CN114167064A - 一种sdf-1测定试剂盒及其制备与检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种SDF‑1测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括：缓冲液10～100mmol/L，防腐剂0.05～1g/L，促凝剂30～50g/L，稳定剂5～15g/L，表面活性剂2～5mL/L；试剂R2包括：缓冲液40～100mmol/L，防腐剂1～2g/L，稳定剂0.5～1g/L，表面活性剂2～5mL/L，抗人SDF‑1抗体混合乳胶颗30～50mg/L；其中，抗人SDF‑1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径。本发明还提供了上述SDF‑1测定试剂盒的制备与测定方法。本发明试剂盒用于测定SDF‑1含量，不仅操作简便、检测时间短、成本低，还具备较高的灵敏度、精密度和稳定性。

Description

一种SDF-1测定试剂盒及其制备与检测方法
技术领域
本发明涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种SDF-1测定试剂盒及其制备与检测方法。
背景技术
基质细胞衍生因子-1(Stromal cellderived factor-1，SDF-1)是新近发现的一种小分子的细胞因子，属CXC(Cys-X-Cys)类趋化因子蛋白，系统命名CXCL12，是已知唯一能与受体CXCR4结合并激活的天然趋化因子，其具有“SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b”两种形式。SDF-1和CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾，其在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。同时，SDF-1与HIV(Human immunodeficiency virus)感染、炎症反应、造血细胞的调控作用、肿瘤细胞的迁移等密切相关。
目前，检测基质SDF-1活性的方法主要是免疫学方法，包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫组化法、免疫印迹法(WB)和免疫比浊法。其中，酶联免疫吸附法的检测灵敏度高，但其操作过程复杂、测定时间长、影响因素较多，且此法主要应用于科学研究，不能用于临床诊断。而目前市售的SDF-1检测ELISA试剂盒，主要是国外进口，价格昂贵，严重影响了该产品的广泛应用。免疫组化法具有特异性好和敏感度高的优点，但其在实验过程中存在很多不可控因素，如一抗的选择、二抗孵育时间以及显色时间的差异等，均会造成结果的不稳定，甚至会导致不同的实验室结果不同或相反。免疫印迹法具有特异性好的优点，但其不足之处在于重复性差以及抗体效价需要滴定等，且单克隆抗体不能识别变性抗原。免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，其基本原理是：在特定的稀释系统中，抗原抗体发生结合，并且在结合比例合适时，会形成微粒从液相析出；在抗原和抗体结合的前后，会发生浊度的变化；通过全自动生化分析仪检测这种浊度变化，并利用标准品绘制线性曲线，可得出相应样品中待测物质的含量。该方法不需要特殊的仪器，操作简单便捷，且检测时间短，能够满足临床大样本检测的需求。
然而，目前全球市场上的SDF-1多采用原核细胞融合表达技术，或变性和复性的传统工艺生产获得，产品纯度低，生物活性难以达到基础研究需要；当采用经典免疫比浊法进行SDF-1活性检测时，少量小抗原抗体复合物难以形成浊度，不符合微量化要求。
据此，目前急需对现有的SDF-1免疫比浊检测方法进行改进，以获得一种不仅操作简便、检测时间短、测定成本低，同时还具备较高灵敏度、精密度和稳定性的SDF-1检测新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种不仅操作简便、检测时间短、测定成本低，同时还具备较高灵敏度、精密度和稳定性的SDF-1测定试剂盒及其制备与检测方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种SDF-1测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：缓冲液10～100mmol/L，防腐剂0.05～1g/L，促凝剂30～50g/L，稳定剂5～15g/L，表面活性剂2～5mL/L；所述试剂R2包括：缓冲液40～100mmol/L，防腐剂1～2g/L，稳定剂0.5～1g/L，表面活性剂2～5mL/L，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒30～50mg/L；其中，所述抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径的乳胶颗粒。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种，pH为7.4～7.8。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为山梨酸钾、叠氮钠、亚硝酸钠、苯酚、procline-300中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1中的促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠、聚凝胺中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的稳定剂为BSA、氯化钠、EDTA、吐温-20中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂为曲拉通-100，吐温-40，Span80中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所试剂R2中，两种不同粒径的乳胶颗粒的粒径分别为100～180nm、180～200nm。
一种上述SDF-1测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)制备抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100～180nm的胶乳微球0.5-1.5mL与粒径为180～200nm的胶乳微球0.5-1.5mL按照体积比(1～3):1进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比(2～4)：1进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L甘氨酸缓冲液，pH 5.5～6.5；
②加入0.5～1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：35～37℃；其中，活化剂为9.0mg/mLEDC；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0～7.4；其中，缓冲液B采用100mmol/L甘氨酸缓冲液；
④加入1.5～2.5mg抗人SDF-1抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5～2.5h，温度范围：35～37℃；
⑤加入1～2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5～2.5h，温度范围：35～37℃；其中，封闭液包括：BSA 30g/L，procline-300 1.2g/L；
⑥反应完成后离心，转速为18000～22000rpm，离心时间为25～35min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒；
(3)配制试剂R2：
①按照试剂R2的组分含量，将缓冲液、防腐剂、稳定剂、表面活性剂混合制成微球稀释液；②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的试剂R2。
一种上述SDF-1测定试剂盒的检测方法，采用如下方法检测样本中的SDF-1：
(1)吸取5μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
(2)再加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；
(3)孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中SDF-1含量。
作为本发明的优选方式之一，通过将ΔA代入“吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式”来确定SDF-1含量；其中，吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)配制校准品缓冲液：
校准品缓冲液包括：
MOPS缓冲液 100mmol/L，pH7.3
BSA 3g/L，
叠氮钠 0.5g/L；
(2)配置各种浓度梯度的校准品
用校准品缓冲液稀释纯化好的SDF-1抗原，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL；
(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
分别向得到的5μLSDF-1标准品中加入180μL试剂R1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式。
工作原理：
本发明SDF-1测定试剂盒，基于胶乳增强免疫比浊法(PETIA)。乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法，利用基因工程方法将抗体与胶乳颗粒结合，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增强了反应吸光度，反应液在一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，计算标本中抗原的含量。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明基于胶乳增强免疫比浊法，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力；同时，胶乳增强免疫比浊法的适用性强、测试方便；
(2)本发明试剂盒采用特有工艺将SDF-1抗体与两种粒径的胶乳微球相偶联，能有效的提高SDF-1检测试剂盒的灵敏度、精确度与线性范围；此外，选择双波长同时检测乳胶抗体抗原复合物的生成及游离胶乳抗体颗粒的减少，可进一步地提高检测精密度；
(3)本发明试剂盒可在全自动生化分析仪上检测血液中SDF-1的含量，直接上机使用，快速精准，成本低廉，自动化程度高，大大提高工作效率；且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种SDF-1测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：磷酸盐缓冲液10mmol/L(pH7.4)，山梨酸钾0.05g/L，PEG-400030g/L，氯化钠5g/L，吐温-40 2mL/L。
试剂R2包括：磷酸盐缓冲液40mmol/L(pH7.4)，山梨酸钾1g/L，氯化钠0.5g/L，吐温-40 2mL/L，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒30mg/L；其中，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒用两种不同粒径(100nm、180nm)的乳胶颗粒，抗人SDF-1抗体采用鼠抗人SDF-1单克隆抗体。
校准品包括：MOPS缓冲液100mmol/L(pH7.3)，BSA 3g/L，叠氮钠0.5g/L，200～3200U/mLSDF-1。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1。
(2)制备抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100nm的胶乳微球0.5mL与粒径为180nm的胶乳微球0.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比2：1进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L甘氨酸缓冲液，pH 5.5。
②加入0.5mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20min，温度37℃；其中，活化剂为9.0mg/mLEDC。
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0；其中，缓冲液B采用100mmol/L甘氨酸缓冲液。
④加入1.5mg抗人SDF-1抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5h，温度37℃。
⑤加入1mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5h，温度37℃；其中，封闭液包括：BSA 30g/L，procline-300 1.2g/L。
⑥反应完成后离心，转速为18000rpm，离心时间为35min。
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制试剂R2：
①按照试剂R2的组分含量，将磷酸盐缓冲液、山梨酸钾、氯化钠、吐温-40混合制成微球稀释液；②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的试剂R2。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：
MOPS缓冲液 100mmol/L，pH7.3
BSA 3g/L，
叠氮钠 0.5g/L。
②用校准品缓冲液稀释纯化好的SDF-1抗原，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL，最终获得各SDF-1浓度梯度的校准品。
实施例2
本实施例的一种SDF-1测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：甘氨酸缓冲液100mmol/L(pH7.8)，亚硝酸钠1g/L，硫酸葡聚糖钠40g/L，EDTA 15g/L，Span80 5mL/L。
试剂R2包括：甘氨酸缓冲液100mmol/L(pH7.8)，亚硝酸钠2g/L，EDTA1g/L，Span805mL/L，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒50mg/L；其中，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒用两种不同粒径(180nm、200nm)的乳胶颗粒，抗人SDF-1抗体采用鼠抗人SDF-1单克隆抗体。
校准品包括：MOPS缓冲液100mmol/L(pH7.3)，BSA 3g/L，叠氮钠0.5g/L，200～3200U/mLSDF-1。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1。
(2)制备抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为180nm的胶乳微球1.5mL与粒径为200nm的胶乳微球1.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比4：1进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L甘氨酸缓冲液，pH 6.5。
②加入1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应30min，温度35℃；其中，活化剂为9.0mg/mLEDC。
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.4；其中，缓冲液B采用100mmol/L甘氨酸缓冲液。
④加入2.5mg抗人SDF-1抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2.5h，温度35℃。
⑤加入2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2.5h，温度35℃；其中，封闭液包括：BSA 30g/L，procline-300 1.2g/L。
⑥反应完成后离心，转速为22000rpm，离心时间为25min。
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制试剂R2：
①按照试剂R2的组分含量，将甘氨酸缓冲液、亚硝酸钠、EDTA、Span80混合制成微球稀释液；②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的试剂R2。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：
MOPS缓冲液 100mmol/L，pH7.3
BSA 3g/L，
叠氮钠 0.5g/L。
②用校准品缓冲液稀释纯化好的SDF-1抗原，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL，最终获得各SDF-1浓度梯度的校准品。
实施例3
本实施例的一种SDF-1测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：Tris-HCl缓冲液50mmol/L(pH 7.5)，叠氮钠0.5g/L，PEG-600050g/L，BSA 10g/L，曲拉通-100 3.5mL/L。
试剂R2包括：MOPS缓冲液50mmol/L(pH 7.5)，procline-300 1.0g/L，BSA 0.5g/L，曲拉通-100 3.5mL/L，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒40mg/L；其中，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒用两种不同粒径(150nm、190nm)的乳胶颗粒，抗人SDF-1抗体采用鼠抗人SDF-1单克隆抗体。
校准品包括：MOPS缓冲液100mmol/L(pH7.3)，BSA 3g/L，叠氮钠0.5g/L，200～3200U/mLSDF-1。
本实施例试剂盒的制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1。
(2)制备抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为150nm的胶乳微球1.5mL与粒径为190nm的胶乳微球0.5mL进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比3：1进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L甘氨酸缓冲液，pH6.0。
②加入0.6mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应25min，温度37℃；其中，活化剂为9.0mg/mLEDC(现配现用)。
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.2；其中，缓冲液B采用100mmol/L甘氨酸缓冲液。
④加入2.0mg抗人SDF-1抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度37℃。
⑤加入1.5mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度37℃；其中，封闭液包括：BSA 30g/L，procline-300 1.2g/L。
⑥反应完成后离心，转速为20000rpm，离心时间为30min。
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒。
(3)配制试剂R2：
①按照试剂R2的组分含量，将MOPS缓冲液、procline-300、BSA、曲拉通-100混合制成微球稀释液；②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的试剂R2。
(4)配制校准品：
①校准品缓冲液包括：
MOPS缓冲液 100mmol/L，pH7.3
BSA 3g/L，
叠氮钠 0.5g/L。
②用校准品缓冲液稀释纯化好的SDF-1抗原，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL，最终获得各SDF-1浓度梯度的校准品。
实施例4
本实施例的一种上述SDF-1测定试剂盒的检测方法，采用如下方法检测样本中的SDF-1：
(1)吸取5μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
(2)再加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；
(3)孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2(反应方法为终点法，反应方向为负反应，反应温度为37C，比色杯光径为1.0cm)；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并将ΔA代入“吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式”来确定SDF-1含量。
其中，吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)准备200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL浓度梯度的SDF-1校准品；
(2)分别向得到的5μLSDF-1标准品中加入180μL试剂R1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式。
实施例5
本实施例用以评价上述SDF-1测定试剂盒的使用效果。
一、准确度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：20例SDF-1浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本(靶值为2000U/mL)。
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家SDF-1检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
分别使用本发明实施例3中制备得到的试剂盒和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同时对SDF-1浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定，重复测3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10％以内视为无干扰，偏差范围超过±10％视为干扰。结果如表1-1、表1-2所示。
表1-1本发明试剂盒的1-10样品检测结果
Figure BDA0003389240890000131
表1-2本发明试剂盒的11-20样品检测结果
Figure BDA0003389240890000141
根据表1-1与表1-2检测结果，计算出本发明试剂盒对20例样品检查结果平均值为451.0，计算出的相对偏差-1.44％；同时，本发明试剂盒和对照试剂检测结果，靶值为450U/mL的质控品3次测定结果平均值为452.0，计算出的相对偏差为-0.44％(如表2所示)，表明本发明SDF-1抗原检测试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
表2细胞基质衍生因子-1抗原血清样本检测结果
Figure BDA0003389240890000142
二、灵敏度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：1份纯化水、1份浓度为200U/mL的细胞基质衍生因子-1抗原低值样本。
用实施例3制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家细胞基质衍生因子-1抗原检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和200U/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表3。
表3本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果
Figure BDA0003389240890000151
Figure BDA0003389240890000161
结果显示，本发明试剂盒检测细胞基质衍生因子-1抗原的灵敏度为1.31mg/L，对照试剂的灵敏度为3.21mg/L，表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
三、精密度分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：2份临床血清样本(320U/mL)(低值样本)、(750U/mL)(高值样本)。
用实施例3制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家细胞基质衍生因子-1抗原检测试剂盒)对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。
表4实施例1试剂盒精密度分析结果(单位：U/mL)
Figure BDA0003389240890000162
Figure BDA0003389240890000171
结果显示，本发明试剂盒的精密度：CV低值为0.81％、CV高值为0.42％，均小于等于10％；而对照试剂盒CV低值为0.59％、CV高值为0.40％，表明本发明试剂盒比对照试剂盒具有更高的精密度。
四、线性分析：
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
检测样本：细胞基质衍生因子-1抗原血清样本(3200U/mL)。
将细胞基质衍生因子-1抗原血清样本(U/mL)用校准品稀释液稀释成5个不同浓度，分别为0U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL，采用实施例1制备得到的试剂盒对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测3次，计算相关系数R值，检测结果见表5。
表5本发明试剂盒线性分析结果
Figure BDA0003389240890000172
Figure BDA0003389240890000181
结果显示，本发明试剂盒检测结果得到的回归方程为y＝0.9646x+47.12，相关系数R2＝0.9995，表明本发明试剂盒在3200U/mL范围内具有良好的线性度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种SDF-1测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：缓冲液10～100mmol/L，防腐剂0.05～1g/L，促凝剂30～50g/L，稳定剂5～15g/L，表面活性剂2～5mL/L；所述试剂R2包括：缓冲液40～100mmol/L，防腐剂1～2g/L，稳定剂0.5～1g/L，表面活性剂2～5mL/L，抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒30～50mg/L；其中，所述抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒中的乳胶颗粒采用两种不同粒径的乳胶颗粒。
2.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种，pH为7.4～7.8。
3.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为山梨酸钾、叠氮钠、亚硝酸钠、苯酚、procline-300中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠、聚凝胺中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的稳定剂为BSA、氯化钠、EDTA、吐温-20中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂为曲拉通-100，吐温-40，Span80中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的SDF-1测定试剂盒，其特征在于，所试剂R2中，两种不同粒径的乳胶颗粒的粒径分别为100～180nm、180～200nm。
8.一种如权利要求1～7任一所述的SDF-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)制备抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒：
①取粒径为100～180nm的胶乳微球0.5～1.5mL与粒径为180～200nm的胶乳微球0.5-1.5mL按照体积比(1～3):1进行混合，得混合微球；接着，再将缓冲液A与混合微球按体积比(2～4)：1进行混合；其中，缓冲液A采用100mmol/L甘氨酸缓冲液，pH 5.5～6.5；
②加入0.5～1mL的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：35～37℃；其中，活化剂为9.0mg/mLEDC；
③加入缓冲液B，调整胶乳溶液的pH值至7.0～7.4；其中，缓冲液B采用100mmol/L甘氨酸缓冲液；
④加入1.5～2.5mg抗人SDF-1抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5～2.5h，温度范围：35～37℃；
⑤加入1～2mL封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5～2.5h，温度范围：35～37℃；其中，封闭液包括：BSA 30g/L，procline-300 1.2g/L；
⑥反应完成后离心，转速为18000～22000rpm，离心时间为25～35min；
⑦离心完成后，去除上清液，即得目标所需的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒；
(3)配制试剂R2：
①按照试剂R2的组分含量，将缓冲液、防腐剂、稳定剂、表面活性剂混合制成微球稀释液；②用稀释液重悬步骤(2)制得的抗人SDF-1抗体混合乳胶颗粒，重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，最终制得获得的混合液即为目标所需的试剂R2。
9.一种如权利要求1～7任一所述的SDF-1测定试剂盒的检测方法，其特征在于，采用如下方法检测样本中的SDF-1：
(1)吸取5μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
(2)再加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；
(3)孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；
(4)按照△A＝A2-A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中SDF-1含量。
10.根据权利要求9所述的SDF-1测定试剂盒的检测方法，其特征在于，通过将ΔA代入“吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式”来确定SDF-1含量；其中，吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
(1)配制校准品缓冲液：
校准品缓冲液包括：
MOPS缓冲液 100mmol/L，pH7.3
BSA 3g/L，
叠氮钠 0.5g/L；
(2)配置各种浓度梯度的校准品
用校准品缓冲液稀释纯化好的SDF-1抗原，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、400U/mL、800U/mL、1600U/mL、3200U/mL；
(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
分别向得到的5μLSDF-1标准品中加入180μL试剂R1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；孵育60s后，采用全自动生化分析仪，于450nm主波长、750nm副波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；分别计算标准品的吸光度变化值△B＝B2-B1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与SDF-1浓度的线性关系公式。
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