拟合玻尔兹曼S形曲线。
TEM成像
将来自ThT荧光实验的样品直接施加到300目碳涂层铜网上。将20μL聚集体样品置于一片封口膜(Parafilm)上，并将铜网置于样品滴上5分钟。将带有样品的铜网移动至水滴中洗涤5分钟，然后用2％乙酸双氧铀染色5分钟。使用透射电子显微镜(Thermo ScientificTalos L120C)以13500×的放大倍数和120kV的加速电压捕获图像。
统计分析
所有数据均得自至少三个独立的制备物。以盲法进行定量。用GraphPad Prism 6进行统计学分析。用非配对t检验分析组间差异。认为p值≤0.05具有显著性。
本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们不与本说明书的明确教导相矛盾即可。
以下是说明实施本申请的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，否则所有的百分率都是重量百分率，并且所有的溶剂混合物的占比都是体积比。
实施例1-初步筛选和神经保护细胞建模
从在GYM培养基中于30℃发酵10天的细菌菌株冠霉素链霉菌BCC 24770(图1A)的乙酸乙酯萃取的粗提取物中分离F8、F9、F10、F11和F13组分。这些组分是根据他们在HPLC上的UV吸光度图案和保留时间(图1B)而命名的，结合LCMS数据，预测这些组分均为新化合物。
对神经元细胞系Neuro2a细胞和HEK293T进行了F8、F9、F10、F11和F13的初步细胞毒性试验。除了F10以外，所有其他级分在1μg/ml时在Neuro2A细胞中显示出细胞毒性，并且F13甚至在0.1μg/ml时显示出细胞毒性。相比之下，即使在10μg/ml的高浓度时，F10也没有细胞毒性(图1C至图1H)。类似地，F8、F9、F11和F13在10μg/ml时在HEK293T细胞中显示出显著的细胞毒性，细胞存活率低于50％，而用F10处理时，细胞存活率接近100％(图11)。因此，选择F10用于进一步研究。同时，在以SPY培养基、于23℃发酵7天的细菌菌株天青链霉菌Aw99c的乙酸乙酯提取的粗提取物中也检测到F10信号。
为了更好地模拟原代神经元，在添加化合物之前，将实验中使用的神经元细胞系(HT22和Neuro2a)分化至少3天。分化后，将几种不同的药物(1μM KU60019、0.5μM VE822、1μM依托泊苷或5mM L-谷氨酸盐)分别施加于培养基以诱导神经元细胞死亡。这些药物处理诱导了20％至40％的细胞死亡(图1J至图1K)。有趣的是，不同于其他模型(KU60019，VE822，依托泊苷)，在L-谷氨酸盐诱导的神经元细胞死亡模型中，F10将细胞存活率从80％挽救至几乎100％，几乎接近对照组(图1K)，从而表明F10可保护神经元细胞免于由L-谷氨酸盐的兴奋性毒性诱导的细胞死亡。
实施例2-化合物chrexanthomycin A(cA)及其类似物的纯化
通过半制备型HPLC(流速：3mL min-1，溶液A：含有0.5‰三氟乙酸(TFA)的乙腈；溶液B：含有0.5‰TFA的Milli-Q水。乙腈浓度在70分钟内从25％提高至45％。保留时间：38.5分钟)富集F10的纯组分，并且我们将该化合物命名为chrexanthomycin A(cA)。将来自半制备HPLC的产物冷冻干燥后，获得了为黄色粉末的cA，cA的分子量通过高分辨率质谱仪确定为621.1235[M+H]+，分子式计算为C31H25O14。在室温使用甲醇作为溶剂，cA的比旋光度为-49.8。UV(MeOH)λmax 224nm、243nm、271nm、401nm。类似地，将来自半制备HPLC的产物冷冻干燥后，也获得了为黄色粉末的cB和cC。使用高分辨率质谱仪确定化合物cB和cC的分子量分别为635.1387[M+H]+，分子式计算为C32H27O14；639.1332[M+H]+，分子式计算为C31H27O15。cB和cC的比旋光度分别为-27.3、-25.3。对于cB，UV(MeOH)λmax 222nm、248nm、270nm、389nm，并且对于cC，UV(MeOH)λmax 224nm、271nm、290nm、401nm。
在半制备过程中，与cC一起收集了chrexanthomycin D(cD)和chrexanthomycin E(cE)的纯级分，因为它们的UV图案与cC相似(流速：3mL min-1，溶液A：含有0.5‰三氟乙酸(TFA)的乙腈；溶液B：含有0.5‰TFA的Milli-Q水。乙腈浓度为40％等度浓度。保留时间：cD为21.6分钟；cE为29.0分钟)。将来自半制备HPLC的产物冷冻干燥后，获得了为黄色粉末的cD和cE。高分辨率质谱仪确定了它们的分子量，化合物cD：653.1784[M+H]+，分子式计算为C32H29O15；cE：667.1959[M+H]+，分子式计算为C33H31O15。与cC相比，cD和cE的分子量差异分别为14和28，表明它们是cC的类似物，UV(MeOH)λmax 222nm、273nm、330nm、401nm。
cF是cA同分异构体，分子量相同但cF具有不同UV吸收；通过半制备HPLC(流速：3mLmin-1，溶液A：含有0.5‰三氟乙酸(TFA)的乙腈；溶液B：含有0.5‰TFA乙腈的Milli-Q水。乙腈浓度为30％等度浓度；保留时间：40.9分钟)富集chrexanthomycin F(cF)的纯组分。将来自半制备HPLC的产物冷冻干燥后，获得了为黄色粉末的cF。高分辨率质谱仪确定了该化合物的分子量为621.1232[M+H]+，分子式计算为C31H25O14。UV(MeOH)λmax 237nm、270nm、325nm、410nm。
实施例3-cA及其类似物的结构鉴定
对于cA的结构鉴定：观察到三个芳香族氢H6(δH＝7.97,1H,dd,J＝8.0,1.5Hz)、H8(δH＝7.79,1H,dd,J＝8.0,1.5Hz)、H7(δH＝7.38,1H,t,J＝8.0Hz)具有COSY相关性，并且H12与C4(δC＝182.9)和C10(δC＝148.4)、H7与C5(δC＝122.7)和C9(δC＝146.4)、以及H8(δH＝7.79)与C6和C10具有HMBC相关性，表明芳环在C9和C10处与羟基连接，并且在C5处与酮连接。糖部分也可以通过COSY和HMBC相关性来确定。根据COSY相关性，H1′(δH＝5.82,1H,d,J＝5.5Hz)、H2′(δH＝4.16,1H,dd,J＝5.5,4.7Hz)、H3′(δH＝4.34,1H,dd,J＝4.7,3.6Hz)以及H4′(δH＝6.23,1H,d,J＝3.6Hz)连接在一起，连同H1′与C5′(δC＝142.2)、H3′与C5′以及H4′与C6′(δC＝165.1)的HMBC相关性，我们可以确定这是4′,5′-脱水葡糖醛酸部分；此外，H1′与C9的HMBC相关性将这两部分通过O-糖苷键连接在一起。我们鉴定的片段的分子量为约400，与HRMS和MALDI所确定的实际结果相去甚远。因此，我们假定在进行NMR测试时存在信号损失。但是随着溶剂、弛豫时间和测试温度的改变，结果并没有得到改善。在结晶的帮助下，使用蒸汽扩散法在容器的底部观察到有光泽的黄色片状体。挑选单晶颗粒进行X射线衍射，成功地进行X射线晶体学研究。XRD数据清楚地表明该化合物的骨架。有趣的是，同时观察到具有相同的五环氧杂蒽酮核并且连接有不寻常的4′,5′-脱水葡糖醛酸部分的两种互变异构结构体。考虑到它们具有相同的分子量，并且当使用甲醇-d4进行NMR测试时观察到一个有趣的现象，即在高场区域中的若干氢信号在室温下较宽，而当温度升高至45℃时这些氢信号变得尖锐，从而推测存在互变异构化可能的结论。然后，我们通过质子转移机制推测了具有两种形式的cA异构体，开环结构体6-(2-氧代丙基)苯甲酸以及闭环环状半缩酮(图2A)。由于在闭环结构体的形成中缺乏选择性，因此理论上该半缩酮的手性中心存在R、S两种构型。相应地，我们的单晶XRD数据显示化合物cA的开环形式和闭环形式(图2E)均以动态平衡方式存在。
一旦确定了cA的结构，就能通过将cB和cC的NMR数据与cA的NMR数据进行比较来鉴定cB和cC的结构。由于cB的UV谱图与cA的UV谱图相同，这表明它们具有相同的发色团和骨架，并且它们的分子量差值为14，表明cB是cA的同系物。结合NMR谱图分析以及与cA比较的CD谱图(图2B)，观察到多了一个甲氧基，δH＝3.96,3H,s，具有碳化学位移δC＝61.5，并且该甲氧基和碳之间的HMBC相关性具有化学位移δC＝135.6，表明C13位被醚化。此外，尽管cB的晶体结构存在无序，但是我们仍然明确地确定了甲氧基的位置。关于cC，由于其分子量比cA的分子量大18，并且UV图案略有不同，表明了发色团的改变，通过分析NMR谱图，C1'(δC＝104.5,δH＝5.16)的端基碳信号和若干连氧次甲基氢的存在证实了在该结构体中存在O-糖苷。观察到了δH2′3.51ppm(δC2’＝73.8)、δH3′3.33ppm(δC3′＝75.8)、δH4′3.45ppm(δC4′＝71.5)、δH5′3.45ppm(δC5′＝75.5)之间的COSY和HMBC相关性，连同H4′、H5′和羧酸碳信号C6′(δC＝170.0)以及H5′与C1′和C3′之间的HMBC相关性确定了该糖部分为葡糖醛酸，并且通过将NMR图谱与具有包含葡糖醛酸的已知结构的NMR谱图进行比较，也可以确定cC的立体化学。当制备cC时，随后收集cD和cE，这是因为cD和cE与cC相似的UV图案以及14和28的分子量差异，表明cD和cE是cC的类似物。观察到了葡糖醛酸和甲氧基。关于cE，与cD相比的差异氢谱低场区1个酚羟基的缺失，根据类似的生物合成途径推测，在C6位被另一个甲氧基取代。关于cF，使用甲醇作为唯一溶剂使用蒸汽扩散法，在室温三天之后，在玻璃管的底部观察到微小的黄色有光泽棒状物；单晶XRD数据较好，足够确定立体化学，并且清楚地揭示了cF的骨架，除了五环氧杂蒽酮环的成环方向差异以外，cF也连接了和cA相同的4',5'-脱水葡糖醛酸部分(图2E，右图)。
综上，通过HRMS、1D NMR、2D NMR谱图(包括1H、13C、COSY、HSQC、HMBC和NOESY)以及单晶X射线衍射晶体学的组合分析确定了cA、cB、cC、cD、cE和cF的结构(图2C)。对于NMR谱图，DMSO-d6和甲醇-d4都可用作NMR测试的溶剂。图2D标示出了关键的2D NMR相关信号(1H-COSY、HMBC、NOESY)。进一步地，图2F示出了该化合物系列的通式。R1-9表示不同的取代基。R1、R2、R6、R7、R8和R9可以是羟基。R3和R5可以是羟基、甲氧基或乙氧基中的任一种。R4可以是式II或式III。
实施例4-化合物cA、cB、cC和cF选择性地结合至DNA(G4C2)4 G4
正是由于被C9orf72相关的ALS/FTD疾病的兴趣推动，我们一直在寻找靶向C9orf72 G4C2 HRE的潜在小分子。通过计算机分析，预计cA、cB和cC都与DNA(G4C2)4 G4具有相互作用(图3A)，DNA(G4C2)4 G4是由C9orf72 HRE DNA形成的二级结构。具有最低能量的对接模型表明化合物cA、cB和cC完全适合G4的两条链之间的宽沟(图3B)。预计在G16(a)、G8(b)、G14(c)与cA、cB和cC的羟基之间形成三个氢键(图4A)。
我们接着通过NMR滴定实验证实了cA与DNA(G4C2)4 G4的结合。根据用从1:1至1:10的不同浓度比的G4与cA滴定的1D 1H-NMR谱图(图3C)，观察到G2/G10、G1/G14、G22和G13的峰中的明显的化学位移变化，从而表明cA与DNA(G4C2)4 G4结构体之间的结合。类似地，通过NMR滴定也证明了cB、cC和cF结合至DNA(G4C2)4 G4(图3C)。
实施例5-化合物cA结合至RNA(G4C2)2 G4和hnRNP H的RRM结构域
除了C9orf72 HRE DNA之外，还发现C9orf72 HRE RNA形成了非标准二级结构G-四链体(G4)(图3D)，其可能会破坏正常转录，从而导致无效RNA转录物的累积以及全长RNA转录物的损失(Cammas,A.&Millevoi,S.RNA G-quadruplexes:emerging mechanisms indisease.Nucleic acids research 45,1584-1595(2017)；Kumar,V.,Kashav,T.,Islam,A.,Ahmad,F.&Hassan,M.I.Structural insight into C9orf72 hexanucleotide repeatexpansions:Towards new therapeutic targets in FTD-ALS.Neurochem Int 100,11-20(2016).)。对RNA(G4C2)2 G4和cA进行了的类似NMR滴定实验。在1D 1H-NMR谱图中观察到，相比于仅有RNA(G4C2)2 G4和DMSO对照，RNA(G4C2)2 G4与cA之比为1:3、1:5和1:10的化学位移发生了变化(图3E)。
值得注意的是，据报道，扩增的RNA G4C2重复序列可双向转录并形成核酸聚点(RNA foci)，这是C9orf72相关的ALS/FTD的发病机理的主要机制之一。在这种情况下，核酸聚点(RNA foci)募集特异性RNA结合蛋白(RBP)，如hnRNP H，从而导致RNA加工缺陷以及对中枢神经系统的进一步细胞毒性(Kumar,V.,Hasan,G.M.&Hassan,M.I.Unraveling theRole of RNA Mediated Toxicity of C9orf72 Repeats in C9-FTD/ALS.Front Neurosci11,711(2017)；Schneider,A.&Mandelkow,E.Tau-based treatment strategies inneurodegenerative diseases.Neurotherapeutics 5,443-457(2008).36.Mauger,D.M.,Lin,C.&Garcia-Blanco,M.A.hnRNP H and hnRNP F complex with Fox2 to silencefibroblast growth factor receptor 2 exon IIIc.Mol Cell Biol 28,5403-5419(2008)；Lee,Y.B.等人，Hexanucleotide repeats in ALS/FTD form length-dependentRNA foci,sequester RNA binding proteins,and are neurotoxic.Cell Rep 5,1178-1186(2013))。因此，我们通过NMR滴定测试了cA与hnRNP H的RRM结构域的结合可能性。根据hnRNP H的RRM1/2和RNA(G4C2)2 G4的重叠的15N-1H HSQC谱图，示出了hnRNP H的RRM结构域结合至RNA(G4C2)2 G4(图4B)，而cA也可结合至hnRNP H的RRM结构域，从而占据cA与RNA(G4C2)2 G4的结合位点(图3E至图3I)。有趣的是，DNA(G4C2)4 G4也显示出对hnRNP H的RRM结构域的强结合亲和性(图4C)。因此，可能是cA结合于由DNA(G4C2)4 G4、RNA(G4C2)2 G4和hnRNP H形成的复合物。相比之下，cB和cF显示出弱得多的与hnRNP H的RRM结构域的结合，而cC与hnRNP H的RRM结构域的结合似乎比cA稍强(图3E至图3I)。
实施例6-化合物cA结合至hnRNP F和Orc6
hnRNP F是另一种RNA结合蛋白，其可在核酸聚点(RNA foci)形成期间被募集。值得注意的是，我们证实了hnRNP F的RRM结构域对DNA(G4C2)4 G4和化合物cA均显示出显著的结合亲和性(图5A、图5B)。而且，cA几乎阻断了hnRNP F RRM结构域对DNA(G4C2)4 G4的所有结合位点(图5C)。此外，我们通过NMR滴定实验证明了cA结合至人Orc6，Orc6是起始识别复合物(ORC)的亚基(图5D)。Orc6上的结合位点如图5E所示，表明cA可以阻断Orc与DNA复制起始点的结合，从而抑制DNA复制。
实施例7-化合物cA不与其他G4结构体结合
在先前的研究中，证明了由C9orf72 HRE DNA和RNA折叠的G4显示出结构多态性，这在C9orf72 ALS/FTD的发病机理中起到重要作用。除了四个重复序列G4C2 DNA G4之外，还存在由两个重复序列G4C2 DNA同时形成的平行和杂合G4构象(Zhou,B.,等人，Characterizations of distinct parallel and antiparallel G-quadruplexes formedby two-repeat ALS and FTD related GGGGCC sequence.Sci Rep 8,2366(2018)；Zhou,B.,Liu,C.,Geng,Y.&Zhu,G.Topology of a G-quadruplex DNA formed by C9orf72hexanucleotide repeats associated with ALS and FTD.Sci Rep 5,16673(2015))。为了检测cA是否能结合至由不同长度的C9orf72 G4C2 HRE DNA形成的G4，进行了DNA(G4C2)2G4与cA比例为1:1、1:5和1:10的NMR滴定(图6A)。1D 1H-NMR谱图示出了，相比于仅有DNA(G4C2)2 G4的谱图，用1:1、1:5和1:10的cA滴定都没有产生显著的化学位移变化(图6B)。除了GGGGCC序列之外，其他富含G的DNA或RNA链也能形成多态性G4。例如，人端粒变体htel21_T18(d[(GGGTTA)2-GGGTTTGGG])是椅子型的(图6C)；而命名为htel23的人端粒四链体蛋白d[TA(GGGTTA)3GGG]的构象为杂合型(Liu,C.,等人，A chair-type G-quadruplexstructure formed by a human telomeric variant DNA in K(+)solution.Chem Sci10,218-226(2019)；Liu,C.,等人，G-quadruplex structures formed by humantelomeric DNA and C9orf72 hexanucleotide repeats.Biophys Rev 11,389-393(2019))(图6D)。为了研究cA的结合偏好，分别进行cA与htel21_T18和htel23_杂合体的NMR滴定。1D 1H-NMR谱图示出了，对于htel21_T18以及用cA以1:10滴定的htel21_T18，没有发生明显的化学位移变化(图6E)。类似地，用cA以1:10滴定的htel23杂合体的1D 1H NMR谱图也没有显示出明显的化学位移变化(图6F)。作为另一个对照，由鸡DNA复制起始点形成的DNA G-四链体(图6G)在1:3滴定时也没有显示出与cA的结合(图6H)。总之，化合物cA示出了对特异性DNA/RNA G4C2 G4结构体的结合偏好，从而表明了高选择性。
其他研究者认为，一种小分子DB1246(图7A)能够结合并稳定RNA(G4C2)4 G4(Simone,R.,等人，G-quadruplex-binding small molecules ameliorate C9orf72 FTD/ALS pathology in vitro and in vivo.EMBO Mol Med 10,22-31(2018))。作为一个不错的对照，我们想知道DB1246是否能直接结合至这些G4结构体。令人惊奇的是，我们发现DB1246不仅强结合至DNA(G4C2)4 G4(图7B)和RNA(G4C2)2 G4(图7C)，而且还强结合至DNA(G4C2)2 G4(图7D)和人端粒htel21_T18 G4(图7E)，这意味着DB1246是G4的常见配体。总之，这些发现提示了cA具有更好的选择性和结合特异性，是值得进一步研究的可能的候选药物。
实施例8-化合物cA和cC在体外和体内挽救G4C2 HRE相关病症
考虑到化合物结合至G4C2 HRE G4(图3A至图3D)的重要性，化合物cA、cB和cC可以以相同的方式结合至细胞中的G4C2 HRE DNA，从而减少G4C2 HRE所引起的细胞死亡。为了进行试验，将DNA(G4C2)29重复序列的质粒转染到Neuro2A细胞中以建立C9orf72 ALS/FTD细胞模型，并且随着(G4C2)29重复序列的过表达而观察到显著的细胞死亡(＞50％)(图8A至图8B)。有趣的是，以1μg/mL的浓度施加的cA和cC部分地提高了细胞存活率，而cB(1μg/mL)使细胞存活率更差(图8B)。
由于cA与RNA(G4C2)2 G4和RNA结合蛋白hnRNP H的结合，hnRNP H与在C9orf72突变的ALS和FTD脑组织中检测的大多数G4C2核酸聚点(RNA foci)共定位(Lee,Y.B.,等人，Hexanucleotide repeats in ALS/FTD form length-dependent RNA foci,sequesterRNA binding proteins,and are neurotoxic.Cell Rep 5,1178-1186(2013))，我们接下来确定化合物cA和cC是否能影响G4C2核酸聚点(RNA foci)的形成，这是C9orf72 ALS中的一个关键病症。首先，我们确定了在(G4C2)29过表达的Neuro2a细胞中特异性观察到核酸聚点(RNA foci)(图8C)。我们发现1μg/mL的cA或cC处理2天显著降低了细胞中的G4C2核酸聚点(RNA foci)数目，但很少改变CAGG(对照探针)核酸聚点(RNA foci)数目(图8D)。
我们接下来通过用固体食物中的化合物喂养幼虫，用cA或cC处理WT野生型果蝇以及用GMR-GAL4驱动基因促进(G4C2)29重复序列(GMR-GAL4-(G4C2)29)表达的果蝇。将DMSO用作阴性对照。具有GMR-GAL4-(G4C2)29的第7天成体蝇的眼部比同龄WT蝇粗糙得多，从而表明了眼部变性(图8E)。受影响的眼部变性面积占整个眼部的50％以上(图8F)。有趣的是，相比于GMR-GAL4-(G4C2)29果蝇的变性的眼部，cA或cC处理使眼部更光滑且更具反射性(图8E)，从而显著挽救了眼部退化变性表型(图8F)。
实施例9-cA、cB、cC的渗透性、细胞毒性和溶血活性
为了评价化合物cA、cB、cC的渗透性，我们通过平行人工膜渗透性试验(PAMPA-09)对这些化合物进行试验。使用美金刚和尼莫地平作为阳性对照，我们发现在三种化合物中，化合物cA示出了最佳的渗透性，具有与尼莫地平相似的水平(图9A)，而DB1246示出了比cA、cB、cC差得多的渗透性。此外，我们还在活细胞上测试了渗透性。对用不同浓度(10μg/mL、20μg/mL)的cA处理不同孵育时间(24小时、48小时)的Neuro2a细胞进行裂解。收集细胞裂解物的上清液，并通过UPLC-MS进行分析。同时，将来自不同处理组的细胞培养基用作对照。在所有组中都检测到了化合物cA，而与24小时孵育组相比，48小时孵育组的信号强度显著提高(图25，1-3)。相比之下，在三个相应的细胞培养基组中，cA信号的强度是相同的(图25，4-6)。这些数据表明，cA能够穿透细胞膜并进入细胞。
为了评价化合物cA、cB和cC的细胞毒性，将不同浓度(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL)的这些化合物施加于HEK293T细胞系。然后通过MTT试验测定细胞存活率。有趣的是，化合物cA和cC在高达10μg/mL时没有表现出细胞毒性，然而，化合物cB即使在非常低的剂量0.1μg/mL时也表现出了显著的细胞毒性(图9B)。此外，测定了cA、cB和cC的溶血活性，以评价这些化合物的安全性指数。巧合地，cA和cC即使在1000μg/mL的浓度也没有表现出溶血活性，而cB从500μg/mL开始以剂量依赖性的方式表现出显著的溶血性(图9C)。总之，这些数据表明，化合物cA和cC具有良好的渗透性、无细胞毒性和溶血活性，是比cB具有更高安全性指数以用于进一步评价的更好的候选物。
实施例10-化合物cA和cC在分化的HT22细胞中挽救谷氨酸盐兴奋性毒性
在C9orf72相关的ALS/FTD中，G4C2 HRE使运动神经元更容易受到异常神经元兴奋毒的侵害(Selvaraj,B.T.,等人，C9ORF72 repeat expansion causes vulnerability ofmotor neurons to Ca2+-permeable AMPA receptor-mediated excitotoxicity.NatCommun 9(2018))。同时，谷氨酸盐受体的超活化会导致神经元活性的中毒水平，从而促进G4C2重复序列相关的DPR蛋白的非ATG(RAN)翻译(Westergard,T.,等人，Repeat-associated non-AUG translation in C9orf72-ALS/FTD is driven by neuronalexcitation and stress.EMBO Mol Med 11(2019))，引起运动神经元的进一步中毒。因此，我们想要在谷氨酸盐(E)诱导的兴奋性毒性细胞模型中测试我们的化合物。有趣的是，化合物cA和cC显著挽救了分化的HT22细胞免于兴奋性毒性所引起的死亡(图10D)。相比之下，与模型组相比，cB和cE加剧了谷氨酸盐诱导的细胞死亡，表明cB和cE具有细胞毒性，且没有神经保护作用(图10D、图10H)；而在谷氨酸盐(E)诱导的兴奋性毒性细胞模型中，cD和cF既未显示出保护作用也未显示出细胞毒性(图10D、图10H)。
同时，测定了cA、cB、cC、cD、cE和cF的剂量-反应关系。作为阳性对照药物，还对美金刚、尼莫地平和DB1246进行了试验。美金刚、尼莫地平和DB1246的EC50分别为23.93μM、1.135μM和12.18μM(图10A至图10C)；而cA、cB、cC、cD、cE的EC50分别为0.3099μM、11.14μM、0.03244μM、53.57μM、1.141e+11μM(图10E至图10G、图10I至图10K)。在这些化合物中，只有cA表现出良好的剂量-反应曲线，甚至优于美金刚，从而表明cA具有被开发为神经保护性化合物的潜力。
实施例11-化合物cA、cB、cC、cD、cE和cF在体外全都抑制tau-R3聚集
在C9orf72 ALS/FTD中，微管结合蛋白tau与G4C2 HRE之间存在强的遗传相关性。后者通过抑制自噬体-溶酶体融合而显著增加了果蝇中的异常tau聚集(Wen,X.,等人，TauAccumulation via Reduced Autophagy Mediates GGGGCC Repeat Expansion-InducedNeurodegeneration in Drosophila Model of ALS.Neurosci Bull(2020)；He,H.,等人，Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated GGGGCC repeat expansion promotes Tauphosphorylation and toxicity.Neurobiol Dis 130,104493(2019))。tau和G4C2重复序列的共表达产生了ALS/FTD的神经退行性病变表型的协同恶化(He,H.,等人，AmyotrophicLateral Sclerosis-associated GGGGCC repeat expansion promotes Tauphosphorylation and toxicity.Neurobiol Dis 130,104493(2019))。考虑到tau聚集与ALS/FTD发病机理的紧密相关性，我们在基于非细胞的tau-R3聚集抑制试验中测试了我们的化合物。使用肝素作为诱导物以及ThT作为探针，cA显著限制了ThT荧光(图11A)，表明cA起到了tau-R3原纤维聚集的抑制剂的作用。cA的抑制IC50为约0.3213μg/mL(图11B)。cB和cC都抑制了tau-R3聚集，IC50分别为1.302μg/mL(图11C至图11D)和3.677μg/mL(图11E至图11F)。此外，我们进行了高放大倍数TEM成像以表征用cA、cB和cC处理的tau-R3原纤维的形态变化。如图11G所示，仅为tau-R3的原纤维长且致密，并且观察到了几束原纤维。而用cA(10μg/mL)、cB(5μg/mL)或cC(10μg/mL)处理时，tau-R3原纤维断裂成更短更细的片段。值得注意的是，在cA的存在下，一些tau-R3形成了无定形聚集物(箭头)。这些数据与ThT试验一致，表明cA、cB和cC在体外破坏了tau-R3原纤维的形成。而且，cD、cE和cF都抑制了tau-R3聚集，IC50分别为3.102μg/mL、4.083μg/mL和2.179μg/mL(图11H至图11M)。这些化合物的抑制率趋势不同于DNA/RNA G4C2 G-四链体结合或神经保护性和溶血性中的趋势，从而表明存在独特的潜在机制。此外，在中枢神经系统的神经元中，tau蛋白错误折叠成微丝可以发现于各种神经变性疾病中，例如阿尔茨海默病等。因此，对tau聚集的抑制代表了cA及其衍生物在靶向超出ALS的多种其他神经变性疾病方面的潜力。
实施例12-cA及其类似物的生物活性比较
这些结构相似的海洋天然化合物的生物活性差异是引人注目的。与cA类似，cB、cC和cF均与DNA(G4C2)4 G-四链体和hnRNP H结合，而根据NMR滴定实验，在这三种化合物中，结合亲和性不同，基本上如cC＞cA＞cB＞cF(图3C至图3E)。有趣的是，cC显示出比cA更好的神经保护活性，而cB、cD、cE和cF都比cA差。在(G4C2)29细胞中，cC使细胞存活率提高了20％至40％，而在cA处理组中细胞存活率提高了30％。相比之下，cB处理组甚至比模型组(G4C229重复序列)更差，表明除保护性之外还具有强的细胞毒性(图8B)。与G4C2重复序列模型一致，cB和cE也使L-谷氨酸盐诱导的细胞死亡模型中的细胞存活率变差。同时，在L-谷氨酸盐细胞死亡模型中，cA和cC都保护了细胞免于兴奋性毒性所引起的死亡。然而，在L-谷氨酸细胞死亡模型中，cD和cF既未显示出保护作用也未显示出细胞毒性(图10D、图10H)。巧合地，cA和cC在1mg/mL的相当高的浓度也没有表现出溶血活性，而cB从500μg/mL开始以剂量依赖性的方式表现出显著的溶血活性(图9C)。
它们的生物活性差异的内在原因可能归因于它们的微小结构差异。根据cA及其衍生物cB、cC，以及cC的衍生物cD和cE的结构差异，构效关系一目了然。C-17中羟基的重要性不仅对于DNA(G4C2)4 G-四链体的结合至关重要，而且对于其神经保护活性和溶血活性也至关重要。cA的甲酯化产物cB表现出显著的溶血活性和高的细胞毒性，因此减弱了其神经保护活性。引入甲氧基的疏水性阻断了化合物与DNA(G4C2)4 G-四链体之间的氢键形成，从而降低了结合亲和性。与cA相比，cC的双键被打开，并且在葡糖醛酸处的C-4'多添加了一个羟基，这有利于cC与G-四链体的结合以及对细胞的神经保护作用。cC的甲基化产物cD和cE也表现出细胞毒性。因此，这些数据表明，被甲氧基取代的羟基与该化合物系列的细胞毒性高度相关。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将想到基于上述内容的各种修改或改变，并且这些修改或改变将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任意组合的方式)或任何其他发明或其实施方案进行组合，并且所有此类组合均包括于本发明的范围内且不限于此。

Claims (15)

1.一种式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物：
式(IV)：
Figure FDA0003262702950000011
式(V)：
Figure FDA0003262702950000012
式(VI)：
Figure FDA0003262702950000021
式(VII)：
Figure FDA0003262702950000022
式(VIII)：
Figure FDA0003262702950000023
式(IX)：
Figure FDA0003262702950000031
2.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
3.一种结合至G-四链体(G4)、RNA结合蛋白hnRNP H的RRM结构域、或DNA结合蛋白hnRNPF或hORC6的方法，所述方法包括向受试者施用式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物，其中所述受试者患有神经退行性疾病。
4.根据权利要求3所述的方法，其中施用途径为静脉内注射或口服施用。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物穿过血脑屏障。
6.根据权利要求5所述的方法，还包括使式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物进入或接触神经元细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述G4为DNA(G4C2)4或RNA(G4C2)2。
8.根据权利要求3所述的方法，还包括降低谷氨酸盐诱导的神经元细胞的兴奋性毒性。
9.根据权利要求3所述的方法，还包括抑制或消除tau异常聚集。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述tau异常聚集为tau原纤维形成、tau寡聚体形成和/或tau初原纤维形成。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、多发性硬化症、癫痫、中风、酒精戒断症、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病(PiD)、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体连锁的伴帕金森症的额颞叶痴呆(FTDP-17)。
12.一种阻断DNA复制的方法，所述方法包括向受试者施用式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物，其中所述式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)或式(IX)的化合物结合至人ORC6蛋白。
13.一种用于使细菌生长的方法，所述方法包括在约20℃至37℃、在160rpm至约200rpm的摇晃速度下，使细菌细胞与GYM培养基接触7天至约14天，其中所述细菌细胞为冠霉素链霉菌和/或天青链霉菌。
14.根据权利要求13所述的方法，其中温度为约23℃至30℃，接触时间为约7天至约10天，并且摇晃速度为约180rpm。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述冠霉素链霉菌为冠霉素链霉菌BCC 24770菌株，并且所述天青链霉菌为天青链霉菌Aw99c菌株。
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