CN114174316A - 修饰肽和相关使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种修饰肽，包括：(i)氨基酸序列(X)‑GRT‑(Y)‑TLC‑(Z)，或(ii)与氨基酸序列(X)‑GRT‑(Y)‑TLC‑(Z)具有至少40％序列同一性的氨基酸序列，其中X、Y和Z与说明书中描述的相同。在这点上，抑制选自AKT1(PKB α)、AKT2(PKB β)、MAP3K8(COT)、MST4、AURKB(Aurora B)、ROCK1、RPS6KB1(p70S6K)、CDC42 BPA(MRCKA)、BRAF、RAF1(cRAF)Y340D Y341D、SGK(SGK1)、MAP4K4(HGK)、AURKA(Aurora A)、AURKC(Aurora C)、BRAF V599E、CHEK1(CHK1)、Gpin)、CHEK2(CHK2)、FGR、IKBKB(IKK beta)、CDK7/细胞周期蛋白H/MNAT1和CDC42BPB(MRCKB)和AbI的至少一种酶的活性的方法；还提供了抑制细胞增殖的方法，以及用于预防或治疗癌症或神经变性疾病或病症的方法。

Description

修饰肽和相关使用方法

对相关应用程序的交叉引用

本公开标题为：修饰肽和相关的使用方法，于2019年6月5日提交并给予美国临时专利申请第62/857,293号的优先权和权益，其出于所有目的通过引用整体并入本文。

背景

1.发现领域。本公开内容总体上涉及修饰的治疗性多肽、它们的组合物以及施用于有需要的生物体以治疗和/或预防疾病例如癌症的方法。

2.背景资料。AGC激酶家族(丝氨酸/苏氨酸蛋白)由63种进化相关的激酶组成，包括PDK1、PKB/AKT、SGK、PKC、PRK/PKN、MSK、RSK、S6K、PKA、PKG、DMPK、MRCK、ROCK、NDR、LATS、CRIK、MAST、GRK、Sgk494、YANK、Aurora和PLK。不同的AGC激酶家族共享其抑制和激活机制的几个方面。许多AGC激酶催化结构域的构象通过激酶结构域小叶PIF袋上的调节位点构象来进行调节。PIF袋在具有不同调节模式的AGC激酶(即PDK1、PKB/AKT、LATS和Aurora激酶)中扮演类似开关的角色。在活性构象中稳定PIF袋的分子探针是激活剂，而稳定被破坏位点的化合物是变构抑制剂。(Leroux等(2018)Semin Cancer Biol 48：1-17.Doi：10.1016)。

丝氨酸-苏氨酸激酶AKT(也称为蛋白激酶B)磷酸化各种蛋白质底物以调节许多关键的生理过程，例如细胞周期、葡萄糖代谢、细胞生长和存活、血管生成和蛋白质合成(Brazil等(2002年))Cell111：293-303)。其催化活性的刺激由磷脂酰肌醇3激酶触发，由Ptdlns(3，4，5)P依赖性AKT从细胞质到膜的募集以及两个调节残基Thr-308和Ser-473的磷酸化引起。由PDK-1催化的Thr-308磷酸化是为了AKT活性必要的一部分，并且这种活性通过Ser-473磷酸化增强了约10倍(Alessi等(1996)EMBO J.15：6541-6551；巴西等(2002)同上)。

蛋白激酶A(PKA)在哺乳动物细胞中普遍表达，并且会调节重要的细胞过程，如生长、发育、记忆、代谢、基因表达和脂肪分解。PKA全酶作为无活性复合物，由两个催化亚基(PKAc)和调节亚基(PKA RI&RII)组成。cAMP的结合促进催化亚基的解离和活化。每个催化亚基由小叶和大叶组成，活性位点在两个叶之间形成裂缝。小叶提供ATP的结合位点，大叶提供催化残基和肽/蛋白质底物的对接表面。大叶中的激活环包含一个磷酸化位点Thr-197，它对催化至关重要(Adams等(1995)Biochemistry34：2447-2454)。

AKT信号通路的失调已知是与一些最普遍且无法治愈的人类疾病直接相关，例如癌症、神经退行性和精神性脑疾病以及传染病(Blain和Massague(2002)Nat.Med.8：1076-1078)；Brazil，等(2004)Trends Biochem.Sci.29：233-242；Chen，等(2003)Cell113：457-468；Colin，等(2005)Eur.J.Neurosci.21：1478-1488；Emamian，等(2004)Nat.Genetics36：131-137；Griffin，等(2005)J.Neurochem.93：105-117；Liang，等(2002)Nat.Med.8：1153-1160；Shin，等(2002)Nat.Med.8：1145-1152；Viglietto，等(2002)Nat.Med.8：1136-1144；Ji&Liu(2008)Recent Pat Biotechnol.(3)：218-26)。众所周知，AKT的过度活跃是几种最普遍的人类恶性肿瘤，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、肝细胞癌、甲状腺癌和中枢神经系统恶性肿瘤(如胶质母细胞瘤和神经胶质瘤)的病理过程的一部分(Brazil等人(2004)同上)。AKT功能与多种神经退行性脑部疾病如阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)有关。(Griffin等(2005)同上，Colin等人(2005)同上，Saudou等人(1998)Cell95：55-66；Chen等人(2003)同上，Emamian等人(2003)Neuron 38：375-387；Kaspar等人(2003)Science 301：839-842)。此外，多项研究表明，激活PI3K-AKT信号是病毒在急性和持续感染中减缓细胞凋亡和延长病毒复制的一种策略。防止细胞死亡也可能促进病毒诱导的致癌作用。越来越多的证据表明PI3K或AKT的活性对于少数病毒，包括HIV和其他类型的病毒的存活至关重要。(Ji&Liu(2008)Recent Pat Biotechnol.(3)：218-26；Chugh等人(2008)Retrovirology vol.511.doi：10.1186/1742-4690-5-11)

AKT信号通路的损伤也与精神分裂症有关(Emamian等(2004)同上)。AKT1基因与精神分裂症的遗传关联已在欧洲(Schwab等人(2005)Biol.Psychiatry58：446-450)和日本(Ikeda等人(2004)Biol.Psychiatry56：698-700)人口识别。此外，已发现PKA信号通路介导DISC1和PDE4B的相互作用，这些遗传因素与提高精神分裂症风险相关(Millar等人(2005)Science 310：1187-1191)。

鉴于AKT与一些最普遍且无法治愈的人类疾病，包括癌症、传染病、神经退行性疾病和精神疾病的关联，本领域需要鉴定与AKT产生相互作用并调节其活性的试剂。本公开满足了本领域的这种需要。

概括

目前描述的是可以靶向几种哺乳动物激酶的催化活性的活性治疗肽，这包括AGC激酶家族的几种成员，以调节多种细胞功能，包括但不限于细胞增殖、细胞存活、细胞死亡等。

在一个方面，本公开提供了一种修饰肽，其包括(i)氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，或(ii)具有至少40％序列同一性的氨基酸序列氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)。在这些式中，X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或其组合；Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

本公开还提供了具有式(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)-(Z)的氨基酸序列的修饰肽或与氨基酸序列(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)-(Z)具有至少40％、50％、60％、70％、80％，90％或更多的序列同一性。在这些式中，seq1为GRT、KGRT、VKGRT、RVKGRT、KRVKGRT、(Orn)-RVKGRT或AKRVKGRT；seq2是TLC、TLCG、TLCGR、TLCGRPE、TLCGRPEY或TLCGRPE-(4-Cl-Phe)；X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合；Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

此公开还包括用于抑制AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)、MAP3K8(COT)、MST4、AURKB(Aurora B)、ROCK1、RPS6KB1(p70S6K)，CDC42 BPA(MRCKA)，BRAF，RAF1(cRAF)Y340D Y341D，SGK(SGK1)，MAP4K4(HGK)，AURKA(Aurora A)，AURKC(Aurora C)，BRAF V599E，CHEK1(CHK1)，Gpin、CHEK2(CHK2)、FGR、IKBKB(IKK beta)、CDK7/细胞周期蛋白H/MNAT1和CDC42 BPB(MRCKB)和Abl组成的组中的至少一种酶的活性的方法；还提供了抑制细胞增殖和抑制细胞增殖的方法，以及用于预防或治疗癌症、传染病或神经变性疾病或病症的方法。

前述一般实用领域仅作为示例给出并且不旨在限制本公开和所附权利要求的范围。根据本发明的权利要求、描述和实施例，本领域普通技术人员将理解与本公开的组合物、方法和过程相关的其他目的和优点。例如，本公开的各个方面和实施例可以以多种组合使用，所有这些组合都被本说明书明确地列出。这些附加的实体和实施例明确地在本公开的范围内列出。在此用于阐明本公开的背景并且在特定情况下提供关于实践的附加细节的出版物和其他材料已以参考列表方式并入。

附图的简要说明

并入并形成说明书的一部分的附图示出了本公开的若干实施例，并且与描述一起用于解释本公开的原理。附图仅用于说明本公开的实施例，不应被理解为本公开的一种限制。通过结合示出本公开的说明性实施例的附图进行的以下详细描述，本公开的发明的进一步的目的、特征和优点将变得显而易见，其中：

图1A和图1B：示例性化合物的细胞内分子靶标：(1A)通过检测识别PI3K-P110或磷酸化PDK1(Ser-241)、总AKT1或磷酸化P53(Ser-46)的抗体，获得基于细胞的检测的代表性免疫印迹。在用不同浓度的载体或从5uM到40uM的示例性化合物以30分钟、2小时或24小时的不同时间间隔处理U251人成胶质细胞瘤细胞后的进行基于细胞的测定。(1B)基于细胞的检测的代表性免疫印迹类似于A用一组不同的一抗探测，包括磷酸AKT1(Thr-308)、p-CRAF(Ser-259)、磷酸-Aurora A(Thr-288)或总Aurora A。

图2在用示例性化合物处理后不同时间间隔U251胶质母细胞瘤细胞的凋亡和存活：将等量的U251人胶质母细胞瘤细胞(5x10⁵)铺在盖玻片上并用载体(顶板)或用示例性化合物处理复合(底部面板)处理20分钟、一天、两天或三天。进行荧光TUNEL(绿色)检测以显示凋亡细胞，并使用DAPI染色显示所有细胞的细胞核(蓝色)。Cleaved-Caspase 3(红色)的间接免疫荧光染色野作为细胞凋亡的另一个标志物进行。与用示例性化合物处理的细胞相比，用载体处理的细胞生长到更高的汇合度(将顶板和底部面板的DAPI信号相比)。共焦图像(20倍)是分别显示三个通道(前三列)和合并图像(最后一列)相同的Z步长。图像显示处理后细胞凋亡率的时间依赖性增加，在处理3天后，几乎100％的示例性化合物细胞通过Tunel(绿色)和增加的Cleaved-Caspase3(红色)显示出细胞凋亡。

图3A和图3B：不同时间间隔的细胞密度和细胞凋亡率的定量分析：将相同数量的细胞铺在盖玻片上并用示例性化合物和载体在不同的时间间隔处理。细胞用DAPI和Tunel染色并用共聚焦显微镜分析。图3A直方图条形表反映了在五个单独的共聚焦场上计数的盖玻片上(DAPI阳性细胞)剩余的平均总细胞数。图3B直方图条形表反映了通过将Tunel阳性细胞数除以盖玻片上剩余的总细胞数(DAPl阳性细胞)在五个单独的共聚焦场上计数而计算出的凋亡细胞的平均百分比。用载体处理的细胞随着时间的推移不断显示出更高的密度，在72小时时达到大约完全融合(未显示)，而用示例性化合物处理的细胞持续显示出细胞密度随时间降低(3A)和凋亡细胞数量随时间增加(3B)，甚至达到处理72小时后几乎100％的细胞凋亡的程度。

图4：示例性化合物在人乳腺癌、肺癌、血液和皮肤癌细胞中的IC-50：转移性人乳腺癌细胞(BT-549和MDA-MB-468)、人急性早幼粒细胞白血病(HL)的代表性平板-60)、多发性骨髓瘤癌细胞系(RPMI-8226)、小细胞肺癌细胞系(DMS-114)、人黑色素瘤癌细胞系(SK-ML-5)利用载体(PBS)、在临床试验(MK-2206)使用的其他激酶抑制剂化合物的对照中的化合物、或临床使用(伊马替尼或格列卫)，从50μM连续稀释至0.7μM处理所列出的细胞系三日。该实验表明，与市场上或临床试验的最新阶段的现有药物类别相比，示例性化合物具有优越的功效和纳摩尔范围的IC-50。

图5A、图5B和图5C：在(5A)脑肿瘤(GBM)动物模型、(5B)肝癌(HCC)动物模型和(5B)动物模型以及转移性乳腺癌的动物模型中局部施用示例性化合物后抑制肿瘤生长：在肿瘤内注射载体(n＝8)或示例性化合物(n＝8)后(第0、3、7、11、14、17和20天)治疗的动物，在不同时间间隔肿瘤大小的百分比变化，p值反映了在相同时间间隔内两组的平均肿瘤大小之间的统计差异，这数据从Student-T检验或Mann-Whitney检验获得。

详细说明

现在将详细参考示例性实施例，其示例在本说明书中示出。在这点上，本示例性实施例可以具有不同的形式并且不应被理解为限于在此阐述内的描述。因此，下面仅通过参考附图来描述示例性实施例，以更全面地解释本说明书。如本文所用，术语″和/或″包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合。诸如″至少其中之一″之类的表达式若出现在元素列表之前，则将修改整个元素列表而不会修改列表的单个元素。

应当理解，虽然术语第一、第二、第三等在本文中可用于描述各种元件、部件、区域、层和/或部分，但这些元件、部件、区域、层和/或部分不应受这些条款的限制。这些术语仅用于将一个元素、组件、区域、层或部分与另一个元素、组件、区域、层或部分区分开来。因此，下面所讨论的第一元件、组件、区域、层或部分均可以被称为第二元件、组件、区域、层或部分，而这并不会使之脱离本实施例的教导。

此处使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在进行限制。如本文所用，单数形式″a″、″an″和″the″也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。

将进一步理解，当在本说明书中使用时，术语″包含″和/或″包含了″或″包括″和/或″包括了″指定所陈述的特征、区域、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、元素、组件的存在。

考虑到所讨论的测量和与特定量的测量相关联的误差(即测量系统的不足)，本文所用的″大约″包括规定的价值并且意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受偏差范围内。例如，″大约″可表示在一个或多个标准偏差内，或在所述值的±30％、20％、10％、5％内的偏差。

除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。还应当理解，术语，例如在常用词典中定义的那些，应当被解释为具有与其在相关领域和本公开中的含义一致，而不是将其赋予理想化或过于正式的意义，除非在此有明确列出其定义。

AKT已成为许多信号转导途径的焦点，调节多种细胞过程，例如葡萄糖代谢、转录、细胞凋亡、细胞增殖、血管生成和细胞运动(Brazil等(2002)同上)。除了作为参与这些过程的许多底物的激酶以外，它还与不是底物的其他蛋白质形成复合物，在此其他蛋白质将调节AKT活性和功能(Brazil等(2002)同上)。

如本文所用，术语″肽″、″多肽″和″蛋白质″可互换使用，并且指具有通过肽键或其他共价键连接的至少两个氨基酸、氨基酸类似物或衍生物的任何分子。

已经确定了AKT和PKAc之间的物理相互作用。发现全长PKAc可有效抑制AKT的催化活性，而活性AKT通过增加PKAc在Thr-197处的磷酸化水平的机制增加PKA的催化活性。出乎意料的是，短的PKAc片段也可以调节AKT。发现一些肽可激活AKT，而其他肽则可抑制AKT活性。特别是，PKAc的Thr-197侧翼的PKAc片段(本文称为ZaTa)足以在体外和体内有效抑制AKT。ZaTa渗入细胞内，与AKT共定位，抑制并重新分布细胞内的AKT，改变PKAc的表达模式。ZaTa还在体外和体内破坏了AKT-PKAc复合物，导致轴突形态发生重大变化。用ZaTa处理培养的细胞也会引起细胞增殖的剂量依赖性抑制。此外，降低PKAc蛋白水平会增加体外和体内AKT蛋白水平。因此，发现PKAc及其片段可用于调节参与调节葡萄糖代谢、转录、细胞凋亡、细胞增殖、血管生成和细胞运动的AKT信号转导途径，从而促进癌症、传染病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和精神疾病的预防或治疗。

为了鉴定直接与AKT产生相互作用的蛋白质，我们进行了免疫共沉淀分析以从脑裂解物中纯化AKT。共免疫沉淀的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并通过质谱法进行分析。通过这种方式，PKA(PKAc)的催化亚基被鉴定为与AKT产生相互作用蛋白。在几个使用两种不同的抗体识别AKT序列上的不同表位的独立的免疫共沉淀实验中，即一种抗体识别Ser-473处的磷酸化AKT，而另一种抗体针对AKT的普列克底物蛋白同源(PH)结构域产生，PKAc在用针对PKAc的抗体通过蛋白质印迹分析中，确定与AKT形成复合物。出乎意料的是，当样品用cAMP处理时，更多的PKAc与AKT复合免疫沉淀，这增加了未与调节亚基结合的PKAc的水平。这些数据证明了内源性PKAc和AKT之间的物理相互作用，其中相互作用发生在PKA激活之后。

为了证明PKAc和AKT共定位，通过免疫荧光共聚焦显微镜分析了PKAc和AKT的亚细胞定位。将表达内源性AKT和PKAc水平的神经母细胞瘤2a(N2a)神经元用抗AKT(PH域)和抗PKAc抗体进行双重标记。在培养的N2a细胞中两种分子的内源性水平的最强信号沿轴突和轴突生长区检测到。然而，NG-108神经元是胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤的体细胞杂交体，在细胞质中显示出更弥散的共定位模式，在神经突中显示出较弱的信号。这些数据证实了免疫共沉淀实验的结果，并表明了AKT和PKAc相互作用在神经元细胞过程的生长和分支中的作用，也确定了AKT和PKAc在源自人类乳腺组织的正常和恶性细胞的非神经元细胞系中的共定位。分析的细胞系是来源于浸润性导管癌的HTB-126细胞、来源于浸润性导管癌周围正常乳腺组织的HTB-125细胞和来自乳腺导管癌患者胸腔积液转移部位的CRL-2865细胞。在这些细胞中，内源性AKT与内源性PKAc共定位于正常和恶性人类乳腺细胞的特定亚细胞区室中。AKT似乎与PKAc共定位在与细胞核(HTB-125和HTB-126)相邻的微管状结构和细胞膜(HTB-125)中。这些数据表明AKT-PKAc相互作用不是神经元细胞特有的，也发生在源自人体组织的正常和恶性细胞系中。

我们使用了激酶抑制剂以评估AKT-PKAc相互作用的重要性。高度选择性和充分表征的PKA抑制剂和激活剂是本领域公知的。因此，培养的神经元用选择性PKA抑制剂H-89和强效PKA激活剂毛喉素处理，过后分析了AKT活性。用PKA抑制剂治疗导致AKT活性的剂量依赖性增加，而通过Thr-308和Ser-473位点的AKT活化依赖性磷酸化水平来衡量，PKA激活剂则具有相反的作用。这些发现表明，培养的神经元中AKT活性水平与PKA活性水平密切相关且呈负相关。

由于观察到的H-89和毛喉素对培养细胞中AKT活性的影响可以解释为其他信号通路的调节干扰的结果，因此使用纯化的AKT和PKAc的活性形式进行体外分析以检查直接结果这种相互作用对激酶催化活性的影响。当将全长的活性PKAc添加到包含活性AKT作为激酶和Ser-9 GSK-3谷胱甘肽(GST)融合蛋白作为底物的AKT激酶测定中时，AKT的动力学活性显着降低。当向反应混合物中加入PKA抑制剂时，PKAc对AKT催化活性的降低受到抑制。这一观察结果表明，PKA的活性是其对AKT的抑制作用所必需的。在AKT1的两种突变体和活性形式中也观察到PKAc对AKT催化活性的降低，一种在PH结构域中缺失，另一种具有Ser473Asp突变。与野生型AKT一样，PKAc对突变体的抑制作用在PKA抑制剂肽的存在下被逆转。这表明AKT的PH结构域以及Ser-473处的磷酸化不是PKAc对AKT的抑制作用所必需的。此外，无论激酶反应中是否存在磷酸酶抑制剂，从牛组织中纯化的活性PKAc或在Sf9细胞中表达的人PKAc都观察到了相同的抑制作用。

由于观察到的H-89和毛喉素对培养细胞中AKT活性的影响可以解释为其他信号通路的调节干扰的结果，因此使用纯化的AKT和PKAc的活性形式进行体外分析以检查这种相互作用对激酶催化活性的影响的直接结果。当将完整的的活性PKAc添加到包含活性AKT作为激酶和Ser-9GSK-3谷胱甘肽(GST)融合蛋白作为底物的AKT激酶测定中时，AKT的动力学活性显着降低。当向反应混合物中加入PKA抑制剂时，PKAc对AKT催化活性的降低受到抑制。这一观察结果表明，PKA的活性是其对AKT的抑制作用所必需的。在AKT1的两种突变体和活性形式中也观察到PKAc对AKT催化活性的降低，一种在PH结构域中缺失，另一种具有Ser473Asp突变。而对于野生型AKT，PKAc对突变体的抑制作用在PKA抑制剂肽的存在下被逆转。这表明AKT的PH结构域以及Ser-473处的磷酸化不是PKAc对AKT的抑制作用所必需的。此外，无论激酶反应中是否存在磷酸酶抑制剂，从牛组织中纯化的活性PKAc或在Sf9细胞中表达的人PKAc都观察到了相同的抑制作用。

为了进一步分析了AKT对PKA催化活性的影响，我们使用含有PKAc作为激酶和DARPP-32作为底物的体外激酶测定法。PKA在Thr-34位点磷酸化DARPP-32，将其转化为蛋白磷酸酶-1的有效抑制剂(Huang等人(1999)J.Biol.Chem.274：7870-7878)。与PKAc对AKT催化活性的抑制作用相反，将活性AKT添加到PKA激酶测定增加了PKAc的催化活性。这是通过使用针对该位点的磷酸化特异性抗体测量DARPP-32在Thr-34处的磷酸化水平来确定的。出乎意料的是，PKAc催化活性的增加伴随着Thr-197处PKAc磷酸化水平的增加，Thr-197是位于PKAc激活环中的一个残基，对正常的生物学功能和可能的细胞运动至关重要(Abel等人(2001)同上；Cheng等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9849-9854)。虽然自体磷酸化和PDK-1磷酸化已被描述为PKAc中Thr-197磷酸化的可能机制(Moore等人(2002)J.Biol.Chem.277：47878-47884)，但公开的体外数据在此表示AKT磷酸化PKAc的Thr-197。当在同一反应管中存在PKAc和AKT特异性底物的情况下进行激酶反应时，观察到类似的对催化活性的相反影响。在对照试验中，既没有观察到PKAc对Ser-9 GSK-3 GST融合蛋白的磷酸化，也没有观察到AKT对重组DARPP-32的Thr-34的磷酸化。

与PKAc和蛋白激酶C(PKC)的有效抑制剂肽容易获得并广泛使用不同，AKT的抑制剂直到最近几年才普遍缺乏(Brazil等人(2004)同上)。经验表明，PKA突变体的使用可以促进对AKT更具选择性的抑制剂的结构设计(Breitenlechner等人(2005)J.Med.Chem.48：163-170)。此外，已修改AKT的最佳底物基序以设计AKT抑制剂(Obata等人(2000)J.Biol.Chem.275：36108-36115)。因为全长PKAc蛋白抑制了AKT的催化活性，基于人(GENBANK登录号NP_002721；SEQ ID NO：1)和牛(GENBANK登录号CAA47627；SEQ ID NO：2)PKAc的肽库蛋白质序列被设计和合成。该文库包含96个重叠肽(表1)，涵盖人和牛PKAc从N端到C端的全长蛋白质序列。我们对该文库进行了广泛筛选，以鉴定介导PKAc对AKT抑制作用的PKAc片段。

表1.示例性化合物

这里使用的一个字母代码包括：A，丙氨酸；R，精氨酸；N，天冬酰胺；D、天冬氨酸；C、半胱氨酸；E、谷氨酸；Q，谷氨酰胺；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；L，亮氨酸；K，赖氨酸；M，蛋氨酸；F，苯丙氨酸；P，脯氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；和V，缬氨酸。

出乎意料的是，库中的个别肽对AKT表现出显着的抑制作用。这些肽包括肽49(SEQID NO：56)、53(SEQ ID NO：60)、62(SEQ ID NO：69)、63(SEQ ID NO：70)和64(SEQ ID NO：71)。在这还测定了连续重叠肽片段的组合对AKT催化活性的影响。当肽25至36(即，SEQ IDNO：32-43)、肽37至48(即，SEQ ID NO：44-55)、肽49至60(即，SEQ ID NOs：56-67)和肽61至72被组合在一起时(即，SEQ ID NOs：68-79)也观察到显着的抑制作用。

对AKT的抑制活性特别感兴趣的是肽Ala-Lys-Arg-Val-Lys-Gly-Arg-Thr-Trp-Thr-Leu-Cys-Gly-Thr-Pro-Glu-Tyr(SEQ ID NO：60)，此肽位于PKAc的Thr-197磷酸化位点两侧。这种肽，命名为ZaTa，足以有效抑制AKT的体外催化活性。将ZaTa肽加入AKT1激酶测定后，Ser-9 GSK-3 GST底物的磷酸化水平显着降低，这是通过SDS-PAGE分离体外激酶测定产物和使用磷酸特异性抗体进行蛋白质印迹分析确定的特异性识别Ser-9处的磷酸化GSK-3β。此外，将ZaTa肽的抑制作用与相邻一种与ZaTa肽的11个N端氨基酸残基重叠并带有Thr-197磷酸化位点的肽(Gly-Phe-Ala-Lys-Arg-Val-Lys-Gly-Arg-Thr-Trp-Thr-Leu；SEQ IDNO：59)进行比较，。在该测定中，γ-³²P掺入Ser-21GSK-3β底物肽的水平用于测量AKT1体外催化活性。虽然相邻的重叠肽不能抑制AKT1，但ZaTa肽在体外有效抑制AKT1催化活性(IC₅₀～0.1μM；图1)。ZaTa肽本身不是AKT的底物，这是由仅包含该肽和AKT的对照激酶反应确定的。这表明AKT本身对Thr-197的磷酸化不是PKAc抑制AKT所必需的，并且Thr-197位点侧翼的氨基酸序列、生化特征和/或结构则在抑制AKT中起作用。ZaTa肽源，自AKT的天然抑制剂，即PKAc，可有效抑制AKT，并且在一系列独立的激酶测定中未对PKAc的催化活性表现出任何抑制作用，PKAc与AKT一样，是其成员AGC激酶家族的成员。

与其体外抑制活性相似，ZaTa肽片段也能够有效地抑制大脑中的AKT。在立体定向注射ZaTa肽后，与注射DMSO作为载体的另一个大脑半球相比，我们观察到注射ZaTa肽的大脑半球纹状体中AKT底物的磷酸化水平降低。这些体内免疫荧光结果也通过蛋白质印迹分析得到证实，表明在立体定向注射ZaTa肽后1小时，体内AKT底物的磷酸化水平显着降低。我们还评估了GSK-3β作为特定底物，它在Ser-9处的磷酸化水平。与注射DMSO作为载体的另一个大脑半球相比，在将ZaTa肽立体定向注射到一个大脑半球的纹状体观察到GSK-3β在Ser-9处的磷酸化水平的特定降低。这种降低是GSK-3βSer-9上的AKT磷酸化位点所特有的，因为没有观察到GSK-3β在Tyr-216或GSK-3α在Tyr-279的磷酸化水平的变化。此外，注射部位AKT底物磷酸化的体内减少更为明显，因为在两个半球之间的额叶皮层或小脑中未观察到AKT底物磷酸化的显着变化。这些数据不仅证实了ZaTa肽对体内AKT催化活性的抑制作用，而且证明了ZaTa肽在整个脑组织中的有效分布和吸收。

为了测试ZaTa作为AKT1抑制剂相对于其他主要激酶的特异性和选择性，在IC₅₀以及十倍更高的浓度对AKT1进行了一系列体外激酶测定。首先使用每种激酶的活性形式和特定底物在体外测试了以下32种激酶：AKT2、AKT3、PKA、PKCα、PKCγ、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ、SGK、PAK2、PAK3、SAPK2/p38、Abl、CaMKII、CDK1/cyclinB、CDK5/p35、CK1、CK2、CSK、GSK3α、GSK3β、JNK1α1、MAPK1、p70S6K、PDGFRα、PDGFRβ、PDK1、PKG1α、TrkB、JAK2、JAK3和Syk。在AKT1(0.1μM)的IC₅₀下，ZaTa在体外对上述任何激酶均无显着抑制作用。然而，在高十倍的浓度下，ZaTa抑制AKT2(63％)、PI3Kδ(72％)、p70S6K(64％)、SGK(73％)、PAK3(83％)、JAK3(79％)、TrkB(84％))和Abl(42％)。为了证实对细胞中这些激酶的体外抑制作用，我们使用基于细胞的测定来确定标记的ZaTa对每种激酶众所周知的细胞内底物磷酸化水平的影响(Zipfel等人(2004)Curr.Biol.14：1222-1231；Wang等人(2003)Arch.Biochem.Biophys.410：7-15；King等人(1998)Nature396：180-183；Rangone等人(2004)Eur.J.Neurosci.19：273-279；Middlemas等人(1994)J.Biol.Chem.269：5458-5466；Huang等人(1999)J.Biol.Chem.274：7870-7878)。这种基于细胞的激酶测定的结果证实，除了AKT外，ZaTa还可以抑制p70S6K。相比之下，标记的ZaTa进入细胞内不会抑制PI3K、SGK、PAK3、JAK3、TrkB或Abl，这些激酶在体外都可以被ZaTa在较高浓度下抑制。这些数据表明，ZaTa在纳摩尔浓度下对AKT1具有选择性抑制作用。然而，在微摩尔浓度下，ZaTa还可以抑制其他所列出的激酶，特别是在基于细胞的检测中的p70s6K。鉴于上面列出的大多数激酶没有已知的抑制剂，预期在体外研究中可以以微摩尔浓度使用ZaTa以抑制所选激酶的活性。

为了分析体内选择性，如上所述，将ZaTa注射到大脑半球第一半，将DMSO注射到另一个半球，并使用磷酸化特异性抗体进行一系列蛋白质印迹分析，这些抗体识别磷酸化底物或浓度较高的ZaTa在体外抑制的每种激酶。该分析的结果证实了ZaTa对p70S6K的有效体内抑制，以及对Abl的较弱体内抑制。没有在体内，观察测定的其他激酶的抑制作用。鉴于p70S6K和AKT之间的高度功能和结构同源性，我们也考虑了ZaTa对p70S6K的体内抑制作用。此外，使用识别这些激酶的磷酸化共有位点的磷酸化特异性抗体，分析了ZaTa对PKA、PKC、CDK底物磷酸化水平的体内影响。与AKT底物磷酸化的持续降低相反，在体内注射ZaTa后未观察到PKA、PKC和CDKs底物的磷酸化水平出现显着变化。

作为PKA和CDK5的纹状体特异性底物，DARPP-32的磷酸化水平在Thr-34(PKA位点)或Thr-75(CDK5位点)处测定(Huang等人(1999)同上)。ZaTa在这些位点中的任何一个都没有引起DARPP-32磷酸化的任何显着变化。因此，与在大脑中表达的其他主要激酶家族(即PKA、PKC和CDK)相比，ZaTa肽片段在体内选择性地抑制了AKT。

肽可以是非常有效的抑制剂，因为它们有效地与酶结合并抑制酶活性。然而，细胞内递送肽会限制它们的功能。除了少数被称为细胞穿透肽(CPP)的肽以外，这些肽已被认可用于位点特异性药物递送，抑制肽在体内酶促研究中可能具有有限的细胞内积累。CPP神经肽在中枢和外周神经系统中作为神经递质。基于ZaTa肽的一级结构(即N端有几个碱性残基的碱性臂和C端有游离羟基的几个残基组成的极性臂的肽)和体内在大脑中产生的抑制作用，从而确定ZaTa肽是否是CPP。鉴于ZaTa肽的C端对抑制活性很重要，因此在ZaTa肽的N端用红色荧光染料标记。通过质谱法评估标记的效率和所标记肽的纯度。

在此发现ZaTa肽可渗透到细胞中并与AKT共定位，从而证明AKT是ZaTa肽的细胞内靶标。ZaTa肽定位的细胞模式因细胞而异；一些细胞显示出强烈的核信号，一些显示出被聚集体染色的细胞质样式，还有一些在细胞膜上显示出明亮的信号。ZaTa在细胞内的这些不同定位模式通常伴随着AKT被重新分布到ZaTa位点。除了在ZaTa进入细胞时AKT的重新分布，这些细胞中AKT底物的磷酸化水平也降低。在将荧光ZaTa立体定向注射到额叶皮层后，在体内也观察到了类似的结果，其中在ZaTa呈阳性的细胞中观察到AKT底物磷酸化水平的特定降低。这些体外和体内观察表明，ZaTa不仅与细胞内的AKT共定位，而且还抑制了其催化活性。

ZaTa进入细胞时，取决于ZaTa的定位，ZaTa也会导致PKAc以不同的模式表达。例如，在对ZaTa显示强核信号的细胞中，PKAc免疫反应性显着降低，而具有ZaTa细胞质聚集体的细胞通常显示PKAc蛋白水平增加。这些数据表明细胞中适当的AKT活性可以影响PKAc的表达程度。不希望受理论束缚，据信由于使用ZaTa处理细胞，AKT的核重新分布引起抑制PKAc表达的转录变化。或者，ZaTa在细胞质区室中的重新分布可能引起补偿效应，即PKAc的上调，以补偿AKT活性的降低。

在此也确定了破坏AKT-PKAc复合物的表型结果。ZaTa肽被注射到大脑半球的纹状体中，而DMSO则作为载体，被注射到麻醉下的成年C57BL/6小鼠的另一个大脑半球。大脑被取出并对其进行了解剖。来自每个大脑半球的等量蛋白质通过抗AKT抗体进行免疫沉淀。从右侧(载体处理的)和左侧(ZaTa处理的)纹状体免疫沉淀的AKT蛋白的量相当；然而，与AKT物理接触的PKAc量在用ZaTa处理后显着减少。这表明ZaTa可以破坏体内AKT和PKAc之间的物理复合物。为了比较ZaTa和载体处理的脑半球裂解物中的PKAc蛋白水平，在此进行了蛋白质印迹分析。尽管两个半球中PKAc的量相当，但在用ZaTa处理的半球中观察到PKAc的分子量明显增加。这表明用ZaTa处理导致PKAc的电迁移率变化，这可能是由于PKAc分子的翻译后所产生的变化。

如本文所公开，N2a细胞在其神经元细胞突起上显示出轴突特异的AKT-PKAc相互作用。因此，在此对还在培养的神经元中分析了AKT-PKAc复合物的稳定性和表型结果。N2a细胞用载体、ZaTa或对照肽处理24小时。处理24小时后除去培养基，从每个处理组中取出相同数量的细胞，在没有处理的情况下再培养24小时，或者裂解并用针对AKT的抗体进行免疫沉淀。在此还收集再培养24小时的细胞并进行免疫沉淀。同时，计算具有神经突的单个神经元的数量。用ZaTa处理减少了与AKT物理接触的PKAc的量，这种效果在没有ZaTa的情况下通过24小时培养可以逆转。同时，用ZaTa处理的细胞表现出具有神经突的神经元数量显着减少(图2)，这种效果在没有ZaTa的情况下通过24小时培养可以逆转。这些数据不仅证实了体内观察结果，显示了ZaTa对AKT-PKAc复合物的破坏，而且还表明了轴突形成与培养的神经元中与AKT物理接触的PKAc量的相关性。此外，这些数据表明ZaTa的作用是可逆的。N2a神经元的实时图像是在用载体或ZaTa(2或5μM)处理后捕获的。这些图像显示了未处理的N2a细胞中神经突形态的正常形态，其中用ZaTa肽处理N2a细胞以剂量依赖性方式引起显着的形态变化。ZaTa介导的变化包括轴突的逐渐丧失、新轴突形成的抑制、细胞运动性的丧失以及大细胞集落的形成。

为了确定在体内环境中破坏AKT-PKAc复合物的表型效应，ZaTa肽被立体定向注射到小鼠的大脑中，并在手术恢复后18小时对动物进行灌注。因为已知AKT在轴突形态中起作用(Markus等人(2002)Neuron 35：65-76)，纹状体的冠状切片用神经丝-H(NF-H)染色，作为轴突特异性标记。与注射DMSO作为载体的其他脑半球相比，在立体定向注射ZaTa肽后观察到纹状体中轴突丝束染色模式的变化。为了排除组织损伤的影响并显示手术后纹状体组织结构得以维持，切片用核标记物(Draq5)共同标记。同一Z步骤的NF-H和核标记染色在同一冠状切片的载体和ZaTa处理的半球中显示出相似的组织结构。这些数据与本文公开的共定位观察一致，表明AKT在轴突生长和轴突再生加速中的作用(也参见Markus等人(2002)同上；Namikawa等人(2000)J.Neurosci.20：2875-2886)。还已知PKA在轴突上生长锥的再生中起作用(Chierzi等人(2005)Eur.J.Neurosci.21：2051-2062)。因此，鉴于本文提供的数据，认为AKT和PKAc之间的适当相互作用涉及维持正常神经元形态。

AKT所影响的网络涉及CDK抑制剂p27^Kip1的表达和亚细胞定位的几种机制正向调节G1/S细胞周期进程(Blain和Massague(2002)Nat.Med.8：1076-1078；Liang，et al.(2002)同上；Shin等人(2002)同上；Viglietto等人(2002)同上)。基于这些研究，对ZaTa肽对细胞增殖的影响进行了评估。使用基于MTT的增殖测定，观察到活细胞数量呈剂量依赖性减少。蛋白质印迹分析显示，在用不同剂量的ZaTa肽处理后，N2a细胞中AKT底物的磷酸化水平随之降低。在不同浓度的ZaTa肽存在下捕获培养的N2a细胞的实时图像证实了分裂细胞数量的明显减少。因此，与先前报告所显示AKT在细胞周期进程中的积极作用一致，本文公开的数据证明ZaTa肽在细胞增殖速率中的抑制作用。

基于ZaTa的C端臂对AKT抑制作用的重要性，从而可确定残基Thr-8、Thr-10(相当于全长PKAc中的Thr-197)、Thr-14和Tyr-17上的游离羟基是否对该肽的生物活性很重要。ZaTa肽的突变体是通过用Asp作为具有带负电荷的侧链的氨基酸代替Thr-8或Thr-10的残基(分别为ZaTa^T8D和ZaTa^T10D)合成的。在此还使用具有亲水性正电荷氨基酸Arg在位置Thr-14或Tyr-17(分别为ZaTa^T14R和ZaTa^Y17R)进行合成，制造了ZaTa突变体。用Asp代替Thr-8或Thr-10显着降低了ZaTa对细胞增殖的抑制作用，同时用Arg代替Thr-14或Tyr-17显着增强了ZaTa活性(图3，直方图系列1)。ZaTa肽对细胞增殖的抑制作用在去除ZaTa处理后在很大程度上是可逆的(图3，直方图系列2)。虽然野生型ZaTa在低至2μM的剂量下导致活细胞数量显着减少，但在去除10μM野生型ZaTa或DMSO载体后24小时未观察到活细胞数量的显着差异。这些观察表明，构成ZaTa肽一级结构的氨基酸侧链的生化特性对该肽的生物学效应很重要。ZaTa可能与其他肽一样，可以在α/β二级结构之间切换，其中一种结构对其活性构象更有利，而另一种结构则产生非活性形式。因此，Thr-14或Thr-17突变为Arg似乎使ZaTa的活性构象更稳定，而将Thr-8或Thr-10改变为Asp更有利于生成无活性构象。

一些细胞增殖试验，如MTT，不能区分活细胞数量的减少是由于分裂细胞数量的减少，还是细胞毒性和死亡的结果。因此，除了捕获实时图像外，细胞在用ZaTa处理后的不同时间间隔用台盼蓝染色，并使用血细胞计数器通过光学显微镜进行计数。观察到活细胞数量的相同剂量依赖性减少。然而，虽然用野生型ZaTa、ZaTa^T8D或ZaTa^T10D处理后在12至72小时的不同时间点计数未见死细胞数量显着增加，但在用ZaTa^T14R或ZaTa^Y17R处理72小时后观察到死细胞数量显着增加。这一观察表明，虽然野生型ZaTa对AKT的抑制作用是可逆的，但ZaTa^T14R或ZaTa^Y17R突变体可以通过对AKT造成不可逆的抑制，引起永久性变化，导致细胞凋亡和细胞死亡。或者，Thr-14或Tyr-17上的游离羟基可能导致ZaTa与AKT的不稳定或者造成裂解，而Arg-14或Arg-17使这种结合更稳定且不可裂解。

在此也通过RNA干扰降低PKAcα蛋白水平来评估转录水平上PKAc和AKT之间的相互作用。PKAc水平降低导致非神经元HeLa细胞和神经元NG-108细胞中AKT1蛋白的量增加。还在PRKACA(PKAc alpha)基因剔除小鼠中分析了AKT表达。由于该品系的纯基因剔除小鼠无法存活到成年，因此在杂合PKAc小鼠中测量了AKT1蛋白水平，与野生型相比，PKAc蛋白表达量约为50％。来自杂合PKAc小鼠额叶皮层的蛋白质提取物显示AKT1蛋白质水平有所增加。这些数据表明，除了AKT和PKA之间的物理相互作用直接影响它们的活性水平外，当中还涉及调节蛋白质水平的活跃转录机制。

现在已经确定AKT通过磷酸化和抑制促凋亡介质如BAD、FOXO家族成员和IKK-β来防止细胞凋亡(Datta等(1999)Genes Dev.13：2905-2927)。为了证明ZaTa对AKT保护功能的影响，将原代皮层培养中的非增殖神经元作为利用AKT细胞增殖活性的最低水平的模型系统进行了分析。用DMSO、1μM或5μM ZaTa或对照肽处理原代神经元1、3、16、24、48或72小时。在TUNEL测定后计算凋亡细胞的数量。该实验的结果显示，与对照肽相比，在用ZaTa处理72小时后，TUNEL阳性细胞的数量出现显着的剂量依赖性增加。用ZaTa处理后凋亡神经元数量的增加与其对AKT的有效神经元内抑制一致。

为了证实ZaTa在体内的凋亡诱导作用，我们将ZaTa通过鼻腔输送到小鼠大脑，与立体定向手术相比，这属于一种微创手术。将化合物鼻内递送到大脑中是局部递送化合物的一种高效且有效的方式，无需通过血脑屏障，脑屏障是研究不同抑制剂/激活剂在CNS中作用的主要障碍(Vyas等人2005Curr.Drug Deliv.2：165-175；Hrafnkelsdottir等人(2005)Biol.Pharm.Bull.28：1038-1042)。对用ZaTa标记的C57BL/6小鼠重复鼻内处理三天显着增加了嗅球中凋亡细胞的数量，这在ZaTa染色阳性的细胞中特别显著。这是通过用荧光TUNEL和核标记对大脑切片进行双重标记来可视化的。相比之下，在ZaTa染色阴性或用对照肽处理后的细胞中没有观察到凋亡细胞的数量变化。总之，这些数据表明ZaTa可以在体外和体内抑制AKT依赖性功能。

为了提高ZaTa的体外活性、体内功效和稳定性，在此制备了一系列修饰肽。因此，本公开内容涉及用于改变激酶活性以治疗与AKT异常表达相关的疾病或病症的方法中的ZaTa修饰肽的组合物。本公开包括的公开的组合物包括合有与药学上可接受的载体混合的ZaTa修饰肽的药物组合物。由于发现ZaTa及其突变体可抑制AKT活性和/或改变其他激酶的活性，特定的实施方案可包含一种或多种ZaTa类似物的药物组合物。

与GSK-3肽和AMP-PNP复合的活化AKT的已知晶体结构促进了修饰肽的合理设计(Yang等人(2002)Nat.Struct.Biol.9：940-944)。该结构揭示了GSK-3肽通过AKT的激活环结合。观察到位于PKAc激活环中的Thr-197周围的ZaTa肽的短序列(SEQ ID NO：60)足以像全长PKAc蛋白一样有效地抑制AKT，这表明了两个分子的活性构象，与Thr-197位点相邻的残基之间的相互作用对于这种抑制是必不可少的。不希望受理论束缚，据信在全长PKAc的活性构象中，围绕Thr-197的特定序列停靠到AKT的活性位点，从而阻止Thr-308的有效磷酸化和/或GKS-3底物肽到AKT的激活环的结合和AKT未能在Ser-9位点磷酸化GSK-3。观察这种相互作用的另一个组成部分，发现与活性PKAc的抑制作用相反，AKT在Thr-197处磷酸化PKAc，这增加了其催化活性。本文公开的数据表明，PKAc对AKT的抑制作用不需要这种磷酸化；然而，它提供了一种构象变化，不仅有利于PKAc处于更活跃的状态，而且还暴露了该位点周围的残基，以便随后全长PKAc对AKT产生抑制作用。因此，作为一个结构模型，PKAc/AKT相互作用成为了一个分子开关，其中AKT首先磷酸化PKAc的Thr-197，这导致PKAc的构象更加活跃，并且它与AKT的激活环结合提供AKT的非活性构象。在分析cAMP诱导的PKA活化时，确定了复合物中PKA的催化和调节(Rlα)亚基的晶体结构(Kim等人(2005)Science 307：690-696)。该分析表明RI亚基的PKA抑制剂肽足以抑制PKAc催化活性。

在此对ZaTa肽的序列进行了一系列修饰，以鉴定出最短的ZaTa肽活性片段。ZaTa肽的几个片段被合成并通过MTT测定进行体外测试，以找到可以显示抗细胞增殖活性的最短序列。该实验表明，只需与Lys-Gly-Arg-Thr-(1-Nal)-Thr-Leu-Cys一样短的ZaTa变体序列就足以抑制细胞增殖。

此外，在体外和体内分析了ZaTa肽形成其单个Cys残基二聚体的能力以及这种二聚化对ZaTa肽的活性水平和效力的影响。对于体外测试，我们使用了MTT测定将ZaTa单体的抗细胞增殖活性与二聚体进行比较。该实验表明，与肽的单体相比，二聚体对细胞增殖的抑制作用更强。在体内测定中，我们对用载体、ZaTa肽的二聚体或单体治疗的动物之间U251异种移植物的肿瘤生长速率做出比较。该动物研究还证实，与单体相比，二聚体形式具有更好的活性。

此外，在体外和体内测试和研究了不同残基的典型肽修饰，例如肽的聚乙二醇化和脂化。该研究表明，肽的脂化和/或聚乙二醇化促进了肽在体外和体内的抗细胞增殖活性。

其他变化，如肽的C端酰化和N端酰胺化也提高了ZaTa肽的抗细胞增殖活性。然而，添加荧光分子如FITC以可视化肽的活性似乎降低了ZaTa肽的抗细胞增殖活性。值得注意的是，用卤化氨基酸衍生物如4-Cl Tyr或4-F Tyr或4-Cl-Phe或4-F-Phe取代ZaTa的亲水性残基(如Thr-15或Tyr-17)，改善了ZaTa的活性。此外，将天然氨基酸(例如Lys)更改为类似的非蛋白氨基酸(例如Orn)也提高了ZaTa的活性。

ZaTa肽序列的变化，例如单个残基替换，或同时用疏水性和正负或中性电荷性质相似的氨基酸替换两个或三个残基，均未显着改变对抗细胞增殖肽活性的干扰。该实验反映了这样一个事实，即该肽的序列可以耐受其序列中的几个突变，不会因此而阻止其抗细胞增殖活性。

检查了ZaTa的抗细胞增殖活性是否需要抑制AKT1活性。合成了具有不同截断和突变的ZaTa的几种变体，并在针对AKT1的体外激酶测定中进行了测试。这项研究表明，确实有几种ZaTa变体不会显着抑制AKT1，但仍然可以抑制细胞增殖。该实验表明，抑制AKT1是ZaTa的一种作用机制，而ZaTa变体的抗细胞增殖活性不需要抑制AKT1。

使用体外激酶测定法，针对约115种参与细胞增殖的不同激酶测试了ZaTa变体的激酶抑制谱。该激酶分析表明，除了AKT1、AKT2、p70S6K和Abl，ZaTa肽的不同变体还可以在纳摩尔范围内抑制其他几种激酶。更具体地说，在不同变体的纳摩尔浓度范围内被抑制的激酶是：

AKT1(PKB alpha)，AKT2(PKB beta)，MAP3K8(COT)，MST4，AURKB(Aurora B)，ROCK1，RPS6KB1(p70S6K)，CDC42 BPA(MRCKA)，BRAF，RAF1(cRAF)Y340DY341K1SG)、MAP4K4(HGK)、AURKA(Aurora A)、AURKC(Aurora C)、BRAFV599E、CHEK1(CHK1)、GSG2(Haspin)、CHEK2(CHK2)、FGR、IKBKB(IKKbeta)、CDK7/cyclin H/MNAT1和CDC42 BPB(MRCKB)

因此，在一个方面，本公开的所阐述的修饰肽，包括：

(一)氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，或

(二)与氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)具有至少40％序列同一性的氨基酸序列，

其中

X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合；

Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；和

Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

在本文所述的任何方面或实施例中，X可包括位于其末端的乙酰基、月桂酰基或棕榈酰基；Y可以是1-Nal、2-Nal；Z可以包括位于其末端的氨基。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X¹)-KGRT-(Y)-TLC-(Z)，其中X¹与上述X相同。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X²)-VKGRT-(Y)-TLC-(Z)，其中X²与上述X相同。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X³)-RVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，其中X³与上述X相同，并且其中Z¹与上面Z。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X⁴)-KRVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，其中X⁴与上述X相同，并且其中Z¹与Z以上。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X⁵)-RVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，其中X⁵与上述X相同，并且其中Z¹与上面Z。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X⁷)-V-(X⁸)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，其中X⁷与以上X相同，并且其中X⁸是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰或其组合。

在本文所述的任何方面或实施方案中，氨基酸序列可以是(X⁹)-KV-(X⁸)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，其中X⁹与上述X相同。

在另一方面，本公开内容包括具有下式的修饰肽：

(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)-(Z)或与氨基酸序列(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)-(Z)

具有至少40％序列同一性的氨基酸序列

其中

seq1是GRT、KGRT、VKGRT、RVKGRT、KRVKGRT、(Orn)-RVKGRT或AKRVKGRT；

seq2是TLC、TLCG、TLCGR、TLCGRPE、TLCGRPEY或TLCGRPE-(4-Cl-Phe)；

X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合；

Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；和

Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

在本文所述的任何方面或实施方案中，X可包括位于其末端的乙酰基或脂质基团。脂质基团可以是C6至C20脂质基团，例如，月桂酰基或棕榈酰基。

在本文所述的任何方面或实施方案中，Y可以是1-Nal，并且Z可以包括位于其末端的氨基。

在本文所述的任何方面或实施方案中，非天然氨基酸是鸟氨酸、萘丙氨酸、4-氯苯丙氨酸或其组合。

另一方面，本公开包括上述修饰肽的二聚体。在本文所述的任何方面或实施方案中，二聚体是同二聚体或异二聚体，并且可以包括二硫键。

根据本公开，示例性修饰肽可以包括以下结构：

月桂酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

月桂酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂

Palmitoyl-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

棕榈酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂

Ac-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂

Ac-AKRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂

Ac-AKRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-KRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂

Ac-KRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-KGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-KGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-VKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-VKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCG-NH₂

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCG-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCGR-NH₂

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCGR-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-(4-Cl-Phe)-NH₂

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC--(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-KV-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-KV-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-KVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-KVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)

Ac-RVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂

Ac-RVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)。

上述结构中，″月桂酰基″所指的是正十二烷酰基，″棕榈酰基″所指的是正十六烷酰基，″Ac″所指的是乙酰基，″Orn″所指的是鸟氨酸，″1-Nal″所指的是1-萘丙氨酸，″2-Nal″所指的是2-萘丙氨酸，″4-Cl-Phe″所指的是4-氯-苯丙氨酸，″Cys″所指的是半胱氨酸。

如本文所用，本公开的″修饰肽″包括重组产生、从天然来源纯化或化学合成的多肽。为了易于纯化和增高产量，本领域通常通过重组蛋白质方法来生产蛋白质及其片段。体内(即基于细胞)产生重组蛋白的方法通常包括分离编码目标蛋白或片段的核酸分子，将核酸分子以适合表达蛋白或片段的形式掺入重组表达载体中进入宿主细胞中，并表达蛋白质。合适的表达形式提供了重组表达载体包括一个或多个调节序列，其以允许核酸转录成mRNA和mRNA翻译的方式与编码感兴趣的蛋白质或片段的核酸分子可操作地连接进入蛋白质。调控序列可以包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列和编码其的载体是本领域技术人员已知的并且在Goeddel，基因表达技术(GeneExpression Technology)：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有所描述。用于在哺乳动物、酵母或原核系统中表达重组蛋白的合适载体可从诸如

INVITROGEN^TM、Pharmacia等来源商购获得。许多这些载体编码异源多肽，即用于分泌的信号序列和/或将有助于纯化感兴趣的蛋白质或片段的其他多肽。优选地，异源多肽具有特定的切割位点以从感兴趣的蛋白质去除异源多肽。可以与感兴趣的蛋白质融合的其他的异源多肽是增加融合蛋白的表达或溶解度或通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化融合蛋白的那些。典型的融合表达载体包括pGEX(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们融合了谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖E结合蛋白，或蛋白质A分别对应于感兴趣的蛋白质。应当理解，表达载体的设计可能取决于诸如要转染的宿主细胞的选择和/或所需的表达水平等因素。

可以使用用于转化细胞的任何常规技术将重组表达载体引入宿主细胞(例如，真核或原核来源的)。在Sambrook等人撰写的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)和其他实验室手册中找到了转化宿主细胞的合适方法。用编码蛋白质的核酸分子转化的宿主细胞的数量将至少部分取决于所用重组表达载体的类型和所用转化技术的类型。重组蛋白或片段可以通过将重组表达载体整合到宿主细胞的基因组中或通过载体的游离维持来瞬时表达，或更典型地稳定表达。

一旦产生，修饰肽可以作为分泌多肽从培养基中回收，或者当在没有分泌信号的情况下直接表达时从宿主细胞裂解物中回收。当修饰肽在非人类来源的重组宿主细胞中表达时，修饰肽基本上不含人类来源的蛋白质或多肽。然而，可能有必要使用常规蛋白质纯化方法从重组细胞蛋白质或多肽中纯化修饰肽以获得与修饰肽基本同质的制剂。作为第一步，将培养基或裂解物离心以去除颗粒细胞碎片。然后分离膜和可溶性蛋白质级分。然后，可以从可溶性蛋白质级分中纯化重组修饰肽。此后，可使用合适的纯化程序从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化重组修饰肽，例如：通过在免疫亲和柱或离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相高效液相色谱法；硅胶或阳离子交换树脂上(如DEAE)的色谱法；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex^TMG-75进行凝胶过滤；和配体亲和层析。

除了重组生产之外，修饰肽可以通过使用固相技术的直接肽合成来生产(Merrifield RB(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化进行。例如，可以使用Applied

431A肽合成仪(Perkin Elmer，Boston，MA)实现自动合成。当生产修饰肽时，其各个部分可以分别化学合成并使用化学方法组合以产生全长分子。

无论是重组生产还是化学合成，修饰肽都可以进一步功能化以供使用。例如，修饰肽在用于抑制AKT和其他激酶的活性之前可以使用众所周知的方法磷酸化、乙酰化、甲基化或以上方式的组合。此外，基于PKAc和PKAc片段的治疗剂可以连接到修饰肽支架上。

在本文所述的任何方面或实施方案中，本公开内容的修饰肽中的氨基酸残基选自任何天然存在的氨基酸。在其他实施方案中，一种或多种或合成的非编码氨基酸用于置换一种或多种天然存在的氨基酸残基。某些常见的非编码氨基酸包括但不限于：肽模拟物或类似物；β或γ氨基酸；基因编码氨基酸的D-对映异构体；2，3-二氨基丙酸(Dpr)；α氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly或Sar)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(Bua)；叔丁基甘氨酸(Bug)；N-甲基异亮氨酸(Melle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；高亮氨酸(hLeu)、高缬氨酸(hVal)；高异烟碱(hlle)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；N-甲基缬氨酸(MeVal)；同型半胱氨酸(hCys)；高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)和高脯氨酸(hPro)；之类的。其余的非编码氨基酸是本领域技术人员熟知的(参考，例如，Fasman(1989)CRC Practical Handbook of Biochemistry andMolecular Biology，CRC Press，Boca Raton，FL，at pp.3-70和其中引用的参考文献提供的各种氨基酸)。此外，本公开的发明的氨基酸可以是L-或D-构型。

修饰肽可用作纯化制剂，或在某些实施方案中，配制成含有有效量的修饰肽或其二聚体的药物组合物，以降低AKT和/或其他激酶的表达或活性。这种药物组合物可以通过本领域公知的方法制备并含有本领域公知的载体。此类方法和成分的普遍认可的概要可在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro，editor，20thed.Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2000找到。例如，可以使用生理pH值的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。药物组合物中也可以添加防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。例如，可以添加苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。脂质体，例如美国专利号5,422,120、WO 95/13796、WO 91/14445或EP 524,968B1中描述的那些，也可作为合适的载体。

取决于预期用途，本公开的药物组合物可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外注射(例如腹膜内、皮下、瘤内或肌肉内注射)、口服或通过局部应用(例如，透皮或通过粘膜表面)。药学上可接受的制剂是指允许本公开的肽分子有效分布在最适合其所需活性的物理位置的组合物或制剂。适合与本公开的肽分子一起配制的药剂的非限制性实例包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、含有亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)，其可以增强药物进入各种组织，例如中枢神经系统(Jolliet-Riantand Tillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.，13，16-26)；可生物降解的聚合物，例如用于植入后持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球(Emerich，DF等，1999，CellTransplant，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.；和负载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的纳米颗粒，它们可以通过血脑屏障传递药物，并可以改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。传递药物策略的其他非限制性实例，包括中枢神经系统递送包括在Boado等人，1998，J.Pharm.科学。，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett。，421，280-284；Pardridge等人，1995，美国PNAS，92，5592-5596；Boado，1995年，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等，1998，Nucleic Acids Res。，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA，96，7053-7058。所有这些参考文献均通过引用并入本文。本公开的修饰肽通过鼻内注射递送到大脑中；将肽溶解在四甘醇(Sigma)中至终浓度为0.5mM，然后将5μl溶液注入鼻腔。

在某些实施方案中，本公开内容提供了作为细胞穿透肽并且可在整个人体组织中快速分布的修饰肽。在某些实施方案中，本文所述的肽被局部递送至肿瘤部位。在示例性实施方案中，本公开的修饰肽通过例如立体定向手术直接注射到肿瘤部位。然而，该技术的一个潜在缺点是局部注射通常不为用于持续释放递送而配制。

因此，还考虑提供和/或适用于本公开的治疗剂的受控和/或持续释放的另外的制剂/递送配制方式。例如，本公开的修饰肽可以缀合(共价键或通过非共价键)或仅包埋在药学上可接受的(即，生物学惰性或生物学相容的)和/或生物学可吸收载体材料中，例如聚合物基质、生物聚合物基质和/或其他基质。如本文所用，″生物学惰性或生物学相容的″是指不会在宿主中导致显着过敏或免疫原性反应的材料。在一个实施例中，该材料包含了胶原蛋白。其他材料包括蛋白质，如弹性蛋白、糖类和凝胶，和/或包含糖类的溶胶，例如羟丙基纤维素(HPC)、HPMC、甲基丙烯酸酯等。在示例性实施例中，所用材料是可吸收的胶原海绵(ACS)或交联的胶原基质，其适于让肽受控和/或持续释放到组织中。可以在递送装置形成的同时或之后将修饰肽插入装置或预成型/预制的基质材料中。在其他实施例中，可以将修饰肽/生物相容性材料(例如，胶原)插入另一个装置中，该装置也是生物可吸收的和/或可植入的，该装置被递送到肿瘤部位以允许持续的局部递送。改性肽/生物相容性材料的组合也可以通过不同的外部设备插入。参见，McKay，B.Local Sustained Delivery ofRecombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2(rhHBMP-2).31^st AnnualInternational Conference of the IEEE EMBS，Sept 2-6，2009；和Chan，B.P.Effects ofPhotochemical Cross-linking on the Microstructure of Collagen and aFeasability Study on Controlled Protein Release.Acta Biomaterialia，4：1627-36(2008)，其全文以引用方式并入本文。

该制剂可以以含有常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的剂量单位制剂的形式口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠给药。本文使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内或鞘内注射或输注技术等。此外，在此提供了包含本公开的核酸分子和药学上可接受的载体的药物制剂。本公开的一种或多种核酸分子可以与一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂以及如果需要的话其他活性成分联合存在。本公开的药物组合物可以是适合口服使用的形式，例如，作为片剂、锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。

用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以提供药学上优雅和适口的配方。片剂含有与适用于制造片剂的无毒且药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以不包衣，也可以用已知技术包衣。在某些情况下，此类包衣可通过已知技术制备以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。比方说，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

口服制剂也可以配制为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如：碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

水悬浮液含有与适合制备水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。这种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七亚乙基氧十六醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸的偏酯和己糖醇的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚山梨醇酐单油酸酯。水性混悬剂也可含有一种或多种防腐剂，例如乙基，或n丙基p羟基苯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种诸如蔗糖或糖精的甜味剂。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂和调味剂以配制可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。

适用于通过加入水制备水悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂或悬浮剂的例子已在上述列出。额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂也可包含在内。

本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯)、酸酐(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。乳液还可含有甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以与甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖)一起配制。此类制剂还可包含缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式配制。该悬浮液可以根据已知技术使用上文提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，我们可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，如油酸的脂肪酸也可用于制备注射剂。

本公开的肽分子也可以栓剂的形式给药，例如用于直肠给药或通过导管直接给药至膀胱本身。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此会在直肠中熔化以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。

本公开的肽分子可以在无菌培养基中肠胃外施用。根据所使用的载体和浓度，药物可以悬浮或溶解在载体中。有利地，如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的佐剂皆可溶解在载体中。

可与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的宿主和特定的给药方式。剂量单位形式通常含有约0.1mg至约1000mg的活性成分。

应当理解，任何特定患者或受试者的特定剂量水平取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。

对于对非人类动物的给药，也可以将组合物添加到动物饲料或饮用水中。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物，以便动物与其饮食一起摄取适量用于治疗的组合物。也可以方便地将组合物作为预混物加入饲料或饮用水中。

该组合物也可以与其他治疗性化合物合并给予受试者以提高整体治疗效果。使用多种化合物来治疗一种适应症可以增加有益效果，同时减少副作用的出现。

在某些实施方案中，本公开内容涵盖已被修饰以携带包含编码修饰肽的核酸的外源或异源核酸的宿主细胞。

术语″宿主细胞″包括可用于携带异源核酸或表达由异源核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以包含在细胞的天然(非重组)形式中找不到的基因，在细胞的天然形式中发现的基因，其中基因被修饰并通过人工手段重新引入细胞，或细胞内源性核酸，经过人工修饰而未从细胞中去除核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。细菌培养所需的一般生长条件可以在诸如BERGEY′S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY，Vol.1，NRKrieg，ed.，Williams and Wilkins，Baltimore/London(1984)的文案中获取资料。″宿主细胞″也可以是其中内源基因或启动子或两者已被修饰以产生本公开的复合物的一种或多种多肽组分的细胞。

本公开的核酸、蛋白质或肽的衍生物或变体包括但不限于包含与本公开的核酸或蛋白质基本上同源的区域的分子，在各种实施方案中，与相同大小的核酸或氨基酸序列或进行比较时比对序列至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的同一性(优选80-95％的同一性)，其中比对是通过本领域已知的计算机同源程序完成的，或者其编码核酸能够在严格、中度严格或低度条件下与编码本公开蛋白质的序列的互补序列杂交严苛的条件。参见，例如Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1993。核酸衍生物和修饰包括通过基因置换、位点特异性突变、缺失、插入、重组获得的那些、修复、改组、核酸内切酶消化、PCR、亚克隆和相关技术。

此外，普通技术人员将认识到″保守突变″还包括改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸的核酸的置换、删除或添加，其中该核酸改变导致化学上相似的氨基酸被取代。可以作为彼此保守取代的氨基酸包括：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水性：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水性：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外，因保守变异而不同的序列通常是同源的。

对包括诱变、PCR、克隆等在内的本公开的实践有用的分子生物学技术的描述包括Berger和Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，METHODS IN ENZYMOLOGY，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(Berger))；Sambrook等人，MOLECULARCLONING--A LABORATORY MANUAL(第2版)，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，1989，和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，FMAusubel等人编辑，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和JohnWiley&Sons，Inc.；Berger、Sambrook和Ausubel，以及Mullis等人，美国专利。第4,683,202号(1987年)；PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis等人编辑)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1990)(Innis)；Arnheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47。

在又一个实施方案中，使用了哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本公开的核酸。对于适用于原核细胞和真核细胞的表达系统，参见例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL的第16和17章。Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。

多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子或RNA分子。多核苷酸如DNA或RNA可以包括其中T(胸苷)也可以是U(尿嘧啶)的序列。如果多核苷酸特定位置的核苷酸能够与反平行DNA或RNA链中相同位置的核苷酸形成Watson-Crick配对，则该多核苷酸和DNA或RNA分子在那个位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此结合以实现所需过程的核苷酸占据时，多核苷酸和DNA或RNA分子基本上彼此互补。

用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域技术人员公知的常规技术进行。″转化″是指在掺入新DNA(即细胞外源DNA)后在细胞中诱导的永久性或瞬时遗传变化。

在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。非限制性的合适的组织特异性启动子的实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人，1987。Genes Dev。1：268-277)，淋巴样特异性启动子(卡蓝默和Eaton，1988.Adv.Immunol43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto and Baltimore，1989.EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人，1983.Cell33：729-740；Queen andBaltimore，1983.Cell33：741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne andRuddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等人，1985Science230：912-916)，和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利4,873,316号和欧洲申请公开号264166)。发育调节的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kesseland Gruss，1990.Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes and Tilghman，1989.Genes Dev.3：537-546).

在任一实施方案中，编码本公开内容的修饰肽的核酸可以作为：一个或多个裸DNA；一种或多种核酸置于合适的表达载体中并保持游离；一种或多种整合到宿主细胞基因组中的核酸；编码复合物组分的内源基因的修饰版本；一种或多种核酸与一种或多种调节性核酸序列组合；或其组合。核酸可任选地在5′端、3′端，或在ORF内的任何位置包含接头肽或融合蛋白组分，例如His-Tag、FLAG-Tag、荧光蛋白、GST、TAT、抗体部分、信号肽等。

当宿主是原核生物，例如大肠杆菌时，能够从指数生长期后收获的细胞制备能够吸收DNA的感受态细胞，随后通过本领域公知的方法使用CaCl₂处理。或者，可以使用MgCl₂、RbCl、脂质体或脂质体-蛋白质缀合物处理。转化也可以在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔进行。这些示例并不成为本公开的限制；还有许多用于转染宿主细胞的技术，这些技术是本领域技术人员熟知的并且在本公开的范围内考虑使用。

当宿主是真核生物时，这种用DNA转染的方法包括磷酸钙共沉淀物、常规机械程序如显微注射、电穿孔、插入包裹在脂质体中的质粒或病毒载体，以及本领域已知的其他方法，皆可使用。真核细胞可以是酵母细胞(例如，酿酒酵母)或可以是哺乳动物细胞，包括人细胞。对于重组蛋白的长期高量生产，稳定表达是首选的条件。

如本文所举例说明的，本公开的修饰肽在抑制AKT和/或其他激酶的表达或活性(例如，如通过Ser-21 GSK-3底物肽的磷酸化所确定的)中发现可应用，其中激酶抑制导致细胞增殖的减少和现有神经突的渐进性剂量依赖性丧失，以及新神经突形成的抑制。因此，本公开不仅包括修饰肽用于降低细胞增殖的用途，本公开还提供了用于预防或治疗癌症或神经退行性疾病或精神疾病或病症的方法。

AKT介导的细胞周期进程控制在本领域中是公认的(参见，例如，Brazil等人(2004)同上)。AKT通过促进G1/S转变和M期的启动来调节细胞周期(Collado等人(2000)J.Biol.Chem.275：21960-21968；Datta等人(1999)Genes Dev.13：2905-2927；Franke等人(1997)Cell88：435-437)。AKT还会磷酸化MDM2，导致其易位到细胞核，在那里促进p53的降解，导致p21 ^Cip1 mRNA转录的减少。在细胞核中，FOXO转录因子会增加p27^Kip1的转录，但该功能受到AKT磷酸化的抑制，导致FOXO蛋白保留在细胞质中。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p21^Cip1和p27^Kip1蛋白也可以被AKT磷酸化，导致它们在细胞质中积累，从而解除对CDK2活性的抑制并促进G1/S转换(Blain和Massague(2002)同上；Liang等人(2002)同上；Shin等人(2002)同上；Viglietto等人(2002)同上)。AKT还通过磷酸化具有FHA和无名指结构域(CHFR)和Myt1的检查点蛋白(Brazil等人(2004)同上；Okumura等人(2002)同上)将细胞周期驱动到M期。鉴于AKT在细胞周期中多个检查点的调节中起重要作用，已知AKT过度活跃与人类最常见的恶性肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌在癌症、肝细胞癌、甲状腺癌和中枢神经系统恶性肿瘤(如胶质母细胞瘤和神经胶质瘤)中有关系，本发明的修饰肽可用于抑制癌细胞增殖，例如：用于癌症的预防和治疗。

胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。胶质母细胞瘤的有丝分裂活动丰富，血管内皮增生突出。这两种机制均由AKT通过磷酸化和蛋白质-蛋白质相互作用严格调节(Brazil等人(2002)同上)。这些特征导致癌细胞快速增长并且大多数患者在诊断后一年内死亡(Underwo od(2004)General and systemic pathology.4^thEdition)。AKT信号通路与胶质母细胞瘤和神经胶质瘤的肿瘤引发和维持有关(Lefranc等人(2005)J.Clin.Oncol.23：2411-22；Kesari等人(2005)Curr.Neurol.Neurosci.Rep..5：186-97)并且靶向AKT是治疗脑肿瘤的有效策略(Kesari等人(2005)同上)。已经在用于治疗胶质母细胞瘤的临床试验中研究了AKT抑制剂(Carpentier(2005)Bull.Cancer92：355-9)。已经研究了单克隆抗体和小肽激素对恶性神经胶质瘤的局部靶向作用(Merl o，等(2003)ActaNeurochir.Suppl.88：83-91)，从而展示了肿瘤通过小肽激素受体显着吸收药物。

发现本文公开的示例性修饰肽在局部施用非常小剂量的该肽(仅1μL mM溶液)后可有效吸收分布于整个小鼠脑组织，并特异性抑制AKT。修饰肽还有效抑制源自不同恶性人类细胞系的癌细胞的细胞增殖。考虑的修饰肽的三种效果的结合，即，在脑组织中的分布，AKT和其它肽的抑制体内和细胞增殖的抑制，修饰肽将在治疗人CNS肿瘤以及在许多其他人类恶性肿瘤中可被使用，这三个过程已被证明在病理发展和不良预后中起着重要作用。在CNS肿瘤的治疗中，本公开内容的修饰肽具有使用先进的微创神经外科技术直接递送到肿瘤部位的优势。目前对CNS肿瘤的治疗通常涉及具有潜在严重手术后并发症的侵入性神经外科手术或强度放疗。

AKT通路的激活也已被证明有助于前列腺癌的发病机制(Culig等人(2005)Endocr.Relat.Cancer 12：229-44)，并且已知抑制该信号通路可在人类前列腺腺癌中的治疗产生正面影响(Wang等人(2004)Neuron 38：915-928)。因此，用本公开内容的修饰肽靶向AKT也可用于治疗前列腺癌。

AKT也被记录为与乳腺癌有关。虽然基于肽的疫苗通常用于靶向乳腺癌(Disis等(2004)Breast Dis.20：3-11)，但本公开的修饰肽可用作乳腺癌治疗中的主要或辅助治疗剂。

抑制细胞增殖的方法通常包括使细胞(例如癌细胞)与有效量的修饰肽(例如，在药物组合物中)接触的步骤，从而与不与修饰肽接触的细胞相比减少细胞的增殖。本文公开了监测细胞增殖减少的方法。

在癌细胞增殖和癌症预防或治疗的背景下，有效量被认为是减少或抑制癌细胞增殖从而阻止肿瘤发展和/或减小肿瘤大小的量。在理想情况当中，该药剂当与其中不存在修饰肽的其他相同条件相比时导致癌细胞增殖或肿瘤大小降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。

如本文所用，″有效剂量″用于指预防、抑制发生或治疗(在一定程度上减轻症状，优选所有症状)疾病状态所需的修饰肽的量。有效剂量取决于疾病的类型、使用的组合物、给药途径、被治疗的动物类型、所考虑的特定动物的身体特征(例如，年龄、体重、性别)、同时所用的药物和其他医学领域的技术人员会认识到的因素。通常，根据效力施用0.001mg/kg和1000mg/kg体重/天之间的量的活性成分。本公开的发明包括包含治疗或预防有效量的治疗剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在一个实施方案中，活性化合物与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.购买。脂质体悬浮液(包括靶向具有病毒抗原的单克隆抗体感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所述。

以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物特别有利于给药和确保剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单元含有预定量的活性化合物，经计算结合所需的药物载体可产生所需的治疗效果。本公开的剂量单位形式的规格由并直接取决于活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，以及配制此类活性化合物用于治疗个别病例的领域中固有的限制。

本发明的核酸分子可以插入载体中作为基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉注射、局部给药(参见，例如，美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(参见，例如，Chen等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括其中嵌入基因递送载体的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产生时，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。药物组合物可与给药说明一起包装在容器、包装或分配器中。

此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如，用于确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(治疗有效剂量为50％的人口)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比值LD₅₀/ED₅₀。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然展示毒副作用的化合物也可被使用，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以尽量减少对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定一系列用于人类的剂量。此类化合物的剂量优选在包括ED₅₀且毒性很小或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的给药途径。对于本公开的方法中使用的任何化合物，有效治疗剂量可以最初从细胞培养测定中预计算出。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度包括在细胞培养物中测定的IC₅₀范围(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。血浆中的药物浓度也可被测量，例如，可以通过高效液相色谱法。

就本发明组合物降低或抑制癌细胞增殖而言，患有或有患癌症的风险的个体例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、肝细胞癌、甲状腺癌或中枢神经系统恶性肿瘤(例如如胶质母细胞瘤和神经胶质瘤)将受益于接受本公开内容的修饰肽或包含其的组合物的治疗。患有癌症的个体通常是指已被诊断出患有癌症的患者，而有患癌症风险的个体可能有癌症家族史或表现出一种或多种与癌症相关的体征或症状(例如，肿瘤、疼痛感增加、虚弱)。此类个体在接受本公开的组合物治疗后，预期将表现出与癌症相关的体征或症状的减少以及生活质量和预期寿命的普遍改善。预期本组合物不仅可用于预防或治疗恶性肿瘤，所述组合物还可用于治疗良性肿瘤，例如良性CNS肿瘤。虽然良性CNS肿瘤不会转移，但由于它们在颅骨中的高生长能力并有对重要的CNS结构施加压力的倾向，会导致严重的并发症和残疾。因此，用本发明组合物治疗将缓解这些症状。

鉴于本公开内容的修饰肽的增强的细胞靶向活性，特定实施方案包括使用修饰肽作为用于将治疗剂或造影剂靶向递送至细胞或组织的部分。因此，与未缀合的药剂相比，本发明的修饰肽可以通过共价连接与化学疗法或治疗药剂有效连接以增加药剂的细胞靶向和摄取。或者，修饰肽可附着于载药脂质体或纳米颗粒的表面以促进药物递送至细胞。可以使用本公开内容的修饰肽靶向细胞(例如，癌细胞或神经元)的药剂包括细胞毒剂，例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、喜树碱(CPT)、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素；治疗剂，包括抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、地卡巴嗪)、烷化剂(例如，甲氯乙胺、硫替巴、氯霉素、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺式二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前的柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，放线菌素)(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))、抗炎剂、抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)和选择性凋亡剂，例如

(Exisulind)、PANZEM^TM(2-甲氧基雌二醇)、

(硼替佐米)蛋白酶体抑制剂、细胞毒剂、烷化剂、抗代谢物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、抗体、激酶抑制剂或其他抗肿瘤剂、放射性同位素、治疗性核酸或多肽、荧光标记物、顺磁性离子、造影剂、金属螯合剂、毒素、激素如类固醇；抗代谢药如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤或氨基蝶呤；蒽环类；丝裂霉素C；长春新碱；地美可辛；依托泊苷；光神霉素；或烷化剂，例如苯丁酸氮芥或美法仑，化疗剂，例如抗肿瘤药物、核酸、核苷酸、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、抗肿瘤剂、肽或假肽螯合剂(例如，接头-螯合剂、甘氨酰-酪氨酰-(N，e-二亚乙基三胺五乙酸)-赖氨酸盐酸盐(GYK-DTPA-HCI)、放射性化合物、白喉毒素(链A)、蓖麻毒素(链A)、阿霉素、苯丁酸氮芥、柔红霉素或美洲商陆抗病毒蛋白以增强其杀肿瘤效力、核磁自旋共振同位素、金属离子等。然而，如本领域技术人员将理解的，本公开不限于任何特定类型或类别的治疗剂，或任何特定要治疗的疾病。

将上面列出的试剂与肽或假肽结合的方法是众所周知的或容易确定的，包括例如与氨基酸侧链、官能团、碳水化合物、脂质和其他小分子的结合。参见例如，Goldenberg，D.M.et al，New England J.Med.，298：1384-1388(1978)，Goldenberg，D.M.et al，J.A.M.A.，250：630-635(1983)，Goldenberg.D.M.et al，Gastroenterol.，84：524-532(1983)，Siccardi，A.G.et al，Cancer Res.，46：4817-4822(1986).Epenetos，A.A.et al，Cancer，55：984-987(1985)，Philben，V.J.et al，Cancer，57：571-576(1986)，Chiou，R.etal，Cancer Res.，45：6140-6146(1985)和Hwang，K.M.et al，J.Natl.Cancer Inst.，76：849-855(1986)，所有这些内容都特别通过引用并入本文。

可与抗体缀合的标志物的实例为本领域技术人员所熟知，包括可通过核磁共振成像检测的物质，即核磁自旋共振同位素和放射性物质。核磁自旋共振同位素的优选示例是钆(Gd)。放射性标记的合适例子包括I¹²⁵、I¹³¹、I¹²³、In¹¹¹、In¹¹³、Ga⁶⁷、Ga⁶⁸、Ru⁹⁷、Ru¹⁰³、Hg¹⁹⁷、Hg²⁰³和Tc⁹⁹。放射性标记的检测是通过如以上引用伽马闪烁照相机或参考文献中所述等进行的。核磁成像设备可用于检测核磁自旋共振同位素标记。

一般而言，本公开的修饰肽具有带净正电荷的两亲性质。通常，两亲性结构在介导肽和蛋白质与膜的相互作用中起重要作用(Sharadadevi，等(2005)Proteins59：791-801)。因为初级两亲性细胞穿透肽已被用于大亲水分子如寡核苷酸和蛋白质的有效细胞内递送，所以它们被用于药物递送(Plenat等人(2005)Biophys.J.89：4300-4309).已经表明，在两亲性螺旋中，强烈偏好出现Arg或Lys(Sharadadevi等人(2005)同上)。净电荷和平均疏水矩之间也存在关系，这是寻膜特性的决定因素。净正电荷似乎比净负电荷有利于更高的疏水性(Sharadadevi等人(2005)同上)。与已知的细胞穿透肽一样，修饰肽的两亲结构可以促进细胞渗透，靶向细胞内的AKT和PKAc等激酶，发挥其生物学活性。Thr-14或Tyr-17突变为Arg会产生更高的净正电荷，从而增加修饰肽的平均疏水时刻并增强其效果，而Thr-8或10突变为带负电荷的Asp会导致正电荷降低净电荷，从而调节生物活性。因此，本公开内容的修饰肽不仅可用作抗癌剂，而且可用于将另外的治疗剂靶向递送至细胞。

ZaTa序列中的其他几种肽修饰提高了其活性。这种修饰的例子是替换单个、两个或三个氨基酸，用类似但异常的氨基酸替换天然氨基酸，例如将Try更改为Nal，或Lys更改为Orn，或将天然亲水性残基(例如Thr或Tyr)替换为卤化氨基酸衍生物，例如4-ClTyr或4-FTyr或4-Cl-Phe或4-F-Phe。

与癌症一样，AKT活性的增加也已知与不同类型的阿尔茨海默病有关(Blain和Massague，(2002)同上；Griffin等(2005)同上；Liang等(2002))同上；Shin等人(2002)同上；Viglietto等人(2002)同上)，而AKT活性的降低与精神分裂症有关(Emamian等人(2004)同上)。此外，PKA信号通路在精神分裂症中也具有新的作用(Millar等人(2005)同上)。

关于神经元突触活动和神经变性，离子通道已被确定为一类新型的PKB/Akt底物，将突触可塑性确定为受该激酶调节的生物过程。特别是A型γ-氨基丁酸(GABA_A)受体的β2亚基在体外和体内都是AKT底物(Wang，et al.(2002)Neuron38：915-928)。这种蛋白质是配体门控氯离子通道的成员，该通道在哺乳动物大脑中的大多数抑制性突触中介导突触传递。苯二氮卓类和巴比妥类等药物对GABA_A受体授以介导抗精神病作用。AKT介导的Ser-410磷酸化增加了质膜表面上GABA_A受体的数量，从而增加了受体介导的GABA能突触抑制的功效(Brazil等人(2004)同上)。

对人类的研究提供了阿尔茨海默病(AD)脑中AKT活化增加和关键AKT底物过度磷酸化的证据(Griffin等人(2005)同上)。与对照神经元相比，在AD颞叶皮层神经元中观察到AKT和磷酸化AKT的差异分布，这伴随着颗粒部分中活性磷酸化AKT水平的增加，以及AD细胞溶质部分中AKT水平的显着降低，导致AD中的AKT(磷酸化AKT/总AKT比率)活化率增高。此外，总AKT底物的磷酸化水平显着增加，包括GSK3β(Ser-9)、tau(Ser-214)、mTOR(Ser-2448)，以及AKT靶标p27^kip1的水平据报道与对照组相比在AD颞叶皮层明显降低。此外，在AD神经元中发现了AKT的主要负调节因子PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物在10号染色体上缺失)的显着丢失和分布改变。在末期AD的海马体CA1中观察到磷酸化AKT和含有PTEN的神经元的丢失(Griffin等(2005)同上)。还分析了来自AD病例和匹配对照的中颞叶和中额叶皮质中AKT的酶活性(Rickle等(2004)Neuroreport 15：955-959)。该分析的结果表明，与非疾病对照和患有另一种神经退行性疾病的阳性疾病对照相比，来自AD的颞叶皮质可溶性组分中AKT(免疫沉淀AKT引起的GSK-3α/β融合蛋白磷酸化)的活性显着增加。此外，颞叶皮质可溶性组分中的AKT活性与神经原纤维变化的Braak分期呈正相关。在经历退化的AD锥体神经元和反应性星形胶质细胞中显示出强烈的磷酸化AKT免疫反应性。鉴于PKAc片段可以有效地降低大脑中AKT底物的磷酸化，抑制AKT可以逆转在患有AD的人类中观察到的变化，从而为AD的治疗提供治疗益处。

许多遗传性神经退行性疾病是由CAG重复序列的扩增引起的，该序列在蛋白质中产生长聚谷氨酰胺(polyQ)束，其长度与疾病的严重程度直接相关(Emamian等人(2003)Neuron 38：375-387；Chen，et al(2003)Cell113：457-68)。已经鉴定了介导1型脊髓小脑共济失调(SCA1)和亨廷顿氏病病理生理学的AKT底物(Humbert等人(2002)Dev.Cell2：831-837；Emamian等人(2003)同上；Chen，等人(2003)同上)。体内突变蛋白的毒性直接由Ser-776的磷酸化介导(Emamian等人(2003)同上)。用Ala替换Ser-776可以完全避免体内病理，即使存在长聚谷氨酰胺束也是如此。因此，虽然疾病发展需要多聚谷氨酰胺扩增，但这还不够。基于此分析，Ser-776被鉴定为AKT磷酸化的位点，这是14-3-3与polyQ扩展形式ataxin-1相互作用必不可少的分子事件(Chen等人(2003年)同上)，其中与14-3-3的结合触发ataxin-1包涵体的形成，介导其神经毒性。在这方面，PKB/Akt介导的SCA1中ataxin-1突变形式的磷酸化触发14-3-3结合、该蛋白质的逐渐积累和随后的神经变性。

与SCA1类似，亨廷顿病的特征是亨廷顿蛋白中的polyQ重复序列扩大，导致细胞核中突变蛋白的聚集和大脑纹状体神经元的选择性凋亡(Saudou等人(1998)Cell95：55-66)。然而，与其在SCA1中的作用相反，AKT正向调节在亨廷顿氏病中看到的退化过程中丢失的纹状体神经元的存活。胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理和纹状体神经元的AKT激活均抑制由突变的亨廷顿蛋白介导的细胞死亡和核内包涵体形成(Humbert等(2002)同上)。PKB/Akt在Ser-421上对突变形式的亨廷顿蛋白进行磷酸化是IGF-1介导的核内包涵体形成和细胞死亡抑制所必需的，这表明受损的AKT活性可能会加剧亨廷顿病的进展。在这方面，对来自亨廷顿氏病患者的脑样本中AKT蛋白的分析揭示了预测由caspase-3介导的AKT裂解全长激酶产生的全长AKT(60kDa)和较短的AKT(49kDa)(Humbert等人(2002)同上)。

还确定了肌萎缩侧索硬化神经元中的AKT信号(Kaspar等人(2003)同上)。IGF-1刺激脊髓中PKB/Akt的活性，并通过在这种情况下增加运动神经元的存活来延长SOD1小鼠的寿命，表明IGF-1的给药可能有益于治疗肌萎缩侧索硬化(Kaspar等人(2003)同上)。

已经为AKT在轴突生长和轴突再生加速中的作用提供了直接证据(Markus等人(2002)同上；Namikawa等人(2000)Nat.Cell Biol.4：111-116)。此外，PKA还显示在斑马鱼嗅觉感觉神经元的轴突寻路中发挥作用(Yoshida，et al.(2002)J.Neurosci.22：4964-4972)，以及轴突再生其生长锥体的能力(Chierzi等人(2005)同上)。已经证明内源性PKAc与AKT沿着神经突长度在N2a神经元中以及在神经突生长区共定位，并且用本公开内容的修饰肽处理导致现有神经突的渐进性剂量依赖性损耗，除了抑制新的神经突形成之外，本公开还包括用于调节神经退行性和精神疾病和病症的方法。特别是，基于AKT在SCA1、亨廷顿病、ALS和AD发病机制中的作用，修饰肽及其组合物可用于预防和治疗这些神经变性疾病。

在另一方面，本公开还提供了使用修饰肽(例如，在药物组合物中)预防或治疗免疫缺陷病症例如AIDS的方法。作为预防剂或治疗剂，将有效药物剂量施用于患有(例如，显示疾病的体征或症状)或处于患有免疫缺陷病症例如AIDS的风险(例如，遗传易感)的患者，以预防(即，抑制或延迟其发展或发作)或治疗(即，改善其体征或症状)疾病或病症。本公开所涵盖的免疫缺陷疾病或病症包括但不限于艾滋病、白血病、淋巴瘤、病毒性疾病，例如肝炎、多发性骨髓瘤、共济失调-毛细血管扩张症、Chediak-Higashi综合征、联合免疫缺陷病、补体缺陷、DiGeorge综合征、低丙种球蛋白血症、Job综合征、白细胞粘附缺陷、全低丙种球蛋白血症、布鲁顿病、先天性无丙种球蛋白血症、IgA选择性缺乏和Wiskott-Aldrich综合征(湿疹)。

在另一方面，本公开还提供了使用修饰肽(例如，在药物组合物中)预防或治疗神经变性疾病或病症的方法。作为预防剂或治疗剂，将有效药物剂量施用于患有(例如，显示疾病的体征或症状)或处于患有神经变性疾病或病症的风险(例如，遗传易感)中以预防(即，抑制或延迟疾病或病症的发展或发作)或治疗其疾病(即改善其体征或症状)。本公开包含的神经变性疾病或病症包括但不限于SCA1、亨廷顿病、ALS和AD。

用于治疗帕金森病的大规模基因疗法临床试验是已知的(Howard(2003)Nat.Biotechnol.21(10)：1117-8)。在这些试验中，将一种基因被克隆到重组表达载体中，该载体已知在疾病中失调，并被局部递送到大脑中的病理部位。因此，预期临床试验中的这些基因治疗方法可以使用相同的设置将编码PKAc蛋白或片段的DNA分子递送到病理部位。这种方法可用于在肿瘤细胞中过度表达PKAc蛋白或片段，从而阻止进肿瘤细胞一步分裂和生长，并最终导致细胞凋亡和死亡。作为另一个例子，使用浦肯野细胞特异性启动子(如PCP-2)和腺病毒载体系统在小脑浦肯野细胞中表达PKAc蛋白或片段，可用于抑制AKT和ataxin-1的磷酸化抑制ataxin-1与14-3-3蛋白的结合。结果，通过阻断病理学发展所需的上游关键信号来防止病理学的进一步发展。由于AKT基因剔除小鼠没有表现出小脑功能障碍表型，因此在浦肯野细胞中抑制AKT预计不会引起副作用，因为AKT似乎在小脑的正常功能中没有关键作用。

通过以下非限制性实施例更详细地描述本公开的发明。

例子

在以下实施例中，示例性化合物和/或示例性组合物是指表1的一些化合物，以及本公开中描述的所有其他示例性化合物，以及包含它们的组合物。

示例性化合物的体外活性分析：示例性组合物选自具有显着修饰以提高其活性的ZaTa肽的若干变体。示例性化合物是穿过细胞膜屏障的细胞穿透肽，可以抑制细胞增殖中的多种重要激酶(包括但不限于AKT、Abl和P70S6K)，可以诱导细胞凋亡，并且可以有效地抑制细胞增殖。进行了一系列体外测定以确认示例性化合物的活性。更具体地，测试了以下内容：每个示例性化合物进入细胞的能力、通过体外和基于细胞的激酶测定的每个示例性化合物的激酶抑制特性、其对诱导细胞凋亡的影响，以及其抑制细胞增殖的效力。更重要的是，示例性化合物的功效在胶质母细胞瘤(GBM)的动物模型上进行了测试，并使用许多体外和啮齿动物研究分析了毒性、稳定性和溶解度。本文所述的研究证实，示例性化合物的活性被保护得很好和在先导优化过程中得到高度改进。更重要的是，研究证明示例性化合物在功效和毒性特征方面明显优于现有药物。

示例性化合物对激酶活性的抑制：为了使用体外激酶测定测试示例性化合物的多激酶抑制特性，针对～115种参与细胞增殖的不同激酶测试了示例性化合物的激酶抑制特性。该激酶分析表明，除了AKT1、AKT2、p70S6K和Abl，这些化合物的不同变体还可以在纳摩尔范围内抑制其他几种激酶。更具体地说，在不同化合物的纳摩尔浓度范围内被抑制的激酶是：AKT1(PKB alpha)、AKT2(PKB beta)、MAP3K8(COT)、MST4、AURKB(Aurora B)、ROCK1、RPS6KB1(p70S6K)，CDC42 BPA(MRCKA)，BRAF，RAF1(cRAF)Y340D Y341D，SGK(SGK1)，MAP4K4(HGK)，AURKA(Aurora A)，AURKC(Aurora C)，BRAF V599E，CHEK1(CHK1)Haspin)、CHEK2(CHK2)、FGR、IKBKB(IKK beta)、CDK7/cyclin H/MNAT1和CDC42 BPB(MRCKB)。设计了一种基于细胞的激酶测定法来检查人类癌细胞中示例性化合物的分子靶标。用几种浓度的示例性化合物和对照物处理U251人胶质母细胞瘤细胞20分钟、2小时和24小时的不同时间间隔，并在每个激酶的已知磷酸化位点测量几种底物的磷酸化或总蛋白水平.此外，还测量了选定先导的几个潜在细胞内靶标的总蛋白质水平。每个底物在已知磷酸化位点的磷酸化水平的降低将反映示例性化合物对激酶活性的抑制。图1显示了通过检测识别PI3K-P110或磷酸-PDK1(Ser-241)、总AKT1、磷酸-P53(Ser-46)、磷酸-AKT1(Thr-308)、p-CRAF(Ser-259)、磷酸-Aurora A(Thr-288)或总Aurora A的抗体进行的基于细胞的检测的代表性免疫印迹。在用5uM至40uM不同浓度的载体或示例性化合物处理U251人胶质母细胞瘤细胞后基于细胞的测定在30分钟、2小时或24小时的不同时间间隔，通过体外激酶分析证实了示例性化合物的一些靶标，并表明示例性化合物能够靶向几种激酶并抑制它们在细胞内的活性以及在.该实验还表明，p53也是示例性化合物的下游靶标(图1)。

示例性化合物的细胞渗透活性：测试了几种癌细胞系以研究修饰的示例性化合物的细胞渗透能力。该实验表明，修饰肽仍然能够进入细胞。例如，在U251细胞中，用荧光标记形式的示例性化合物处理2小时后，～10-15％的细胞用示例性化合物呈现阳性染色(图像未显示)。在用示例性化合物处理3天后，该百分比显着增加90％。该实验的结果显示了在优化过程中示例性化合物的细胞渗透性能的稳定性。

示例性化合物诱导细胞凋亡：示例性化合物活性的一个重要方面是它们在恶性癌细胞中诱导细胞凋亡的能力。测试示例性化合物的能力以确保新的修饰依然保留肽的细胞凋亡诱导能力。U251人成胶质细胞瘤细胞用示例性化合物于几个时间间隔分别处理。图2显示了在用示例性化合物处理后不同时间间隔的U251胶质母细胞瘤细胞的凋亡和存活。将等量的U251人成胶质细胞瘤细胞(5x10⁵)铺在盖玻片上并用载体(顶板)或示例性化合物(底板)处理20分钟、1天、2天或3天。进行荧光TUNEL(绿色)检测以显示凋亡细胞，并使用DAPI染色显示所有细胞的细胞核(蓝色)。Cleaved-Caspase3(红色)的间接免疫荧光染色作为细胞凋亡的另一个标志物进行。与用示例性化合物处理的细胞相比，用载体处理的细胞生长到更高的汇合度(与顶部和底部面板的DAPI信号相比)。共焦图像(20X)是相同的Z步，分别显示三个通道(前三列)和合并图像(最后一列)。图2中的图像显示处理后细胞凋亡率的时间依赖性增加，处理3天后，Tunel(绿色)和增加的Cleaved-Caspase 3(红色)显示几乎100％的细胞凋亡。

不同时间间隔的细胞密度和细胞凋亡率的定量分析：将相同数量的细胞铺在盖玻片上并用示例性化合物和载体于不同的时间间隔对其进行处理。细胞用DAPI和Tunel染色并用共聚焦显微镜分析。图3(A)显示的直方图条形反映了盖玻片上残留的总细胞数(DAPI阳性细胞)在五个单独的共聚焦场上计数的平均数。图3(B)是直方图条，显示通过将Tunel阳性细胞数除以盖玻片上剩余的总细胞数(DAPI阳性细胞)在五个单独的共聚焦场计数所计算的平均凋亡细胞百分比。用载体处理的细胞随着时间的推移不断显示出更高的密度，在72小时时达到大约完全融合(未显示)，而用示例性化合物处理的细胞始终显示出细胞密度随时间显着降低和在凋亡细胞数量方面显示了时间依赖性增加，以至于在处理72小时后，几乎100％的细胞已经凋亡(图3)。

示例性化合物对细胞增殖的抑制：

示例性化合物最重要的活性是抑制细胞增殖。因此，测量了三种示例性化合物对几种癌细胞类型的细胞增殖率的影响。图4显示了示例性化合物在人乳腺癌、肺癌、血液和皮肤癌细胞中的IC 50。此图中显示了少数人类癌细胞系的代表性平板，包括转移性人类乳腺癌细胞(BT-549和MDA-MB-468)、人类急性早幼粒细胞白血病(HL-60)、多发性骨髓瘤癌细胞系(RPMl-8226)、小细胞肺癌细胞系(DMS-114)、人类黑色素瘤癌细胞系(SK-ML-5)。将细胞用三种示例性化合物、载体(PBS)或临床试验中的其他激酶抑制剂化合物(MK-2206)或临床使用中的对照(伊马替尼或格列卫)处理三天，从50μM连续稀释至0.7微米。该实验显示了与市场上或临床试验的最新阶段的现有药物类别相比，示例性化合物的优越功效和纳摩尔范围的IC-50(图4)。还进行了MTT细胞增殖试验以测试示例性化合物的抗细胞增殖活性和进行Promega Cell

试验以测量几种GBM细胞系的IC-50。示例性化合物对六种不同的胶质母细胞瘤细胞(包括U87、U251、SNB-75、SF-268、SF-295和SF-539)的IC-50在0.2至2.5μM之间，而在N2a神经母累胞瘤细胞则是在0.6至1.2μM之间。在相同细胞系上，这种IC-50比

的IC-50好一个数量级(Sun等人，2012，Torres等人，2011，Milano等人，2009，Kanzawa等人，2004)。

是目前市场上领先的脑肿瘤药物，其IC-50在胶质母细胞瘤细胞上为421-1021μM，在神经母细胞瘤细胞上为602μM(Sun等人，2012，Torres等人，2011，Milano等人.，2009，Kanzawa等人，2004)。据报道，格列卫的IC-50在胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞系中分别为15.7-18.7μM和9-13μM(Beppu等人，2004；Kinsella等人，2011；Kinsella等人，2012)。

与其他FDA批准的多激酶抑制剂的比较功效研究：为了比较示例性化合物与其他FDA批准的多激酶抑制剂药物在临床使用中的功效，在人肝癌细胞系(HCC)、胰腺癌和转移性乳腺癌上测量了示例性化合物的IC50，并将其与索拉非尼(已获批用于HCC)、拉帕替尼(已获批用于乳腺癌)、舒尼替尼和厄洛替尼(已获批用于胰腺癌)的IC50进行比较。数据显示，对于相同的FDA批准的适应症，与索拉非尼、舒尼替尼、厄洛替尼和拉帕替尼相比，示例性化合物具有高度优越的功效和显着更低的IC50。

示例性化合物在动物模型中对肿瘤生长的抑制：测试示例性化合物在动物模型中的功效，并测试其局部抑制肿瘤生长的能力，胶质母细胞瘤(GBM)、肝细胞癌(HCC)和转移性乳腺癌在约6周龄的雌性Nu/Nu小鼠中造出。一旦肿瘤达到～100mm³的体积，将动物随机分成载体组与化合物处理组两组，每组大约八只动物。在注射之前，在注射后的指定时间间隔，通过卡尺测量肿瘤大小，并在图5A中显示GBM、图5B中显示HCC和图5C中显示转移性乳腺癌。在试验期间，在体重减轻和任何毒性迹象方面密切监测动物。每三天，向动物瘤内施用100ul的50mg/kg的单剂量示例性化合物或100ul盐水。试验结果如图5所示。动物对50mg/kg剂量的耐受性非常好，没有任何体重减轻或任何可见的毒性迹象。接受载体的动物体内的肿瘤继续快速生长，但先导治疗组的肿瘤没有生长，并且早在试验的第7天时明显比对照组小得多。事实上，肿瘤几乎完全停止生长并且不需要增加示例性化合物的初始剂量。一旦对照组中的肿瘤达到～3000mm³的体积，所有的动物就被处死并将其肿瘤解剖提出(图5)。虽然对照组中的动物由于晚期癌症而看起来严重恶病质和不适，但示例性化合物治疗组中的动物看起来很健康并且没有任何毒性迹象，而且它们的体重稳定。早在第一次注射后的第7天，就在对照和治疗组之间观察到肿瘤体积的非常显着差异，这在整个试验中仍然非常显着(图5A、5B和5C)。

与其他成功的激酶抑制剂(如厄洛替尼(商品名Tarceva)或拉帕替尼(商品名Tykerb和Tyverb)或那些已在临床使用的其他成功激酶抑制剂的类似动物功效研究、或处于III期临床试验的药物，例如MK-2206(一种AKT抑制剂)相比时，动物试验的结果特别值得一提。厄洛替尼是一种受体酪氨酸激酶抑制剂，作用于表皮生长因子受体(EGFR)，而拉帕替尼是一种双重酪氨酸激酶抑制剂，可阻断HER2/neu和表皮生长因子受体(EGFR)通路。Hirai等人的研究比较了MK-2206、厄洛替尼和拉帕替尼在异种移植模型中单独作为单一化合物或联合治疗的疗效。将示例性化合物的试验结果与Hirai等人的研究中MK-2206、厄洛替尼和拉帕替尼的功效结果进行比较，证明了示例性化合物在许多方面与这些成功药物相比具有高度优越的功效：

a)

示例性化合物作为单一组合物显示出优异的功效，当单独给予时，MK-2206、厄洛替尼

和拉帕替尼三种均未显示相似功效。

b)单独的示例性化合物的功效甚至优于MK-2206和厄洛替尼的组合，或MK-2206和拉帕替尼的组合。这其实就是预期的结果，因为示例性化合物同时靶向细胞增殖中的几个关键激酶。

c)示例性化合物在相同动物中的有效剂量(50mg/kg/三天)比MK-2206的有效剂量(60、120和360mg/kg/天)，厄洛替尼(50mg/kg)/天)和拉帕替尼(100mg/kg/天)显得更好。对示例性化合物的动物试验以每三天50mg/kg的最小剂量开始并且该最小剂量已足以完全破坏肿瘤生长。

体外和细胞系中的稳定性研究：在我们的非GLP实验室进行了包括-20℃、4℃、25℃和40℃的不同温度下温育之后，以及在多个冻融循环之后研究示例性组合物的稳定性。温育后，几个样品被淹没并明显检查不稳定的物理迹象(例如：聚集或沉淀)。还在GBM细胞系中测试了样品，以查看温育后IC-50是否发生变化(类似于图4中所示的实验)。该研究证实了先导组合物粉末形式的稳定性在-20℃下可保持数年，在4℃下至少可保持一年，在25℃下可保持6个月，在40℃下至少可保持12周.它还可以耐受多达十次的冻融循环。这并不出奇，因为肽的序列很短，并且没有任何导致不稳定的氨基酸残基(例如：易于脱酰胺的Asn或Gln，或易于水解和异构化的Asp或Trp，或任何导致二聚化的游离半胱氨酸)。

溶解度研究：由于其两亲性质，示例性组合物的水溶性极高，它可以容易地溶解在高达50mg/ml浓度的任何水基溶液中。它们还可以很好地溶解在通常用于药物配方的许多有机溶液中。

体外和动物毒性研究：作为药物开发的第一个关键测试，在体外和啮齿动物中分析了示例性化合物的毒性，并将结果与其他几种成功的激酶抑制剂药物进行了比较。与目前临床使用的几种其他激酶抑制剂药物相比，这些测试证明示例性化合物具有优异的毒性特征。

作为第一次体外测试，使用细菌中的艾姆斯试验的98孔格式将示例性化合物的毒性与格列卫进行了比较。艾姆斯试验是毒理学中最常用的试验之一，是一种以细菌致突变性为终点的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验鉴定致癌物。几乎所有工业中使用的新药用物质和化学品者随过该测定法进行测试。该测试的结果表明示例性化合物在细菌中测试的多个剂量下是安全的。作为对照试验，对阳性对照和阴性对照以及相同剂量的格列卫进行了测试，以验证该测试的准确性。

作为另一种常用的体外毒性试验，使用了hERG试验。许多结构和功能无关的药物会阻断hERG钾通道。hERG通道参与心脏动作电位复极化，hERG功能降低会延长心室细胞动作电位，延长心电图中的QT间期，并增加潜在致命性室性心律失常的风险。为了降低将资源投资于因QT延长而未能通过临床前安全性研究的候选药物的风险，重要的是在先导优化过程的早期筛选化合物的hERG通道活性。使用Predictor^TMhERG荧光偏振测定针对hERG通道测量示例性化合物的IC-50。该测定表明示例性化合物在任何测试浓度都不抑制hERG。

示例性化合物在啮齿动物中的毒性还通过测量小鼠的最大耐受剂量(MTD)并将剂量与市场上成功的激酶抑制剂药物进行比较来测试。C57BL/6小鼠的单剂量MTD从25mg/kg到400mg/kg的一系列剂量进行了测试，以临床评分和体重作为终点。动物每天接受单剂量的示例性化合物或格列卫，第一天开始为25mg/kg，第3天为50mg/kg，第5天为100mg/kg，第7天为200mg/kg，和在第9天为400mg/kg。使用该剂量递增研究，示例性化合物直至剂量为200mg/kg的耐受性非常好，而格列卫良好的耐受性只有直至剂量为100mg/kg。许多在C57BL/6小鼠中测量了临床中其他几种化疗药物的毒性的研究证实(Aston等人，2017年)，该剂量是C57BL/6小鼠可接受的MTD。将该剂量与Gleevec的MTD进行比较，并且还考虑到在Nu/Nu小鼠中以每三天50mg/kg的单剂量长期使用示例性化合物具有良好耐受性并且完全破坏肿瘤生长的事实，示例性化合物应该通过I期临床试验中的毒性。

虽然已经结合目前被认为是实际的示例性实施例描述了本公开，但是应当理解，本公开的发明不限于所公开的实施例，而是相反地，旨在涵盖各种包括在所附权利要求的精神和范围内的修改和等效布置。

Claims (33)

1.一种修饰肽，包括：

(一世)氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，或

(二)与氨基酸序列(X)-GRT-(Y)-TLC-(Z)具有至少40％序列同一性的氨基酸序列，

其中

X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合；

Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；和

Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

2.如权利要求1所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X¹)-KGRT-(Y)-TLC-(Z)，

其中X¹是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或其组合。

3.如权利要求1或2所述的修饰肽，其特征在于，所述氨基酸序列为：

(X²)-VKGRT-(Y)-TLC-(Z)，

其中X²是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或其组合。

4.根据权利要求1-3任一项所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X³)-RVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，

其中X³是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合，并且其中Z¹是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X⁴)-KRVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，

其中X⁴是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或其组合，并且其中Z¹是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

6.根据权利要求1-5任一项所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X⁵)-RVKGRT-(Y)-TLCGRPE-(Z¹)，

其中X⁵是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合，并且其中Z¹是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

7.根据权利要求1-6任一项所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X⁷)-V-(X⁸)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，

其中X⁷是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合，并且其中X⁸是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰或其组合。

8.根据权利要求1-7任一项所述的修饰肽，其中所述氨基酸序列为：

(X⁹)-KV-(X⁸)-GRT-(Y)-TLC-(Z)，

其中X⁹是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合，并且其中X⁸是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰或其组合。

9.根据权利要求1-9任一项所述的修饰肽，其中：

X包括位于其末端的乙酰基、月桂酰基或棕榈酰基；

Y是1-Nal；和

Z包含位于其末端的氨基。

10.具有下式的修饰肽：

(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)-(Z)或与氨基酸序列(X)-(seq1)-(Y)-(seq2)具有至少40％序列同一性的氨基酸序列)-(Z)，

其中：

seq1是GRT、KGRT、VKGRT、RVKGRT、KRVKGRT、(Orn)-RVKGRT或AKRVKGRT；

seq2是TLC、TLCG、TLCGR、TLCGRPE、TLCGRPEY或TLCGRPE-(4-Cl-Phe)；

X是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、乙酰基、脂质基团或它们的组合；

Y是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰，或它们的组合；和

Z是天然氨基酸、非天然氨基酸、天然或非天然氨基酸的化学修饰、胺基或其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的修饰肽，其中X包含位于其末端的乙酰基或脂质基团。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的修饰肽，其中所述脂质基团是C6至C20脂质基团。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的修饰肽，其中所述脂质基团为月桂酰基或棕榈酰基。

14.根据权利要求1-13中任一项的修饰肽，其中Y是1-Nal。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的修饰肽，其中Z包含位于其末端的氨基。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的修饰肽，其中所述非天然氨基酸为鸟氨酸、萘丙氨酸、4-氯苯丙氨酸或其组合。

17.根据权利要求1至16任一项的修饰肽的二聚体。

18.根据权利要求17所述的二聚体，其中所述二聚体包含二硫键。

19.根据权利要求17或18所述的二聚体，其中，所述二聚体为同型二聚体或异型二聚体。

20.具有下式的修饰肽：

(i)以下结构的组合物：

月桂酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

月桂酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂，

棕榈酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

棕榈酰-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂，

Ac-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-(Orn)-RVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂，

Ac-AKRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂，

Ac-AKRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-KRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂，

Ac-KRVKGRT-(1-Nal)-TLCGRPE-(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-KGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-KGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-VKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-VKGRT-(1-Nal)-TLC-NH2(Cys-Cys二聚体)，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-孔C-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCG-NH₂，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCG-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCGR-NH₂，

Ac-V-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLCGR-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-(4-Cl-Phe)-NH₂，

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC--(4-Cl-Phe)-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-KV-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-KV-(Orn)-GRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-KVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，

Ac-KVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)，

Ac-RVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂，或

Ac-RVKGRT-(1-Nal)-TLC-NH₂(Cys-Cys二聚体)；或者

(ii)与权利要求20中的上述组合物具有40％肽序列同一性的组合物。

21.一种包含至少一种根据权利要求1至20中任一项所述的修饰肽和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

22.一种编码根据权利要求1至20中任一项所述的修饰肽的分离的核酸。

23.根据权利要求22所述的分离核酸，其中所述分离核酸还包含至少一种与编码所述修饰肽的核酸相邻的额外多核苷酸组分，并且其中所述额外多核苷酸位于编码修饰肽的核酸的5′末端或3′末端或两者。

24.一种包含可操作地连接至一个或多个调节核酸序列的权利要求22的核酸的载体。

25.包含权利要求24的载体的宿主细胞。

26.根据权利要求25的宿主细胞，其中宿主细胞是原核或真核细胞。

27.一种用于局部递送治疗剂的装置，包括载体和根据权利要求21的药物组合物，其中所述载体允许修饰肽的受控释放。

28.一种用于将治疗剂或造影剂靶向递送至细胞或组织的载体，其包含选自PKAc、PKAc片段及其具有权利要求1到20的修饰肽的氨基酸序列的变体PKAc片段中的至少一种。

29.一种抑制选自蛋白激酶B(AKT1)、p70S6K和Abl、AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)、MAP3K8(COT)、MST4、AURKB(Aurora B)，ROCK1，RPS6KB1(p70S6K)，CDC42 BPA(MRCKA)，BRAF，RAF1(cRAF)Y340D Y341D，SGK(SGK1)，MAP4K4(HGK)，AURKA(Aurora A)，AURKC，VBRAFora、CHEK1(CHK1)、GSG2(Haspin)、CHEK2(CHK2)、FGR、IKBKB(IKK beta)、CDK7/细胞周期蛋白H/MNAT1和CDC42 BPB(MRCKB)的酶的活性的方法，其中该方法包括接触选自以下的至少一种具有根据权利要求1所述的修饰肽、根据权利要求28所述的载体或根据权利要求21所述的药物组合物的氨基酸序列的PKAc的酶、PKAc片段和变体PKAc片段，从而抑制所述酶的活性。

30.一种抑制细胞增殖的方法，包括使细胞与权利要求21的药物组合物接触，其中细胞的增殖受到抑制。

31.一种预防或治疗癌症的方法，包括向患有癌症或有患癌症风险的患者施用有效量的根据权利要求21的药物组合物，其中可预防或治疗癌症。

32.一种预防或治疗神经变性疾病或病症的方法，包括向患有神经变性疾病或病症或有患神经变性疾病或病症的风险的患者施用有效量的根据权利要求21的药物组合物，其中预防或治疗神经变性疾病或病症。

33.一种预防或治疗免疫缺陷疾病的方法，包括但不限于艾滋病、白血病、淋巴瘤、病毒性疾病，例如肝炎、多发性骨髓瘤、共济失调毛细血管扩张症、Chediak-Higashi综合征、联合免疫缺陷病、补体缺陷、DiGeorge综合征、低丙种球蛋白血症、Job综合征、白细胞粘附缺陷、全低丙种球蛋白血症、布鲁顿病、先天性无丙种球蛋白血症、IgA选择性缺乏症和Wiskott-Aldrich综合征，其中该方法包括向有需要的患者施用根据权利要求21的有效剂量。

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