WO2013117789A2 - Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores - Google Patents

Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores Download PDF

Info

Publication number
WO2013117789A2
WO2013117789A2 PCT/ES2013/070065 ES2013070065W WO2013117789A2 WO 2013117789 A2 WO2013117789 A2 WO 2013117789A2 ES 2013070065 W ES2013070065 W ES 2013070065W WO 2013117789 A2 WO2013117789 A2 WO 2013117789A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
compound
alkyl
group
alkylene
Prior art date
Application number
PCT/ES2013/070065
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013117789A3 (es
Inventor
María del Carmen RAMOS MARTÍN
Sonia Campoy García
Javier Santos Burgos Muñoz
José Luis Adrio Fondevila
Javier Velasco Alvarez
Original Assignee
Neuron Biopharma, S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neuron Biopharma, S.A. filed Critical Neuron Biopharma, S.A.
Priority to JP2014556114A priority Critical patent/JP2015513525A/ja
Priority to IN6536DEN2014 priority patent/IN2014DN06536A/en
Priority to EP13711061.5A priority patent/EP2813222B1/en
Priority to AU2013217893A priority patent/AU2013217893A1/en
Priority to BR112014018411A priority patent/BR112014018411A8/pt
Priority to US14/377,143 priority patent/US9453004B2/en
Priority to CA2863820A priority patent/CA2863820A1/en
Priority to MX2014009626A priority patent/MX2014009626A/es
Publication of WO2013117789A2 publication Critical patent/WO2013117789A2/es
Publication of WO2013117789A3 publication Critical patent/WO2013117789A3/es
Priority to IL233770A priority patent/IL233770A0/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C223/00—Compounds containing amino and —CHO groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C223/02—Compounds containing amino and —CHO groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/03—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/22—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/24—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/25—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium
    • C12R2001/82—Penicillium chrysogenum

Definitions

  • the invention relates to the use of formulated analogs of xanthocycins and their derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases, cognitive deficits, dementias and especially Alzheimer's disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • acetylcholinesterase (AChE) inhibitors and memantine, an inhibitor of the NMDA glutamatergic receptor (N-methyl-D-aspartic acid).
  • Current therapeutic options against AD are based on the inhibition of acetylcholinesterase with drugs such as donepezil, galantamine or rivastigmine, or on the ability of memantine to antagonize the NMDA receptor.
  • drugs such as donepezil, galantamine or rivastigmine
  • memantine an inhibitor of the NMDA glutamatergic receptor
  • MCI also known as incipient dementia or isolated memory impairment
  • MCI is one of the previous stages associated with AD and other dementias.
  • MCI is recognized as a risk factor for AD, and affects about 30 million people worldwide, and is considered as a previous step to AD, where between 10 and 15% of individuals with MCI progress to AD every year (Grundman et al. Arch. Neurol 2004; 61 [1]: 59-66).
  • the activity of one of the two compounds was evaluated against Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Burkholderia thailandersis and Fusarium pallidoroseum, but showed no activity in these trials.
  • the authors of the present invention have identified a series of compounds corresponding to formylated xanthocycline analogs, obtained from an extract produced by a strain of the Penicillium chrysogenum species, which have demonstrated a surprising neuroprotective effect against neuronal death caused Oxidative damage, which gives them beautiful properties as neuroprotective compounds.
  • the in vitro antioxidant capacity analysis of these compounds has surprisingly shown that these compounds are antioxidants.
  • the experimental results obtained show the potential use of the formulated analogs of xanthocycins in the prevention and / or treatment of neuronal death associated with neurodegenerative diseases, cognitive deficits, dementias, diseases associated with aging, pathological processes associated with age and progeria .
  • the results obtained can be extrapolated for prophylactic or therapeutic purposes for application to the population at risk.
  • a first aspect of the present invention is constituted by a compound of formula (I):
  • Ri is selected from alkyl, OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, NH 2 , H-alkyl, N (alkyl) 2 and halogen
  • R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from hydrogen, alkyl, OH , O-alkyl, SH, S-alkyl, H 2 , NH-alkyl, N (alkyl) 2 and halogen
  • Ri and R 2 and / or R 3 and R 4 form a group -O-alkylene-O-, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or prodrug thereof, for use in the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases.
  • the invention is directed to compounds of formula (II):
  • Ri is selected from alkyl, OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, NH 2 , NH-alkyl, N (alkyl) 2 and halogen
  • R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from hydrogen, alkyl, OH , O-alkyl, SH, S-alkyl, NH 2 , NH-alkyl, N (alkyl) 2 and halogen
  • Ri and R 2 and / or R 3 and R 4 form a group -O-alkylene-O-, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or prodrug thereof, with the proviso that formula (II) does not include:
  • R 2 and R 4 are hydrogen and Ri and R 3 are independently selected from OH and methoxy.
  • the invention is directed to a pharmaceutical formulation comprising a compound of formula (II) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention is also directed to a compound of formula (II) for use in medicine.
  • the invention is directed to a process for the preparation of a compound of formula (II) from an extract produced by the Penicillium chrysogenum species.
  • the invention is directed to a process for the preparation of a compound of formula (II) comprising:
  • R represents an alkyl group
  • SE means a protective group
  • the invention is directed to a strain of microorganism of the species Penicillium chrysogenum deposited in the CECT with the registration number CECT 20783.
  • Figure 1 is the photograph of the sample M082-08, which belongs to a marine sponge taken in Cabo de Gata (Almer ⁇ a).
  • Figure 2 is the photograph of the isolate as pure culture of the sample M082-08 inoculated on a petri dish with PD A-marine medium, the isolate strain was designated 0882_08.
  • Figure 3 is a bar chart showing the protection of different dilutions of extract 08 055 C08 against cell death caused by xanthine 10 ⁇ 7 xanthine oxidase 60 mU / mL (XXO).
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% produced by XXO) of cultures treated with dilutions 1/100, 1/400, 1 / 1,000, 1 / 4,000 and 1 / 10,000 of the extract in the presence of XXO , representing the means ⁇ SD of an experiment in triplicate.
  • * Significant difference with respect to XXO treatment according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 4 is a list of the lethal, sublethal, teratogenic and toxicological parameters observed at 48 hours post-treatment in zebrafish embryos exposed to extract 08_055 C08 at dilutions 1/100, 1/200 and 1/400.
  • Figure 5 is the sequencing of the fragment obtained by PCR of the 28 S gene of strain 0882_08.
  • Figure 6 is the chromatogram of the low resolution FIPLC / MS analysis of compounds with molecular weights of m / z 340 (corresponding to peak G27) and m / z 324 (peak G28) obtained from fractionation of extract 08 055 C08 .
  • Figure 7 is the mass spectrum (ESI-TOF) of peak G28 and corresponding to compound PS0156.
  • Figure 8 is the 1 H NMR spectrum of the G28 peak and corresponding to compound PS0156.
  • Figure 9 is the 13 C NMR spectrum of peak G28 and corresponding to compound NPS0156.
  • Figure 10 shows the chemical shifts of 1H (500 MHz) and 13 C (125 MHz) for compound PS0156 in DMSO-d6.
  • Figure 11 is the mass spectrum (ESI-TOF) of peak G27 and corresponding to compound PS0155.
  • Figure 12 is the 1 H NMR spectrum of the G27 peak and corresponding to compound PS0155.
  • Figure 13 is a diagram showing the correlations observed in the COZY (red) and FIMBC (blue) spectra for the aromatic protons of the 3,4-dihydroxyphenyl substituent.
  • Figure 14 shows the chemical shifts of 1H (500 MHz) and 13 C (125 MHz) for compound PS0155 in DMSO-d6.
  • Figure 15 shows in (A) the normalized cell index of SK-N-MC human neuroblastoma cells treated for 24 h with XXO and various concentrations of PS0155 (from 10 to 4,000 ng / ml).
  • the XY scatter plot shows the real-time measurement of a representative test, in duplicate measurements; and in (B) the percentage of the normalized cell index referred to the cells treated with XXO and with PS0155 at the indicated concentrations at 20 h post treatment.
  • the results are the mean ⁇ SEM of two tests performed in duplicate. * Significant difference with respect to XXO treatment according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 16 shows in (A) the normalized cellular index of SK-N-MC human neuroblastoma cells treated for 24 h with XXO and various concentrations of NPS0156 (10 to 4,000 ng / ml).
  • the XY scatter plot shows the real-time measurement of a representative test, in duplicate measurements; and in (B) the percentage of the normalized cellular index referred to the cells treated with XXO and with NPS0156 at the indicated concentrations at 20 h post treatment.
  • the results are the mean ⁇ SEM of two tests performed in duplicate. * Significant difference with respect to XXO treatment according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 17 shows in (A) the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA, for the carrier cells of the wild-type APP variant (APPwt) treated with camptothecin (CPT) 50 ⁇ during 6 h and for pre-treatment for 24 h with NPS0155 at 4 and 10 ⁇ g / ml followed by treatment with CPT (the percentage of apoptosis indicated is measured on the sub- region Gl of each of the conditions.); and in (B) the representative histograms showing the percentage of DNA fragmentation referred to APPwt cells treated with CPT and with pre-treatment with NPS0155 at 4 and 10 ⁇ g / ml, representing the means ⁇ SD of two independent experiments by sixfold.
  • A the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA
  • Figure 18 shows in (A) the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA, for the carrier cells of the Swedish APP variant (APPswe) treated with 50 ⁇ CPT for 6 h and for pre-treatment for 24 h with NPS0155 at 4 and 10 ⁇ g / ml followed by treatment with CPT (the percentage of apoptosis indicated is measured on the sub-Gl region of each of the conditions.); and in (B) the representative histograms showing the percentage of DNA fragmentation referred to APPswe cells treated with CPT and with pre-treatment with NPS0155 at 4 and 10 ⁇ g / ml, representing the means ⁇ SD of two independent experiments by sixfold. * Significant difference with respect to the treatment with CPT according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 19 shows in (A) the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA, for the carrier cells of the wild-type APP variant (APPwt) treated with 50 ⁇ CPT for 6 h and for pretreatment for 24 h with NPS0156 at 4 and 10 ⁇ g / ml followed by treatment with CPT (the percentage of apoptosis indicated is measured on the sub-Gl region of each of the conditions.); and in (B) representative histograms showing the percentage of DNA fragmentation referred to APPwt cells treated with CPT and with pre-treatment with NPS0156 at 4 and 10 ⁇ g / ml, representing the means ⁇ SD of two independent experiments by sixfold. * Significant difference with respect to the treatment with CPT according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 20 shows in (A) the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA, for the carrier cells of the Swedish APP variant (APPswe) treated with 50 ⁇ CPT for 6 h and for pretreatment for 24 h with NPS0156 at 4 and 10 ⁇ g / ml followed by treatment with CPT (the percentage of apoptosis indicated is measured on the sub-Gl region of each of the conditions.); and in (B) representative histograms showing the percentage of DNA fragmentation referred to APPswe cells treated with CPT and with the pre treatment with PS0156 at 4 and 10 ⁇ g / ml, representing the means ⁇ SD of two independent experiments per sextuplicate. * Significant difference with respect to the treatment with CPT according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 21 shows the synthesis scheme of an xanthocillin X derivative, as an example of the synthesis route to generate the analogs of compound PS0155.
  • the steps indicated consist of: a. H 3 ac, THF, ta., 3 days; b. N-Bu 3 SnH, Pd (PPh 3 ) 4 , THF, 0 ° C, 0.5 h; C. Pb (OAc) 4 , TMS (CH 2 ) 2 OH, DMF, 0 ° C to 50 ° C, 8 h; d. Pb (OAc) 2 , CuCL 2 , THF, 0 ° C, 0.5 h; and.
  • Figure 22 shows the nature of groups A to P representing Ar 1 and Ar 2 on the schematic structure in (II), which defines a family of xanthocycline derivatives.
  • Figure 23 is a matrix showing the value of the CLOGP, defined as the log P of a compound, which is the partition coefficient between n-octanol and water, log (c oc tanoi / cagua), of the different combinations of substituents of the molecule of formula (II).
  • Figure 24 shows the synthesis scheme of compounds PS0158 (G + G), PS0159 (F + F), PS0160 (P + P), NPS0161 (H + H) and PS0163 (J + J).
  • Figures 25-28 show in (A) the normalized cell index of SK-N-MC human neuroblastoma cells treated for 24 h with XXO and various concentrations of the synthesized analogs (100 to 1000 ng / ml).
  • the XY scatter plot shows the real-time measurement of a representative test, in duplicate measurements; and in (B) the percentage of the normalized cell index referred to the cells treated with XXO and with the analogues synthesized at the indicated concentrations at 20 h post treatment.
  • Figures 25-28 correspond respectively to the results of analogs PS0158 (G + G), PS0159 (F + F), PS0160 (P + P) and PS0161 (H + H). The results are the mean ⁇ SD of 2-3 trials performed in duplicate. * Significant difference with respect to XXO treatment according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 29 shows the results obtained with analogs PS0158, PS0159, PS0160 and PS0161 on the production of Reactive Oxygen Species (ROS) corrected for LDH (lactate dehydrogenase activity), as a measure of cell viability, with respect to XXO treatment of each analog in a dose response curve.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • LDH lactate dehydrogenase activity
  • Figure 30 shows in (A) the flow cytometry analysis of the propidium iodide fluorescence against the amount of DNA, for pre-treated SK-N-MC cells for 24 h with NPS0158 and NPS0159 at 10 ⁇ g / ml, NPS0160 at 1 ⁇ g / ml and NPS0161 at 0.4 ⁇ g / ml followed by treatment with camptothecin (CPT) 50 ⁇ for 6 h (the percentage of apoptosis indicated is measured on the sub-Gl region of each of the conditions.) ; and in (B) representative histograms showing the percentage of DNA fragmentation referred to SK-N-MC cells treated with CPT. Z-VAD-fmk is used as a commercial apoptosis inhibitor. The results represent the means ⁇ SD of two independent experiments in quadruplicate. * Significant difference with respect to the treatment with CPT according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • a "neurotoxic substance” as used herein is chemical substances that produce functional, structural and biochemical alterations of the central nervous system. These adverse effects involve changes that cause deregulation or alteration of the nervous system. The nature of such change may be neurochemical, morphological, or behaviorally related and may manifest itself temporarily or permanently.
  • neurodegenerative disease includes diseases that result from degeneration or deterioration of nerve tissue, particularly neurons, which leads, over time, to dysfunction or inability;
  • degeneration includes loss of cell viability, loss of cell function and / or loss of cell numbers (neurons and others).
  • Illustrative, non-limiting examples of neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, Huntingon's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Alexander's disease, cognitive and / or psychomotor deficits, ataxias, dementias, cerebrovascular diseases, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis (MS), as well as diseases associated with aging, pathological processes associated with age and progeria.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • MS multiple sclerosis
  • said neurodegenerative disease is a disease related to neuronal death caused by a neurotoxic substance, for example, a substance that produces endoplasmic reticulum stress, apoptosis, cytoskeleton disorganization, basal ganglia degeneration or mitochondrial damage.
  • a neurotoxic substance for example, a substance that produces endoplasmic reticulum stress, apoptosis, cytoskeleton disorganization, basal ganglia degeneration or mitochondrial damage.
  • neuronal degeneration and “neuroprotector”, as used herein, refer to the attenuation of the effects of neuronal degeneration or death by any known mechanism or by knowing for example, necrosis, apoptosis, autophagy, excitotoxicity, oxidative damage , mitochondrial damage, endoplasmic reticulum damage, byproduct deposition, loss of cellular architecture, etc., or the disappearance of the effects of degeneration or neuronal death by any known mechanism or by knowing for example, necrosis, apoptosis, autophagy, excitotoxicity , oxidative damage, mitochondrial damage, endoplasmic reticulum damage, byproduct deposition, loss of cellular architecture, etc., or the decrease or disappearance of its side effects.
  • subject refers to a member of a mammalian species, and includes, but is not limited to, pets, primates and humans; preferably, the subject is a human being, male or female, of any age or race. In a particular embodiment, said subject is a mammal that suffers, or is susceptible to suffering from a neurodegenerative disease, such as a chronic neurodegenerative disease or a disease associated with aging.
  • a neurodegenerative disease such as a chronic neurodegenerative disease or a disease associated with aging.
  • salt should be understood as meaning any form of xanthocycline derivatives in which the compound assumes an ionic form, or is charged and coupled with a counterion (a cation or anion) or is in solution. This is why it should be understood also complexes of the active compound with other molecules and ions, and in particular complexes that are complexed through ionic interactions.
  • solvate should be understood as meaning any form of the xanthocycline derivative of formula (I) that has another molecule (more likely a solvent) attached through a non-covalent bond.
  • solvates include hydrates and alcoholates, for example methanolate.
  • the solvates are pharmaceutically acceptable solvates.
  • prodrug or “prodrug” is used in its broadest sense and encompasses those derivatives that are converted in vivo into the compounds of the invention. Those skilled in the art would readily produce such derivatives, and include, depending on the functional groups present in the molecule and without limitation, the following derivatives of the present compounds: esters, amino acid esters, phosphate esters, carbamates, amides, etc. Examples of well-known methods for producing a prodrug of a given performance compound are known to those skilled in the art and can be found, for example, in Krogsgaard-Larsen et al, "Textbook of Drugdesign and Discovery” Taylor & Francis (April 2002 ).
  • Particularly favorable derivatives or prodrugs are those that increase the bioavailability of the compounds of this invention when such compounds are administered to a patient (for example, allowing a compound administered orally to be more easily absorbed in the blood) or those that increase the administration of the original compound to a biological compartment (for example, the brain or lymphatic system) in relation to the original species.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular compositions and entities that are physiologically tolerable and do not normally produce allergic reactions or similar unfavorable reactions such as gastric disorders, dizziness, and reactions of the same style, when administered in humans or animals.
  • alkyl refers to a hydrocarbon chain, linear or branched, consisting of carbon and hydrogen atoms, which does not contain unsaturations, and having one to twelve carbon atoms, preferably one to eight carbon atoms, plus preferably one to six carbon atoms, and that is attached to the rest of the molecule through a single bond.
  • alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl and hexyl.
  • halogen includes fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • alkylene in the substituent “O-alkylene-O” refers to a hydrocarbon chain, linear or branched, consisting of carbon and hydrogen atoms, which does not contain unsaturations, and which has one to twelve carbon atoms, preferably from one to eight carbon atoms, more preferably from one to six carbon atoms, and which is attached to the oxygen atoms through a single bond.
  • O-alkylene-O examples include O-methylene-0 (0-CH 2 -0), O-ethylene-0 (0-CH 2 -CH 2 0), O-propylene-0 (0-CH 2 -CH 2 -CH 2 0) or O-butylene-0 (0-CH 2 - CH 2 -CH 2 -CH 2 0).
  • the present invention relates to a compound of formula (I), as previously defined, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug or solvate, for use in the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases.
  • Ri is selected from alkyl, OH and O-alkyl, or Ri is bound to R 2 forming a -O-alkylene-O group.
  • R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from hydrogen, alkyl, OH and O-alkyl, or R 2 is linked to Ri forming a group - O-alkylene-O, and / or R 3 and R 4 are linked together forming an -O-alkylene-O group.
  • R 4 is in the meta position of the aromatic ring.
  • Ri is OH, alkyl or form, together with R 2 , a group -O-alkylene-O. More preferably, Ri is OH, methoxy, ethoxy, ethyl, methyl or forms, together with R 2 , a -O-alkylene-O group. Also preferably, R 2 is hydrogen, OH, alkyl or form, together with Ri, a group -O-alkylene-O. More preferably, R 2 is hydrogen, OH, ethyl, methyl or forms, together with Ri, a group -O-alkylene-O.
  • R 3 is OH, alkyl or form, together with R 4 , a group -O-alkylene-O. More preferably, R 3 is OH, ethyl, methyl or forms, together with R 4 , a group -O-alkylene-O.
  • R 4 is hydrogen, OH, alkyl or form, together with R 3 , a -O-alkylene-O group. More preferably, R 4 is hydrogen, OH, ethyl, methyl or forms, together with R 3 , a group -O-alkylene-O.
  • the compound of formula (I) is selected from the following compounds:
  • results of the research carried out by the inventors demonstrate that the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases, mild cognitive impairment, cognitive deficits, dementias, diseases associated with aging and / or pathological processes associated with age and progeria with the analogues of Xanthocycins described in the present invention, takes place, at least partially, by neuroprotection, in particular by direct inhibition of neuronal death, that is, by inhibiting the death of neuronal cells of the nervous system. Therefore, this mechanism of action would take place without the involvement of the immune system.
  • neurodegenerative diseases are selected from Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, Huntingon's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Alexander's disease, cognitive and / or psychomotor deficits, ataxias, dementias, cerebrovascular diseases, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis (MS), as well as diseases associated with aging, pathological processes associated with age and progeria.
  • said neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
  • the compounds of formula (I) may be in the form of salts, preferably pharmaceutically acceptable salts, in the form of solvates, preferably pharmaceutically acceptable solvates, or in the form of prodrugs.
  • Said pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs of the compound of formula (I), when administered to the recipient, can provide (directly or indirectly) a compound of formula (I) such as that described herein.
  • Pharmaceutically acceptable salts are also within the scope of the invention because they can be useful for preparing pharmaceutically acceptable salts.
  • salts and solvates can be carried out by methods known in the art.
  • pharmaceutically acceptable salts of compounds provided herein are synthesized from the original compound, which contains one or more basic moieties, by conventional chemical methods.
  • such salts are prepared, for example, by reacting the free base forms of these compounds with the appropriate base or acid in water or in an organic solvent or in a mixture of the two.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include inorganic acid addition salts such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iodhydrate, sulfate, nitrate, phosphate, etc., and addition salts of organic acid such as, for example, acetate, maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, etc.
  • inorganic acid addition salts such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iodhydrate, sulfate, nitrate, phosphate, etc.
  • organic acid such as, for example, acetate, maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, etc.
  • a preferred pharmaceutically acceptable form is the crystalline form, including such form in a pharmaceutical composition.
  • the additional solvent and ionic residues must also be non-toxic.
  • the compounds of the invention can have different polymorphic forms, it is intended that the invention encompasses all these forms.
  • any compound that is a prodrug of a compound of formula (I) is within the scope of the invention.
  • the compounds of the invention are also intended to include compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms.
  • compounds having the present structures, except for the substitution of a hydrogen for a deuterium or tritium, or the substitution of a carbon for a carbon enriched in 13 C or in 14 C or a nitrogen enriched in 15 N are found within the scope of this invention.
  • the compounds of the present invention represented by the formula (I) described above may include isomers such as enantiomers or diastereoisomers depending on the presence of chiral centers.
  • the unique isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof are within the scope of the present invention.
  • the xanthocycline analogs of formula (I) may be formulated in a pharmaceutical composition, in a therapeutically effective amount, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients.
  • Said pharmaceutical composition may contain one or more analogs of xanthocycins of formula (I) or one or more other drugs, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients.
  • said pharmaceutical composition comprises only an xanthocycline derivative of formula (I).
  • Said pharmaceutical composition is useful for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • Pharmaceutical compositions comprising the xanthocycline analogs of formula (I) may be formulated in any pharmaceutical form of administration suitable for administration by the route of administration chosen.
  • the pharmaceutical compositions may be formulated in a solid pharmaceutical form for oral administration (eg, granules, tablets, capsules, etc.), in a liquid pharmaceutical form for oral administration (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.), in a pharmaceutical form for parenteral administration (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.).
  • a solid pharmaceutical form for oral administration eg, granules, tablets, capsules, etc.
  • a liquid pharmaceutical form for oral administration eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.
  • parenteral administration eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.
  • the pharmaceutically acceptable carriers and excipients appropriate for the chosen dosage form and route of administration will be chosen, for example, binders, diluents, disintegrants, lubricants, humectants, etc., for the formulation of forms solid administration pharmaceuticals, and buffers, surfactants, etc., for the formulation of liquid pharmaceutical dosage
  • Such vehicles and excipients must be pharmaceutically acceptable and pharmacologically tolerable and must be able to be combined with other components of the formulation without exerting any adverse effect on the treated subject.
  • Information on said vehicles and excipients, as well as on said pharmaceutical forms of administration of said active ingredient can be found in galenic pharmacy treaties.
  • a review of the different pharmaceutical forms of administering drugs, in general, and their methods of preparation can be found in the book "Tratado de Farmacia Galenica", C. Fauli i Trillo of, I Edition, 1993, Luzan 5, SA of Editions.
  • the pharmaceutical composition employed in the present invention comprises at least one xanthocycline analog of formula (I) in a therapeutically efficient amount.
  • therapeutically efficient amount refers to the amount of drug calculated to produce the desired effect.
  • the dose of drug to be administered to a subject may vary within a wide range depending on numerous factors, including the characteristics of the drug used, eg, its activity and biological half-life, the concentration of the drug in the pharmaceutical composition, the clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form of administration chosen, etc.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be administer one or more times a day for preventive or therapeutic purposes or with other administration guidelines, not necessarily daily but also on a timely, weekly basis, etc.
  • the present invention is directed to the use of a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug or solvate thereof, for the manufacture of a medicament aimed at the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases. .
  • the present invention relates to a method for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases, in a subject in need of treatment, which comprises administering to said subject a pharmaceutical composition comprising a therapeutically efficient amount of one or more compounds of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug and / or solvate thereof.
  • this method of prevention or treatment acts by neuroprotection, in particular by direct inhibition of neuronal death.
  • the pharmaceutical composition used for the prevention or treatment of said diseases can be used together with other drugs, for example, drugs useful in the treatment of neurodegenerative diseases, cognitive deficits, dementias or diseases associated with aging, with in order to increase the efficiency of the pharmaceutical composition, thereby generating a combination therapy.
  • additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided as a separate pharmaceutical composition for administration at the same time (simultaneous administration) as the pharmaceutical composition employed or at different times (sequential administration).
  • examples of additional drugs that may be part of the same therapy or pharmaceutical composition together with the xanthocycline analogs of formula (I) are: drugs for the treatment of Alzheimer's (tacrine, rivastigmine, memantine, donepezil, galantamine, statins %), from parkinson's (carbidopa, levodopa, bromocriptine, pramipexole, ropinirole, amantadine, rasagiline Among others, antipsychotics such as haloperidol, antidepressants such as amitriptyline, anxiolytics such as lorazepam, anti-inflammatories such as aspirin, dietary supplements such as vitamins E, C, B, folate or Ginkgo biloba extract or drugs against the rest of neurodegeneratives indicated in the patent.
  • the present invention is directed to a compound of formula (II) as previously defined, or to a pharmaceutically acceptable salt, prodrug or solvate thereof. They are excluded from this formula:
  • R 2 and R 4 are hydrogen and Ri and R 3 are independently selected from OH and methoxy.
  • Ri is selected from methyl, ethyl and ethoxy. In another particular embodiment, Ri is selected from alkyl, OH and O-alkyl, or Ri is bound to R 2 forming a -O-alkylene-O group.
  • R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from hydrogen, alkyl, OH and O-alkyl, or R 2 is linked to Ri forming a group - O-alkylene-O, and / or R 3 and R 4 are linked together forming an -O-alkylene-O group.
  • R 4 is in the meta position of the aromatic ring.
  • Ri is OH, O-alkyl, alkyl or form, together with R 2 , a -O-alkylene-O group. More preferably, Ri is OH, methoxy, ethoxy, ethyl, methyl or forms, together with R 2 , a -O-alkylene-O group.
  • R 2 is hydrogen, OH, alkyl or form, together with Ri, a group -O-alkylene-O. More preferably, R 2 is hydrogen, OH, ethyl, methyl or forms, together with Ri, a group -O-alkylene-O.
  • R 3 is OH, O-alkyl, alkyl or form, together with R 4 , a group -O-alkylene-O. More preferably, R 3 is OH, methoxy, ethoxy, ethyl, methyl or forms, together with R 4 , a -O-alkylene-O group. Also preferably, R 4 is hydrogen, OH, alkyl or form, together with R 3 , a -O-alkylene-O group. More preferably, R 4 is hydrogen, OH, ethyl, methyl or forms, together with R 3 , a group -O-alkylene-O.
  • the compound of formula (II) is selected from the following compounds:
  • the present invention is directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of formula (II), or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug or solvate thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • vehicle refers to a diluent, adjuvant or excipient with which the active substance is administered.
  • Such pharmaceutical vehicles may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like.
  • water or aqueous solutions of saline solution and aqueous solutions of dextrose and glycerol are used as vehicles, particularly for injectable solutions.
  • Suitable pharmaceutical vehicles are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by EW Martin, 1995.
  • the vehicles of the invention are approved by the regulatory agency of a state or federal government or are listed in the United States Pharmacopoeia or other pharmacopoeia recognized in general for use in animals, and more particularly in humans.
  • Examples of pharmaceutical compositions include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (solutions, suspensions or emulsions) for oral, topical or parenteral administration.
  • compositions containing compounds of the invention can be administered by encapsulation in liposomes or nanospheres, in sustained release formulations or by other usual means of administration.
  • the formulations can be prepared according to conventional methods such as those described in the Spanish, European or United States Pharmacopoeias, or in similar reference texts, for example "Galenic Pharmacy Treaty", by C. Faul ⁇ i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzán 5, SA of Editions.
  • the correct dosage of the compounds will vary according to the particular formulation, the mode of application, the site and the particular neurodegenerative disease being treated. Other factors such as age, body weight, sex, diet, administration time, excretion rate, drug combinations, reaction sensitivities and disease severity should also be taken into account. Administration may be carried out continuously or periodically within the maximum tolerated dose.
  • the compounds and compositions of this invention can be used with other drugs to provide a combination therapy.
  • the other drugs may be part of the same composition, or they may be provided as a separate composition for administration at the same time or at a different time.
  • a further aspect of the present invention is a compound of formula (II) as previously described for use in medicine.
  • Another additional aspect of the present invention is the use of a compound of formula (II) for the preparation of a medicament.
  • the present invention is directed to a process for the preparation of a compound of formula (II) from an extract produced by the Penicillium chrysogenum species.
  • said extract is produced by a strain of microorganism of the species Penicillium chrysogenum deposited in the CECT with the registration number 20783.
  • a sample is obtained from a marine sponge collected in the area of Cabo de Gata (Almer ⁇ a), from which a strain corresponding to the species Penicillium chrysogenum. Said strain makes it possible to obtain an extract from which, by fractionation and purification, the compounds of formula (II) are obtained, as described in examples 1 and 5 of the present application.
  • the compounds of formula (II) can be obtained synthetically by a process comprising:
  • R represents an alkyl group
  • aryl group includes the substituents Ri to R4 depending on the compound of formula (II) that is desired to be obtained.
  • Step a) of the route involves the transformation of an alkyl ester of the aryl propionic acid of formula (III) into its corresponding amide of formula (IV).
  • said reaction is carried out by treatment with ammonia.
  • the alkyl ester of aryl propionic acid is the methyl ester of aryl propionic acid.
  • Step b) of the synthetic route involves a hydrostannination, so that the triple bond of the compound of formula (IV) is reduced, incorporating an alkylstannan group.
  • this reaction is carried out in presence of an alkyltin hydride and is catalyzed by a palladium compound.
  • the alkyl tin hydride is tributyltin hydride and the catalyst is a complex of Pd and triphenylphosphine, in particular, Pd (PPh 3 ) 4 .
  • the Baumgarten oxidation reaction of step c. l) which leads to obtaining the protected carbamate of formula (VI) is carried out using an oxidizing agent, such as Pb (OAc) 4 , in the presence of a silanol, such as for example TMS (CH 2 ) 2 0H (2- Trimethylsilanyl ethanol).
  • an oxidizing agent such as Pb (OAc) 4
  • OAc oxidizing agent
  • silanol such as for example TMS (CH 2 ) 2 0H (2- Trimethylsilanyl ethanol.
  • the homoacoupling reaction d. l) is performed using a copper catalyst, for example CuCl 2 and air.
  • the stage e. l) of the synthetic route is carried out in two phases, a first one in which formamido groups are incorporated by a formylation reaction in the presence of a strong base and a second one in which the carbamate group protective groups are removed.
  • the mentioned incorporation of the formamido groups is carried out with a formic acetic anhydride after treatment with a strong base such as lithium hexamethyldisylilazanide (commonly known as LiHMDS).
  • LiHMDS lithium hexamethyldisylilazanide
  • l can be carried out using a quaternary ammonium fluoride, in particular tetra - "- butylammonium fluoride, either in the form of a trihydrate or dissolved in THF, since it is a salt commonly used to remove silyl ether protecting groups .
  • a quaternary ammonium fluoride in particular tetra - "- butylammonium fluoride, either in the form of a trihydrate or dissolved in THF, since it is a salt commonly used to remove silyl ether protecting groups .
  • step c.2 corresponds to step c. 1) and, therefore, is carried out with an oxidizing agent in the presence of a silanol, as mentioned for step c. l).
  • Step d.2) of the synthetic route is carried out in two phases, a first in which a formamido group is incorporated by a formylation reaction after treatment with a strong base and a second in which the protective group is removed of the carbamate group.
  • the mentioned incorporation of the formamido group is carried out with a formic acetic anhydride after treatment with a strong base such as lithium hexamethyldisylilazanide (commonly known as LiHMDS).
  • the carbamate group deprotection phase can lead to made using a quaternary ammonium fluoride, in particular, tetra - "- butylammonium fluoride, either in its trihydrate form or dissolved in THF, since it is a salt commonly used to remove silyl ether protecting groups.
  • a quaternary ammonium fluoride in particular, tetra - "- butylammonium fluoride, either in its trihydrate form or dissolved in THF, since it is a salt commonly used to remove silyl ether protecting groups.
  • the homocoupling reaction e.2) is also carried out using a copper catalyst, for example CuCl 2 and air, as described for step d. l).
  • reaction d.3) of transformation of the carbamate of formula (VI) into the formamide of formula (IX) is carried out in the presence of a reducing agent.
  • said reducing agent is a lithium borohydride, preferably lithium triethyl borohydride.
  • the homoacoupling reaction e.3) is also carried out using a copper catalyst, for example CuCl 2 and air, as described for step d.1) and e.2).
  • a copper catalyst for example CuCl 2 and air, as described for step d.1) and e.2).
  • This type of synthetic route allows obtaining the compounds in which the substituents Ri and R 3 and R 2 and P of each aromatic ring are the same.
  • a method such as that described in Tetrahedron Letters, 2005, 46, 5017-5020 can be followed.
  • a final aspect of the invention refers to a strain of microorganism of the Penicillium chrysogenum species deposited in the CECT with the registration number 20783.
  • Said strain was obtained from a sea sponge, as described in example 1 of this document.
  • the strain was identified by PCR and sequencing technique as described in example 4 of this document, as well as by microscopic and macroscopic observation. From said strain, it is possible to obtain an extract from which the compounds employed in the present invention are isolated as previously described and as shown in Examples 1 and 5 of this document.
  • Sample M082-08 was isolated from a sea sponge taken in Cabo de Gata (Almer ⁇ a) ( Figure 1). To process the sample, a piece of the sponge was extracted with the help of sterile tweezers and scissors and several washings were carried out with Artificial Marine Water (ASW), whose composition in g / L is: KBr 0.1; NaCl 23.48; MgC12 » 6H20 10.61; KC12 » 2H20 1.47; KC1 0.66; SrC12 » 6H20 0.04; Na2S04 3.92; NaHC03 0.19; H3B03 0.03; autoclaved (Presoclave II 75 L, from JP Selecta) at 121 ° C for 20 minutes.
  • ASW Artificial Marine Water
  • strain 0882 08 was isolated as a pure culture with the help of a sterile planting handle, inoculating it in a 90 mm petri dish with 30 ml of PDA-marine medium after which it is incubated in an oven at 28 ° C ( Figure 2). Once the pure culture was obtained, it was grown in medium inclined agar tubes
  • Power whose composition in g / L is: sucrose 15; bacteriological peptone 2,5; lactose 2.5; corn maceration solids 0.5; NaCl 2; NaN03 1; KC1 26.1;
  • a spore suspension was prepared with the following procedure: 5 ml of sterile 40% (w / v) glycerol are added to each tube and 10-15 glass beads of 5 mm in diameter The culture is stirred until a homogeneous suspension is achieved and with it the cryovials that are stored at -80 ° C are generated in a freezer (905 -86C ULT Freezer, Thermo Scientific).
  • the culture preparation for obtaining the natural extract was carried out by inoculating a 13 ml polypropylene tube with 3 ml of inclined agar of solid YES medium, whose composition in g / L was: sucrose 150; yeast extract 20; MgSO4 » 7H20 0.5; agar 10; with 0.05 ml of the spore suspension stored at -80 ° C.
  • the incubation of the tube was carried out in an oven at 28 ° C for 14 days. After that time, 3 mL of ethyl acetate was added to the culture, after which it was vigorously stirred with a vortex for a few seconds.
  • the crude extract obtained was resuspended in 800 ⁇ of DMSO for testing on the model of cell death due to oxidative stress.
  • This test is performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from "American Type Culture Collection (ATCC, Cod. HTB-10 TM)", following strict sterility standards and handling in class biological safety cabins II that They follow the European standard EN 12469.
  • the cells were kept in MEM medium (Minimun Essential Medium Eagle (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% bovine serum on these cells, the inhibition produced by the cell death extract caused by treatment with xanthine / xanthine oxidase (XXO) that causes oxidative damage (production of free radicals such as hydrogen peroxide, superoxide anion) was analyzed.
  • MEM medium Minimun Essential Medium Eagle (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% bovine serum on these cells
  • MEM medium Minimun Essential Medium Eagle (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine,
  • WST-1 (Roche) was added, following the manufacturer's specifications.
  • the WST-1 test is based on the measurement of metabolic activity so that cells that are metabolically active (live) reduce the tetrazolium salt of WST-1 to formazan by the mitochondrial respiratory chain succinate-tetrazolium reductase system .
  • the formazan produced is detected colorimetrically.
  • the results obtained are shown in Figure 3, as the percentage of cell death for each dilution referred to the death produced by the XXO.
  • the inventors decided to evaluate the antioxidant capacity in vitro of the extract, for which the TEAC test (absorbance capacity by electron transfer) was used.
  • This method is based on the formation of the radical ferryl myoglobin produced by the reaction of metmyoglobin with hydrogen peroxide, followed by oxidation of ABTS reagent [I 2,2' -azino- bis (3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic] by ferril-myoglobin, which produces the cation radical ABTS * +, which can be determined colorimetrically.
  • the compounds with antioxidant capacity suppress the production of the radical in a concentration-dependent manner.
  • trolox water-soluble vitamin E analogue
  • OECD guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline: Fish Embryo Toxicity (FET) Test ".
  • This test is an alternative method to the acute toxicity test with juvenile and adult fish (OECD Test Guideline 203).
  • LC50 Concentration of the test sample that causes the mortality of 50% of the animals.
  • NOEC Higher concentration that does not cause mortality.
  • LOEC Lower concentration that produces 100% mortality.
  • the test methodology was based on the use of a series of concentrations of the compound to be evaluated as well as an appropriate control. The following toxicological parameters were determined in this study.
  • Lethal parameters i) determination of the number of coagulated eggs; ii) tail detachment; iii) heart rate (presence or absence); iv) formation of the somites (longitudinal series of the mesoderm that by delamination, fusion and migration become the axial skeleton, the dermis and the dorsal muscles and the wall of the body and the extremities).
  • the following sublethal parameters were also studied: i) spontaneous movements; ii) pigmentation; iii) formation of edemas; iv) clot formation.
  • EXAMPLE 4 Identification and escalation of strain 0882 08 4.1.
  • Strain identification was performed using a PCR that amplifies 560 bp of the 28S gene.
  • the PCR mixture carries the following components: PCR buffer, 1.5 mM MgC12, 0.2 mM dNTP mixture, 0.4 ⁇ oligonucleotides (NL1: 5'-gca tat caá taa gcg gag gaa aag-3 '(SEQ ID No: 1) and NL4: 5'-ggt ccg tgt ttc aag acg-3 '(SEQ ID No: 2)), DNA Polymerase PFU (Bioneer) 1 U, DNA extracted from the strain with the Wizard SV Genomic DNA Purification System kit (Promega ) at 1: 50 final dilution.
  • the PCR program consisted of: denaturation in 1 cycle of 96 ° C for 5 min; amplification in 30 cycles with three temperature ramps: 94 ° C for 30 sec, 60 ° C for 40 sec and 72 ° C for 1 min; elongation in 1 cycle of 72 ° C for 10 min.
  • the characteristics used in the classification were: microscopic observation, growth data, colony morphology and teleomorphic state formation, if any.
  • the results of microscopic observation showed fruiting bodies (brushes) of the genus Penicillium. Conidiophores with three branching points (terverticillates) characteristic of the subgenus Penicillium. Stipe with smooth wall. Ampuliform phialides. Spherical to ellipsoidal conidia, smooth.
  • the characteristics studied in the macroscopic observation were: size, texture and color of the colonies, production of exudate and diffusible pigment and observation of the reverse.
  • the results are the following:
  • the molecular level identification was then carried out by the following molecular methods: a) Amplification and sequencing of the ribosomal DNA zone that comprises the ITS 1 and ITS2 intergenic spaces and that includes the 5.8S rDNA gene. b) Amplification and subsequent partial sequencing of the B-Tubulin gene (with two-way readings), with primers Bt2a and Bt2b (Glas & Donaldson, Appl Environ Microb 1995; 61: 1323-30).
  • the amplification products were 495 and 477 base pairs respectively.
  • 100% similarity was obtained for the ITS-5.8S rDNA zone and 99% for the ⁇ -Tubulin gene with the Penicillium chrysogenum species, CBS strain 306.48.
  • cultures were prepared to obtain the natural extract by inoculating with 1.2 ml of spore suspension per plate 25 plates of 14 cm in diameter containing 80 ml of YES medium, whose composition in g / L is: sucrose 150 ; yeast extract 20; MgSO4 » 7H20 0.5; agar 10; and incubating said plates at 28 ° C for 14 days.
  • the culture was extracted by crushing with the help of a blender so that it was completely homogeneous, then 2300 mL of ethyl acetate was added and kept under stirring for 6 hours with the help of a stirrer. After this time the supernatant was collected and filtered through a paper funnel. The extraction was repeated by adding 1900 mL of ethyl acetate and kept under stirring for another 4 hours. The supernatant was collected next to the previous one. All this was evaporated to dryness by a rotary evaporator, resulting in 3.3 g of the dried crude extract.
  • Fractionation and purification Extract 08 055 C08 was analyzed by analytical HPLC (Agilent 1 100-DAD, Column Zorbax RX-C8 5 ⁇ 4.6X250 mm) with 5-100% acetonitrile / water for 40 min and it was observed that the extract contained metabolites In all polarity ranges, a generic low pressure fractionation by wide-range adsorption / resorption resin (SP207ss) was performed on a Combiflash® automated chromatograph.
  • SP207ss wide-range adsorption / resorption resin
  • the fractionation was scaled, using preparative HPLC, of the positive fractions with a gradient of 2 to 20% acetonitrile / water with a Zorbax SB-C8 7 ⁇ 21.2 x 250 mm column with a flow of 20 mL / min and detection at 210 and 280 nm.
  • the preparative HPLC fractions were tested to find out which peak or peaks of the chromatography exhibited protective death activity.
  • ESI-TOF mass spectrum
  • Figure 11 the presence in the mass spectrum of ammonium adducts (m / z 358.1365), sodium (m / z 363.0935) and potassium (m / z 379.0676) corroborate the proposed molecular formula.
  • the molecule therefore seems to have the same chemical nature as the compound G28, including an additional oxygen atom in its structure.
  • Compound G27 obtained in the bioassay chromatography of extract 08 055 C08, therefore has the structure of (lZ, 3Z) -l- (3,4-dihydroxyphenyl) -4- (4-hydroxyphenyl) -2, 3- diformamide-1, 3-butadiene.
  • the bibliographic search of the structure also confirmed that it is a new natural product.
  • EXAMPLE 6 Protective effect of peaks G27 (or compound NPS0155) and G28 (NPS0156) on neuronal death induced by oxidative stress
  • the researchers decided to analyze the neuroprotective effect of the compounds PS0155 and PS0156.
  • the assays were performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture, maintained as detailed in Example 2.
  • the inhibition produced by both compounds of cell death caused by xanthine / xanthine oxidase treatment was analyzed in real time. which produces oxidative damage (generating free radicals such as hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical) which triggers cell death.
  • oxidative damage generating free radicals such as hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical
  • These cells in pass not exceeding 15, were seeded on plates of 16 specific wells for real-time testing with the RTCA system (Real-Time Cell Analyzer, XCelligence, Roche) with a cell concentration of 5x104 cells / well.
  • cell treatments were carried out for the control conditions (culture medium); XXO (xanthine 10 ⁇ 7 xanthine oxidase 60 mU / mL); XXO plus G27 or G28 at 10, 40, 100, 400, 1000 or 4000 ng / ml.
  • the cells were incubated (at 37 ° C and 5% C02) with these treatments for 72 h, collecting readings every 10 minutes.
  • the values obtained are arbitrary units indicated by the cellular index, calculated from the impedance values, which is a magnitude that establishes the relationship between the voltage and the current intensity of the adhered cells and that is used as a measure of cell viability.
  • the results obtained for compound PS0155 are shown in Figure 15 as the normalized cell index (A) of each condition analyzed throughout the treatment and as a percentage of cell death (B) for each treatment referred to the death produced by the XXO at 20 h post-treatment. Death protection was observed in the range of 100 to 400 ng / ml of PS0155, the maximum being 27% at 100 ng / ml, so this compound shows a protective effect of the death of human cells of neuronal origin caused Oxidative stress
  • the results obtained for compound PS0156 are shown in Figure 16 as the normalized cell index (A) of each condition analyzed throughout the treatment and as a percentage of cell death (B) for each treatment referred to the death produced by the XXO at 20 h post-treatment. Death protection was observed in the range of 10 to 1,000 ng / ml of PS0156, the maximum being 69% at 100 ng / ml, so this compound shows a protective effect of the death of human cells of neuronal origin caused Oxid
  • EXAMPLE 7 Antioxidant effect of compounds NPS0155 (G27) and NPS0156 (G2S) Based on the above results, the researchers decided to analyze the antioxidant capacity in vitro of compounds PS0155 and PS0156 using the TEAC test, described in Example 2. To To quantify the antioxidant capacity, a standard curve with increasing concentrations of trolox (water-soluble analogue of vitamin E) was used, so that the results are indicated as a measure of trolox equivalents (TE). The PS0155 test gave a result of 81 ⁇ 19 ⁇ 19 TE ⁇ g compound, indicating that this compound shows antioxidant capacity in vitro. The PS0156 test gave a result of 104 ⁇ 29 ⁇ TE ⁇ g compound, indicating that this compound shows antioxidant capacity in vitro. EXAMPLE 8. Antiapoptotic effect of compounds NPS0155 and NPS0156 in cells with wild and mutated APP
  • the researchers decided to analyze the antiapoptotic effect of the compounds PS0155 and PS0156.
  • the assays were performed on two cell lines in SK-N-MC human neuroblastoma culture stably transfected with constructs expressing the amyloid precursor protein (APP) gene encoding the mostly expressed isoform in the brain of 695 amino acids , cloned into the pcDNA3.1 expression vector (Invitrogen).
  • APP amyloid precursor protein
  • One of the lines expresses the wild APP gene (APPwt) and the other expresses the APP gene with the Swedish mutation (APPswe) which is a double mutation in exon 16 of the gene and produces a transversion from G to T resulting in the change of amino acid Lys595Asn and another transversion from A to C that produces the Met596Leu change, said mutation being related to Alzheimer's disease in its senile or hereditary form.
  • the cells were maintained as the SK-N-MC parental cells, as detailed in Example 2, using geneticin at 400 ⁇ g / ml as a selection antibiotic.
  • DNA fragmentation was analyzed by flow cytometry, produced by treatment with camptothecin (CPT) that inhibits topoisomerase I enzyme, which prevents DNA duplication and triggers apoptotic cell death.
  • CPT camptothecin
  • the two cell lines in pass not exceeding 10, were seeded on 12 well plates treated for adherent cells with a cell concentration of 4x105 cells / well. After 24 h of incubation of the cells at 37 ° C and 5% C02, the cells were pre-treated with 4 and 10 ⁇ g / mL of NPS0155 or NPS0156 for 24 h; subsequently treated with 50 ⁇ 50 CPT for 6 h.
  • the cells were collected together with their culture medium and centrifuged at 300xg for 5 min. The medium was removed, washing with PBS was performed and fixed for 2 minutes with 500 ⁇ ⁇ of 70% ethanol at -20 ° C. Once fixed, they were centrifuged at 400xg for 5 min, washed with PBS and propidium iodide added to 0.05 mg / mL, diluted in a cycle buffer (0.1% sodium citrate, Nonidet P-40 0.3% and RNAse 0.02 mg / mL) and incubated 1 hour at 37 ° C. 18 ha were maintained 4 ° C and, after this time, were analyzed by flow cytometry, comparing the fluorescence of propidium iodide against the amount of DNA.
  • a cycle buffer (0.1% sodium citrate, Nonidet P-40 0.3% and RNAse 0.02 mg / mL
  • this example shows that compounds PS0155 and PS0156 have a protective effect of apoptosis in human cells of neuronal origin that express wild and mutated APP.
  • the carbamate (4) is obtained, which has the appropriate stereochemistry to give the product (5) a homologous reaction catalyzed by palladium.
  • This product has the skeleton corresponding to the type of analog of interest. The last two reactions are intended to protect the carbamates and introduce the formamide groups.
  • route 3 ⁇ 4 ⁇ 5 ⁇ 6 it can be passed from 3 to isocyanate 7 by oxidation of Baumgarten (without being trapped with silanol), transform 7 into formamide 8 and then perform homocoupling to give 6 (route 3 ⁇ 7 ⁇ 8 ⁇ 6) or also, convert carbamate 4 into formamide 8 and then perform homoacoupling to give 6 (route 3 ⁇ 4 ⁇ 8 ⁇ 6).
  • methoxyphenyl 1 or 2 radicals (C, D and E) (eg, 4-methoxyphenyl)
  • alkoxyhydroxyphenyl 1 or 2 radicals (L, M or N) (eg, 3-hydroxy-4-methoxyphenyl or 3- hydroxy-4-ethoxyphenyl) • ethoxyphenyl: 1 or 2 radicals (O and P) (eg, 4-ethoxyphenyl)
  • the lipophilicity was determined by the value of the CLOGP, defined as the log P of a compound, which is the partition coefficient between n-octanol and water, log (coctanol / cagua).
  • Theoretical lipophilicity is essential to predict the passage of blood brain barrier (BHE) by passive diffusion, said step being greater as the value of CLOGP is higher.
  • BHE blood brain barrier
  • the results of the CLOGP values are presented in Figure 23, and were calculated from the online application Osiris Property Explorer (http: //www.organicchemistry.org/prog/peo/).
  • Osiris Property Explorer http: //www.organicchemistry.org/prog/peo/
  • the mentioned compound is obtained in quantitative yield (pale yellow solid), after 2 h of reaction at 0 ° C, using 4- methylbenzaldehyde (3.05 g, 25.37 mmol), PPh 3 (29, 94 g, 1,14, 16 mmol) and CBr 4 (20, 19 g, 60.89 mmol) as starting substances.
  • the mentioned compound is obtained in 89% yield (pale yellow oil), using l- (2,2-dibromovinyl) -4-methylbenzene (6.93 g, 25.11 mmol), n-BuLi (24 mL, 2.5 M in hexanes; 60.27 mmol) and ClC0 2 Me (2.70 mL, 35, 15 mmol), as starting substances.
  • the mentioned compound is obtained in 82% yield (yellow solid), using l- (2,2-dibromovinyl) -4-ethoxybenzene (7.50 g, 24., 0 mmol), n-BuLi (19.6 mL, 2.5 M in hexanes; 49.01 mmol) and ClC0 2 Me (2.66 mL, 34.30 mmol), as starting substances.
  • the mentioned compound is obtained in 54% yield (yellow oil), after 2 h of reaction at 0 ° C, using 3 - (3, 4-dimethylphenyl) prop-2-inamide (4.10 g , 28.23 mmol), Bu 3 SnH (9.00 mL, 33.88 mmol) and Pd (PPh 3 ) 4 (0.65 g, 0.56 mmol) as starting substances.
  • EXAMPLE 10 Protective effect of cell death of analogs NPS0158 (G + G), NPS0159 (F + F), NPS0160 (P + P) and NPS0161 (H + H).
  • the assays were performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture, maintained as detailed in Example 2. Inhibition produced by cell death compounds caused by treatment with xanthine / xanthine oxidase (XXO) that produces oxidative damage was analyzed in real time, which triggers cell death.
  • the test was performed following the same procedure as described in example 6, testing the analogs at 40, 100, 400 or 1000 ng / ml in the presence of XXO.
  • the cells were incubated (at 37 ° C and 5% C0 2 ) with these treatments for 72 h, collecting readings every 10 minutes. The values obtained are arbitrary units indicated by the cellular index, calculated from the impedance values and used as a measure of cell viability.
  • Figures 25-28 The results obtained for the analogs are shown in Figures 25-28 as the normalized cell index (A) of each condition analyzed throughout the treatment; and as a percentage of cell death (B) for each treatment referred to the death produced by the XXO at 20 h post-treatment.
  • Figures 25, 26, 27 and 28 correspond respectively to the results of analogs PS0158 (G + G), PS0159 (F + F), PS0160 (P + P) and PS0161 (H + H). * Is indicated for the significant difference with respect to XXO treatment according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • EXAMPLE 11 Antioxidant effect of analogs NPS0158 (G + G), NPS0159 (F + F), NPS0160 (P + P) and NPS0161 (H + H) in in vitro and cellular models.
  • ROS reactive oxygen species
  • the ROS measurement test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture, maintained as detailed in Example 2, subjected to aggression with xanthine / xanthine oxidase (XXO).
  • the measurement of ROS is performed by adding a permeable non-fluorescent probe in living cells (2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, H 2 DCFDA; Biotium) which is oxidized by the action of ROS, generating 2', 7 ' -dichlorofluorescein (DCF) that can be detected in a fluorimeter at 485 nm excitation and 538 nm emission. Fluorescence results were normalized by cell viability, measured by lactate dehydrogenase (LDH) activity, using Roche's Cytotoxicity Detection Kit (LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • EXAMPLE 13 Passive permeability of analogs NPS0158 (G + G) and NPS0161 (H + H): prediction of theoretical and in vitro blood brain barrier passage.
  • BHE blood brain barrier
  • lipids derived from pig brain were used, with a phospholipid composition very similar to that which constitutes human BHE, and which is called PBL (Porcine Polar Brain Lipid, Avanti Polar Lipids Inc) which is Prepares on plates with MAIPNTR10 filter (Millipore), with a PVDF membrane and pore size of 45 ⁇ .
  • PBL Porcine Polar Brain Lipid, Avanti Polar Lipids Inc
  • MAIPNTR10 filter Micropore
  • V D donor volume (cm 3 )
  • A filter area (cm 2 )

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención se dirige a análogos formilados de xantocilinas para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, a algunos de dichos análogos, así como a procedimientos para su obtención y composiciones farmacéuticas que los comprenden. La invención también se dirige a una cepa de microorganismo de la especie Penicillium chrysogenum a partir de la cual se pueden obtener dichos análogos.

Description

ANÁLOGOS FORMILADOS DE XANTOCILINAS COMO
NEUROPROTECTORES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la utilización de análogos formilados de las xantocilinas y de sus derivados para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias y en especial de la enfermedad de Alzheimer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más común. De acuerdo con la OMS en el año 2006 el número de personas afectadas por demencia ascendía a 37 millones en el mundo, de los cuales 18 millones eran enfermos de Alzheimer. En este sentido se espera que el número de pacientes se doble en los próximos 25 años, alcanzando los 34 millones en 2025. Sólo en España se estima que más de medio millón de personas sufren actualmente la EA (Mount&Downtown, Nat Med 2006; 12[7]: 780- 4)·
Los costes asociados a esta enfermedad son proporcionalmente altos. En 2005, los costes sanitarios de la enfermedad de Alzheimer y de otras demencias en los 27 países que forman la Unión Europea se estimaba en 130.000 millones de euros, unos 21.000 euros por paciente y año. Se calcula que el coste total derivado del cuidado de los enfermos de Alzheimer en Estados Unidos durante 2005 fue de 91.000 millones de dólares, detectándose un aumento en el gasto médico asociado a la enfermedad que ha superado los 160.000 millones de dólares en 2010 (Mount&Downtown, Nat Med 2006; 12[7]: 780-4). Por las razones anteriores, la EA y las enfermedades asociadas con el envejecimiento como los déficits cognitivos o las demencias, se han convertido en un problema de primer orden en todo el mundo. Sin embargo, no existen fármacos eficientes que prevengan o impidan las enfermedades neurodegenerativas (EN), con lo que la búsqueda y validación de nuevos compuestos neuroprotectores que eviten el daño neuronal se ha convertido en una necesidad, especialmente teniendo en cuenta que los mecanismos patofisiológicos de las mismas aún están por dilucidar. Las patologías neurodegenerativas son consecuencia de la muerte neuronal y de la consecuente desaparición de masa cerebral, consecuencia de la ausencia de neuronas en zonas específicas del cerebro. Por este motivo, una de las estrategias válidas para el tratamiento y/o prevención de las EN es la búsqueda de fármacos que impidan la muerte neuronal, es decir, que sean neuroprotectores. Sin embargo, los fármacos utilizados hasta el momento para la EA han resultado ser sintomáticos, no evitando la progresión o la aparición de la enfermedad. Hasta el momento existen dos tipos de fármacos en el mercado: los inhibidores de acetilcolinesterasa (AChE) y la memantina, un inhibidor del receptor glutamatérgico de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico). Las opciones terapéuticas actuales frente a la EA se basan en la inhibición de la acetilcolinesterasa con fármacos como el donepezilo, la galantamina o la rivastigmina, o en la capacidad de la memantina en antagonizar el receptor de NMDA. No obstante, se ha demostrado que el uso de rivastigmina no detiene o enlentece la progresión del daño cognitivo leve (DCL) o de la EA (Feldman et al. Lancet Neurol 2007; 6[6]: 501-12), mientras que el uso del donepezilo sólo muestra beneficios discretos a corto plazo, pero con el inconveniente de presentar efectos secundarios significativos (Birks and Flicker, Cochrane Datábase Syst Rev 2006; 3 : CD006104). De acuerdo con la Asociación de Alzheimer americana, la llegada de fármacos que retrasaran solamente 5 años el inicio de la enfermedad reportaría un ahorro de unos 50.000 millones de dólares solamente en los Estados Unidos. En este sentido, la utilización de estrategias preventivas, como la intervención en los procesos de deterioro cognitivo leve (DCL) o MCI (del inglés Mild Cognitive Impairment), resultarían ser una alternativa válida.
El MCI, también conocido como demencia incipiente o deterioro aislado de memoria, es una de las etapas previas asociadas a la EA y a otras demencias. El MCI está reconocido como un factor de riesgo de la EA, y afecta a unos 30 millones de personas en todo el mundo, y se considera como un paso previo a la EA, donde entre el 10 y el 15% de los individuos con MCI progresan a EA cada año (Grundman et al. Arch. Neurol 2004; 61 [1]: 59-66). A pesar de la significativa prevalencia del MCI y del alto riesgo de los pacientes a progresar a demencias, no existe en la actualidad ningún tratamiento o terapia para esta entidad clínica, con lo que se recomienda el uso de antioxidantes o fármacos contra la EA para el tratamiento del MCI. Así pues, en la actualidad no existen fármacos para el tratamiento del MCI, y los actuales fármacos contra la EA ofrecen pocos beneficios a los pacientes, los cuales retrasan temporalmente (en el mejor de los casos un año), algunos síntomas de la dolencia, pero no evitan su evolución. Debido al poco éxito de los fármacos frente a las EN se han abierto nuevas líneas de investigación. De entre ellas cabe destacar las estrategias de búsquedas de nuevas entidades químicas (NCE, del inglés New Chemical Entities) a partir de biodiversidad natural. De hecho, la búsqueda de compuestos bioactivos frente a diferentes patologías es una de las materias centrales de la química de productos naturales. Recientemente se han comenzado a aplicar estrategias de búsqueda masiva de compuestos y extractos a partir de diferentes fuentes biológicas, entre las que se encuentran los microorganismos. De este modo, la búsqueda de biomoléculas activas requiere el aislamiento y cultivo de los microorganismos productores de compuestos a partir de diferentes ambientes. De hecho, de los 250.000 metabolitos bioactivos que se calcula que existen, más de 20.000 son producidos por microrganismos. Los hongos filamentosos, bacterias unicelulares y los actinomicetos son los grupos más prolíficos a la hora de producir este tipo de compuestos. Sólo, aproximadamente, un 1% de estos compuestos, unos 160, son utilizados directamente en medicina humana, animal y en agricultura. Este ratio (un 0,2- 0,3%) es, sin embargo, muy superior al alcanzado por la industria farmacéutica mediante nuevas entidades químicas obtenidas por síntesis (0,001%). Sólo entre los años 2005 y 2007, un 19% de los fármacos lanzados al mercado fueron productos naturales o derivados de productos naturales. La variedad química de estos metabolitos es enorme ya que depende del microorganismo, de la composición del medio de cultivo y de las condiciones en las que se realice el mismo. En este sentido, se han descrito análogos formilados de xantocilina con un único sustituyente en cada anillo aromático obtenidos por fermentación mixta de A. fumigatus con S. peucetis (Zuck et al, J. Nat. Prod. 2011, 74, 1653-1657), los cuales han demostrado actividad antitumoral utilizando el panel de las 60 líneas celulares NCI-60. Dos de estos compuestos mostraron actividad frente a algunas líneas celulares (de cáncer de pulmón, sistema nervioso central, melanoma, ovárico, renal y leucemia), mientras que el resto de compuestos resultaron inactivos. Se evaluó la actividad de uno de los dos compuestos frente a Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Burkholderia thailandesis y Fusarium pallidoroseum, pero no mostró actividad en dichos ensayos.
También se ha demostrado que el análogo formilado de xantocilina aislado de Cordyceps brunnearubra BCC 1395, así como los compuestos hexametilados y hexaacetilados obtenidos por metilación y acetilación, muestran actividad frente al parásito de la malaria Plasmodium falciparum, citotoxicidad frente a células de cáncer de mama, mientras que carece de actividad frente a carcinoma epidermoide humano oral y células de cáncer de pulmón y células Vero no cancerosas (Isaka et al, J. Nat. Prod. 2007, 70, 656-658). No obstante, no se ha demostrado para ninguno de estos compuestos aislados de los microorganismos mencionados actividad neuroprotectora.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han identificado una serie de compuestos que corresponden con análogos formilados de xantocilinas, obtenidos a partir de un extracto producido por una cepa de la especie Penicillium chrysogenum, los cuales han demostrado un sorprendente efecto neuroprotector frente a la muerte neuronal causada por daño oxidativo, lo que les confiere unas magníficas propiedades como compuestos neuroprotectores. Además, el análisis de la capacidad antioxidante in vitro de estos compuestos ha demostrado de forma sorprendente que estos compuestos son antioxidantes.
Asimismo, se ha demostrado que estos compuestos protegen de la apoptosis causada por las modificaciones de la proteína precursora del amiloide (APP) en dos modelos celulares que portan las variantes salvaje y mutante sueca de dicha proteína, la cual está relacionada con la enfermedad de Alzheimer.
Los resultados experimentales obtenidos ponen de manifiesto el potencial empleo de los análogos formilados de xantocilinas en la prevención y/o tratamiento de la muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias, enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos patológicos asociados a la edad y progeria. Los resultados obtenidos pueden ser extrapolados con fines profilácticos o terapéuticos para su aplicación sobre la población de riesgo.
Así, un primer aspecto de la presente invención lo constituye un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000006_0001
donde:
Ri se selecciona entre alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, H-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, H2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, o Ri y R2 y/o R3 y R4 forman un grupo -O-alquilen-O-, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En un segundo aspecto, la invención se dirige a compuestos de fórmula (II):
Figure imgf000006_0002
Ri se selecciona de alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, o Ri y R2 y/o R3 y R4 forman un grupo -O-alquilen-O-, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, con la condición de que la fórmula (II) no incluye:
- el compuesto en el que R1-R4 son OH y R4 está en posición meta del anillo aromático;
- el compuesto en el que R1-R4 son OCH3 y el sustituyente R4 está en posición meta del anillo aromático;
- los compuestos en los que R2 y R4 son hidrógeno y Ri y R3 se seleccionan independientemente de OH y metoxi.
En un tercer aspecto, la invención se dirige a una formulación farmacéutica que comprenden un compuesto de fórmula (II) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención se dirige asimismo a un compuesto de fórmula (II) para su uso en medicina.
Adicionalmente, la invención está dirigida a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) a partir de un extracto producido por la especie Penicillium chrysogenum.
Asimismo, la invención se dirige a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) que comprende:
a) una reacción de condensación mediante la cual el éster del ácido aril propiónico, de fórmula (III), se transforma en su correspondiente amida de fórmula (IV):
Figure imgf000007_0001
III IV
donde R representa un grupo alquilo;
b) hacer reaccionar la amida de fórmula (IV) con un hidruro de alquilestaño para producir el estannano de fórmula (V):
Figure imgf000007_0002
IV V y,
a continuación, someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c. l) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000008_0001
V VI
donde SE significa un grupo protector;
d. l) someter el carbamato de fórmula (VI) a una reacción de homoacopl
Figure imgf000008_0002
VI
y
e. l) desproteger los grupos carbamato e introducir los grupos formamido para obtener el compuesto de fórmula (II) de la invención; someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.2) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000008_0003
VI d.2) desproteger los grupos carbamato e introducir los grupos formamido para obtener el compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000009_0001
VI VIII
y
e.2) someter la formamida de fórmula (VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención;
o
someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.3) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el isocianato de fórmula (IX):
Figure imgf000009_0002
V IX
d.3) convertir el isocianato de fórmula (IX) en la formamida de fórmula (VIII):
Figure imgf000009_0003
IX VIII
y
e.3) someter la formamida de fórmula (VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención;
donde el grupo arilo (Ar) incluye los sustituyentes ¾ a R4 en función del compuesto de fórmula (II) que se desee obtener. Finalmente, la invención se dirige a una cepa de microorganismo de la especie Penicillium chrysogenum depositada en el CECT con el número de registro CECT 20783.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es la fotografía de la muestra M082-08, que pertenece a una esponja marina tomada en Cabo de Gata (Almería).
La Figura 2 es la fotografía del aislado como cultivo puro de la muestra M082-08 inoculada sobre una placa petri con medio PD A-marino, la cepa de aislado se denominó 0882_08.
La Figura 3 es un diagrama de barras donde se refleja la protección de diferentes diluciones del extracto 08 055 C08 frente a la muerte celular causada por xantina 10 μΜ7 xantina oxidasa 60 mU/mL (XXO). La figura muestra el porcentaje de la muerte celular (tomando el 100% la producida por XXO) de los cultivos tratados con diluciones 1/100, 1/400, 1/1.000, 1/4.000 y 1/10.000 del extracto en presencia de XXO, representando las medias±SD de un experimento por triplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 4 es un listado de los parámetros letales, subletales, teratogénicos y toxicológicos observados a 48 horas post-tratamiento en los embriones de pez cebra expuestos al extracto 08_055 C08 a las diluciones 1/100, 1/200 y 1/400.
La Figura 5 es la secuenciación del fragmento obtenido por PCR del gen 28 S de la cepa 0882_08.
La Figura 6 es el cromatograma del análisis por FIPLC/MS de baja resolución de los compuestos con pesos moleculares de m/z 340 (correspondiente al pico G27) y m/z 324 (pico G28) obtenidos a partir del fraccionamiento del extracto 08 055 C08.
La Figura 7 es el espectro de masas (ESI-TOF) del pico G28 y que corresponde al compuesto PS0156.
La Figura 8 es el espectro de 1H RMN del pico G28 y que corresponde al compuesto PS0156.
La Figura 9 es el espectro de 13C RMN del pico G28 y que corresponde al compuesto NPS0156. La Figura 10 muestra los desplazamientos químicos de 1H (500 MHz) y 13C (125 MHz) para el compuesto PS0156 en DMSO-d6.
La Figura 11 es el espectro de masas (ESI-TOF) del pico G27 y que corresponde al compuesto PS0155.
La Figura 12 es el espectro de 1H RMN del pico G27 y que corresponde al compuesto PS0155.
La Figura 13 es un diagrama que muestra las correlaciones observadas en los espectros de COSY (rojo) y FIMBC (azul) para los protones aromáticos del sustituyente 3,4- dihidroxifenilo.
La Figura 14 muestra los desplazamientos químicos de 1H (500 MHz) y 13C (125 MHz) para el compuesto PS0155 en DMSO-d6.
La Figura 15 muestra en (A) el índice celular normalizado de las células de neuroblastoma humano SK-N-MC tratadas durante 24 h con XXO y varias concentraciones de PS0155 (de 10 a 4.000 ng/ml). La gráfica de dispersión XY muestra la medida a tiempo real de un ensayo representativo, en medidas por duplicado; y en (B) el porcentaje del índice celular normalizado referido a las células tratadas con XXO y con PS0155 a las concentraciones indicadas a 20 h post tratamiento. Los resultados son la media±SEM de dos ensayos realizados por duplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 16 muestra en (A) el índice celular normalizado de las células de neuroblastoma humano SK-N-MC tratadas durante 24 h con XXO y varias concentraciones de NPS0156 (de 10 a 4.000 ng/ml). La gráfica de dispersión XY muestra la medida a tiempo real de un ensayo representativo, en medidas por duplicado; y en (B) el porcentaje del índice celular normalizado referido a las células tratadas con XXO y con NPS0156 a las concentraciones indicadas a 20 h post tratamiento. Los resultados son la media±SEM de dos ensayos realizados por duplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 17 muestra en (A) el análisis por citometría de flujo de la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA, para las células portadoras de la variante salvaje del APP (APPwt) tratadas con camptotecina (CPT) 50 μΜ durante 6 h y para el pre-tratamiento durante 24 h con NPS0155 a 4 y 10 μg/ml seguido del tratamiento con CPT (el porcentaje de apoptosis indicado se mide sobre la región sub- Gl de cada una de las condiciones.); y en (B) los histogramas representativos que muestran el porcentaje de la fragmentación de DNA referido a las células APPwt tratadas con CPT y con el pre-tratamiento con NPS0155 a 4 y 10 μg/ml, representando las medias±SD de dos experimentos independientes por sextuplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 18 muestra en (A) el análisis por citometría de flujo de la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA, para las células portadoras de la variante sueca del APP (APPswe) tratadas con CPT 50 μΜ durante 6 h y para el pre- tratamiento durante 24 h con NPS0155 a 4 y 10 μg/ml seguido del tratamiento con CPT (el porcentaje de apoptosis indicado se mide sobre la región sub-Gl de cada una de las condiciones.); y en (B) los histogramas representativos que muestran el porcentaje de la fragmentación de DNA referido a las células APPswe tratadas con CPT y con el pre- tratamiento con NPS0155 a 4 y 10 μg/ml, representando las medias±SD de dos experimentos independientes por sextuplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 19 muestra en (A) el análisis por citometría de flujo de la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA, para las células portadoras de la variante salvaje del APP (APPwt) tratadas con CPT 50 μΜ durante 6 h y para el pre- tratamiento durante 24 h con NPS0156 a 4 y 10 μg/ml seguido del tratamiento con CPT (el porcentaje de apoptosis indicado se mide sobre la región sub-Gl de cada una de las condiciones.); y en (B) los histogramas representativos que muestran el porcentaje de la fragmentación de DNA referido a las células APPwt tratadas con CPT y con el pre- tratamiento con NPS0156 a 4 y 10 μg/ml, representando las medias±SD de dos experimentos independientes por sextuplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 20 muestra en (A) el análisis por citometría de flujo de la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA, para las células portadoras de la variante sueca del APP (APPswe) tratadas con CPT 50 μΜ durante 6 h y para el pre- tratamiento durante 24 h con NPS0156 a 4 y 10 μg/ml seguido del tratamiento con CPT (el porcentaje de apoptosis indicado se mide sobre la región sub-Gl de cada una de las condiciones.); y en (B) los histogramas representativos que muestran el porcentaje de la fragmentación de DNA referido a las células APPswe tratadas con CPT y con el pre- tratamiento con PS0156 a 4 y 10 μg/ml, representando las medias±SD de dos experimentos independientes por sextuplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 21 muestra el esquema de la síntesis de un derivado de xanthocillin X, como ejemplo de la ruta de síntesis para generar los análogos del compuesto PS0155. Los pasos que se indican consisten en: a. H3 ac, THF, ta., 3 días; b. N-Bu3SnH, Pd(PPh3)4 , THF, 0 °C, 0.5 h; c. Pb(OAc)4, TMS(CH2)2OH, DMF, 0 °C a 50 °C, 8 h; d. Pb(OAc)2, CuCL2, THF, 0 °C, 0.5 h; e. LHMDS, HMPA, acetic formic anhydride, THF, -78 °C, 2 h; f. TBAF, THF, 0 °C a RT, 2 h; g. Pb(OAc)4, THF, RT, 0.5 h; h. LiEt3BH, THF, -78 a -30 ° C, 2 h.
La Figura 22 muestra la naturaleza de los grupos A a P que representan Ar1 y Ar2 sobre la estructura esquemática en (II), lo que define una familia de derivados de xantocilinas.
La Figura 23 es una matriz que muestra el valor del CLOGP, definido como el log P de un compuesto, el cual es el coeficiente de partición entre n-octanol y agua, log(coctanoi/cagua), de las diferentes combinaciones de sustituyentes de la molécula de fórmula (II).
La Figura 24 muestra el esquema de síntesis de los compuestos PS0158 (G+G), PS0159 (F+F), PS0160 (P+P), NPS0161 (H+H) y PS0163 (J+J).
Las Figuras 25-28 muestran en (A) el índice celular normalizado de las células de neuroblastoma humano SK-N-MC tratadas durante 24 h con XXO y varias concentraciones de los análogos sintetizados (de 100 a 1000 ng/ml). La gráfica de dispersión XY muestra la medida a tiempo real de un ensayo representativo, en medidas por duplicado; y en (B) el porcentaje del índice celular normalizado referido a las células tratadas con XXO y con los análogos sintetizados a las concentraciones indicadas a 20 h post tratamiento. Las figuras 25-28 corresponden respectivamente a los resultados de los análogos PS0158 (G+G), PS0159 (F+F), PS0160 (P+P) y PS0161 (H+H). Los resultados son la media±SD de 2-3 ensayos realizados por duplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0,05).
La Figura 29 muestra los resultados obtenidos con los análogos PS0158, PS0159, PS0160 y PS0161 sobre la producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) corregido por LDH (actividad lactato deshidrogenasa), como medida de la viabilidad celular, respecto al tratamiento con XXO de cada análogo en una curva dosis respuesta. Se utilizó un compuesto conocido de control de reducción de ROS (C+). Los resultados son la media±SD de cuatro ensayos realizados por sextuplicado. Se indica * para la diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0,05).
La Figura 30 muestra en (A) el análisis por citometría de flujo de la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA, para las células SK-N-MC pre-tratadas durante 24 h con NPS0158 y NPS0159 a 10 μg/ml, NPS0160 a 1 μg/ml y NPS0161 a 0.4 μg/ml seguido del tratamiento con camptotecina (CPT) 50 μΜ durante 6 h (el porcentaje de apoptosis indicado se mide sobre la región sub-Gl de cada una de las condiciones.); y en (B) los histogramas representativos que muestran el porcentaje de la fragmentación de DNA referido a las células SK-N-MC tratadas con CPT. Se usa Z- VAD-fmk como inhibidor comercial de la apoptosis. Los resultados representan las medias±SD de dos experimentos independientes por cuadruplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT de acuerdo al test de Student (p<0,05).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones Para facilitar la comprensión de la invención objeto de esta solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones utilizados en el contexto de la invención.
Una "sustancia neurotóxica" tal como aquí se utiliza son sustancias químicas que producen alteraciones funcionales, estructurales y bioquímicas del sistema nervioso central. Estos efectos adversos implican cambios que producen una desregulación o alteración del sistema nervioso. La naturaleza de dicho cambio puede ser neuroquímica, morfológica, o relacionada con la conducta y puede manifestarse transitoria o permanentemente.
El término "enfermedad neurodegenerativa", tal como aquí se utiliza, incluye enfermedades que resultan de la degeneración o deterioro del tejido nervioso, en particular de las neuronas, que conduce, a lo largo del tiempo, a una disfunción o a una incapacidad; el término degeneración incluye pérdida de la viabilidad celular, pérdida de la función celular y/o pérdida del número de células (neuronas y otras). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Huntingon, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alexander, déficits cognitivos y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades cerebrovasculares, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), así como enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos patológicos asociados a la edad y progeria. En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad relacionada con la muerte neuronal causada por una sustancia neurotóxica, por ejemplo, una sustancia que produce estrés de retículo endoplásmico, apoptosis, desorganización del citoesqueleto, degeneración de los ganglios básales o daño mitocondrial.
Los términos "neuroprotección" y "neuroprotector", tal como aquí se utilizan, se refieren a la atenuación de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, excitotoxicidad, daño oxidativo, daño mitocondrial, daño de retículo endoplásmico, deposición de subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc, o a la desaparición de los efectos de la degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, excitotoxicidad, daño oxidativo, daño mitocondrial, daño de retículo endoplásmico, deposición de subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc., o a la disminución o desaparición de sus efectos secundarios.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. En una realización particular, dicho sujeto es un mamífero que padece, o es susceptible de padecer una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad neurodegenerativa crónica o una enfermedad asociada al envejecimiento.
El término "sal" debe entenderse que significa cualquier forma de derivados de xantocilinas en el que el compuesto asume una forma iónica, o está cargado y se acopla con un contraión (un catión o anión) o están en disolución. Por esto debe entenderse también complejos del compuesto activo con otras moléculas e iones, y en particular complejos que se complejan a través de interacciones iónicas.
El término "solvato" según esta invención debe entenderse que significa cualquier forma del derivado de xantocilinas de fórmula (I) que tenga unido otra molécula (más probablemente un disolvente) a través de un enlace no covalente. Ejemplos de solvatos incluyen hidratos y alcoholatos, por ejemplo metanolato. Preferiblemente, los solvatos son solvatos farmacéuticamente aceptables.
El término "profármaco" o "prodroga" se usa en su sentido más amplio y engloba aquellos derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Los expertos en la técnica producirían fácilmente tales derivados, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los presentes compuestos: ésteres, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, carbamatos, amidas, etc. Ejemplos de métodos bien conocidos para producir un profármaco de un compuesto de actuación dado son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Krogsgaard-Larsen et al, "Textbook of Drugdesign and Discovery" Taylor & Francis (Abril 2002). Derivados o profármacos particularmente favorables son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba más fácilmente en la sangre) o aquéllos que aumentan la administración del compuesto original a un compartimiento biológico (por ejemplo, el cerebro o sistema linfático) en relación con la especie original.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones y entidades moleculares que son tolerables fisiológicamente y no producen normalmente reacciones alérgicas o reacciones no favorables similares como trastornos gástricos, mareos, y reacciones del mismo estilo, cuando son administradas en humanos o animales.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora de un gobierno de estado o federal o está incluido en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida de modo general para su uso en animales, y de manera más particular en seres humanos. El término "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, consistente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturaciones, y que tiene de uno a doce átomos de carbono, preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono, más preferiblemente de uno a seis átomos de carbono, y que está unida al resto de la molécula a través de un enlace sencillo. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, tert-butilo y hexilo.
El término "halógeno" incluye flúor, cloro, bromo o yodo.
El término "alquilen" en el sustituyente "O-alquilen-O" se refiere a una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, consistente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturaciones, y que tiene de uno a doce átomos de carbono, preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono, más preferiblemente de uno a seis átomos de carbono, y que está unida a los átomos de oxígeno a través de un enlace sencillo. Ejemplos del sustituyente "O-alquilen-O" inluyen O-metilen-0 (0-CH2-0), O- etilen-0 (0-CH2-CH20), O-propilen-0 (0-CH2-CH2-CH20) o O-butilen-0 (0-CH2- CH2-CH2-CH20).
En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido previamente, o de una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En una realización particular, Ri se selecciona entre alquilo, OH y O-alquilo, o Ri se encuentra unido a R2 formando un grupo -O-alquilen-O.
En otra realización particular, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH y O-alquilo, o R2 se encuentra unido a Ri formando un grupo - O-alquilen-O, y/o R3 y R4 se encuentran unidos formando un grupo -O-alquilen-O. De forma preferente, R4 se encuentra en posición meta del anillo aromático.
También de forma preferente, Ri es OH, alquilo o forma, junto con R2, un grupo -O- alquilen-O. Más preferentemente, Ri es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R2, un grupo -O-alquilen-O. También de forma preferente, R2 es hidrógeno, OH, alquilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, R2 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O.
También de forma preferente, R3 es OH, alquilo o forma, junto con R4, un grupo -O- alquilen-O. Más preferentemente, R3 es OH, etilo, metilo o forma, junto con R4, un grupo -O-alquilen-O.
También de forma preferente, R4 es hidrógeno, OH, alquilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, R4 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O. En una forma de realización aún más preferente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona de los siguientes compuestos:
Figure imgf000018_0001
Los resultados de la investigación realizada por los inventores demuestran que la prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits cognitivos, demencias, enfermedades asociadas al envejecimiento y/o procesos patológicos asociados a la edad y progeria con los análogos de xantocilinas descritos en la presente invención, tiene lugar, al menos parcialmente, mediante neuroprotección, en particular mediante la inhibición directa de la muerte neuronal, esto es, mediante la inhibición de la muerte de las células neuronales del sistema nervioso. Por tanto, este mecanismo de acción tendría lugar sin la participación del sistema inmune. Numerosos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto tanto el efecto neuroprotector de extractos ricos en derivados de xantocilinas, como de análogos de xantocilinas, frente a la acción de diferentes sustancias neurotóxicas, como su efecto antiapoptótico en neuronas colinérgicas de origen humano. En una forma de realización particular, las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan entre enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Huntingon, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alexander, déficits cognitivos y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades cerebrovasculares, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), así como enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos patológicos asociados a la edad y progeria. De forma preferente, dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
Los compuestos de fórmula (I) pueden estar en forma de sales, preferiblemente sales farmacéuticamente aceptables, en forma de solvatos, preferiblemente solvatos farmacéuticamente aceptables, o en forma de profármacos. Dichas sales, solvatos o profármacos farmacéuticamente aceptables del compuesto de fórmula (I), cuando se administran al receptor, pueden proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de fórmula (I) tal como el descrito en el presente documento. Las sales farmacéuticamente no aceptables también se encuentran dentro del alcance de la invención porque pueden ser útiles para preparar sales farmacéuticamente aceptables.
La preparación de sales y solvatos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de compuestos proporcionados en el presente documento se sintetizan a partir del compuesto original, que contiene uno o más restos básicos, mediante métodos químicos convencionales. En general, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de base libre de estos compuestos con la base o ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. En general, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los ejemplos de las sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido inorgánico tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, etc., y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato, etc.
Una forma farmacéuticamente aceptable preferida es la forma cristalina, incluyendo tal forma en una composición farmacéutica. En el caso de sales y solvatos, los restos de disolvente e iónicos adicionales también deben ser no tóxicos. Los compuestos de la invención pueden presentar diferentes formas polimórficas, se pretende que la invención englobe todas estas formas.
Cualquier compuesto que es un profármaco de un compuesto de fórmula (I) se encuentra dentro del alcance de la invención. Los compuestos de la invención también pretenden incluir compuestos que difieren sólo en presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, compuestos que tienen las presentes estructuras, excepto para la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o en 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, se encuentran dentro del alcance de esta invención.
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) descrita anteriormente pueden incluir isómeros tales como enantiómeros o diastereoisómeros dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros únicos, enantiómeros o diastereoisómeros y mezclas de los mismos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Para su administración en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, los análogos de xantocilinas de fórmula (I) se pueden formular en una composición farmacéutica, en una cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dicha composición farmacéutica puede contener uno o varios análogos de xantocilinas de fórmula (I) o uno o más fármacos diferentes, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende únicamente un derivado de xantocilina de fórmula (I). Dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los análogos de xantocilinas de fórmula (I) pueden formularse en cualquier forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por la vía de administración elegida. A modo ilustrativo, no limitativo, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una forma farmacéutica sólida de administración por vía oral (e.g., gránulos, comprimidos, cápsulas, etc.), en una forma farmacéutica líquida de administración por vía oral (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), en una forma farmacéutica para su administración por vía parenteral (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). Para ello, en cada caso, se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida, por ejemplo, aglutinantes, diluy entes, disgregantes, lubrificantes, humectantes, etc., para la formulación de formas farmacéuticas de administración sólidas, y tampones, tensioactivos, etc., para la formulación de formas farmacéuticas de administración líquidas. Dichos vehículos y excipientes deben ser farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de la formulación sin ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de dicho principio activo puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, Ia Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
La composición farmacéutica empleada en la presente invención comprende, al menos, un análogo de xantocilinas de fórmula (I) en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a la cantidad de fármaco calculada para producir el efecto deseado. La dosis de fármaco a administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del fármaco utilizada, e.g., su actividad y vida media biológica, la concentración del fármaco en la composición farmacéutica, la situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma farmacéutica de administración elegida, etc. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos o con otras pautas de administración, no necesariamente diaria sino también de forma puntual, semanal, etc.
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige al uso de un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento dirigido a la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
En otro aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para la prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en un sujeto con necesidad de tratamiento, que comprende la administración a dicho sujeto de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficiente de uno o más compuestos de fórmula (I), o una sal, prodroga y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto preferido, este método de prevención o tratamiento actúa mediante neuroprotección, en particular mediante la inhibición directa de la muerte neuronal.
En una realización particular, la composición farmacéutica empleada para la prevención o tratamiento de las mencionadas enfermedades puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o enfermedades asociadas con el envejecimiento, con el fin de aumentar la eficiencia de la composición farmacéutica, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que la composición farmacéutica empleada o en momentos diferentes (administración secuencial). A modo ilustrativo, no limitativo, ejemplos de fármacos adicionales que pueden formar parte de la misma terapia o composición farmacéutica junto con los análogos de xantocilinas de fórmula (I) son: fármacos para el tratamiento del Alzhéimer (tacrina, rivastigmina, memantina, donepezilo, galantamina, estatinas...), de parkinson (carbidopa, levodopa, bromocriptina, pramipexol, ropinirol, amantadina, rasagilina...), antipsicóticos como el haloperidol, antidepresivos como la amitriptilina, ansiolíticos como el lorazepam, antiinflamatorios como la aspirina, suplementos dietéticos como las vitaminas E, C, B, el folato o el extracto de Ginkgo biloba o fármacos contra el resto de neurodegenerativas indicadas en la patente.
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a un compuesto de fórmula (II) como se ha definido previamente, o a una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Quedan excluidos de dicha fórmula:
- el compuesto en el que R1-R4 son OH y R4 está en posición meta del anillo aromático;
- el compuesto en el que R1-R4 son OCH3 y el sustituyente R4 está en posición meta del anillo aromático; y
- los compuestos en los que R2 y R4 son hidrógeno y Ri y R3 se seleccionan independientemente de OH y metoxi.
En una realización particular, si R2 es hidrógeno, Ri se selecciona de metilo, etilo y etoxi. En otra realización particular, Ri se selecciona de alquilo, OH y O-al quilo, o Ri se encuentra unido a R2 formando un grupo -O-alquilen-O.
En otra realización particular, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH y O-alquilo, o R2 se encuentra unido a Ri formando un grupo - O-alquilen-O, y/o R3 y R4 se encuentran unidos formando un grupo -O-alquilen-O. De forma preferente, R4 se encuentra en posición meta del anillo aromático.
También de forma preferente, Ri es OH, O-alquilo, alquilo o forma, junto con R2, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, Ri es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R2, un grupo -O-alquilen-O.
También de forma preferente, R2 es hidrógeno, OH, alquilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, R2 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O.
También de forma preferente, R3 es OH, O-alquilo, alquilo o forma, junto con R4, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, R3 es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R4, un grupo -O-alquilen-O. También de forma preferente, R4 es hidrógeno, OH, alquilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O. Más preferentemente, R4 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O.
En una forma de realización aún más preferente, el compuesto de fórmula (II) se selecciona de los siguientes compuestos:
Figure imgf000024_0001
R1=R3 = Me, Et, OEt
R4 = OH, Me, Et
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II), o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra el principio activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se emplean preferiblemente como vehículos agua o disoluciones acuosas de solución salina y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para las disoluciones inyectables. Vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, 1995. Preferiblemente, los vehículos de la invención están aprobados por la agencia reguladora de un gobierno de estado o el federal o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (disoluciones, suspensiones o emulsiones) para la administración oral, tópica o parenteral.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención puede ser mediante cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales y administración intravenosa e intraperitoneal. Pueden administrarse composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la invención mediante encapsulación en liposomas o nanoesferas, en formulaciones de liberación sostenida o mediante otros medios de administración habituales. Las formulaciones se pueden preparar según métodos convencionales tales como los que se describen en las Farmacopeas Española, Europea o de Estados Unidos de América, o en textos de referencia similares, por ejemplo "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
La dosificación correcta de los compuestos variará según la formulación particular, el modo de aplicación, el sitio y la enfermedad neurodegenerativa particular que se esté tratando. También deben tenerse en cuenta otros factores como la edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y gravedad de la enfermedad. Puede llevarse a cabo la administración de manera continua o periódica dentro de la dosis tolerada máxima. Los compuestos y composiciones de esta invención pueden usarse con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o pueden proporcionarse como una composición aparte para la administración al mismo tiempo o en un tiempo diferente.
Un aspecto adicional de la presente invención lo constituye un compuesto de fórmula (II) como se ha descrito previamente para su uso en medicina.
Otro aspecto adicional de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto de fórmula (II) para la preparación de un medicamento.
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) a partir de un extracto producido por la especie Penicillium chrysogenum. De forma particular, dicho extracto es producido por una cepa de microorganismo de la especie Penicillium chrysogenum depositada en el CECT con el número de registro 20783.
En una forma de realización particular, para la obtención de los compuestos de fórmula (II), se parte de una muestra procedente de una esponja marina recogida en la zona de Cabo de Gata (Almería), a partir de la cual se hace crecer una cepa correspondiente a la especie Penicillium chrysogenum. Dicha cepa permite obtener un extracto a partir del cual, mediante fraccionamiento y purificación, se obtienen los compuestos de fórmula (II), tal como se describe en los ejemplos 1 y 5 de la presente solicitud.
De forma alternativa, los compuestos de fórmula (II) se pueden obtener por vía sintética mediante un procedimiento que comprende:
a) una reacción de condensación mediante la cual el éster del ácido aril propiónico, de fórmula (III), se transforma en su correspondiente amida de fórmula (IV):
Figure imgf000026_0001
III IV
donde R representa un grupo alquilo;
hacer reaccionar la amida de fórmula (IV) con un hidruro de alquilestaño para producir el estannano de fórmula (V):
Figure imgf000026_0002
IV V a continuación, someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c. l) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000026_0003
V VI donde SE significa un grupo protector;
d. l) someter el carbamato de fórmula (VI) a una reacción de homoacopl
Figure imgf000027_0001
VI
y
e. l) introducir los grupos formamido y desproteger los grupos carbamato para obtener el compuesto de fórmula (II) de la invención; someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.2) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000027_0002
V VI
d.2) introducir los grupos formamido y desproteger los grupos carbamato para obtener el compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000027_0003
VI VIII e.2) someter la formamida de fórmula (VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención;
o
someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.3) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el isocianato de fórmula (IX):
Figure imgf000028_0001
v IX
d.3) convertir el isocianato de fórmula (IX) en la formamida de fórmula (VIII):
Figure imgf000028_0002
IX VIII
y
e.3) someter la formamida de fórmula (VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención;
donde el grupo arilo incluye los sustituyentes Ri a R4 en función del compuesto de fórmula (II) que se desee obtener.
La etapa a) de la ruta supone la transformación de un éster alquílico del ácido aril propiónico de fórmula (III) en su correspondiente amida de fórmula (IV). En una forma de realización particular, dicha reacción se lleva a cabo por tratamiento con amoníaco. De forma preferente, el éster alquílico del ácido aril propiónico es el éster metílico del ácido aril propiónico.
La etapa b) de la ruta sintética supone una hidroestanninación, de manera que se reduce el triple enlace del compuesto de fórmula (IV), incorporándose un grupo alquilestannano. En una forma de realización particular, esta reacción se lleva a cabo en presencia de un hidruro de alquilestaño y es catalizada por un compuesto de paladio. De forma preferente, el hidruro de alquilestaño es hidruro de tributilestaño y el catalizador es un complejo de Pd y trifenilfosfina, en particular, Pd(PPh3)4.
En una forma de realización particular, la reacción de oxidación de Baumgarten de la etapa c. l) que conduce a la obtención del carbamato protegido de fórmula (VI) se realiza utilizando un agente oxidante, como puede ser Pb(OAc)4, en presencia de un silanol, como por ejemplo TMS(CH2)20H (2-Trimetilsilanil-etanol). Dicho silanol permite incorporar grupos silil éter con el fin de proteger los grupos carbamato.
En otra forma de realización particular, la reacción de homoacoplamiento d. l) se realiza utilizando un catalizador de cobre, por ejemplo CuCl2 y aire.
La etapa e. l) de la ruta sintética se lleva a cabo en dos fases, una primera en la que se incorporan grupos formamido mediante una reacción de formilación en presencia de una base fuerte y una segunda en la que se eliminan los grupos protectores del grupo carbamato. En una realización particular, la mencionada incorporación de los grupos formamido se realiza con un anhídrido acético fórmico tras tratamiento con una base fuerte como por ejemplo hexametildisililazanuro de litio (conocido comúnmente como LiHMDS). Por su parte, la fase de desprotección de los grupos carbamato en la etapa e. l) se puede llevar a cabo utilizando un fluoruro de amonio cuaternario, en concreto, fluoruro de tetra-«-butilamonio, ya sea en su forma de trihidrato o disuelta en THF, dado que es una sal comúnmente empleada para eliminar grupos protectores silil éter.
La reacción de oxidación de Baumgarten de la etapa c.2) corresponde con la etapa c. l) y, por tanto, se lleva a cabo con un agente oxidante en presencia de un silanol, tal como se ha mencionado para la etapa c. l). La etapa d.2) de la ruta sintética se lleva a cabo en dos fases, una primera en la que se incorpora un grupo formamido mediante una reacción de formilación tras tratamiento con una base fuerte y una segunda en la que se elimina el grupo protector del grupo carbamato. En una realización particular, la mencionada incorporación del grupo formamido se realiza con un anhídrido acético fórmico tras tratamiento con una base fuerte como por ejemplo hexametildisililazanuro de litio (conocido comúnmente como LiHMDS). Por su parte, la fase de desprotección del grupo carbamato se puede llevar a cabo utilizando un fluoruro de amonio cuaternario, en concreto, fluoruro de tetra-«- butilamonio, ya sea en su forma de trihidrato o disuelta en THF, dado que es una sal comúnmente empleada para eliminar grupos protectores silil éter.
En otra forma de realización particular, la reacción de homoacoplamiento e.2) se realiza también utilizando un catalizador de cobre, por ejemplo CuCl2 y aire, tal como se ha descrito para la etapa d. l).
La reacción de oxidación de Baumgarten de la etapa c.3) se lleva a cabo con un agente oxidante, tal como se ha mencionado para las etapas c. l) y c.2), pero en ausencia del silanol dado que no es necesaria la protección del grupo isocianato. Por su parte, la reacción d.3) de transformación del carbamato de fórmula (VI) en la formamida de fórmula (IX) se realiza en presencia de un agente reductor. En una realización particular, dicho agente reductor es un borohiduro de litio, preferentemente trietil borohidruro de litio.
En otra forma de realización particular, la reacción de homoacoplamiento e.3) se realiza también utilizando un catalizador de cobre, por ejemplo CuCl2 y aire, tal como se ha descrito para la etapa d.1) y e.2).
Este tipo de ruta sintética permite la obtención de los compuestos en los que los sustituy entes Ri y R3 y R2 y P de cada anillo aromático son iguales. Para la obtención de compuestos en los que no se da esta circunstancia, es decir para los compuestos asimétricos, se puede seguir un método como el que se describe en Tetrahedron Letters, 2005, 46, 5017-5020.
Un último aspecto de la invención hace referencia a una cepa de microorganismo de la especie Penicillium chrysogenum depositada en el CECT con el número de registro 20783. Dicha cepa se obtuvo de una esponja marina, tal como se describe en el ejemplo 1 del presente documento. La identificación de la cepa se realizó mediante técnica PCR y secuenciación tal como se describe en el ejemplo 4 del presente documento, así como por observación microscópica y macroscópica. A partir de dicha cepa, es posible obtener un extracto del cual se aislan los compuestos empleados en la presente invención tal como se ha descrito previamente y como ponen de manifiesto los ejemplos 1 y 5 del presente documento.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
EJEMPLO 1. Crecimiento de la cepa 0882-08 y obtención del extracto 08 055 C08
1.1. Aislamiento y crecimiento de la cepa
Se aisló la muestra M082-08 de una esponja marina tomada en Cabo de Gata (Almería) (Figura 1). Para procesar la muestra se extrajo un trozo de la esponja con ayuda de pinzas y tijeras estériles y se realizaron varios lavados con Agua Marina Artificial (ASW), cuya composición en g/L es: KBr 0,1; NaCl 23,48; MgC12»6H20 10,61; KC12»2H20 1,47; KC1 0,66; SrC12»6H20 0,04; Na2S04 3,92; NaHC03 0, 19; H3B03 0,03; esterilizada en autoclave (Presoclave II 75 L, de J.P. Selecta) a 121°C durante 20 minutos.
Luego se extrajeron dos trozos de 0,5 cm3, depositándolos en una placa petri de 90 mm conteniendo 30 mi de medio PDA-marino, cuya composición en g/L es: agar dextrosa patata 39; agar 5; esterilizada en autoclave (Presoclave II 75 L, de J.P. Selecta) a 121°C durante 20 minutos. La placa se incubó en una estufa universal (INE700, Memmert) a 28°C durante 3-5 días, comprobando el crecimiento de las colonias periódicamente. La colonia de la cepa 0882 08 se aisló como cultivo puro con ayuda de un asa de siembra estéril, inoculándola en una placa petri de 90 mm con 30 mi de medio PDA-marino tras lo que se incuba en una estufa a 28°C (Figura 2). Una vez obtenido el cultivo puro se hizo crecer en tubos de agar inclinado de medio
Power (PW), cuya composición en g/L es: sacarosa 15; peptona bacteriológica 2,5; lactosa 2,5; sólidos de maceración del maíz 0,5; NaCl 2; NaN03 1; KC1 26,1 ;
K2HP04 0,25; MgS04»7H20 0,25; KH2P04 0,03; FeS04»7H20 0,005;
FeC13»6H20 0,0015; CuS04»5H20 0,0005; agar 20; pH 5,5; esterilizada en autoclave (Presoclave II 75 L, de J.P. Selecta) a 121°C durante 20 minutos. Transcurridos 7 días y comprobado que el cultivo había crecido y esporulado, se preparó una suspensión de esporas con el siguiente procedimiento: se añaden 5 mi de glicerol 40% (p/v) estéril a cada tubo y de 10-15 perlas de vidrio de 5 mm de diámetro. Se agita el cultivo hasta conseguir una suspensión homogénea y con ella se generan los crioviales que se conservan a -80°C en un ultracongelador (905 -86C ULT Freezer, Thermo Scientific).
1.2. Obtención del extracto
La preparación del cultivo para la obtención del extracto natural se realizó inoculando un tubo de polipropileno de 13 mi con 3 mi de agar inclinado de medio YES sólido, cuya composición en g/L fue: sacarosa 150; extracto de levadura 20; MgS04»7H20 0,5; agar 10; con 0,05 mi de la suspensión de esporas conservada a -80°C. La incubación del tubo se llevó a cabo en una estufa a 28°C durante 14 días. Pasado ese tiempo se añadió al cultivo 3 mL de acetato de etilo, tras lo que se agitó vigorosamente con un vórtex durante unos segundos. Después se introdujo durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos, tras lo que se añadió 1 g de sulfato sódico anhidro y se volvió a agitar unos segundos en un vórtex. Se centrifugó a 3000xg. durante 10 minutos, tras lo que se recogió el sobrenadante. Al pellet resultante de la centrifugación se le añadieron otros 3 mL de acetato de etilo y se realizó otro ciclo de extracción (éste sin adición de sulfato sódico), al final del cual el sobrenadante se unió al extraído anterior. Se evaporó en un rotavapor o bajo corriente de nitrógeno, hasta sequedad, resultando entre 1 a 10 mg del extracto crudo seco. Se evaporó en rotavapor y speed-vac hasta sequedad.
EJEMPLO 2. Evaluación de la capacidad neuroprotectora y antioxidante del extracto 08 055 C08
2.1. Evaluación de la capacidad neuroprotectora
El extracto crudo obtenido se resuspendió en 800 μΕ de DMSO para su ensayo sobre el modelo de muerte celular por estrés oxidativo. Este ensayo se realiza sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC, Cod. HTB-10™)", siguiendo estrictas normas de esterilidad y realizando la manipulación en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en medio MEM (Minimun Essential Médium Eagle (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0, 1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%. Sobre estas células se analizó la inhibición producida por el extracto de la muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa (XXO) que origina daño oxidativo (producción de radicales libres como peróxido de hidrógeno, anión superóxido, radical hidroxilo) lo que desencadena muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio. Tras 24 h de incubación de las células a 37°C y 5% C02 se realizaron los tratamientos celulares para las condiciones de control (medio de cultivo); XXO (xantina 10 μΜ/ xantina oxidasa 60 mU/mL, que produce la muerte del 50% de las células); XXO más el extracto a dilución final 1/100, 1/400, 1/1.000, 1/4.000 y 1/10.000. Tras 22 h de incubación se añadió el reactivo WST-1 (Roche), siguiendo las especificaciones del fabricante. El test WST-1 se basa en la medida de la actividad metabólica de tal forma que las células que están metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de tetrazolium del WST-1 a formazán mediante el sistema succinato- tetrazolium reductasa de la cadena respiratoria mitocondrial. El formazán producido es detectado colorimétricamente. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3, como el porcentaje de muerte celular para cada dilución referido a la muerte producida por la XXO. Se observó protección a las diluciones 1/400, 1/1.000, 1/4.000 y 1/10.000 siendo la máxima del 90% a 1/400, por lo que el extracto 08 055 C08 muestra un efecto protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo. 2.2. Evaluación de la capacidad antioxidante
A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron evaluar la capacidad antioxidante in vitro del extracto, para lo que se utilizó el ensayo TEAC (capacidad de absorbancia por transferencia de electrones). Este método se basa en la formación del radical la ferril-mioglobina producido por la reacción de la metmioglobina con el peróxido de hidrógeno, seguido por la oxidación del reactivo ABTS [ácido 2,2'-azino- bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfónico] por la ferril-mioglobina, lo que produce el catión radical ABTS*+, que puede ser determinado colorimétricamente. En este ensayo los compuestos con capacidad antioxidante suprimen la producción del radical de forma dependiente de concentración. Para cuantificar la capacidad antioxidante se usa una curva estándar con concentraciones crecientes de trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina E), de tal forma que los resultados se indican como medida de equivalentes trolox (TE). El ensayo del extracto 08 055 C08 a dilución 1/1.000 dio un resultado de 101±18 μΜ TE, lo que indica que este extracto muestra capacidad antioxidante in vitro.
EJEMPLO 3. Evaluación de la bioseguridad del extracto 08 055 C08
3.1. Evaluación de la seguridad en líneas celulares humanas
A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron evaluar adicionalmente la seguridad de este extracto en dos líneas celulares humanas: de origen neuronal (SK- N-MC, Cod. ATCC HTB-10™) y hepático (HepG2, Cod. ATCC HB8065™), mediante la medida de la viabilidad de las células con el extracto 08 055 C08 a la máxima dilución (1/100) para lo que se utiliza la medida de la actividad metabólica mediante el test WST-1 (Roche). Se obtiene una viabilidad de 126±7% respecto al control en las células SK-N-MC y de 101±7% en las HepG2, por lo que el extracto 08 055 C08 no muestra toxicidad in vitro. 3.2. Evaluación de la seguridad en embriones de pez cebra
A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron evaluar la bioseguridad en embriones de pez cebra siguiendo las especificaciones definidas en el Draft Guideline del May 30, 2006 (lst Versión) denominado "OECD guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline: Fish Embryo Toxicity (FET) Test". Este test constituye un método alternativo al test de toxicidad aguda con peces juveniles y adultos (OECD Test Guideline 203). Tres embriones de pez cebra, en 10 réplicas (n=30 por condición) fueron expuestos en cada uno de los pocilios de una microplaca de 96 pocilios a tres concentraciones de la sustancia a evaluar (1/100, 1/200, 1/400). El test se inició inmediatamente después de la fertilización y se continuó durante 48 horas sin recambio de tratamiento. Los efectos letales, descritos por cuatro puntos finales, fueron determinados por comparación con los controles para identificar los valores de LC50, NOEC y LOEC, parámetros que se definen a continuación. LC50: Concentración de la muestra problema que produce la mortalidad del 50% de los animales. NOEC: Concentración más alta que no causa mortalidad. LOEC: Concentración más baja que produce el 100% de mortalidad. La metodología del test se basó en el uso de una serie de concentraciones del compuesto a evaluar así como un control apropiado. Los siguientes parámetros toxicológicos fueron determinados en este estudio. Parámetros letales: i) determinación de número de huevos coagulados; ii) desprendimiento de la cola; iii) ritmo cardíaco (presencia o ausencia); iv) formación de las somitas (series longitudinales del mesodermo que por delaminación, fusión y migración se convierten en el esqueleto axial, la dermis y los músculos dorsales y la pared del cuerpo y las extremidades). Además, también se estudiaron los siguientes parámetros subletales: i) movimientos espontáneos; ii) pigmentación; iii) formación de edemas; iv) formación de coágulos. Por último se estudiaron los siguientes parámetros teratogénicos: i) malformaciones en órganos y estructuras; ii) escoliosis; iii) raquitismo, iv) retardo generalizado del desarrollo. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4, mostrando los parámetros de toxicidad en embrión de pez cebra en un ensayo basado en el FET a las 48 horas posttratamiento (hpt) del extracto 08 055 C08. Se observa que a las dosis utilizadas y a tiempo final (48 h post tratamiento), no se determinó ningún fenómeno toxicológico en los embriones de pez cebra, por lo que dicho extracto mostró una extraordinaria seguridad en los modelos evaluados.
EJEMPLO 4. Identificación y escalado de la cepa 0882 08 4.1. Identificación de la cepa La identificación de la cepa se realizó mediante una PCR que amplifica 560 pb del gen 28S. La mezcla de PCR lleva los siguientes componentes: tampón de PCR, MgC12 1.5 mM, mezcla de dNTP 0.2 mM, oligonucleótidos 0.4 μΜ (NL1 : 5'-gca tat caá taa gcg gag gaa aag-3' (SEQ ID No: 1) y NL4: 5'-ggt ccg tgt ttc aag acg g-3' (SEQ ID No:2)), ADN Polimerasa PFU (Bioneer) 1 U, ADN extraído de la cepa con el kit Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega) a dilución final 1 :50. El programa de PCR consistió en: desnaturalización en 1 ciclo de 96°C durante 5 min; amplificación en 30 ciclos con tres rampas de temperatura: 94°C durante 30 seg, 60°C durante 40 seg y 72°C durante 1 min; elongación en 1 ciclo de 72°C durante 10 min.
El fragmento obtenido del gen 28S (Figura 5, SEQ ID No:3) fue secuenciado y mostró similitud con el género Penicillium, por comparación con la base de datos de la herramienta "Basic Local Alignment Search Tool" (BLAST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI, EE.UU), lo que coincidía con sus características microscópicas y macroscópicas. A partir de este resultado se hizo una primera aproximación de esta cepa al género Penicillium. Así pues, según el procedimiento descrito por Samson y Frisvad (2004) [Frisvad&Samson, Stud. Mycol. 2004; 49: 1- 173], la cepa fue inoculada en los siguientes medios de cultivo e incubada durante 7 días a distintas temperaturas:
• Czapek Yeast Extract Agar (CYA). Incubada a 5°C, 26°C y 37°C
• Malt Extract Agar (MEA). Incubada a 26°C · Yeast Extract Sucrose Agar (YES). Incubada a 26°C
• Creatine Sucrose Agar (CREA). Incubada a 26°C
• 25% Glycerol Nitrate Agar (G25N). Incubada a 26°C.
Las características utilizadas en la clasificación fueron: observación microscópica, datos del crecimiento, morfología de las colonias y formación del estado teleomórfico si lo hubiese. Los resultados de observación microscópica mostraron cuerpos fructíferos (pinceles) propios del género Penicillium. Conidióforos con tres puntos de ramificación (terverticilados) característicos del subgénero Penicillium. Estipe con pared lisa. Fiálides ampuliformes. Conidios esféricos a elipsoidales, lisos.
Las características estudiadas en la observación macroscópica fueron: tamaño, textura y color de las colonias, producción de exudado y pigmento difusible y observación del reverso. Los resultados son los siguientes:
• Crecimiento en CYA a 26°C: colonias de 35 mm de diámetro. Textura aterciopelada a flocosa, fasciculada. Micelio de color blanco. Conidios de color verde grisáceo. No produce exudado. Produce pigmento difusible al medio de color amarillo. Reverso de color amarillo.
• Crecimiento en CYA a 5°C y 37°C: colonias de 10 mm de diámetro. Textura aterciopelada. Conidios de color blanco. No produce exudado ni pigmento difusible al medio. Reverso crema.
• Crecimiento en MEA y G25N a 26°C: colonias de 33 mm y 27 mm de diámetro, respectivamente. Textura flocosa. Conidios de color verde grisáceo. No produce exudado ni pigmento difusible al medio. Reverso crema. · Crecimiento en YES a 26°C: colonias de 40 mm de diámetro. Textura aterciopelada a flocosa. Micelio de color blanco. Conidios de color verde grisáceo. No produce exudado ni pigmento difusible al medio. Reverso crema con centro grisáceo.
• Crecimiento en CREA a 26°C: escaso crecimiento, colonias de 9 mm de diámetro. Producción de ácido.
A continuación se realizó la identificación a nivel molecular por los siguientes métodos moleculares: a) Amplificación y secuenciación de la zona del DNA ribosómico que comprende los espacios intergénicos ITS 1 e ITS2 y que incluye al gen 5,8S rDNA. b) Amplificación y posterior secuenciación parcial del gen de la B-Tubulina (con lecturas en las dos direcciones), con los cebadores Bt2a y Bt2b (Glas& Donaldson, Appl Environ Microb 1995; 61 : 1323-30).
Los productos de amplificación fueron de 495 y de 477 pares de bases respectivamente. Como resultado de su comparación con las secuencias existentes en las bases de datos, se obtuvo un 100% de similitud para la zona ITS-5.8S rDNA y un 99% para el gen de la β-Tubulina con la especie Penicillium chrysogenum, cepa CBS 306.48.
Así, pues se concluye que la cepa pertenece a la especie Penicillium chrysogenum. 4.2. Escalado del cultivo
Para el crecimiento escalado del cultivo se prepararon los cultivos para la obtención del extracto natural inoculando con 1.2 mi de suspensión de esporas por placa 25 placas de 14 cm de diámetro conteniendo 80 mi de medio YES, cuya composición en g/L es: sacarosa 150; extracto de levadura 20; MgS04»7H20 0,5; agar 10; e incubando dichas placas a 28°C durante 14 días.
La extracción del cultivo se realizó por trituración con ayuda de una batidora de forma que quedara totalmente homogéneo, después se añadió 2300 mL de acetato de etilo y se mantuvo en agitación durante 6 horas con ayuda de un agitador de varillas. Pasado este tiempo se recogió el sobrenadante y se filtró a través de un embudo de papel. Se repitió la extracción añadiendo 1900 mL de acetato de etilo y se mantuvo en agitación durante otras 4 horas. El sobrenadante se recogió junto al anterior. Todo ello se evaporó a sequedad mediante un rotavapor, resultando en 3.3 g del extracto crudo seco.
EJEMPLO 5. Fraccionamiento, purificación bioguiada y resolución de la estructura del compuesto activo presente en el extracto 08 055 C08 del cultivo de la cepa 0882 08
5.1. Fraccionamiento y purificación El extracto 08 055 C08 se analizó por HPLC analítico (Agilent 1 100-DAD, Columna Zorbax RX-C8 5 μιη 4.6X250 mm) con 5-100% acetonitrilo/agua durante 40 min y se observó que el extracto contenía metabolitos en todos los rangos de polaridad, por ello se realizó un fraccionamiento de baja presión genérico por resina de adsorción/resorción de amplio rango (SP207ss) en un cromatógrafo automatizado Combiflash®. Para ello se disolvió 1.2 g del extracto en 2 mL de acetato de etilo/metanol 50/50 y después se le añadió 5 gramos de resina sp207ss escurrida en agua, evaporando a sequedad todo el disolvente obteniendo así la cabeza de la columna de cromatografía. Así pues el total del crudo se fraccionó en un cromatógrafo automatizado Combiflash mediante columna de 70 mL (100mm x 35mm) de resina SP207ss en un gradiente parabólico de 10-100% de acetona en agua durante 25 min con un lavado adicional de 35 minutos de acetona al 100%. Se obtuvieron 17 fracciones a las que se añadió 1.4 mL de DMSO por fracción y se evaporaron los disolventes de cromatografía mediante un evaporador centrífugo Genevac durante 7 horas, resultando las fracciones en DMSO 100% al 715X WBE (Whole Broth Equivalent o Concentración Equivalente en Fermentación). Las fracciones se analizaron frente la muerte por xantina/xantina oxidasa (con el mismo método usado para el análisis de cribado descrito en el Ejemplo 2), obteniendo protección en varias de las fracciones analizadas, por lo que la purificación se centró en la zona de mayor actividad a diluciones altas.
Para ello se escaló el fraccionamiento, mediante HPLC preparativo, de las fracciones positivas con un gradiente del 2 al 20% de acetonitrilo/agua con una columna Zorbax SB-C8 7 μηι 21.2 x 250 mm con un flujo de 20 mL/min y detección a 210 y 280 nm. Se ensayaron las fracciones de HPLC preparativo para localizar qué pico o picos de la cromatografía presentaban actividad protectora de la muerte.
Se obtuvieron dos compuestos mayoritarios (Figura 6) en las fracciones G27 y G28, cuyo análisis por HPLC/MS de baja resolución mostró que presentaban pesos moleculares de m/z 340 y 324, respectivamente. Durante la re-purificación, apareció un tercer pico para el que, el análisis por HPLC/MS de baja resolución indicó un peso molecular m/z 324, y que por HPLC analítico y RMN/Masas se confirmó como un confórmero presente en equilibrio con el G28 original. 5.2. Resolución de la estructura
Para llevar a cabo la elucidación estructural de los dos compuestos bioactivos purificados G27 (m/z 340) y G28 (m/z 324) se utilizó una combinación de técnicas espectroscópicas que incluyeron la espectrometría de masas de alta resolución ESI- TOF y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) en una y dos dimensiones, apoyadas con búsquedas en bases de datos que usan la fórmula molecular y/o características estructurales que pueden ser deducidas a partir de los espectros de RMN del compuesto. Para esta última tarea se utilizó la última edición del Diccionario de Productos Naturales de Chapman & Hall (Chapman & Hall, 2011).
5.2.1. Elucidación de la estructura de G28 (NPS0156) Para la elucidación de la estructura del compuesto G28 se realizó un análisis de alta resolución mediante ESI-TOF que indicó la presencia de un ión pseudomolecular a una relación m/z de 325.1169, en concordancia con una fórmula molecular de C18H16N204 (calculado para [M+H]+ 325.1183, Δ=-4.3 ppm). La presencia en el espectro de masas (Figura 7) de los correspondientes aductos de amonio (m/z 342.1418), sodio (m/z 347.0989) y potasio (m/z 363.0737) confirmó la fórmula molecular propuesta para el compuesto.
Una búsqueda de dicha fórmula molecular en el Diccionario de Productos Naturales Chapman & Hall reveló la presencia de dos moléculas con estas características, N- Nitrosoxylopine, aislada de la planta Duguetia furfuracea, y (lZ,3Z)-l,4-Di(4- hidroxifenil)-2,3-diformamido-l,3-butadieno, molécula previamente obtenida a partir de caldos de cultivo del hongo Penicillium notatum. Tras una prueba de solubilidad en distintos disolventes, se decidió que el DMSO-d6 era el más apropiado para el registro de los espectros de RMN. El espectro de 1H RMN (Figura 8) resultó ser bastante complejo, con un número de señales que indicaba la presencia de, al menos, 32 protones en la molécula, lo cual indujo a pensar que la molécula presentaba algún tipo de equilibrio conformacional, ya detectado durante el proceso de purificación, que daba lugar a un desdoblamiento de las señales. Adicionalmente, el espectro contenía, aparte de las señales residuales del disolvente deuterado, señales debidas únicamente a la presencia de protones aromáticos y/o de doble enlace y de protones unidos a heteroátomos, permitiendo descartar todas aquellas moléculas que contienen protones alifáticos tales como N- Nitrosoxyl opine. El otro candidato encontrado en la búsqueda por fórmula molecular, (lZ,3Z)-l,4-Di(4-hidroxifenil)-2,3-diformamido-l,3-butadieno, mostraría características estructurales que podrían estar de acuerdo con el espectro observado y además incluiría dentro de su estructura dos grupos formamida, cuyo equilibrio conformacional podría ser detectado mediante RMN, dando lugar a un desdoblamiento de señales. Existían tres posibles conformaciones para los dos grupos amida: cis-cis, trans-trans y cis-trans, con dos posibilidades equivalentes para éste último debido a la simetría de la molécula. Dicha simetría determina que el número de señales distintas en protón que se observaría para las posibles conformaciones fuera de 32, coincidente con el número de señales observadas en el espectro. Para confirmar la identidad del compuesto G28 se procedió a la realización de un espectro de 13C RMN (Figura 9), todas las señales descritas de los espectros de 1H y 13C RMN se detallan en la Figura 10. Dicho espectro mostró un número de señales consistente con la existencia de confórmeros en la molécula y con unos desplazamientos químicos coincidentes con los descritos en bibliografía para (lZ,3Z)-l,4-Di(4-hidroxifenil)-2,3- diformamido-l,3-butadieno (Zuck et al, J. Nat. Prod. 2011; 74: 1653-7). Así mismo, el número de señales y desplazamientos químicos observados en el espectro de 1H RMN también están de acuerdo con los descritos para esta molécula. Se concluye por lo tanto, que el compuesto G28 obtenido en la cromatografía guiada por bioensayo del extracto 08 055 C08 posee la estructura de (lZ,3Z)-l,4-Di(4-hidroxifenil)-2,3- diformamido- 1 ,3 -butadieno.
Figure imgf000041_0001
G28 (NPS0156)
5.2.2. Elucidación de la estructura de G27 (NPS0155)
El compuesto G27 posee una formula molecular C18H16N205 según se deduce del análisis de su espectro de masas (ESI-TOF) (m/z 341.1116, calculado para [M+H]+ 341.1132, Δ=-4.6 ppm). Al igual que ocurría en el caso del compuesto G28, la presencia en el espectro de masas (Figura 11) de aductos de amonio (m/z 358.1365), sodio (m/z 363.0935) y potasio (m/z 379.0676) corroboran la fórmula molecular propuesta. La molécula parece tener por lo tanto la misma naturaleza química que el compuesto G28, incluyendo un átomo de oxígeno adicional en su estructura. La búsqueda de su fórmula molecular en el Diccionario de Productos Naturales identificó en este caso tres moléculas posibles, cephalinone B, acetylnybomycine y picrasidine E, ninguna de ellas relacionada con dicho compuesto. Parecía ser, sorprendentemente, que el compuesto G27 era un nuevo producto natural. Al igual que para el compuesto G28, el DMSO-d6 se reveló como el disolvente más apropiado para llevar a cabo los experimentos de RMN. El espectro de protón, 1H RMN, (Figura 12) mostró mayor complejidad que el del compuesto G28, con la existencia de numerosas señales en las zonas de protones aromáticos y/o de doble enlace y en la de protones unidos a heteroátomo. La presencia de un oxígeno adicional en la estructura rompería la simetría de este compuesto y el número de señales observables en el espectro se incrementaría notablemente, teniendo en cuenta la existencia ahora de cuatro confórmeros de amida (cis-cis, trans-trans, cis-trans y trans-cis) cada uno de los cuales daría lugar a señales distintas. Sería de esperar por lo tanto la existencia de 64 señales distintas (16 H χ 4 conformaciones) en el espectro de protón de la molécula. Una inspección detallada del espectro de 1H RMN mostró la presencia de 12 señales de protones fenólicos (δΗ 9.67, 9.66, 9.62, 9.60, 9.20, 9.16, 9.13, 9.10, 9.02, 8.97 (χ2) y 8.92), confirmando de este modo la presencia de un hidroxilo fenólico adicional con respecto al compuesto G28. Para localizar dicho grupo fenólico se analizó la región del espectro correspondiente a los protones aromáticos. En dicha región se observa la presencia de dobletes a 7.02 (J=2.0 Hz), 7.00 (J=2.0 Hz), 6.94 (J=2.0 Hz) y 6.92 (J=2.0 Hz) que correlacionaban en el espectro 1H-1H COSY con un grupo de señales entre 6.77 y 6.82 ppm y en HMBC con carbonos a 121.3-121.6 ppm y a 145.1-145.6 ppm. El grupo de señales a 6.77-6.82 ppm en protón correlacionaba a su vez con un multiplete centrado a 6.70 ppm en el espectro de COSY y con señales de carbono a 115.8-116.6 y 145.1-145.6 en el espectro de HMBC. Por último, el multiplete centrado a 6.70 ppm correlacionaba en HMBC con carbonos a 126.5-126.9 ppm y a 144.9-145.3 ppm. Todos estos datos están en concordancia con el reemplazo de uno de los grupos 4-hidroxifenilo presentes en la estructura del compuesto G28 por 3-4- dihidroxifenilo en el compuesto G27 (Figura 13). Aparte de las señales ya comentadas, en el espectro de protón se observan otras señales correspondientes a los protones de los grupos H de amida a δΗ 9.48 (s,x 2), 9.36 (s), 9.35 (s), 9.30 (d), 9.26 (d), 9.22 (d) y 9.17(d) ppm, cuatro de ellas singletes correspondientes a las conformaciones de amida cis y las otras cuatro dobletes, correspondientes a las trans. Del mismo modo, se observan las señales de los protones de los dos grupos formamida a 8.19 (s), 8.18 (sx 2), y 8.17 (s) (cis), y a 7.86 (d), 7.84 (d), 7.79 (d) y 7.77 (d) (trans). Se completan las señales observadas en el espectro con las correspondientes a los protones del sustituyente 4-hidroxibencilo (7.30-7.38 y 6.72- 6.77 ppm) y las de ocho singletes correspondientes a los protones Hl y H4 del butadieno presente en la molécula (δΗ 6.46 (χ2), 6.43, 6.39, 6.39, 6.38, 6.36, 6.32). Todas las restantes señales no descritas anteriormente del espectro de 13C RMN (Figura 14) y las correlaciones observadas en los espectros bidimiensionales de COSY, HSQC y HMBC corroboran la estructura propuesta. El compuesto G27, obtenido en la cromatografía guiada por bioensayo del extracto 08 055 C08, posee por lo tanto la estructura de (lZ,3Z)-l-(3,4-dihidroxifenil)-4-(4-hidroxifenil)-2,3- diformamido-l,3-butadieno. La búsqueda bibliográfica de la estructura confirmó además que se trata de un nuevo producto natural.
Figure imgf000043_0001
EJEMPLO 6. Efecto protector de los picos G27 (o compuesto NPS0155) y G28 (NPS0156) sobre la muerte neuronal inducida por estrés oxidativo
A partir de los resultados anteriores los investigadores decidieron analizar el efecto neuroprotector de los compuestos PS0155 y PS0156. Los ensayos fueron realizados sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC, mantenidas como se detalla en el Ejemplo 2. Se analizó a tiempo real la inhibición producida por ambos compuestos de la muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que produce daño oxidativo (generando radicales libres como peróxido de hidrógeno, anión superóxido, radical hidroxilo) lo que desencadena muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 16 pocilios específicas para el ensayo a tiempo real con el sistema RTCA (Real-Time Cell Analyzer, XCelligence, Roche) con una concentración celular de 5x104 células/pocilio. Tras 24 h de incubación de las células a 37°C y 5% C02 se procedió a los tratamientos celulares para las condiciones de control (medio de cultivo); XXO (xantina 10 μΜ7 xantina oxidasa 60 mU/mL); XXO más G27 o G28 a 10, 40, 100, 400, 1000 ó 4000 ng/ml. Las células fueron incubadas (a 37°C y 5% C02) con estos tratamientos durante 72 h, recogiendo lecturas cada 10 minutos. Los valores que se obtienen son unidades arbitrarias indicadas por el índice celular, calculada a partir de los valores de impedancia, que es una magnitud que establece la relación entre la tensión y la intensidad de corriente de las células adheridas y que se usa como medida de viabilidad celular.
Los resultados obtenidos para el compuesto PS0155 se muestran en la Figura 15 como el índice celular normalizado (A) de cada condición analizada a lo largo del tratamiento y como porcentaje de muerte celular (B) para cada tratamiento referido a la muerte producida por la XXO a 20 h post-tratamiento. Se observó protección de la muerte en el rango de 100 a 400 ng/ml de PS0155, siendo la máxima del 27% a 100 ng/ml, por lo que este compuesto muestra un efecto protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo. Los resultados obtenidos para el compuesto PS0156 se muestran en la Figura 16 como el índice celular normalizado (A) de cada condición analizada a lo largo del tratamiento y como porcentaje de muerte celular (B) para cada tratamiento referido a la muerte producida por la XXO a 20 h post-tratamiento. Se observó protección de la muerte en el rango de 10 a 1.000 ng/ml de PS0156, siendo la máxima del 69 % a 100 ng/ml, por lo que este compuesto muestra un efecto protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo.
EJEMPLO 7. Efecto antioxidante de los compuestos NPS0155 (G27) y NPS0156 (G2S) A partir de los resultados anteriores los investigadores decidieron analizar la capacidad antioxidante in vitro de los compuestos PS0155 y PS0156 mediante el ensayo TEAC, descrito en el Ejemplo 2. Para cuantificar la capacidad antioxidante se utilizó una curva estándar con concentraciones crecientes de trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina E), de tal forma que los resultados se indican como medida de equivalentes trolox (TE). El ensayo de PS0155 dio un resultado de 81±19 μΜ TE^g compuesto, lo que indica que este compuesto muestra capacidad antioxidante in vitro. El ensayo de PS0156 dio un resultado de 104±29 μΜ TE^g compuesto, lo que indica que este compuesto muestra capacidad antioxidante in vitro. EJEMPLO 8. Efecto antiapoptótico de los compuestos NPS0155 y NPS0156 en células con APP salvaje y mutado
A partir de los resultados anteriores los investigadores decidieron analizar el efecto antiapoptótico de los compuestos PS0155 y PS0156. Los ensayos fueron realizados sobre dos líneas de células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC transfectadas establemente con construcciones que expresan el gen de la proteína precursora de amiloide (APP) que codifica para la isoforma mayoritariamente expresada en el cerebro, de 695 aminoácidos, clonadas en el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen). Una de las líneas expresa el gen APP salvaje (APPwt) y la otra expresa el gen APP con la mutación sueca (APPswe) que es una mutación doble en el exón 16 del gen y produce una transversión de G a T resultando en el cambio de aminoácido Lys595Asn y otra transversión de A a C que produce el cambio Met596Leu, estando dicha mutación relacionada con la enfermedad de Alzheimer en su forma senil o hereditaria. Las células fueron mantenidas como las células parentales SK-N-MC, como se detalla en el Ejemplo 2, utilizando geneticina a 400 μg/ml como antibiótico de selección. Para determinar el efecto sobre la apoptosis (muerte celular programada) de los compuestos NPS0155 y NPS0156, se analizó la fragmentación de DNA mediante citometría de flujo, producida por el tratamiento con camptotecina (CPT) que inhibe la enzima topoisomerasa I, lo que impide la duplicación del DNA y desencadena muerte celular apoptótica. Las dos líneas celulares, en pase no superior a 10, fueron sembradas sobre placas de 12 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 4x105 células/pocilio. Tras 24 h de incubación de las células a 37°C y 5% C02 se procedió al pre-tratamiento de las células con 4 y 10 μg/mL de NPS0155 o de NPS0156 durante 24 h; posteriormente se trataron con 50 μΜ CPT durante 6 h. Tras el tratamiento las células se recogieron junto con su medio de cultivo y se centrifugaron a 300xg durante 5 min. Se eliminó el medio, se realizó un lavado con PBS y se fijaron durante 2 minutos con 500 μΐ^ de etanol al 70% a -20°C. Una vez fijadas se centrifugaron a 400xg durante 5 min, se lavaron con PBS y se les añadió yoduro de propidio a 0.05 mg/mL, diluido en tampón de ciclo (Citrato sódico 0.1%, Nonidet P- 40 0.3% y RNAsa 0.02 mg/mL) y se incubaron 1 hora a 37°C. Se mantuvieron 18 h a 4°C y, pasado este tiempo, se analizaron por citometría de flujo, comparando la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA.
Los resultados obtenidos para el compuesto PS0155 en las células APPwt se recogen en la Figura 17 donde se muestra el porcentaje de apoptosis en la región sub- Gl de cada una de las condiciones (A), así como el porcentaje de la inhibición de la apoptosis de cada tratamiento referido a la apoptosis producida por CPT (B). Se observó protección del PS0155 a las dos dosis ensayadas en las células APPwt.
Los resultados obtenidos para el compuesto PS0155 en las células APPswe se recogen en la Figura 18 donde se muestra el porcentaje de apoptosis en la región sub- Gl de cada una de las condiciones (A), así como el porcentaje de la inhibición de la apoptosis de cada tratamiento referido a la apoptosis producida por CPT (B). Se observó protección del PS0155 a las dos dosis ensayadas en las células APPswe.
Los resultados obtenidos para el compuesto PS0156 en las células APPwt se recogen en la Figura 19 donde se muestra el porcentaje de apoptosis en la región sub- Gl de cada una de las condiciones (A), así como el porcentaje de la inhibición de la apoptosis de cada tratamiento referido a la apoptosis producida por CPT (B). Se observó protección del PS0156 a las dos dosis ensayadas en las células APPwt.
Los resultados obtenidos para el compuesto PS0156 en las células APPswe se recogen en la Figura 20 donde se muestra el porcentaje de apoptosis en la región sub- Gl de cada una de las condiciones (A), así como el porcentaje de la inhibición de la apoptosis de cada tratamiento referido a la apoptosis producida por CPT (B). Se observó protección del NPS0156 a las dos dosis ensayadas en las células APPswe.
En conclusión, en este ejemplo se muestra que los compuestos PS0155 y PS0156 presentan un efecto protector de la apoptosis en células humanas de origen neuronal que expresan el APP salvaje y mutado.
EJEMPLO 9. Síntesis y diseño de análogos de xantocilinas con capacidad neuroprotectora
9.1. Síntesis de análogos de xantocilinas A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron diseñar un proceso de síntesis de derivados de xantocilinas basados en el compuesto PS0155, para lo que se basaron en la síntesis de la xanthocillin X con algunas modificaciones (Tatsuta et al 2005. Tetrahedron Letters 46: 5017-20). La ruta de síntesis diseñada se representa en la Figura 21. Dicha síntesis consiste en transformar el éster del ácido arilpropiólico (1) en su amida, (2); esta amida (2) se convierte en el estannano (3) por adición de hidruro de tributilestaño. Por oxidación de Baumgarten se obtiene el carbamato (4), que tiene la estereoquímica apropiada para dar por una reacción de homoacoplamiento catalizada por paladio el producto (5). Este producto tiene el esqueleto correspondiente al tipo de análogo de interés. Las dos últimas reacciones tienen por objeto desproteger los carbamatos e introducir los grupos formamido.
Esta estrategia de síntesis admite cierta flexibilidad. Alternativamente a la ruta 3→ 4 → 5→ 6, puede pasarse de 3 al isocianato 7 mediante la oxidación de Baumgarten (sin el atrapado con el silanol), transformar 7 en la formamida 8 y realizar entonces el homoacoplamiento para dar 6 (ruta 3 → 7 → 8 → 6) o también, convertir el carbamato 4 en la formamida 8 y realizar entonces el homoacoplamiento para dar 6 (ruta 3→ 4→ 8→ 6).
Utilizando la ruta descrita para la xanthocillin X con algunas modificaciones se obtiene el compuesto que se esquematiza en la Figura 22 y para generar diferentes análogos del compuesto G27 se introducen en las posiciones Arl y Ar2 los siguientes grupos:
• hidroxifenil: 1 ó 2 radicales (A y B) (p.e., 4-hidroxifenil)
• metoxifenil: 1 ó 2 radicales (C, D y E) (p.e., 4-metoxifenil)
• 1,3-benzodioxolil (F) (p.e., l,3-benzodioxol-5-il) · metilfenil: 1 ó 2 radicales (G y H) (p.e., 4-metilfenil)
• etilfenil: 1 ó 2 radicales (I y J) (p.e., 4-etilfenil)
• fenil (K)
• alcoxihidroxifenil: 1 ó 2 radicales (L, M o N) (p.e., 3-hidroxi-4-metoxifenil o 3- hidroxi-4-etoxifenil) • etoxifenil: 1 ó 2 radicales (O y P) (p.e., 4-etoxifenil)
A partir de los grupos A a P descritos en la Figura 22, se realizaron estudios de combinación de residuos en la molécula de fórmula (II), analizándose el efecto de las diferentes estructuras sobre el índice de lipofilicidad teórica, el cual resulta esencial para predecir el paso de barrera hematoencefálica (BHE), siendo éste un parámetro que condiciona el uso de moléculas como potenciales neuroprotectores, tal y como se muestra en la Figura 23.
9.2. Diseño de nuevos análogos derivados de xantocilinas para su uso como neuroprotectores
A partir de los distintos derivados mostrados en el punto anterior, los inventores decidieron analizar la lipofilicidad de las combinaciones de sustituyentes en las posiciones Arl y Ar2 de fórmula (II). La lipofilicidad fue determinada por el valor del CLOGP, definido como el log P de un compuesto, el cual es el coeficiente de partición entre n-octanol y agua, log(coctanol/cagua). La lipofilicidad teórica resulta esencial para predecir el paso de barrera hematoencefálica (BHE) por difusión pasiva, siendo dicho paso mayor conforme mayor es el valor de CLOGP. Los resultados de los valores de CLOGP se presentan en la Figura 23, y fueron calculados a partir de la aplicación on-line Osiris Property Explorer (http://www.organic- chemistry.org/prog/peo/). Sorprendentemente las diferentes combinaciones en los residuos incrementan notablemente los valores de CLOGP, y por tanto su potencial paso de BHE, respecto a los compuestos PS0155 (combinación A+B) y PS0156
(A+A).
9.3. Síntesis particular de los compuestos NPS0158 (G+G), NPS0159 (F+F), NPS016 +P), NPS0161 (H+H) y NPS0163 (J+J)
Figure imgf000048_0001
De forma particular, para la síntesis de los compuestos PS0158 (G+G), PS0159 (F+F), PS0160 (P+P), PS0161 (H+H) y PS0163 (J+J) se sigue la ruta mostrada en la Figura 24 que ejemplifica la ruta sintética descrita para la síntesis de los compuestos de fórmula (II). Brevemente, se parte del aldehido comercial 9, que se transformó en el alquino 11 mediante una reacción de Corey-Fuchs y atrapado in situ del acetiluro recién formado con cloroformiato de metilo; el posterior tratamiento con amoníaco acuoso en TUF permite aislar la propiolamida 12. La hidroestannilación del alquino da lugar a la aparición de dos regioisómeros, siendo mayoritario el isómero 13, que se transforma en el isocianato 14 por reacción con acetato de plomo (transposición de Baumgarten), reduciéndolo posteriormente con superhidruro. Se obtiene así el estannil derivado 15, que se dimerizó en presencia de cloruro de cobre.
De forma particular, se siguen las siguientes etapas para la ruta de síntesis de los compuestos PS0158 (G+G), PS0159 (F+F), PS0160 (P+P), PS0161 (H+H) y PS0163 (J+J).
9.3.1. Síntesis de los compuestos 10 a partir de los compuestos 9:
Figure imgf000049_0001
Procedimiento general:
Sobre una disolución de PPh3 en CH2CI2 (1,7 M), enfriada a 0 °C, se adiciona bajo atmósfera de argón, una disolución de CBr4 en CH2CI2 (0,7 M). La disolución incolora vira a color amarillo y luego a rojizo. Se deja en agitación 30 min a 0 °C. A continuación, se añade gota a gota el aldehido 9 y se deja reaccionar a 0 °C durante 1,5 h. Se diluye con CH2CI2 (100 mL) y se añade hexano (50 mL) precipitando óxido de trifenilfosfina. Se filtra a vacío y el sólido se lava con más mezcla CH2Cl2/hexano (2: 1; 150 mL, x2). Las aguas de filtración se concentran a sequedad dando lugar a un sólido que se suspende en CH2CI2 y se carga en una columna cromatográfica de gel de sílice (100% CH2CI2) dando lugar a los compuestos deseados 10.
Síntesis de l-(2,2-dibromovinil)-4-metilbenceno
Figure imgf000050_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en rendimiento cuantitativo (sólido amarillo pálido), tras 2 h de reacción a 0 °C, empleando 4- metilbenzaldehido (3,05 g, 25,37 mmol), PPh3 (29,94 g, 1 14, 16 mmol) y CBr4 (20, 19 g, 60,89 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de 5-(2,2-dibromovinil)-L3-benzodioxol
Figure imgf000050_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 97% de rendimiento (aceite amarillo pálido), tras 30 min de reacción a 0 °C, empleando 1,3- benzodioxol-5-carbaldehido (4,00 g, 26,64 mmol), PPh3 (18, 17 g, 69,27 mmol) y CBr4 (11,49 g, 34,63 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de l-(2,2-dibromovinil)-4-etoxibenceno
Figure imgf000050_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 86% de rendimiento (aceite amarillo pálido), tras 1 h de reacción a 0 °C, empleando 4- etoxibenzaldehido (4,32 g, 28,76 mmol), PPh3 (19,61 g, 74,78 mmol) y CBr4 (12,40 g, 37,39 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de 4-(2,2-dibromovinil)-L2-dimetilbenceno
Figure imgf000050_0004
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 99% de rendimiento (aceite amarillo pálido), tras 2 h de reacción a 0 °C, empleando 3,4- dimetilbenzaldehido (5,33 g, 39,73 mmol), PPh3 (27,09 g, 103,30 mmol) y CBr4 (17, 13 g, 51,64 mmol) como sustancias de partida. Síntesis de l-(2,2-dibromovinil)-4-etilbenceno
Figure imgf000051_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 79 % de rendimiento (aceite amarillo pálido), tras 3 h de reacción a 0 °C, empleando 4- etilbenzaldehido (5,00 g, 37,26 mmol), PPh3 (25,41 g, 96,88 mmol) y CBr4 (16,06 g, 48,44 mmol) como sustancias de partida.
9.3.2. Síntesis de los compuestos li a partir de los compuestos 10:
Figure imgf000051_0002
t.a., 3 h
Procedimiento general:
A una disolución de la sustancia de partida 10 en THF (0,07 M), enfriada a -78 °C, se añade gota a gota n-BuLi (2,5 M en hexanos). La disolución se deja en agitación a esta temperatura durante lh. A continuación, se deja llegar a t.a. (t= 1 h) y se vuelve a enfriar a -78 °C. Se añade ClC02Me, se deja llegar a t.a. y se agita durante 3 h. Se añade H4C1 ac. sat. hasta pH= 7 y a continuación se diluye con AcOEt (250 mL) y H20 (100 mL). La fase orgánica se decanta, se seca con Na2S04 anhidro, se filtra, el disolvente se elimina a vacío y el residuo se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (0-5% AcOEt/hexanos) dando lugar al producto esperado 11.
Síntesis de 3-(4-metilfenil)prop-2-inoato de metilo
Figure imgf000052_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 89% de rendimiento (aceite amarillo pálido), empleando l-(2,2-dibromovinil)-4-metilbenceno (6,93 g, 25, 11 mmol), n-BuLi (24 mL, 2,5 M en hexanos; 60,27 mmol) y ClC02Me (2,70 mL, 35, 15 mmol), como sustancias de partida.
Síntesis de 3-(L3-bezodioxol-5-il)pro-2-inoato de metilo
Figure imgf000052_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 84% de rendimiento (sólido blanco), empleando 5-(2,2-dibromovinil)-l,3-benzodioxol (7,85 g, 25,65 mmol), n-BuLi (20,5 mL, 2,5 M en hexanos; 51,32 mmol) y ClC02Me (2,78 mL, 35,91 mmol), como sustancias de partida.
Síntesis de 3-(4-etoxifenil)prop-2-inoato de metilo
Figure imgf000052_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 82% de rendimiento (sólido amarillo), empleando l-(2,2-dibromovinil)-4-etoxibenceno (7,50 g, 24.,0 mmol), n-BuLi (19,6 mL, 2,5 M en hexanos; 49,01 mmol) y ClC02Me (2,66 mL, 34,30 mmol), como sustancias de partida.
Síntesis de 3-(3,4-dimetilfenil)prop-2-inoato de metilo
Figure imgf000052_0004
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 88% de rendimiento (aceite castaño), empleando 4-(2,2-dibromovinil)-l,2-dimetilbenceno (11,40 g, 39,31 mmol), n-BuLi (31,5 mL, 2,5 M en hexanos; 78,62 mmol) y ClC02Me (4,26 mL, 55,03 mmol), como sustancias de partida. Síntesis de 3-(4-etilfenil)prop-2-inoato de metilo
Figure imgf000053_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 93% de rendimiento (aceite amarillo pálido), empleando l-(2,2-dibromovinil)-4-etilbenceno (8,50 g, 29,31 mmol), n-BuLi (23,4 mL, 2,5 M en hexanos; 58,60 mmol) y ClC02Me (3, 18 mL, 41,03 mmol), como sustancias de partida.
9.3.3. Síntesis de los compuestos 12 a partir de los compuestos 11:
Figure imgf000053_0002
Procedimiento general:
Sobre una disolución de la sustancia de partida 11 en THF (40 mL) se añade H4OH (40 mL). La reacción se deja en agitación a t.a. durante 3 días. Se eliminan los disolventes a sequedad y el sólido obtenido se tritura con Et20 (3x10 mL) dando lugar al producto deseado 12.
Síntesis de 3-(4-metilfenil)prop-2-inamida
Figure imgf000053_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en rendimiento cuantitativo (sólido crema), tras 2 días de reacción, empleando 3-(4-metilfenil)prop-2- inoate de metilo (3,88 g, 22,27 mmol) como sustancia de partida.
Síntesis de 3-(L3-bezodioxol-5-il)prop-2-inamida
Figure imgf000054_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en rendimiento cuantitativo (sólido blanco), tras 3 días de reacción, empleando 3-(l,3-benzodioxol-5- il)prop-2-inoate de metilo (3,78 g, 18,51 mmol) como sustancia de partida. Síntesis de 3-(4-etoxifenil)prop-2-inamida
Figure imgf000054_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 75% de rendimiento (sólido blanco), tras 3 días de reacción, empleando 3-(4-etoxifenil)prop-2- inoato de metilo (4,10 g, 20,07 mmol) como sustancia de partida.
Síntesis de 3-(3,4-dimetilfenil)prop-2-inamida
Figure imgf000054_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 82% de rendimiento (sólido blanco), tras 1 día de reacción, empleando 3-(3,4-dimetilfenil)prop- 2-inoato de metilo (6,52 g, 34,64 mmol) como sustancia de partida. Síntesis de 3-(4-etilfenil)prop-2-inamida
Figure imgf000054_0004
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en rendimiento cuantitativo (sólido crema), tras 2 días de reacción, empleando 3-(4-etilfenil)prop-2- inoato de metilo (5, 10 g, 27,09 mmol) como sustancia de partida. 9.3.4. Síntesis de los compuestos 13 a partir de los compuestos 12:
Figure imgf000055_0001
12 0°C, 0,5 h 13
Procedimiento general:
Sobre una disolución de la sustancia de partida 12 en THF (80 mL), enfriada a 0 °C, se añade Pd(PPh3)4 y a continuación, gota a gota, Bu3SnH. La mezcla de reacción se agita a 0 °C durante 30 min. Se eliminan los disolventes a sequedad y el residuo se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (0-20% AcOEt/hexanos) dando lugar al producto esperado 13.
Síntesis de ( !r)-3-(4-metilfenil)-2-(tribultilestannil)acrilamida
Figure imgf000055_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 67% de rendimiento (aceite castaño), tras 30 min de reacción a 0 °C, empleando 3-(4- metilfenil)prop-2-inamida (3,84 g, 29,27 mmol), Bu3SnH (19,4 mL, 73, 18 mmol) y Pd(PPh3)4 (1,69 g, 1,46 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de ( !r)-3-(L3-bezodioxol-5-il)-2-(tributilestannil)acrilamida
Figure imgf000055_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 58% de rendimiento (aceite amarillo), tras 3 h de reacción a 0 °C, empleando 3 -(1,3- benzodioxol-5-il)prop-2-inamida (3,82 g, 23,71 mmol), Bu3SnH (6,90 mL, 25,98 mmol) y Pd(PPh3) (0,50 g, 0,43 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de ( !r)-3-(4-etoxifenil)-2-(tributilestannil)acrilamida
Figure imgf000055_0004
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 76% de rendimiento (aceite amarillo), tras 2 h de reacción a 0 °C, empleando 3-(4- etoxifenil)prop-2-inamida (2,35 g, 12,42 mmol), Bu3SnH (3,95 mL, 14,90 mmol) y Pd(PPh3)4 (0,29 g, 0,25 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de ( !r)-3-(3,4-dimetilfenil)-2-(tributilestannil)acrilamida
Figure imgf000056_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 54% de rendimiento (aceite amarillo), tras 2 h de reacción a 0 °C, empleando 3 -(3, 4- dimetilfenil)prop-2-inamida (4, 10 g, 28,23 mmol), Bu3SnH (9,00 mL, 33,88 mmol) y Pd(PPh3)4 (0,65 g, 0,56 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de ( !r)-3-(4-etilfenil)-2-(tributilestannil)acrilamida
Sn(n-Bu)3
CONH,
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 72% de rendimiento (aceite amarillo), tras 1,5 h de reacción a 0 °C, empleando 3-(4- etilfenil)prop-2-inamide (3,93 g, 27,06 mmol), Bu3SnH (8,60 mL, 32,47 mmol) y Pd(PPh3)4 (0,62 g, 0,54 mmol) como sustancias de partida.
9.3.5. Síntesis de los compuestos 14 a partir de los compuestos 13:
Figure imgf000056_0002
t.a., 1 h
13 14
Procedimiento general:
Sobre una disolución de la sustancia de partida 13 en THF (140 mL), enfriada a 0 °C, se añade Pb(OAc)4. Se deja llegar a t.a. y se agita durante 1 h. A continuación, se diluye con H20 (100 mL) y AcOEt (100 mL). Se decanta la fase orgánica y la fase acuosa se extrae con más AcOEt (2x100 mL). Las fases orgánicas combinadas se secan con Na2S04 anhidro, se filtran, el disolvente se elimina a vacío y el residuo se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice (0-5% AcOEt/hexanos) dando lugar al producto esperado 14.
Síntesis de (j )-tributil[l-isocianato-2-(4-metilfenil)vinil]estannano
Figure imgf000057_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 38% de rendimiento (aceite amarillo), tras 1 h de reacción a temperatura ambiente, empleando (JE)-3-(4-metilfenil)-2-(tributilestannil)acrilamida (8,81 g, 19,57 mmol) y Pb(OAc)4 (10,40 g, 23,48 mmol) como sustancias de partida. Síntesi s de (iT)-tributil [ 1 -i socianato-2-( 1 , 3 -bezodioxol-5 -iDvinil] estannano
Figure imgf000057_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en rendimiento cuantitativo (aceite amarillo, está impuro), tras 2 h de reacción a temperatura ambiente, empleando (JE)-3-(l,3-benzodioxol-5-il)-2-(tributilestannil)acrilamida (6,01 g, 12,60 mmol) y Pb(OAc)4 (6,70 g, 15, 11 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de (j )-tributil[l-isocianato-2-(4-etoxifenil)vinil]estannano
Figure imgf000057_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 38% de rendimiento (aceite amarillo), tras 1,5 h de reacción a temperatura ambiente, empleando (JE)-3-(4-etoxifenil)-2-(tributilestannil)acrilamida (4,51 g, 9,40 mmol) y Pb(OAc)4 (5,00 g, 11,27 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de (j )-tributil[l-isocianato-2-(3,4-dimetilfenil)vinil]estannano
Figure imgf000057_0004
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 49% de rendimiento (aceite amarillo), tras 4 h de reacción a temperatura ambiente, empleando (£)-3-(3,4-(ümetilfenil)-2-(tributilestannil)acrilamida (6,98 g, 15,03 mmol) y Pb(OAc)4 (8,00 g, 18,04 mmol) como sustancias de partida. Síntesis de (j )-tributil[l-isocianato-2-(4-etilfenil)vinil]estannano
Figure imgf000058_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 57% de rendimiento (aceite amarillo), tras 5 h de reacción a temperatura ambiente, empleando (JE)-3-(4-etilfenil)-2-(tributilestannil)acrilamida (8,95 g, 19,28 mmol) y Pb(OAc)4 (10,26 g, 23, 13 mmol) como sustancias de partida.
9.3.6. Síntesis de los compuestos 15 a partir de los compuestos 14:
Figure imgf000058_0002
Procedimiento general: Sobre una disolución de la sustancia de partida 14 en THF (100 mL), enfriada a -78 °C, se añade gota a gota, bajo atmósfera de argón, LiEt3BH (1M en THF). Se calienta a -40 °C y se deja reaccionar 2 h a esta temperatura. A continuación, se deja llegar a a t.a. y se añade NaHC03 ac.sat. hasta alcanzar pH= 7. Se añade Et20 (100 mL), se decanta la fase orgánica, se seca con Na2S04 anhidro, se filtra, el disolvente se elimina a vacío y el residuo se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (0-10% AcOEt/hexanos) dando lugar al producto esperado 15.
Síntesis de (iT)-N-[2-(4-metilfenin- 1 -tributilestannil)vinil]formamida
Figure imgf000058_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 95% de rendimiento (aceite incoloro), tras 1,5 h de reacción, empleando (£)-tributil[l- isocianato-2-(4-metilfenil)vinyl]estannano (3,31 g, 7,38 mmol) y LiEt3BH (8, 12 mL, 1 M en THF; 8, 12 mmol) como sustancias de partida. Síntesis de (E)-N-[2-(l ,3-benzodioxol-5-il)-l-tributilestannil)vinil]formamida
Figure imgf000059_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 18% de rendimiento (aceite castaño), tras 1 h de reacción, empleando (£)-tributil[l-isocianato- 2-(l,3-benzodioxol-5-il)vinil]estannano (6,03 g, 12,60 mmol) y LiEt3BH (13,23 mL, 1 M en THF; 13,23 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de (iT)-N-[2-(4-etoxifenin- 1 -tributilestannil)vinil]formamida
Figure imgf000059_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 51% de rendimiento (aceite amarillo), tras 1 h de reacción, empleando (£)-tributil[l-isoiyanato- 2-(4-etoxifenil)vinil]estannano (2,01 g, 4,20 mmol) y LiEt3BH (4,41 mL, 1 M en THF; 4,41 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de (E)-N-[2-(3 ,4-dimetilfeniQ- 1 -tributilestannil)vinil]formamida
Figure imgf000059_0003
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 82% de rendimiento (aceite amarillo), tras 35 min de reacción, empleando (£)-tributil[l- isocianato-2-(3,4-dimetilfenil)vinil]estannano (3,40 g, 7,35 mmol) y LiEt3BH (7,72 mL, 1 M en THF; 7,72 mmol) como sustancias de partida.
Síntesis de (iT)-N-[2-(4-etilfenin- 1 -tributilestannil)vinil]formamida Sn(n-Bu)3
NHCHO
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 97% de rendimiento (aceite amarillo), tras 1 h de reacción, empleando (£)-tributil[l-isocianato- 2-(4-etilfenil)vinil]estannano (5, 10 g, 1 1,03 mmol) y LiEt3BH (11,58 mL, 1 M en THF; 11,58 mmol) como sustancias de partida.
9.3.7. Síntesis de los compuestos 6 a partir de los compuestos 15:
Figure imgf000060_0001
Procedimiento general:
Sobre una disolución de la sustancia de partida 15 en THF (30 mL), enfriada a 0 °C, se añade CuCI. A continuación, a la suspensión se le burbujea una corriente de aire mientras se mantiene la temperatura durante 6 h. Se diluye la mezcla con Et20 (100 mL) y se filtra a través de celita eluyendo con Et20 (4x20 mL). Las aguas de filtración se concentran a sequedad y el sólido verde se suspende en CH2C12 (100 mL) y se lava con H4OH ac. 10% hasta que los lavados salgan incoloros (7x70 mL). La fase orgánica se seca con Na2S04 anhidro, se filtra, el disolvente se elimina a vacío y el residuo se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice (0-2% MeOH/CH2Cl2). Se obtienen un sólido que se tritura con Et20 (+gotas de MeOH) dando lugar al producto esperado 6.
Síntesis de PS0158. (lZ2Z)-2-(formilamino)-l-(4-metilbenciliden)-3-(4- metilfenil)prop-2-enilformamida
OHC.
CHO Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 8% de rendimiento (sólido blanco), tras 4 h de reacción, empleando (E)-N-[2-(4-metilfenil)-l- (tributilestannil)vinil]formamida (3, 14 g, 6,97 mmol) y CuCl (2,07 g, 20,91 mmol) como sustancias de partida. 1H-RMN (DMSO-de, 250 MHz) δ ppm: Mezcla de rotámeros:
9,70-9,26 (m, 2H, CHO); [8, 19 (s) + 7,91-7,73 (m)] (2H, NH); 7,53-7,07 (m, 8H, ArH); 6,64-6,48 (m, 2H, alqueno); 2,30 (s, 6H, CH3).
Síntesis de NPS0159. (lZ2Z)-3-(1.3-benzodioxol-5-il)-l-(1.3-benzodioxol-5-ilmetilen)- 2-(formilamino)prop-2-enilformamida
Figure imgf000061_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 25% de rendimiento (sólido blanco), tras 2 h de reacción, empleando (E)-N-[2-(l,3- benzodioxol-5-il)-l-(tributilestannil)vinil]formamida (0,50 g, 1,04 mmol) y CuCl (0,3 1 g, 3, 12 mmol) como sustancias de partida. Se varía la purificación descrita en el procedimiento general: la mezcla de reacción se suspende en Me-THF (60 mL) y se lava con una disolución acuosa de amoníaco (10%, 20 mL x 3). La fase orgánica se concentra a sequedad, obteniéndose un sólido blanco que se tritura con EtOH y con Et20.
1H-RMN (DMSO-de, 250 MHz) δ ppm: Mezcla de rotámeros:
9,62-9,28 (m, 2H, CHO); [8, 18 (s) + 7,91-7,73 (m)] (2H, NH); 7,20-6,85 (m, 6H, ArH); 6,56-6,44 (m, 2H, alqueno); 6,03 (s, 4H, CH2).
Síntesis de NPS0160. (l 2Z)-2-(formilamino)-l-(4-etoxibenciliden)-3-(4- etoxifenil)prop-2-enilformamida
Figure imgf000061_0002
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtuvo en 39% de rendimiento (sólido blanco), tras 3 h de reacción, empleando (£)-N-[2-(4-etoxifenil)-l- (tributilestannil)vinil]formamida (1,03 g, 2, 15 mmol) y CuCl (0,43 g, 4,29 mmol) como sustancias de partida. Se varía la purificación descrita en el procedimiento general: la mezcla de reacción se suspende en Me-THF (60 mL) y se lava con una disolución acuosa de amoníaco (10%, 30 mL x 3). La fase orgánica se concentra a sequedad, obteniéndose un sólido blanco que se tritura con MeOH y con Et20.
1H-RMN (DMSO-de, 250 MHz) δ ppm: Mezcla de rotámeros: 9,60-9,27 (m, 2H, CHO); [8, 18 (s) + 7,90-7,75 (m)] (2H, NH); 7,52-6,85 (m, 8H, ArH); 6,56-6,46 (m, 2H, alqueno); 4,02 (q, J= 6,8 Hz, 4H, CH2); 1,31 (t, J= 6,8 Hz, 6H, CH3).
Síntesis de NPS0161. (l 2Z)-l-(3.4-dimetilbenciliden)-3-(3.4-dimetilfenil)-2- (formilamino)-prop-2-enilformamida
Figure imgf000062_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 55% de rendimiento (sólido blanco), tras 1 h de reacción, empleando (E)-N- [2-(3, 4- dimetilfenil)-l-(tributilestannil)vinil]formamida (1,38 g, 2,97 mmol) y CuCl (0,59 g, 5,95 mmol) como sustancias de partida.
Se varía la purificación descrita en el procedimiento general: la mezcla de reacción se suspende en Me-THF (50 mL) y se lava con una disolución acuosa de amoníaco (10%, 50 mL x 3). La fase orgánica se concentra a sequedad, obteniéndose un sólido blanco que se tritura con EtOH y con Et20.
1H-RMN (DMSO-de, 250 MHz) δ ppm: Mezcla de rotámeros:
9,69-9,28 (m, 2H, CHO); [8, 19 (s) + 7,90-7,70 (m)] (2H, NH); 7,38-7,03 (m, 6H, ArH); 6,62-6,42 (m, 2H, alqueno); 2,20 (s, 12H, CH3). Síntesis de NPS0163. (l 2Z)-2-(formilamino)-l-(4-etilbenciliden)-3-(4-etilfenil)-prop-
Figure imgf000063_0001
Siguiendo el procedimiento general, el compuesto citado se obtiene en 20% de rendimiento (sólido blanco), tras 1 h de reacción, empleando (E)-N- [2-(4-etilfenil)-l - (tributilestannil)vinil]formamida (1,50 g, 3,23 mmol) y CuCl (0,64 g, 6,46 mmol) como sustancias de partida.
Se varía la purificación descrita en el procedimiento general: la mezcla de reacción se diluye con Me-THF (50 mL) y se lava con una disolución acuosa de amoníaco (10%, 30 mL x 3). La fase orgánica se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra a sequedad, obteniéndose un sólido blanco que se tritura con MeOH y con Et20.
1H-RMN (DMSO-de, 250 MHz) δ ppm: Mezcla de rotámeros:
9,67-9,31 (m, 2H, CHO); [8, 19 (s) + 7,93-7,76 (m)] (2H, NH); 7,50-7, 15 (m, 8H, ArH); 6,64-6,50 (m, 2H, alqueno); 2,59 (q, J= 6,7 Hz, 4H, CH2); 1,17 (t, J= 6,7 Hz, 6H, CH3). La purificación de los compuestos PS0158, PS0159, PS0160, PS0161 y PS0163 se realiza mediante la formación de una suspensión en MeTHF, lavada con amoníaco acuso, para eliminar restos de cobre. Posteriormente se concentra la suspensión orgánica y se tritura con alcohol (MeOH o EtOH) y con Et20, obteniendo los compuestos finales como sólidos blancos de pureza elevada (>95%).
EJEMPLO 10. Efecto protector de la muerte celular de los análogos NPS0158 (G+G), NPS0159 (F+F), NPS0160 (P+P) y NPS0161 (H+H).
Siguiendo con el estudio de los análogos sintetizados los investigadores decidieron analizar el efecto neuroprotector de los mismos. Los ensayos fueron realizados sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC, mantenidas como se detalla en el Ejemplo 2. Se analizó a tiempo real la inhibición producida por los compuestos de la muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa (XXO) que produce daño oxidativo, lo que desencadena muerte celular. El ensayo se realizó siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 6, ensayando los análogos a 40, 100, 400 ó 1000 ng/ml en presencia de XXO. Las células fueron incubadas (a 37°C y 5% C02) con estos tratamientos durante 72 h, recogiendo lecturas cada 10 minutos. Los valores que se obtienen son unidades arbitrarias indicadas por el índice celular, calculada a partir de los valores de impedancia y que se usa como medida de viabilidad celular.
Los resultados obtenidos para los análogos se muestran en las Figuras 25-28 como el índice celular normalizado (A) de cada condición analizada a lo largo del tratamiento; y como porcentaje de muerte celular (B) para cada tratamiento referido a la muerte producida por la XXO a 20 h post-tratamiento. Las figuras 25, 26, 27 y 28 corresponden respectivamente a los resultados de los análogos PS0158 (G+G), PS0159 (F+F), PS0160 (P+P) y PS0161 (H+H). Se indica * para la diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0,05). Se observó protección de la muerte para los cuatro análogos sintetizados, siendo la máxima del 27% a 1000 ng/ml para PS0158, del 35% a 1000 ng/ml para PS0159, del 23% a 100 ng/ml para PS0160 y del 26% a 100 ng/ml para PS0161. En resumen, estos análogos muestran un efecto protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo.
EJEMPLO 11. Efecto antioxidante de los análogos NPS0158 (G+G), NPS0159 (F+F), NPS0160 (P+P) y NPS0161 (H+H) en modelos in vitro y celulares.
11.1. Efecto antioxidante de los análogos NPS0158 y NPS0159 in vitro A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron evaluar la capacidad antioxidante in vitro de los análogos sintetizados, para lo que se utilizó un ensayo de medida de capacidad antioxidante válido para compuestos lipofílicos, según el método ABTS*+ (Samaniego et al. 2007. Analytica Chimica Acta 593 : 103-107). Este método se basa en la formación del catión radical ABTS*+ mediante la oxidación con persulfato amónico del reactivo ABTS [ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico], que puede ser determinado colorimétricamente. En este ensayo los compuestos con capacidad antioxidante suprimen la oxidación del radical de forma dependiente de concentración. Para cuantificar la capacidad antioxidante se usa una curva estándar con concentraciones crecientes de trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina E), de tal forma que los resultados se indican como medida de equivalentes trolox (TE). Los resultados obtenidos para los análogos PS0158 y PS0159 son 174±13 μΜ TE y 165+44 μΜ TE, respectivamente, para 0, 1 μg de cada compuesto, por lo que muestran una alta capacidad antioxidante in vitro.
11.2. Capacidad de reducción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) por los análogos NPS0158, NPS0159, NPS0160 y NPS0161 en un modelo celular.
A partir de los resultados anteriores los inventores decidieron evaluar la capacidad antioxidante de los análogos en un modelo celular. El ensayo de medida de ROS se realizó sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC, mantenidas como se detalla en el Ejemplo 2, sometidas a una agresión con xantina/xantina oxidasa (XXO). La medida de ROS se realiza mediante la adición de una sonda no fluorescente permeable en las células vivas (2',7'-diclorodihidrofluoresceina diacetato, H2DCFDA; Biotium) que es oxidada por la acción de ROS, generándose 2',7'-diclorofluoresceina (DCF) que puede ser detectada en un fluorímetro a 485 nm de excitación y 538 nm de emisión. Los resultados de fluorescencia fueron normalizados por la viabilidad celular, medida mediante la actividad lactato deshidrogenasa (LDH), utilizando el Cytotoxicity Detection Kit (LDH) de Roche. Los resultados obtenidos con los análogos sobre la producción de ROS se muestran en la Figura 29 como el porcentaje de ROS corregido por LDH respecto al tratamiento con XXO de cada análogo en una curva dosis respuesta. Se utilizó un compuesto conocido de control de reducción de ROS (C+). Se indica * para la diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO de acuerdo al test de Student (p<0,05). Se observó reducción de ROS para los cuatro análogos sintetizados, siendo la máxima del 34% a 100 ng/ml para PS0158, del 27% a 100 ng/ml para PS0159, del 31% a 100 ng/ml para PS0160, del 45% a 400 ng/ml para PS0161. En conclusión, estos análogos muestran capacidad antioxidante en células humanas de origen neuronal.
EJEMPLO 12. Efecto antiapoptótico de los análogos NPS0158 (G+G), NPS0159
(F+F), NPS0160 (P+P) y NPS0161 (H+H) en un modelo celular. Siguiendo con el estudio, los investigadores decidieron analizar el efecto antiapoptótico de los análogos sintetizados analizando la fragmentación de DNA celular mediante citometría de flujo. El ensayo de medida de fragmentación celular se realizó sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC, mantenidas como se detalla en el Ejemplo 2, y sometidas a una agresión con camptotecina (CPT), siguiendo la misma aproximación que se detalla en el ejemplo 8. Se usa Z-VAD-fmk a 50 μΜ como inhibidor comercial de la apoptosis. Los resultados obtenidos muestran protección de la apoptosis con PS0158 entre 1 y 10 g/ml, siendo máxima a 10 g/ml (28%); con PS0159 máxima del 23% a 10 Mg/ml; con PS0160 máxima del 30% a 1 Mg/ml y con PS0161 máxima del 35% a 0, 1 pg/ml. En la Figura 30 se recogen los histogramas representativos de un ensayo donde se muestra el porcentaje de apoptosis en la región sub-Gl de cada una de las condiciones. En conclusión, se observa un efecto protector de la apoptosis en células humanas de origen neuronal con los análogos sintetizados.
EJEMPLO 13. Permeabilidad pasiva de los análogos NPS0158 (G+G) y NPS0161 (H+H): predicción del paso de barrera hematoencefálica teórica e in vitro.
A continuación los investigadores decidieron estudiar la permeabilidad sobre la barrera hematoencefálica (BHE) de los análogos sintetizados mediante dos métodos: uno teórico usando la aproximación de Rishton et al. (Rishton et al. 2006. Curr Opin Drug Disc & Dev, 9[3] : 303) y otro in vitro mediante el ensayo PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) que mimetiza la BHE por medio de un sistema que incluye una mezcla de lípidos cerebrales muy semejante a la existente en la BHE humana, siguiendo las recomendaciones de Avdeef et al. (Avdeef et al. 2007. Journal of Pharmaceutical Sciences 96 [1 1] : 2893-2909). 13.1. Predicción del paso de barrera hematoencefálica teórica
Se utilizó la ecuación de Rishton para determinar el paso de barrera teórico, ya que esta fórmula tiene en cuenta los parámetros cLogP (coeficiente de partición octanol/agua) y PSA (área molecular de superficie polar) para obtener el valor de logBB, que se define como el coeficiente de partición del compuesto entre plasma y tejido cerebral. El cálculo de dicho parámetro para el análogo sintetizado PS0158 es de 0,34 y para PS0161 es de 0,44, lo que indica que ambos compuestos atraviesan de forma teórica la barrera (valores entre 0 y 0,5 indicarían paso de barrera).
13.2. Predicción del paso de barrera hematoencefálica in vitro
Para mimetizar la barrera hematoencefálica se usó una mezcla de lípidos derivados de cerebro de cerdo, con una composición de fosfolípidos muy semejante a la que constituye la BHE humana, y que se denomina PBL (Porcine Polar Brain Lipid, Avanti Polar Lipids Inc) que se prepara sobre placas con filtro MAIPNTR10 (Millipore), con una membrana de PVDF y tamaño de poro de 45 μιη. Para asegurar la solubilidad de los compuestos se añade al tampón de ensayo (KH2PO4 28 mM, Na2HP04 41 mM) un 20% de metanol. En este sistema se utilizaron dos controles del ensayo; un compuesto que pasa la BHE (el verapamilo) y otro que no pasa la barrera (la teofilina). Los compuestos a estudio se mantuvieron durante 4 h en el sistema tras lo que se realizó la medida en el espectrofotómetro a la longitud de onda de 335 nm para los compuestos PS0158 y PS0161 y a 278 nm para los compuestos control. A partir de los datos de absorbancia obtenidos se calculó el porcentaje de paso de barrera y la permeabilidad efectiva (Pe). Para calcular la Pe, se aplicó la siguiente fórmula:
Figure imgf000067_0001
Donde
VD=volumen donador (cm3)
A= área del filtro (cm2)
t= tiempo de ensayo
R= tanto por uno de retención
Co(t)= concentración del donador
CD(t=0)=concentración del original
Los resultados obtenidos en el modelo muestran que el verapamilo tiene un valor Pe= l,53xl0"5 cm/s y un porcentaje de permeabilidad de 38% y la teofilina un Pe= -6, 16xl0"6 cm/s y un porcentaje de permeabilidad de 2%. Valores de Pe por encima de 4x10"6 cm/s indican una elevada permeabilidad y por debajo de 2x10"6 cm/s o valores negativos indican una baja permeabilidad, por lo que los resultados de los controles validan la calidad de la membrana para el ensayo. Los resultados obtenidos muestran un valor de Pe para PS0158 igual a 5, 19xl0"6 cm/s y un porcentaje de permeabilidad del 13% y para PS0161 una Pe igual a l,47xl0"5 cm/s y un porcentaje de permeabilidad del 29%). En conclusión, se obtiene una alta permeabilidad de PS0161 a la BHE, y una permeabilidad moderada de PS0158.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000069_0001
donde:
Ri se selecciona entre alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, H-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno,
R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH, O- alquilo, SH, S-alquilo, H2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, o Ri y R2 y/o R3 y R4 forman un grupo -O-alquilen-O-, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Compuesto según la reivindicación 1, donde las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan entre enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Huntingon, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt- Jakob, enfermedad de Alexander, déficits cognitivos y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades cerebrovasculares, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), así como enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos patológicos asociados a la edad y progeria.
Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde Ri se selecciona entre alquilo, OH y O-alquilo, o Ri se encuentra unido a R2 formando un grupo -O-alquilen-O.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH y O-alquilo, o R2 se encuentra unido a Ri formando un grupo -O-alquilen-O, y/o R3 y R4 se encuentran unidos formando un grupo -O-alquilen-O. 6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde R4 se encuentra en posición meta del anillo aromático.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde Ri es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R2, un grupo -O-alquilen-O.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde R2 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O.
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde R3 es OH, etilo, metilo o forma, junto con R4, un grupo -O-alquilen-O.
10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde R4 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O. 11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona de los siguientes compuestos:
Figure imgf000070_0001
R1=R3 = OH, Me, Et, OEt
R4 = OH, Me, Et
12. Un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000071_0001
donde:
Ri se selecciona de alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno,
R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, OH, O-alquilo, SH, S-alquilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)2 y halógeno, o Ri y R2 y/o R3 y R4 forman un grupo -O-alquilen-O-, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, con la condición de que la fórmula (II) no incluye:
- el compuesto en el que R1-R4 son OH y R4 está en posición meta del anillo aromático;
- el compuesto en el que R1-R4 son OCH3 y el sustituyente R4 está en posición meta del anillo aromático; - los compuestos en los que R2 y R4 son hidrógeno y Ri y R3 se seleccionan independientemente de OH y metoxi.
13. Compuesto según la reivindicación 12, donde si R2 es hidrógeno, Ri se selecciona de metilo, etilo y etoxi.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, donde Ri se selecciona de alquilo, OH y O-alquilo, o Ri se encuentra unido a R2 formando un grupo -O-alquilen-O.
15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, OH y O-alquilo, o R2 se encuentra unido a Ri formando un grupo -O-alquilen-O, y/o R3 y R4 se encuentran unidos formando un grupo -O-alquilen-O.
16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde R4 se encuentra en posición meta del anillo aromático.
17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde Ri es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R2, un grupo -O-alquilen-O. 18. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, donde R2 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con Ri, un grupo -O-alquilen-O.
19. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, donde R3 es OH, metoxi, etoxi, etilo, metilo o forma, junto con R4, un grupo -O-alquilen-O.
20. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, donde R4 es hidrógeno, OH, etilo, metilo o forma, junto con R3, un grupo -O-alquilen-O.
21. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, donde el compuesto de fórmula (II) se selecciona de los siguientes compuestos:
Figure imgf000072_0001
1= 3 = Me, Et, OEt 4 = OH, Me, Et 22. Una formulación farmacéutica que comprenden un compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. Compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 para su uso en medicina. 24. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 a partir de un extracto producido por la especie Penicillium chrysogenum. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 que comprende:
a) una reacción de condensación mediante la cual el éster del ácido aril propiónico, de fórmula (III), se transforma en su correspondiente amida de fórmula (IV):
Figure imgf000073_0001
III IV
donde R representa un grupo alquilo;
b) hacer reaccionar la amida de fórmula (IV) con un hidruro de alquilestaño para producir el estannano de fórmula (V):
Figure imgf000073_0002
y,
a continuación, someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c. l) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000073_0003
V VI
donde SE significa un grupo protector;
d. l) someter el carbamato de fórmula (VI) a una reacción de homoacoplamiento para dar el compuesto de fórmula (VII):
Figure imgf000074_0001
VI
y
e. l) introducir los grupos formamido y desproteger los grupos carbamato para obtener el compuesto de fórmula (II) de la invención; someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.2) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el carbamato de fórmula (VI) protegido:
Figure imgf000074_0002
V VI
d.2) introducir los grupos formamido y desproteger los grupos carbamato para obtener el compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000074_0003
VI VIII
y
e.2) someter la formamida de fórmula (VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención; someter el compuesto de fórmula (V) a una secuencia de reacciones que comprende:
c.3) reacción de oxidación de Baumgarten para proporcionar el isocianato de fórmula (IX):
Figure imgf000075_0001
V IX
d.3) convertir el isocianato de fórmula (IX) en la formamida de fórmula (VIII):
Figure imgf000075_0002
IX VIII
y
e.3) someter la formamida de fórmula VIII) a una reacción de homoacoplamiento para proporcionar el compuesto de fórmula (II) de la invención;
donde el grupo arilo (Ar) incluye los sustituyentes ¾ a R4 en función del compuesto de fórmula (II) que se desee obtener.
Cepa de microorganismo de la especie Penicillium chrysogenum depositada en el CECT con el número de registro 20783.
PCT/ES2013/070065 2012-02-07 2013-02-06 Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores WO2013117789A2 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014556114A JP2015513525A (ja) 2012-02-07 2013-02-06 神経保護剤としてのホルミル化キサントシリン類似体
IN6536DEN2014 IN2014DN06536A (es) 2012-02-07 2013-02-06
EP13711061.5A EP2813222B1 (en) 2012-02-07 2013-02-06 Formylated xanthocillin analogues as neuroprotectants
AU2013217893A AU2013217893A1 (en) 2012-02-07 2013-02-06 Formylated xanthocillin analogues as neuroprotectants
BR112014018411A BR112014018411A8 (pt) 2012-02-07 2013-02-06 Composto de fórmula (i), composto de fórmula (ii), formulação farmacêutica, método para a preparação de um composto de fórmula (ii) e cepa de microrganismo
US14/377,143 US9453004B2 (en) 2012-02-07 2013-02-06 Formylated xanthocillin analogues as neuroprotective agents
CA2863820A CA2863820A1 (en) 2012-02-07 2013-02-06 Formylated xanthocillin analogues as neuroprotective agents
MX2014009626A MX2014009626A (es) 2012-02-07 2013-02-06 Analogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores.
IL233770A IL233770A0 (en) 2012-02-07 2014-07-23 Xanthocillin analogs with formalin groups for use as neuroprotective agents

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201230174A ES2418684B1 (es) 2012-02-07 2012-02-07 Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores
ESP201230174 2012-02-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013117789A2 true WO2013117789A2 (es) 2013-08-15
WO2013117789A3 WO2013117789A3 (es) 2013-11-28

Family

ID=47913452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2013/070065 WO2013117789A2 (es) 2012-02-07 2013-02-06 Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9453004B2 (es)
EP (1) EP2813222B1 (es)
JP (1) JP2015513525A (es)
AU (1) AU2013217893A1 (es)
BR (1) BR112014018411A8 (es)
CA (1) CA2863820A1 (es)
ES (1) ES2418684B1 (es)
IL (1) IL233770A0 (es)
IN (1) IN2014DN06536A (es)
MX (1) MX2014009626A (es)
PL (1) PL2813222T3 (es)
WO (1) WO2013117789A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181201A (zh) * 2020-09-15 2022-03-15 香港科技大学 作为针对各种神经退行性疾病的潜在治疗剂的新化合物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007191460A (ja) * 2005-04-14 2007-08-02 Nissan Chem Ind Ltd キサントシリン類縁体の製造方法
EP2241561A1 (en) * 2009-04-16 2010-10-20 Neuron Biopharma, S.A. Neuroprotective, hypocholesterolemic and antiepileptic compound

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVDEEF ET AL., JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 96, no. 11, 2007, pages 2893 - 2909
BIRKS; FLICKER, COCHRANE DATABASE SYST REV, vol. 3, 2006
C. FAULI I TRILLO: "Tratado de Farmacia Galenica", 1993, LUZAN 5, S.A. DE EDICIONES
C. FAULI I TRILLO: "Tratado de Farmacia Galénica", 1993, LUZÁN 5, S.A. DE EDICIONES
E.W. MARTIN: "Remington's s Pharmaceutical Sciences", 1995
FELDMAN ET AL., LANCET NEUROL, vol. 6, no. 6, 2007, pages 501 - 12
FRISVAD; SAMSON, STUD. MYCOL., vol. 49, 2004, pages 1 - 173
GLAS; DONALDSON, APPL ENVIRON MICROB, vol. 61, 1995, pages 1323 - 30
GRUNDMAN ET AL., ARCH. NEUROL, vol. 61, no. 1, 2004, pages 59 - 66
ISAKA ET AL., J. NAT. PROD., vol. 70, 2007, pages 656 - 658
KROGSGAARD-LARSEN ET AL.: "Textbook of Drug Design and Discovery", April 2002, TAYLOR & FRANCIS
MOUNT; DOWNTOWN, NAT MED, vol. 12, no. 7, 2006, pages 780 - 4
RISHTON ET AL., CURR OPIN DRUG DISC & DEV, vol. 9, no. 3, 2006, pages 303
SAMANIEGO ET AL., ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 593, 2007, pages 103 - 107
TATSUTA ET AL., TETRAHEDRON LETTERS, vol. 46, 2005, pages 5017 - 20
TETRAHEDRON LETTERS, vol. 46, 2005, pages 5017 - 5020
ZUCK ET AL., J. NAT. PROD., vol. 74, 2011, pages 1653 - 1657
ZUCK ET AL., J. NAT. PROD., vol. 74, 2011, pages 1653 - 7

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181201A (zh) * 2020-09-15 2022-03-15 香港科技大学 作为针对各种神经退行性疾病的潜在治疗剂的新化合物
CN114181201B (zh) * 2020-09-15 2023-12-01 香港科技大学 作为针对各种神经退行性疾病的潜在治疗剂的新化合物

Also Published As

Publication number Publication date
IN2014DN06536A (es) 2015-06-26
PL2813222T3 (pl) 2017-01-31
BR112014018411A2 (es) 2017-06-20
MX2014009626A (es) 2014-11-10
US20150011621A1 (en) 2015-01-08
US9453004B2 (en) 2016-09-27
EP2813222B1 (en) 2016-07-06
ES2418684B1 (es) 2014-06-05
WO2013117789A3 (es) 2013-11-28
AU2013217893A1 (en) 2014-09-25
CA2863820A1 (en) 2013-08-15
IL233770A0 (en) 2014-09-30
JP2015513525A (ja) 2015-05-14
ES2418684A1 (es) 2013-08-14
BR112014018411A8 (pt) 2017-07-11
EP2813222A2 (en) 2014-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bai et al. Development of chalcone-O-alkylamine derivatives as multifunctional agents against Alzheimer's disease
Sunassee et al. Cytotoxicity of lapachol, β-lapachone and related synthetic 1, 4-naphthoquinones against oesophageal cancer cells
KR101568724B1 (ko) 신규한 화합물, 이의 생산 방법, 및 히스톤 디메틸라제 저해제로서 이의 용도
KR20100092094A (ko) 신이로부터 분리된 리그난 성분과 그 용도
Monjas et al. Enzymatic and solid-phase synthesis of new donepezil-based L-and D-glutamic acid derivatives and their pharmacological evaluation in models related to Alzheimer's disease and cerebral ischemia
KR100926798B1 (ko) 페리너스 속 버섯 또는 이노노투스 속 버섯의 균사체배양물로부터 분리된 히스피딘 유사체를 포함하는 항산화조성물
KR102001381B1 (ko) 신규한 ｏ-치환된 호노키올 유도체 화합물 및 이를 포함하는 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2013117789A2 (es) Análogos formilados de xantocilinas como neuroprotectores
Ol'ga et al. Cytotoxicity of new n-butylamino and sulfur-containing derivatives of polyfluorinated 1, 4-naphthoquinone
KR102409583B1 (ko) 신규 화합물 및 그를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
Rayavarapu et al. Synthesis of Putrescine Bisamides as Antimicrobial and Anti-Inflammatory Agents
EP3750904A1 (en) Therapeutic drug for neurodegenerative disease and application thereof
KR101603317B1 (ko) 케르세틴-아미노산 접합체를 포함하는 항암 및 항생제 내성 억제효능을 보이는 조성물 및 그 방법
KR101584528B1 (ko) 케르세틴-아미노산 접합체를 포함하는 항암 및 항생제 내성 억제효능을 보이는 조성물 및 그 방법
Cheng et al. Secondary metabolites from the culture broth of actinomycete Acrocarpospora Sp. Firdi 001 and their antimicrobial activity
JP2022524540A (ja) 抗酸化活性および神経保護活性を有する大環状化合物
RU2819611C1 (ru) Производное 7-гидроксикумарина для индукции митофагии в клетках, способ его получения и применения
KR100424392B1 (ko) 믹소첼린-에이를 유효성분으로 하는 항산화 및 항암용약학 조성물
JP2004210768A (ja) 新規化合物およびそれを含む薬学的組成物
CN107473978B (zh) 一种姜黄素衍生物及其制备方法与应用
US20130261133A1 (en) Therapeutic Compounds for Protozoal and Microbial Infections and Cancer
KR100672904B1 (ko) 천연 항산화 화합물
WO2018171684A1 (zh) 7H-薁[1,2,3-i,j]异喹啉-7-酮化合物、单晶及其用途
BR102019017773A2 (pt) USO DE COMPOSTOS SINTÉTICOS β-CARBOLÍNICOS SINTETIZADOS A PARTIR DA TRIPTAMINA E DO L-TRIPTOFANO COMO AGENTES ANTIMALÁRICOS E ANTITUMORAIS
Dao et al. Compounds from culture broth of marine bacterium Oceanisphaera sp

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13711061

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013711061

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013711061

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 233770

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2863820

Country of ref document: CA

Ref document number: 2014556114

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14377143

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2014/009626

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013217893

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20130206

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112014018411

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014018411

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20140725