CN114159572A - 一种用于治疗病毒性肝炎的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用于治疗病毒性肝炎的药物组合物，包括非甾体抗炎药和mTOR抑制剂，及其用于治疗或预防病毒性肝炎的应用，以及用于制备用于治疗或预防病毒性肝炎尤其是乙型肝炎的药物中的用途。

Description

一种用于治疗病毒性肝炎的药物组合物

技术领域

本申请涉及抗病毒药物技术领域，具体地，涉及一种用于治疗或预防病毒性肝炎的化合物、药物组合物及其应用。

背景技术

人乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的重要公共健康问题。急性乙肝病毒感染后，仍有8％左右发展为慢性乙型肝炎感染，持续性HBV感染将导致肝硬化，甚至肝癌。乙肝传播途径主要通过垂直传播与水平传播。垂直传播是指母婴传播；水平传播主要通过血液传播。

乙型肝炎的治疗也是一个长期的过程，治疗目标就是最大限度地抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维素化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。

目前市场上有很多乙型肝炎治疗药物，主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。对于干扰素而言，重组DNA白细胞干扰素(IFN-α)可抑制HBV的复制。但是干扰素在治疗乙肝时，往往伴随着较强的不良反应，包括骨髓抑制，影响甲状腺功能和抑郁等。

核苷类似物主要通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生，临床可用药物包括以下类别：拉米夫定、泛昔洛韦、如阿昔洛韦、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦、膦甲酸钠等，这些药物均有一定抑制HBV效果。

这些逆转录酶抑制剂虽然可以有效降低HBV DNA水平，使患者控制乙肝病毒水平，但是由于其作用靶点为RNA逆转录为DNA的过程，对于HBeAg和HBsAg的清除无直接作用。因此核苷类似物单药治疗发生HBeAg和HBsAg血清学转化的概率极低，并不能真正治愈乙肝，患者需要长期甚至终身服用药物。

上述逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物严重的副作用等问题也不容小觑。关键是，目前仍然没有一种药物能够完全清除病毒达到功能性治愈乙肝。因此，本领域迫切需要提供一种新的治疗乙型肝炎、不需要长期甚至终身服用、达到功能性治愈的药物。

非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)是一类不含有甾体结构的抗炎药，NSAIDs自阿司匹林于1898年首次合成后，100多年来已有百余种上千个品牌上市，这类药物包括阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布等，该类药物具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种疼痛症状的缓解。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作为PI3K/Akt下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，通过激活核糖体激酶调节肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭转移。近年来，PI3K/AkUmTOR通路备受关注，mTOR抑制剂在针对神经内分泌肿瘤、肾癌、乳腺癌等一系列临床研究中被证实具有可观的治疗前景，代表药物是雷帕霉素、依维莫司和坦罗莫司。

发明内容

本申请提供了一种药物组合物，包括非甾体抗炎药，以及mTOR抑制剂，及其用于制备治疗或预防病毒性肝炎的药物中的用途，所述药物组合物特别用于降低HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平。

发明人意外发现，非甾体抗炎药与mTOR抑制剂的组合能够产生协同作用，特别是在降低HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平方面，产生了强于二者任何一个，并且优于二者叠加的效果。本申请的组合物有希望达到清除乙肝病毒的效果，甚至达到完全治愈。

在一个实施方式中，所述非甾体抗炎药包括阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布中的至少一种，所述mTOR抑制剂包括雷帕霉素、依维莫司和坦罗莫司中的至少一种。

在一个实施方式中，所述药物组合物通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。

在一个实施方式中，所述药物组合物经口服施用，优选为片剂或胶囊的形式。

本申请还提供了上述药物组合物在制备治疗病毒性肝炎的药物中的用途。

本申请还提供了塞来昔布或其可药用盐与雷帕霉素或其可药用盐在制备降低HBVDNA、HBsAg和/或HBeAg水平的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述病毒性肝炎为乙型肝炎或丁型肝炎，所述用途优选为降低乙型肝炎患者的HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平的用途。

本申请的技术方案具有以下有益效果：

1.将非甾体抗炎药和mTOR抑制剂的组合物，特别是塞来昔布和雷帕霉素应用于治疗或预防病毒性肝炎，从而提供了一种新颖的病毒性肝炎治疗选项。

2.非甾体抗炎药和mTOR抑制剂的组合物，在有效降低乙型肝炎病毒HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平上，具有协同作用，有望成为乙型肝炎功能性治愈的后续药物组合。

3.作为市面上常见的非甾体抗炎药和mTOR抑制剂，具有优异的临床安全性和药代动力学性质，具有较好的成药性。

4.非甾体抗炎药和mTOR抑制剂的组合物，能够显著提高清除乙肝病毒的作用，具有较好的协同增效。

附图说明

图1：HD042、HD082、及其组合对于HBV DNA的抑制结果。

图2：HD042、HD082、及其组合对于HBeAg的抑制结果。

图3：HD042、HD082、及其组合对于HBsAg抑制结果。

图4：HD042和HD082组合对于HBV DNA的抑制联合作用分析。

图5：HD042和HD042组合对于HBeAg的抑制联合作用分析。

图6：HD042和HD042组合对于HBsAg的抑制联合作用分析。

图7：对照化合物RG7834检测结果。

图8：对照化合物ETV检测结果。

具体实施方式

本申请的发明人通过多次实验，筛选出了具有乙肝治疗效果的组合物，进一步通过生物学实验的验证，该组合物具有潜在清除HBsAg和/或HBeAg的效果，有望功能性治愈乙肝，清除乙肝病毒。

在一个方面中，本申请提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的非甾体抗炎药以及治疗有效量的mTOR抑制剂，所述组合物特别用于降低HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平。

在一个实施方式中，所述非甾体抗炎药包括奥美拉唑、塞来昔布、泮托拉唑、雷贝拉唑、艾司奥美拉唑中的至少一种，所述mTOR抑制剂包括雷帕霉素、依维莫司和坦罗莫司中的至少一种。

在一个优选实施方式中，所述病毒性肝炎为乙型肝炎或丁型肝炎。

在一个优选实施方式中，所述组合物能够降低乙型肝炎病毒HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平。

在一个优选实施方式中，所述组合物通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。

在一个优选实施方式中，所述组合物经配制通过口服施用，优选为片剂或胶囊的形式。

术语定义

非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)是一类不含有甾体结构的抗炎药，NSAIDs自阿司匹林于1898年首次合成后，100多年来已有百余种上千个品牌上市，这类药物包括阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布等，该类药物具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种疼痛症状的缓解。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作为PI3K/Akt下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，通过激活核糖体激酶调节肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭转移。近年来，PI3K/AkUmTOR通路备受关注，mTOR抑制剂在针对神经内分泌肿瘤、肾癌、乳腺癌等一系列临床研究中被证实具有可观的治疗前景，代表药物是雷帕霉素、依维莫司和坦罗莫司。

本文的罗非昔布和雷帕霉素包括其氘代物。

病毒性肝炎

病毒性肝炎的病原学分型，目前已被公认的有甲、乙、丙、丁、戊五种肝炎病毒，分别写作HAV、HBV、HCV、HDV、HEV，除乙型肝炎病毒为DNA病毒外，其余均为RNA病毒。

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。

乙型病毒性肝炎的病原为乙型肝炎病毒，缩写为HBV，乙型肝炎病毒为DNA病毒。基因组是双链、环形、不完全闭合DNA。病毒最外层是病毒的外膜或称衣膜，其内层为核心部分，核蛋白即是核心抗原(HBcAg)，不能在血清中检出。HBsAg阳性者的血清在电子显微镜下可见3种颗粒，直径为22nm的圆形和丝状颗粒，还有较少的直径为42埃的球形颗粒，又称为Dane氏颗粒，是完整的HBV颗粒。

乙型肝炎的标志检测如下：①HBsAg与抗-HBs：HBsAg阳性示HBV目前处于感染阶段，抗-HBs为免疫保护性抗体阳性示已产生对HBV的免疫力。慢性HBsAg携带者的诊断依据为无任何临床症状和体征、肝功能正常，HBsAg持续阳性6个月以上者。②HBeAg与抗-HBe：HBeAg阳性为HBV活跃复制及传染性强的指标，被检血清从HBeAg阳性转变为抗-HBe阳性表示疾病有缓解感染性减弱。③HBcAg与抗-HBc：HBcAg阳性提示存在完整的HBV颗粒直接反应，HBV活跃复制由于检测方法复杂临床少用。抗-HBc为HBV感染的标志，抗-HBc IgM阳性提示处于感染早期，体内有病毒复制。在慢性轻度乙型肝炎和HBsAg携带者中HBsAg、HBeAg和抗-HBc三项均阳性具有高度传染性指标难以阴转。

如本文中所使用，“治疗有效量”或“有效量”是指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。乙肝治疗剂的治疗有效量将取决于障碍或症状的性质并取决于特定的试剂，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。

治疗结果可以是，如，减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不需要是“治愈”。治疗结果也可以是预防性的。

给药途径

本公开的药物或药物组合物通过适合于待治疗病症的任何途径施用。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。在某些实施方式中，本文公开的药物或药物组合物通过静脉内注射施用。将会理解，优选途径可根据例如接受者的状况而变化。本公开药物或药物组合物的一个优点在于，它们是口服生物可利用的并且可以口服施用。

在一个优选实施方式中，所述组合物通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。

在一个优选实施方式中，所述组合物经配制通过口服施用，优选为片剂或胶囊的形式。

本公开的药物组合物可以用常规载体和赋形剂(其将根据通常的实践选择)配制。片剂将含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当用于通过非口服施用递送时，通常是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如“Handbook ofPharmaceutical Excipients”(1986)中所述的赋形剂。

制剂包括适用于前述施用途径的制剂。本申请的组合物中的两种或多种药物可以分别以单位剂型存在，也可以是这些药物组合在一起共同形成一个单位剂型。所述制剂或剂型可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)中找到。这样的方法包括使活性成分与由一种或多种辅助成分构成的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地和紧密地结合在一起，然后根据需要使产品成形来制备制剂。

适用于口服施用的本申请的制剂可以作为以下形式存在：各自含有预定量活性成分的离散单元，如胶囊剂或片剂；粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。本申请的组合物可以是缓释或控释剂型。该组合物也可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。

通过以下实施例的描述，本申请的目的、优势和新特征对本领域普通技术人员将更为清晰。

实施例

应用HepG2-NTCP细胞评价雷帕霉素和非甾体抗炎药的体外抗HBV协同作用

1.化合物

雷帕霉素(编号HD082)和塞来昔布(编号HD042)购自上海陶素生物科技有限公司。

化合物配制方法如下：

以配制20mM浓度为例，溶剂DMSO的体积(μl)＝样品质量(mg)×纯度÷分子量÷20×10⁶

对照化合物为恩替卡韦(ETV，批号：P1214012；99.0％纯度)，购自上海泰坦科技股份有限公司。以上化合物的母液浓度均为20mM，并在-20℃下保存。

2.细胞和培养基

HepG2-NTCP细胞：由上海药明康德新药开发有限公司提供

冻存PHH培养培养基：主要是含10％胎牛血清(FBS，Hyclon货号SV3008703)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco货号11960051)，主要用于细胞的培养。

冻存PHH铺板培养基：主要是含10％胎牛血清(FBS，Hyclon货号SV3008703)和1％青霉素-链霉素InvitroGRO CP Medium(BIOIVT货号S03316)，主要用于细胞的铺板。

病毒感染培养基：主要是含1％青霉素-链霉素Williams'Medium E(SIGMA货号W1878)，主要用于HBV病毒感染。

3.主要试剂

所用的主要其他试剂和细胞见表1。

表1.主要试剂和细胞

4.实验方案

铺细胞和化合物处理

第0天，HepG2-NTCP细胞接种到48孔细胞板中(7.5×10⁴细胞/孔)。

感染病毒和化合物处理

第2天，先加入化合物预处理细胞2小时，然后加入D型HBV感染HepG2-NTCP细胞(感染同时加入化合物)。受试化合物设置1-2个单药浓度，并两两设置联合用药，对照化合物为ETV和RG7834各3个浓度。化合物浓度见表2。

第3天、第5天和第7天更换一次含化合物的培养液。第9天，收集细胞上清用于检测HBV DNA(qPCR)、HBeAg和HBsAg(ELISA)。待收集细胞上清后，加入CellTiter-Glo检测细胞活力，收集细胞冷冻保存(备用)。

表2.各化合物的测试浓度

样品检测

1)qPCR法检测细胞培养上清中HBV DNA的含量

参照QIAamp 96DNA Blood Kit说明书，提取细胞培养上清中的DNA。通过qPCR方法检测HBV DNA的含量。PCR反应：95℃，10min；95℃，15sec；60℃，1min，40个循环。

2)ELISA法检测细胞培养上清中HBeAg和HBsAg的含量

方法参照试剂盒说明书，方法简述如下：分别取50μl的标准品、样品和对照品加入到检测板中，然后每孔加入50μl酶结合物，37℃孵育60分钟，用洗液洗板后吸干，然后加入50μl预混发光底物，室温避光孵育10分钟，最后酶标仪测定发光值。

CellTiter-Glo细胞活力检测

参照CellTiter-Glo试剂盒说明书测定细胞活力，方法简述如下：收集细胞培养上清之后，每孔加入CellTiter-Glo(培养基1:1稀释)，室温孵育10分钟，酶标仪测定发光值。

数据分析

HBV DNA抑制率(％)＝(1-化合物组样品的HBV拷贝数/DMSO对照组的HBV拷贝数)×100％

HBsAg抑制率(％)＝(1-样品的HBsAg值/DMSO对照组HBsAg值)×100％

HBeAg抑制率(％)＝(1-样品的HBeAg值/DMSO对照组HBeAg值)×100％

％细胞活力＝(样品的信号值-培养基对照的信号值)/(DMSO对照的信号值-培养基对照的信号值)×100％

应用GraphPad Prism软件(four parameter logistic equations)计算EC50值。

用联合指数分析Combination Index(CI)软件CompuSyn softeware V1.0.软件，以Non-Constant Combo方法分析雷帕霉素和塞来昔布的协同作用。

实验接受的指标

如果实验中对照化合物测试得到预期结果，则认为该实验中的其他数据是有效可用的。并且会在报告中对数据进行分析说明。

结果分析

检测结果参见表3-6,以及图1-6，雷帕霉素与塞来昔布二者联用时，在抑制HBVDNA、HBsAg和HBeAg方面具有明显的协同作用。

为了更加清楚地分析其协同作用，采用联合指数分析Combination Index(CI)软件CompuSyn softeware V1.0.软件对一系列数据进行了分析，结果参见表4-6，图4-6。

对照化合物ETV结果见表5。

表3 HD042、HD082分别对HBV的抑制作用

表4 HD042+HD082对HBV DNA抑制率联合作用分析

表5 HD042+HD082对HBeAg抑制率联合作用分析

表6 HD042+HD082对HBsAg抑制率联合作用分析

以上试验结果显示，HD042和HD082联用时，能有效降低HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg，并有明显的协同作用。

根据上述结果可知，雷帕霉素和塞来昔布组合能够产生协同作用，有望成为新的乙肝药物治疗组合。

虽然已参照特定实施方式对本申请进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本申请主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本申请范围通过所附权利要求书限定。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其包括非甾体抗炎药和mTOR抑制剂。

2.权利要求1所述的药物组合物，所述非甾体抗炎药选自阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布中的至少一种；所述mTOR抑制剂选自雷帕霉素或其可药用盐、依维莫司和坦罗莫司中的至少一种。

3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述非甾体抗炎药是塞来昔布或其可药用盐，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其可药用盐。

4.权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为选自以下途径施用的药物组合物：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。

5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述药物组合物为口服剂型。

6.权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物为片剂或胶囊。

7.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物在制备治疗病毒性肝炎的药物中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中所述病毒性肝炎为乙型肝炎。

9.塞来昔布或其可药用盐与雷帕霉素或其可药用盐在制备降低HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg水平的药物中的用途。

10.权利要求8或9所述的用途，其中，所述用途为降低乙型肝炎患者的HBV DNA、HBsAg和/或HBeAg的水平。

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