CN114149494A - 一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用 - Google Patents

一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。利用该毒力蛋白，设计抗体，可用于柱状黄杆菌病原菌的检测。通过在柱状黄杆菌上缺失编码该蛋白的毒力基因，可获得柱状黄杆菌弱毒株，利用该弱毒株，可以实现柱状黄杆菌感染鱼类细胞系和鱼体的能力下降；进而作为候选疫苗株，实现对柱状黄杆菌引发的柱形病的免疫防控。

Description

一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用。
背景技术
柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是鱼类柱形病(在我国也称为细菌性烂鳃病)的病原。该菌是一种革兰氏阴性细菌，在全球范围的自然环境和人工养殖环境中广泛存在，并给淡水养殖业带来严重威胁。我国人工养殖的几乎所有经济鱼类如草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)和鳜鱼(Sinipercachuatsi)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)和黄颡(Pelteobagrus fulvidraco)等都极易感染该菌，并引发巨大的经济损失(农业部渔业渔政管理局，2014)。
鱼类在感染柱状黄杆菌后通常表现为体色发黑、鳃部溃烂、背部溃疡和鳍条坏死等一系列症状。根据感染进程不同，严重程度有所差异。对于柱形病的防治，目前仍主要采取抗生素或化学药物治疗的方法。但是，抗生素的大量使用会导致耐药菌株的增加，并具有抗性基因传播的风险。化学药物的大量使用，则会污染生态环境，引起养殖水域内环境失衡。因此，开展柱形病的快速检测及疫苗的研发，对于降低鱼类感染柱形病的风险，推动淡水养殖的可持续发展具有积极意义。
近年来，尽管已有62株柱状黄杆菌经过全基因组测序并获得完整拼接，但有关该菌的毒力因子及其致病机制和弱毒疫苗的开发却鲜有报道。这主要是柱状黄杆菌的特殊分类地位、培养特性，特别是在遗传操作上的异常困难所导致。柱状黄杆菌属于拟杆菌门，与变形菌门中高效的遗传操作相比，拟杆菌门的许多病原菌导入外源基因困难、同源重组效率低，遗传改造难度大。因此，研究人员也推测了一些柱状黄杆菌可能的毒力因子，如：硫酸软骨素裂解酶(chondroitin lyase)、胶原酶(collagenase)和外膜蛋白A(OmpA)等，但并未找到它们与毒力相关的直接证据，仅检测了其表达水平(Laanto et al.,2014；Penttinenet al.,2016)。我们将这些经推测的可能的毒力蛋白，以及拟杆菌门其它病原菌中已报道的毒力因子，如：锌金属蛋白酶(zinc metalloprotease)和溶血素(hemolysin)等(Wexler,2007；
Figure BDA0003370085180000011
&Wiklund,2010；Miller&Scott,2021)，分别进行原核表达和纯化，与鱼类细胞共孵育，也并未观察到明显的细胞病变。
鉴于从拟杆菌门现有的研究资料难以筛选到柱状黄杆菌毒力因子的情况，本发明通过深入分析62株已报道的柱状黄杆菌全基因组序列，并结合该菌感染鱼体的特征，从数十个柱状黄杆菌胞外蛋白中进行与该菌毒力相关的蛋白的研究，最终获得一个与柱状黄杆菌毒力相关的基因。
参考文献：
农业部渔业渔政管理局.《中国水生动物卫生状况报告》.中国农业出版社,2014.Declercq AM,Haesebrouck F,Van den Broeck W,Bossier P,DecostereA.Columnaris disease in fish:a review with emphasis on bacterium-hostinteractions.Vet Res 2013,44(1),27.
Figure BDA0003370085180000021
E,Wiklund T.Hemolytic activity in Flavobacteriumpsychrophilum is a contact-dependent,two-step mechanism and differentlyexpressed in smooth and rough phenotypes.Microb Pathog.2010,49(6):369-75.
Laanto E,Penttinen RK,Bamford JK,Sundberg LR.Comparing the differentmorphotypes of a fish pathogen--implications for key virulence factors inFlavobacterium columnare.BMC Microbiol.2014,26；14:170.
Miller DP,Scott DA.Inherently and Conditionally Essential ProteinCatabolism Genes of Porphyromonas gingivalis.Trends Microbiol.2021,29(1):54-64.
Wexler HM.Bacteroides:the good,the bad,and the nitty-gritty.ClinMicrobiol Rev.2007,20(4):593-621.
Penttinen R,Kinnula H,Lipponen A,Bamford JK,Sundberg LR.High nutrientconcentration can induce virulence factor expression and cause highervirulence in an environmentally transmitted pathogen.Microb Ecol.2016,72(4):955-964.
发明内容
本发明的目的是提供柱状黄杆菌毒力蛋白在细胞裂解中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一个目的在于提供了柱状黄杆菌毒力蛋白的抗体，在制备柱状黄杆菌检测试剂中的应用，所述的抗体为以抗原为KNLKQESIHDGPKSE的多肽制备的抗体。
本发明的还有一个目的在于提供了通过敲除柱状黄杆菌毒力蛋白获得的柱状黄杆菌弱毒株。
本发明最后一个目的在于提供了柱状黄杆菌弱毒株的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
柱状黄杆菌毒力蛋白的获得：根据目前已经公开了62株柱状黄杆菌全基因组序列，结合柱状黄杆菌的感染特征进行筛选，最终发现cytolysin为毒力基因，其包含两个同源基因ctl1和ctl2，这两个基因对应的蛋白对细胞均具有明显裂解效果。所述的黄杆菌毒力蛋白Ctl1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2所示；所述的黄杆菌毒力蛋白Ctl2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO.4所示。
黄杆菌毒力蛋白在细胞裂解中的应用，所述的黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
柱状黄杆菌毒力蛋白的抗体在制备柱状黄杆菌检测试剂中的应用，包括利用本领域的常规方式，以柱状黄杆菌毒力蛋白或其核心抗原表位为抗原，制备的单抗或多抗，用于柱状黄杆菌检测。
以上所述的应用中，优选的，所述的抗体为以抗原为KNLKQESIHDGPKSE的多肽制备的抗体。
通过本领域的常规方式，敲除柱状黄杆菌毒力蛋白(SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.3所示)获得的柱状黄杆菌弱毒株也属于本发明的保护范围。
柱状黄杆菌弱毒株的应用，所述的应用包括但不限于用于制备成柱状黄杆菌弱毒疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.首次在柱状黄杆菌这一鱼类病原中筛选到毒力蛋白cytolysin。发现其编码基因为ctl1和ctl12，所编码的蛋白可裂解鱼类细胞。
2.首次在柱状黄杆菌中成功缺失了两个毒力基因cytolysin1(ctl1)和/或cytolysin2(ctl12)，以便从事柱状黄杆菌研究的人员能快速且深入研究其致病机制。
3.首次实现了对柱状黄杆菌的毒力基因cytolysin的原核表达和抗体制备，为制备柱状黄杆菌检测制剂提供支持。
4.首次将柱状黄杆菌cytolysin缺失突变株，在材料鱼的鱼体上开展毒力试验，进一步证明cytolysin对材料鱼具有毒性，为开发弱毒疫苗株奠定了基础。
5.首次以cytolysin缺失突变株为候选疫苗株，开展免疫保护测试，取得一定的保护效果。
附图说明
图1为cytolysin1和cytolysin2原核表达蛋白感染鱼类细胞系示意图。
图2为cytolysin抗体Western Blot检测细菌结果示意图；
其中泳道M为Marker，WT为黄杆菌强毒株野生型为G4株，Δctl1Δctl2为ctl1和ctl2双基因缺失株。
图3为cytolysin1和/或cytolysin2基因缺失突变株感染材料鱼结果示意图。
图4为cytolysin1和/或cytolysin2基因缺失突变株免疫材料鱼后，再行人工感染结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明权利范围的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
本发明实施例所用的柱状黄杆菌强毒株野生型为G4株(Difference in genesbetween a high virulence strain G4 and a low virulence strain G18 ofFlavobacterium columnare by using suppression subtractive hybridization.Li N,Zhang J,Zhang LQ,Nie P.J Fish Dis.2010May；33(5):403-12.doi:10.1111/j.1365-2761.2009.01132.x.Epub 2010Jan 24.)。实施例中所涉及的基因缺失突变株是在G4株中，进行基因缺失突变获得的菌株。
实施例1：
柱状黄杆菌毒力蛋白的获得：
根据目前已经公开的62株柱状黄杆菌全基因组序列，结合柱状黄杆菌的感染特征，筛选出可能的毒力基因。通过体外表达和亲和纯化的方式，获得这些基因的外源表达蛋白。分别用这些蛋白与鱼类细胞共孵育以检测其毒力。结果发现仅有具备巯基活化细胞毒素家族(Thiol-activated cytolysin superfamily)结构域的蛋白cytolysin能引起鱼类细胞病变。经过对比这两条cytolysin的编码序列ctl1和ctl2，发现虽然两者序列高度相似，也具备相同的结构域(Thiol-activated cytolysin superfamily)，但只有ctl2的原核表达蛋白对细胞具有明显裂解效果，所述的ctl1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2所示；所述的ctl2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO.4所示。
实施例2：
柱状黄杆菌ctl1和ctl2基因原核表达蛋白的毒力检测，具体方法包括：
(1)原核表达纯化Ctl1和Ctl2蛋白
将Ctl1蛋白的25-558aa区域和Ctl2蛋白的23-558aa区域分别克隆至pGEX-4T-AB1载体，将表达质粒转入大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株中。将携带表达质粒的菌株在16℃诱导表达16h，进行破碎处理。取破碎后上清进行纯化并酶切，去掉GST标签后，去内毒素备用。
(2)制备毒力蛋白cytolysin的多克隆抗体
选择毒力蛋白cytolysin抗原表位合成多肽(KNLKQESIHDGPKSE)，制备兔多克隆抗体。将免疫后的兔血清进行亲和纯化后，获得柱状黄杆菌cytolysin的多克隆抗体。
(3)将细胞接种至24孔板
将鲤科鱼类上皮细胞系EPC按照3-3.5×105个/孔接种于24孔板中，28℃静置过夜培养，以形成单层细胞。
(4)用纯化后的蛋白刺激鱼类细胞系
取0.6μg纯化后的Ctl1蛋白和Ctl2蛋白分别用150μl M199培养基稀释后备用，另外取0.6μg纯化后的Ctl1蛋白和Ctl2蛋白分别与cytolysin的抗体混合孵育5min后(对照组，即证明这种裂解作用，确实是用蛋白引起，而不是由溶解蛋白的缓冲液所引起的)，再分别用150μl M199培养基稀释后备用。
用移液器将24孔板中的细胞培养基上清吸弃，实验组每孔加入上述稀释后的蛋白溶液或蛋白抗体复合物溶液，对照孔加入150μl M199培养基，28℃静置孵育30min。
孵育结束后，在各孔中加入1μl PI后，在荧光显微镜下各孔细胞的破裂情况。
结果如图1所示，毒力因子原核表达并经过去内毒素纯化后，Ctl2蛋白对细胞具有显著的毒性(图1中C)，Ctl1蛋白也对细胞有毒性，但毒性比Ctl2蛋白低(图1中A)。两种蛋白的毒性可通过制备的多克隆抗体中和减弱(图1中B、D、E)。
实施例3:
柱状黄杆菌弱毒株的构建：
(1)将ctl1基因的开放阅读框编码的起始密码子及其上游的序列(共2084bp)克隆至柱状黄杆菌自杀质粒pMS75的PstI和SalI酶切位点，再将该基因ORF的终止密码子及其下游序列(共1989bp)克隆至自杀质粒pMS75的BamHI和SalI酶切位点。最终形成用于ctl1基因缺失的自杀质粒pNL-73。
(2)采用相同方法，将ctl21基因的起始密码子及其上游的序列(共2069bp)克隆至自杀质粒pMS75的BamHI和SalI酶切位点，再将该基因ORF的终止密码子及其下游序列(共2011bp)克隆至自杀质粒pMS75的SalI和PstI酶切位点。最终形成用于ctl2基因缺失的自杀质粒pNL-65。
(3)将上一步获得的基因敲除质粒转化到能用于接合转移的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中(SM10、S17-1λ等均可)。筛选阳性菌株培养至对数生长期，离心收集菌体。用Shieh液体培养基将柱状黄杆菌培养至对数生长期，收集菌体。两种菌体经不含抗生素的Shieh液体培养基分别洗涤两次。再用无抗的Shieh培养基重悬，并将悬液滴至Shieh固体培养基上。将该平板在28℃静置培养20-24h。
(4)筛选在柱状黄杆菌中发生两次同源重组的菌株
用玻棒刮取已完成接合转移的细菌混合物，涂布至含抗生素的Shieh平板，28℃静置培养至有菌落长出。该菌落即为完成第一次同源重组的菌株。
将这些菌株分别接种在无抗Shieh液体培养基中过夜培养，将菌液涂布于含10％蔗糖的Shieh平板。在28℃静置培养24-48h，选择单菌落分别在含四环素和不含四环素的Shieh平板上划线培养。选取只能在无四环素的Shieh平板上生长的该菌株即可获得经过两轮同源重组的细菌。
(5)缺失突变株筛选和确认
将经过两轮同源重组的细菌接种至液体Shieh培养基中，振荡培养至对生生长期。在待缺失DNA区域的序列的上游和下游分别选择一段序列作为正向和反向引物，菌液PCR方法检测经过两轮同源重组的细菌，以相同方法检测野生型菌株基因组为对照。若扩增获得的片段，与野生型菌株基因组中扩增得到序列大小相同，表明细菌经过两轮同源重组后恢复了野生型；不能用于后续测试。若扩增得到的片段，与突变株基因组中的对应序列大小，表明该菌株毒力基因已发生缺失突变，选取菌株用于毒力检测和免疫测试。分别将在野生型G4中敲除了ctl1基因的Δctl1突变株命名为FCG-67，将敲除了ctl2基因的Δctl2突变株命名为FCG-60。
ctl1突变株的检测引物序列为：
Pr164：5’–aactatttaaaattctttatatta–3’
Pr157：5’–taaatggtgtaataaatgtttttgaa–3’
扩增产物片段大小：2046bp表明回复野生型；372bp表明ctl1基因已被成功缺失突变。ctl2突变株的检测引物序列为：
Pr141：5’–caaattagagaaagggctaaat–3’
Pr149：5’–ggctgtctgaagaggttataa–3’
扩增产物片段大小：2147bp表明回复野生型；476bp表明ctl2基因已被成功缺失突变。
以FCG-60菌株为背景，按照上述步骤将ctl1基因的缺失突变质粒pNL-73转入FCG-60中，经过两轮同源重组和PCR检测的方法，筛选在FCG-60中敲除了ctl1基因的菌株。该菌株即ctl1和ctl2均被敲除了的双缺失突变株Δctl1Δctl2，将其命名为FCG-66。该过程所涉及的PCR检测引物如下：
Pr164：5’–AACTATTTAAAATTCTTTATATTA–3’
Pr157：5’–TAAATGGTGTAATAAATGTTTTTGAA–3’
扩增产物片段大小：2046bp表明回复野生型；372bp表明在FCG-60菌株中，ctl1基因已被成功缺失突变，最终形成了ctl1和ctl2基因双缺失突变株。
实施例4：
柱状黄杆菌cytolysin抗体在细菌检测中的应用，具体方法包括：
本例以Western Blot方法为例来阐述毒力蛋白cytolysin多克隆抗体在柱状黄杆菌检测药物中的应用：
将柱状黄杆菌野生型G4株和双缺失突变株FCG-66株分别培养至对数生长期。
样品制备：取1ml菌液离心收集菌体，重悬于5×loading buffer，沸水浴15min。
电泳及转膜：将样品经SDS-PAGE胶电泳分离，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜。
封闭：用终浓度为5％脱脂奶粉TBST溶液室温封闭1h。
一抗孵育：根据抗体效价，以1:5000～1:1000的比例将抗体稀释于含1％脱脂奶粉的TBST中，室温孵育1-4h。TBST溶液洗膜4次，每次5min。
二抗孵育：以1:1000的比例将HRP标记的羊抗兔抗体稀释于含1％脱脂奶粉的TBST中，室温孵育30min-1h。TBST溶液洗膜4次，每次5min。
显色：加入化学发光底物进行显色，待目的带出现终止反应。
结果如图2所示，仅野生型菌株有显色条带，双缺失突变株FCG-66株无检出，说明利用本发明抗原制备的抗体特异性良好。
实施例5：
实施例3制备的柱状黄杆菌毒力ctl1和/或ctl2基因缺失突变株毒力测试。包括以下步骤：
(1)培养细菌至对数生长期
将柱状黄杆菌野生株、ctl1缺失突变株FCG-67、ctl2缺失突变株FCG-60以及ctl1和ctl2双缺失突变株FCG-66分别培养至对数生长期(OD600＝0.4-0.5)。以不接种细菌的等体积Shieh培养基作为对照。
(2)浸泡感染斑马鱼
分别将上述各组细菌在250ml温度为28℃的水体中稀释至约0.8×105cfu/ml，对照组将等体积的Shieh培养基在相应的水体中稀释备用。向各组水体中分别放入10尾健康成年斑马鱼，在28℃浸泡感染1h后，转移至2L的养殖水体中。连续7天观察并记录感染及死亡情况。结果显示，突变株感染鱼体的能力明显下降，受试鱼存活率较野生株提高10-70％。存活率的计算公式：存活率＝(受试斑马鱼总数-7天累计死亡的斑马鱼数量)×100/受试斑马鱼总数。
表1材料鱼经野生株和突变株感染后的存活率
菌株名称 G<sub>4</sub> Δctl1 Δctl2 Δctl1Δctl2
存活率 10％ 20％ 50％ 80％
实施例6：
柱状黄杆菌基因缺失突变株在制备柱状黄杆菌弱毒株疫苗中的应用：
(1)用ctl1和ctl2基因突变株免疫斑马鱼
取500ml温度为28℃的养殖水体，将处于对数生长期的单基因缺失突变株FCG-67、FCG-60和双基因缺失突变株FCG-66分别稀释至约2.5×104cfu/ml。同时，将等体积的Shieh培养基在相应的水体中作为对照组。向各组水体中分别放入20尾健康成年斑马鱼，28℃浸泡1h后，转移至4L的养殖水体中养殖4周。
(2)用强毒株的野生型分别感染各组斑马鱼
将柱状黄杆菌强毒株(G4菌株)的野生型培养至对数生长期(OD600＝0.4-0.5)。按照本例步骤(1)中的方法分别将细菌稀释至约0.8×105cfu/ml后，分别将步骤(1)中经过免疫并饲养4周的斑马鱼和对照组的斑马鱼浸泡感染1h，然后转移至4L的养殖水体中养殖一周，观察并记录死亡情况。结果显示，突变株免疫斑马鱼后，鱼体被野生强毒株感染后存活的数量较对照提高约30％。
表2经突变株免疫的材料鱼人工感染后的存活率
菌株名称 对照组 Δctl1 Δctl2 Δctl1Δctl2
存活率 10％ 10％ 25％ 40％
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Phe Leu Lys Leu Asn Ala Lys Trp Thr Leu Leu Ala Leu Met
1 5 10 15
Gln Leu Ser Val Leu Ser Cys Asn Lys Glu Asp Val Ala Ala Asn Glu
20 25 30
Ser Asp Lys Asp Gly Lys Asn Leu Lys Gln Glu Ser Ile His Asp Gly
35 40 45
Pro Lys Ser Glu Leu Gln Ile Ser Arg Arg Ile Leu Ser Ser Pro Pro
50 55 60
Asp Gln Val Gly Ser Ala Ser Cys Lys Thr Ile Glu Glu Thr Tyr Asn
65 70 75 80
Lys Thr Phe Asp Asn Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Thr His Leu Leu
85 90 95
Trp Pro Gly Asn Ile Val Gln Gly Gly Thr Ile Val Ser Gly Asn Leu
100 105 110
Ala Ser Ile Pro Ile Asp Pro Lys Gly Arg Asn Thr Ile Glu Val Lys
115 120 125
Val Asp Ala Phe Ser Ser Ser Glu Ser Lys Ser Ser Ser Lys Glu Val
130 135 140
Glu Asn Pro Thr Ala Gly Lys Val Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Asn Ser Tyr Tyr Thr Ser Gly Thr Lys Phe Pro Ala Asn Tyr Ala Val
165 170 175
Glu Ile Gln Arg Thr Tyr Asp Ser Lys Gln Leu Gln Val Ala Leu Gly
180 185 190
Val Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Val Gly Leu Ser Ala Ser Leu Gly Leu
195 200 205
Ser Phe Lys Lys Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Val Thr Leu Lys Gln Lys
210 215 220
Phe Phe Asn Val Ser Val Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Gly Asp Phe
225 230 235 240
Gly Trp Ile Lys Lys Glu Tyr Pro Arg Ser Glu Phe Asp Lys Tyr Ile
245 250 255
Gly Glu Arg Asn Pro Ala Ala Tyr Ile Ser Ser Val Thr Tyr Gly Arg
260 265 270
Leu Tyr Thr Leu Val Tyr Glu Ser Asp Glu Ser Ser Phe Asp Met Glu
275 280 285
Gln Ala Leu Asn Phe Ala Tyr Lys Asn Pro Ala Ala Ser Ile Thr Val
290 295 300
Asp Gln Lys Leu Lys Tyr Ser Thr Thr Leu Gln Asn Thr Lys Val Tyr
305 310 315 320
Ala Lys Gln Leu Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Leu Asp Ala Ala Phe
325 330 335
Gly Ala Phe Ala Gly Asn Phe Glu Lys Val Arg Asp Phe Val Val Asn
340 345 350
Gly Ala Asp Val Ser Lys Asp Asn Pro Gly Tyr Pro Ile Glu Tyr Thr
355 360 365
Ala Val Asn Ile Glu Ser Asn Leu Asp Ala Thr Ile Asn Val Asn Gly
370 375 380
Ile Ser Asn Tyr Ser Glu Cys Glu Glu Thr Val Tyr Thr Ala Lys Thr
385 390 395 400
Leu Asp Glu Ala Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu Lys Thr Glu Tyr Gly
405 410 415
Tyr Asn Ser Cys Ala Lys Ile Ile Ile Phe Asn Asn Thr Asp Arg Glu
420 425 430
Ile Leu Leu Lys Asn Tyr Thr Pro Trp Ser Gly Ser Thr Phe Ser Asn
435 440 445
Leu Pro Pro Thr Ser Ile Pro Ala Gly Arg Tyr Gly Tyr Leu Leu Ala
450 455 460
Val Asn Gln Tyr Gly Thr Ser Lys Gly Thr Tyr Asn Gln Ile Ser Tyr
465 470 475 480
Leu Phe Asp Asn Lys Thr Ile Ser Phe Gly Thr Tyr Ala Pro Val Glu
485 490 495
Ser Gly Arg Thr Asn Asn Val Leu Val Asn Phe Arg Glu Ile Thr Glu
500 505 510
Thr Glu Leu Asn Tyr Asn Ser Thr Arg Pro Ser Ile Glu Lys Ile Gln
515 520 525
Asp Asn Ile Arg Ile Arg Gly Thr Ile Glu Ser Lys Ala Ala Pro Tyr
530 535 540
Val Asn Phe Thr Ile Thr Gly Lys Gly Asn Ser Val Ile Asn
545 550 555
<210> 2
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaattttt taaaactaaa tgccaagtgg acattgcttg cattaatgca attgtcggtt 60
ctaagttgta ataaagaaga tgttgcagcg aatgaatcag ataaggatgg aaaaaatcta 120
aaacaagaaa gcattcatga tggtcctaaa tcagaattac agattagtag aagaattctt 180
tcgtcaccac cagatcaagt aggatctgcg agttgtaaaa cgattgaaga aacttataat 240
aaaacatttg ataatttttc aaaattagga gcagcgactc atttattgtg gccaggaaat 300
attgtgcaag gtgggactat tgtttcagga aacttagcat ctattcctat tgatccaaaa 360
ggaagaaata ctattgaggt gaaggtagat gctttttcat ctagtgaatc aaaatcatca 420
agtaaggagg tagaaaatcc aacagcaggt aaagtacaag atgctttaga aaaaatatta 480
aactcatatt atacatcagg aactaagttt cctgctaatt atgctgttga aattcaaaga 540
acgtatgata gtaaacaatt acaagtagct ttaggtgttg gttatacagg gcctgctgta 600
ggtttgtcag cgagtttggg gctaagcttt aaaaagaaca agacttatta tgccgttacg 660
cttaaacaaa aattctttaa cgtatcagta tctgcaaaac caggacttca aggggatttt 720
ggttggataa aaaaagagta tccgagatct gaatttgata aatatatagg agaaagaaat 780
ccagctgcct atatatcatc tgtaacctat ggtagattat atactttagt ttacgaatcc 840
gatgaaagtt cttttgatat ggaacaagct ttaaattttg cttataaaaa tccagctgca 900
agtataacag ttgatcaaaa attaaaatat tctactacat tacaaaatac aaaagtatat 960
gcaaaacagt taggaggtag tgcttctggt ggattagatg cagcatttgg agcatttgca 1020
ggaaattttg aaaaagtaag agattttgtg gtgaatggag cagatgtttc taaagataat 1080
ccaggatacc caatagaata cacagctgta aatattgaat caaaccttga tgcgactatt 1140
aacgttaatg gaatatcaaa ttattcagaa tgtgaagaaa ctgtatatac agcaaaaacg 1200
cttgatgaag ctaaaaaaag agttgaagac ttaaaaacgg aatatggtta taatagttgt 1260
gctaagatta ttatatttaa taacacagat agagaaattc tattaaaaaa ttatactcct 1320
tggtctggta gtactttttc aaacttacca cctacttcta ttccagcagg aagatatgga 1380
tatttattag ctgttaatca atatggtact tcaaaaggta catataacca aatttcatat 1440
ttatttgata ataaaacaat aagtttcggt acctatgcgc ccgttgaatc aggtagaacg 1500
aacaatgttt tagttaattt tagagaaata acagaaacag agttaaatta taatagcacg 1560
agaccttcta tagaaaaaat acaagataat attcgaatta gaggaactat tgaatcaaaa 1620
gctgcaccgt atgttaattt cacgattact ggtaaaggaa atagtgttat aaactaa 1677
<210> 3
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Phe Leu Lys Pro Asn Ala Arg Leu Ala Leu Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Gln Met Ser Val Leu Ser Cys Asn Asn Glu Asp Val Val Thr Asn Glu
20 25 30
Ser Pro Lys Glu Ser Gln Ala Leu Asn Asp Lys Gly Ile Tyr Ala Gly
35 40 45
Pro Lys Thr Glu Leu Lys Ile Ser Arg Arg Ile Leu Ser Pro Ser Ser
50 55 60
Asn Glu Arg Gly Tyr Ser Ser Cys Lys Thr Ile Glu Glu Arg Tyr Asp
65 70 75 80
Lys Thr Phe Glu Asn Phe Ser Lys Leu Gly Gly Gly Ala His Leu Leu
85 90 95
Trp Pro Gly Asn Ile Val Gln Gly Gly Thr Ile Val Ser Gly Asn Leu
100 105 110
Ala Ser Ile Pro Ile Asp Gly Thr Gly Arg Asn Ser Ile Glu Val Lys
115 120 125
Val Asp Ala Phe Ser Ala Ser Ser Ser Lys Pro Ser Ser Met Asn Val
130 135 140
Glu Asn Pro Thr Ala Gly Lys Val Gln Gly Ala Leu Glu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Asp Gly Tyr Tyr Glu Ser Gly Thr Lys Phe Pro Ala Asn Tyr Ala Val
165 170 175
Glu Ile Gln Arg Thr Tyr Asp Ser Lys Gln Leu Gln Val Ala Val Gly
180 185 190
Val Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ile
195 200 205
Asn Phe Lys Lys Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Val Thr Leu Lys Gln Lys
210 215 220
Phe Phe Asn Val Ser Val Leu Ala Lys Pro Gly Leu Gln Gly Asp Phe
225 230 235 240
Gly Trp Ile Lys Lys Glu Tyr Pro Arg Ser Glu Phe Asp Lys Tyr Ile
245 250 255
Gly Glu Lys Asn Pro Ala Ala Tyr Ile Ser Ser Val Thr Tyr Gly Arg
260 265 270
Leu Tyr Thr Leu Val Tyr Glu Ser Asp Glu Ser Ser Phe Glu Met Glu
275 280 285
Gln Ala Leu Asn Phe Ala Tyr Lys Asn Pro Ala Ala Asn Ile Thr Ala
290 295 300
Glu Gln Lys Leu Arg Tyr Ala Ser Thr Phe Gln Asn Thr Lys Val Tyr
305 310 315 320
Ala Lys Gln Leu Gly Gly Ser Ala Thr Gly Gly Leu Asp Ser Ala Phe
325 330 335
Gly Ala Phe Ala Gly Asn Phe Glu Lys Val Arg Asp Phe Val Val Asn
340 345 350
Gly Ala Glu Val Ser Lys Gln Asn Pro Gly Tyr Pro Ile Glu Tyr Thr
355 360 365
Ala Val Asn Ile Glu Ser Asn Leu Asp Val Thr Ile Asn Val Asn Gly
370 375 380
Val Ser Asn Tyr Ser Glu Cys Glu Glu Thr Leu Tyr Thr Ala Lys Thr
385 390 395 400
Tyr Asp Glu Ala Lys Lys Ala Val Asp Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Gly
405 410 415
Ile Ala Asn Cys Ala Lys Ile Ile Ile Phe Asn Asn Thr Asp Arg Glu
420 425 430
Ile Val Leu Lys Asn Tyr Thr Pro Trp Tyr Gly Ser Tyr Phe Tyr Asn
435 440 445
Thr Pro Pro Thr Ser Ile Pro Val Lys Lys Tyr Gly Tyr Val Leu Ala
450 455 460
Val His Lys Thr Gly Ala Ser Thr Gly Thr Phe Asn Gln Ile Ala Tyr
465 470 475 480
Thr Ile Asp Asp Lys Thr Val Ser Phe Gly Thr Tyr Ala Pro Trp Asp
485 490 495
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500 505 510
Ser Glu Leu Tyr Asn Asn Ser Val Arg Pro Ser Ile Glu Lys Leu Gln
515 520 525
Gly Pro Phe Arg Val Arg Gly Thr Ile Ala Thr Gly Asp Ala Pro Tyr
530 535 540
Val Asn Phe Glu Val Asn Gly Lys Gly Asn Ser Tyr Ile Asn
545 550 555
<210> 4
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaattttt taaaaccaaa tgctagattg gcattactac tagtgatgca aatgtccgtt 60
ttaagttgta acaacgaaga cgttgtgacc aatgaatccc caaaagagag tcaagctctt 120
aatgacaaag ggatttatgc tggtcctaaa acagaattaa aaattagtag aagaatcctt 180
tctccatcat caaatgaaag aggctattca agctgtaaaa cgattgaaga acgctatgat 240
aagacatttg aaaatttttc aaaattagga ggaggagctc atttgctgtg gccaggaaac 300
attgtgcaag gaggaactat tgtatcagga aatctagcgt ctattcctat tgatggaaca 360
ggaagaaatt caattgaagt aaaagtagat gctttttcag caagttcatc aaaaccttca 420
agcatgaatg tagaaaatcc aacggcagga aaagtacaag gagccttaga aaaaatacta 480
gatggatact atgaatcagg aacaaagttt cctgctaatt atgctgttga aattcagaga 540
acctacgata gcaagcaatt acaagtagcc gtaggggttg gttatacagg accggcagca 600
ggtttgtcag cgagtttggg aataaacttt aagaaaaaca agacttatta cgctgttacg 660
cttaaacaaa aattctttaa tgtatcagta ttagcaaaac caggacttca aggcgatttt 720
ggttggataa aaaaagagta tccaagatct gaatttgata aatatatagg agaaaaaaat 780
ccagctgcct atatatcatc tgtaacctat ggtagattat atactttagt ttacgaatcc 840
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aacataacag ccgagcaaaa gttaagatat gccagtacat ttcaaaatac aaaagtatat 960
gcaaaacagt taggaggtag cgcaactggt ggattagatt cagcatttgg ggcttttgca 1020
ggaaattttg aaaaagtaag agactttgtg gtgaatggag cagaggtttc taaacaaaac 1080
ccaggatacc caatagaata tactgctgta aatattgaat caaaccttga tgttactatt 1140
aatgttaatg gagtatcaaa ctactcagaa tgtgaagaaa ctttatacac agcgaagact 1200
tatgatgaag ctaaaaaagc agtggataaa ctaaaatcag attacggtat agctaattgt 1260
gccaaaatta tcatattcaa taatacagat agagaaattg tattaaaaaa ttatactcct 1320
tggtatggta gttattttta caatacacca ccaacctcta ttccagtaaa aaaatacgga 1380
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actatagatg ataaaacagt aagttttgga acctatgcac cttgggatca gtttagaacc 1500
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gatgctcctt atgtgaattt tgaagttaat ggaaaaggaa atagttatat aaattaataa 1680
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Asn Leu Lys Gln Glu Ser Ile His Asp Gly Pro Lys Ser Glu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aactatttaa aattctttat atta 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaatggtgt aataaatgtt tttgaa 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaattagag aaagggctaa at 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggctgtctga agaggttata a 21

Claims (5)

1.柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)毒力蛋白在细胞裂解中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
2.柱状黄杆菌毒力蛋白的抗体在制备柱状黄杆菌检测试剂中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的抗体为以抗原为KNLKQESIHDGPKSE的多肽制备的抗体。
4.敲除柱状黄杆菌毒力蛋白获得的柱状黄杆菌弱毒株，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求4所述的柱状黄杆菌弱毒株在制备成鱼类柱形病疫苗中的应用。
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