CN114149421B - 巴马汀衍生物、其制备方法和抗血栓用途 - Google Patents

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CN114149421B CN202111339954.1A CN202111339954A CN114149421B CN 114149421 B CN114149421 B CN 114149421B CN 202111339954 A CN202111339954 A CN 202111339954A CN 114149421 B CN114149421 B CN 114149421B
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Abstract

本发明涉及一系列新的巴马汀衍生物，其具有通式(1)的结构：
Figure DDA0003352061240000011
本发明还涉及这些巴马汀衍生物的制备方法及其抗血栓的用途。

Description

巴马汀衍生物、其制备方法和抗血栓用途
技术领域
本发明涉及一系列新的巴马汀衍生物，还涉及这些巴马汀衍生物的制备方法及其抗血栓的用途。
背景技术
血小板异常聚集是血栓形成的主要原因之一。血小板的异常活化、粘附和聚集可能诱发血栓形成并引起阻塞性心脑血管疾病，从而导致更高的死亡率或发病率。抑制血小板活化和聚集是发现预防或治疗血栓疾病的新药的有用策略。
在刺激或血管内皮损伤下，血小板会被活化，从而导致血小板粘附和聚集。P-选择素的增加是识别血小板活化的特异性分子标志物。在ADP或其他激动剂的刺激下，P-选择素介导血小板板与内皮细胞、中性粒细胞或单核细胞的粘附，这可能引发血栓形成。
Akt(蛋白激酶B)是PI3K的下游分子；PI3K/Akt信号通路在血小板活化和聚集中起关键作用，被认为是治疗血栓形成的有用靶点。由于Akt可被PI3K磷酸化，因此如果某一化合物对Akt磷酸化具有抑制作用，意味着该化合物可能会影响PI3K活性。ADP可刺激诱导血小板中Akt的活化，表现为p-Akt(Ser473)水平的显著增加。
对于目前临床使用的抗血栓药物，仍有出血倾向等副作用。因此，开发新的抗血栓药物以克服出血等副作用具有科学和临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供新的具有抗血栓作用的巴马汀衍生物，其制备方法及其制药用途。
本发明的第一方面在于提供一种化合物，其具有通式(1)的结构：
Figure BDA0003352061220000021
其中：
R1为卤素或-S(＝O)2C6H5；
R2为氢、取代的苄基或C2-C6烯基；
R3为-OR4、-OC(＝O)R5、-OS(＝O)2C6H5、-NHR6或C1-C6烷氧基；
其中：
R4为取代的苄基、C3-C6环烷基C1-C6烷基或C1-C6烷基；
R5为取代的苄基；
R6为取代的苄基、
Figure BDA0003352061220000022
或C1-C6烷基羰基。
在优选的实施方案中，
R1为-Cl、-Br或-S(＝O)2C6H5；
R2为氢，被独立地选自以下的基团单取代或双取代的苄基：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基羰基C2-C6烯基、氰基或硝基，或C2-C6烯基；
R3为-OR4、-OC(＝O)R5、-OS(＝O)2C6H5、-NHR6或C1-C6烷氧基；
其中：
R4为被独立地选自以下的基团单取代或双取代的苄基：C1-C6烷氧基、卤素、卤素取代的C1-C6烷基、氰基，C3-C6环烷基C1-C6烷基或C1-C6烷基；
R5为C1-C6烷基取代的苄基；
R6为卤素取代的苄基、三环癸烷羰基或C1-C6烷基羰基。
在进一步优选的实施方案中，
R1为-Cl或-Br；
R2为氢；
R3为-OR4或-NHR6；其中：
R4为氰基取代的苄基或C3-C6环烷基C1-C6烷基；
R6为卤素取代的苄基。
在进一步优选的实施方案中，
R4为氰基取代的苄基，优选为邻位氰基取代的苄基；或环丙基C1-C6烷基，优选为环丙基甲基；
R6为氯取代的苄基，优选为对位氯取代的苄基。
在进一步优选的实施方案中，所述化合物具有以下结构式：
Figure BDA0003352061220000031
本发明第二方面涉及一种制备如本发明第一方面所述的化合物的方法，其采用以下路线之一制备：
路线I，其包括以下步骤：
(1)将巴马汀在195-210℃，30-40mmHg的条件下反应10min-1h，优选30min，生成中间体化合物1，
(2)将化合物1、K2CO3和NaI溶于溶剂中，将反应体系加热至65-75℃，优选71℃，然后将相应的苄基卤或卤代烃加入到反应体系中，反应2-24h，得到目标化合物；或将化合物1和Et3N溶于溶剂中，然后加入酰氯/磺酰氯，或加入磺酰氯进行酯化，在60-70℃，优选65℃下反应3-8h，得到目标化合物；
路线II：将巴马汀与仲胺在95–120℃下反应4–72h，得到目标化合物；
路线III，其包括以下步骤：
(1)将巴马汀与2,4-二甲氧基苄胺在110-120℃，优选105℃下反应4-10h，优选7h，得到中间体化合物6，
(2)将化合物6进行脱保护反应，优选用体积比为1:1的HCl/CH3OH进行脱保护反应20-30h，优选24h，得到中间体化合物7，
(3)将化合物7和吡啶溶于溶剂中，与相应的酰氯在65-75℃，优选71℃下反应3-24h，得到目标化合物；
路线IV，其包括以下步骤：
(1)将巴马汀和K2CO3溶于溶剂中，通过还原，优选以NaBH4作为还原剂得到中间体化合物9，
(2)将化合物9和K2CO3溶于溶剂中，加入卤代烃，回流3-24h后进行氧化，优选用NBS进行氧化，并继续回流0.5-1h，得到目标化合物。
在优选的实施方案中：
在路线I中，所述苄基卤为3',5'-二甲氧基苄基溴、间-氟苄基溴、间-溴苄基溴、对-三氟甲基苄溴、邻-氰基苄溴或间-氰基苄溴，所述卤代烃为溴甲基环丙烷、1-溴异丁烷或1-溴正庚烷；所述酰氯为邻-甲基苯甲酰氯、环戊基甲酰氯、环己基甲酰氯、1-金刚烷甲酰氯、正丁酰氯或正戊酰氯；
在路线II中，所述仲胺为苄胺；
在路线III中，所述酰氯为环戊基甲酰氯、环己基甲酰氯、1-金刚烷甲酰氯、正丁酰氯或正戊酰氯；
在路线IV中，所述卤代烃为溴代烃，优选对-甲基苄溴、3',5'-二甲基苄溴、2'-甲氧基羰基乙烯基-1'溴、邻-氰基苄溴、对-硝基苄溴、丁-2-烯-1-基溴或环庚-2-烯-1-基溴。
在优选的实施方案中，上述制备方法优选采用路线I或路线II进行。
本发明第三方面涉及根据本发明第一方面所述的化合物在制备用于抑制血小板聚集或蛋白激酶B磷酸化的药物中的用途。
本发明第四方面涉及根据本发明第一方面所述的化合物在制备用于抗血栓的药物中的用途。
在本发明的上下文中，除非另有说明，取代基具有以下含义：
在本发明的上下文中，卤素包括氟、氯、溴和碘，优选氟、氯或溴。
在本发明的上下文中，烷基为在每种情况下具有特定碳原子数的直链或支链烷基基团。优选的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基和2-乙基丁基。
在本发明的上下文中，环烷基为具有3至6个碳原子的单环饱和烷基基团。优选的实例包括：环丙基、环戊基和环己基。
在本发明的上下文中，烷基羰基为具有1至6个，优选1至4个碳原子并在1位连接羰基基团的直链或支链烷基基团。优选实例包括：甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、异丁基羰基和叔丁基羰基。
在本发明的上下文中，烷氧基为具有1至6个，优选1至4个碳原子的直链或支链烷氧基基团。优选实例包括：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。
在本发明的上下文中，烯基为具有2至6个，优选2至4个碳原子的直链或支链的单价烃基，其含有一个双键。优选实例包括：乙烯基、烯丙基、1-甲基丙-2-烯-1-基、2-甲基丙-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-3-烯-1-基、1-甲基丁-3-烯-1-基和1-甲基丁-2-烯-1-基。炔基为例如炔丙基、丁-2-炔-1-基、丁-3-炔-1-基、1-甲基丁-3-炔-1-基或异丙烯基。
其中，本申请中的一些英文缩写具有以下含义：
PMT           巴马汀
BBR           小檗碱
Asp           阿司匹林
MAR           最大聚集率
ADP           二磷酸腺苷
HUVEC         人脐静脉内皮细胞
PE            藻红蛋白
FITC          异硫氰酸荧光素
Akt           蛋白激酶B
PRP           富血小板血浆
PPP           贫血小板血浆
NBS           N-溴代琥珀酰亚胺
附图说明
图1示出了化合物2j、2p、2v和5e对HUVEC的细胞毒性作用。
图2示出了化合物2j、2p、2v和5e以剂量依赖性抑制ADP诱导的血小板聚集。
图3示出了化合物2j、2p、2v和5e对Akt磷酸化的体外抑制作用。
图4和5分别示出了化合物2v对离体血小板聚集和Akt磷酸化的抑制作用。
图6示出了抑制角叉菜胶诱发的小鼠血栓模型建立的具体流程。
图7示出了化合物2v对角叉菜胶诱发的小鼠尾部血栓形成的抑制作用。
图8示出了化合物2v对角叉菜胶诱发的小鼠尾部血栓形成的抑制作用。(A)小鼠尾部切片的H&E染色。(B)小鼠的血栓形成率。
图9示出了化合物2v对角叉菜胶诱发的小鼠肺血栓形成的抑制作用。(A)小鼠肺的H&E染色。(B)小鼠的血清P-选择素水平。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下文将结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但应认识到这些实施例和附图仅为对本发明进行示例说明，而非意在限制本发明。
I.制备实施例
原料巴马汀(PMT)及所有目标化合物的结构如下表1所示：
表1：
Figure BDA0003352061220000061
Figure BDA0003352061220000062
Figure BDA0003352061220000071
所有目标化合物的合成路线如方案1所示。
Figure BDA0003352061220000081
其中：(a)195-210℃，30-40mmHg，30min；(b)取代的苄基卤或卤代烃，K2CO3或K2CO3/NaI，DMF，71℃，2-24h；(c)RCOCl/RSO2Cl，Et3N，65℃，3-8h；(d)RSO2Cl，Et3N，65℃，6h；(e)RNH2，95–120℃，4–72h；(f)2,4-二甲氧基苄胺，105℃，7h；(g)1:1HCl/CH3OH，24h；(h)R1COCl，吡啶，71℃，3-24h；(i)NaBH4，5％NaOH，K2CO3，CH3OH，3h；(j)卤化物，K2CO3，回流，3-24h；(k)NBS，0.5-1h。
化合物2a-z、3a-d和4a-b的合成路线：以巴马汀为原料，将其经加热酸化得到关键中间体化合物1，收率为80％。然后，使用K2CO3作为碱，由化合物1和相应的苄基卤或卤代烃获得2a-z，收率为37-64％。或者，将化合物1用酰氯/磺酰氯或磺酰氯酯化，生成3a-d或4a-b，收率为37-57％。
化合物5a-h、6、7和8a-j的合成路线：以巴马汀为原料，通过与相应的仲胺反应，得到各种氨基取代的巴马汀衍生物，即化合物5a-h和6。然后，通过化合物6与HCl/CH3OH(体积比为1:1)的脱保护反应获得具有9-NH2的化合物7。接下来，通过化合物7和相应酰氯的酰胺化反应获得产物8a-j，收率为31-59％。
化合物9、10a-i和11a-i的合成路线：以巴马汀为原料，以NaBH4为还原剂将其选择性地还原为二氢巴马汀，即化合物9，收率为81％。将化合物9用取代的卤化物和K2CO3处理，获得化合物10a-i，然后将化合物10a-i用NBS进行氧化以获得所需的产物，即化合物11a-i。
制备实施例1-9：化合物2f-k、2p、2w和2y的制备及表征如下：
以巴马汀(20g)为原料，在195-210℃，30-40mmHg的条件下反应30min，冷却至室温酸化后得到化合物1，收率为80％。将化合物1(0.40mmol)、K2CO3(1.60mmol)和NaI(1.60mmol)，溶于无水DMF(6mL)中，将反应体系加热至71℃，然后将相应的苄基卤(1.6mmol)或卤代烃(1.6mmol)加入到反应体系中，3-8h后，将反应混合物冷却、过滤并通过快速色谱纯化得到目标化合物2f-k、2p、2w或2y，收率为37-64％。
制备实施例1：2,3,10-三甲氧基-9-3',5'-二甲氧基苄氧基原巴马汀溴化物(化合 物2f)的制备。
所使用的苄基卤为3',5'-二甲氧基苄基溴，加入后的反应时间为6h。
收率为47％；棕色固体；熔点(m.p.)为162–164℃。
1H NMR:δ9.81(s,1H),9.04(s,1H),8.22(dd,J＝9.0,1.8Hz,1H),8.04(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.10(s,1H),6.75(d,J＝2.4Hz,2H),6.46(t,J＝2.4Hz,1H),5.30(s,2H),4.93(t,J＝6.6Hz,2H),4.10(d,J＝1.2Hz,3H),3.94(s,3H),3.87(s,3H),3.74(d,J＝1.2Hz,6H),3.21(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ160.4(2),151.5,150.5,148.7,145.4,141.8,138.6,137.6,133.0,128.6,126.6,123.6,121.8,119.9,118.9,111.3,108.7,106.5(2),100.2,75.2,57.1,56.2,55.9,55.5,55.3(2),26.0；HRMS:C29H30NO6Br[M–Br]+:计算值:488.2068,实测值:488.2068.
制备实施例2：2,3,10-三甲氧基-9-间-氟苄氧基原巴马汀溴化物(化合物2g)的制 备。
所使用的苄基卤为间-氟苄基溴，加入后的反应时间为6h。
收率为31％；黄色固体；熔点为237–239℃。
1H NMR:δ9.82(s,1H),9.06(s,1H),8.24(d,J＝9.0Hz,1H),8.06(d,J＝9.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.52–7.42(m,3H),7.26–7.16(m,1H),7.10(s,1H),5.37(s,2H),4.96(t,J＝6.6Hz,2H),4.09(s,3H),3.94(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ162.1,151.5,150.5,148.7,145.3,141.7,139.4,137.7,133.0,130.4,128.6,126.6,124.5,123.8,121.6,119.9,118.9,115.2,115.1,111.3,108.8,74.4,57.1,56.2,55.9,55.5,26.0；HRMS:C27H25NO4FBr[M–Br]+:计算值:446.1762,实测值:446.1764.
制备实施例3：2,3,10-三甲氧基-9-间-溴苄氧基原巴马汀溴化物(化合物2h)的制 备。
所使用的苄基卤为间-溴苄基溴，加入后的反应时间为3h。
收率为42％；黄色固体；熔点为201–203℃。
1H NMR:δ9.82(s,1H),9.04(s,1H),8.24(d,J＝9.0Hz,1H),8.07(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(t,J＝1.8Hz,1H),7.71(s,1H),7.63–7.53(m,2H),7.38(t,J＝7.8Hz,1H),7.11(s,1H),5.34(s,2H),4.95(t,J＝6.6Hz,2H),4.08(s,3H),3.94(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ162.7,152.0,151.0,149.2,145.8,142.2,139.7,138.1,133.5,131.7,131.6,131.0,129.1,128.0,127.0,124.3,122.1,122.0,120.3,119.3,111.7,109.2,74.8,57.5,56.6,56.3,56.0,26.5；HRMS:C27H25NO4Br2[M–Br]+:计算值:506.0962,实测值:506.0962.
制备实施例4：2,3,10-三甲氧基-9-对-三氟甲基苄氧基原巴马汀溴化物(2i)的制 备。
所使用的苄基卤为对-三氟甲基苄溴，加入后的反应时间为5h。
收率为36％；黄色固体；熔点为234–236℃。
1H NMR:δ9.81(s,1H),9.05(s,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),8.05(d,J＝9.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,2H),7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.70(s,1H),7.08(s,1H),5.43(s,2H),4.93(t,J＝6.6Hz,2H),4.05(s,3H),3.91(s,3H),3.85(s,3H),3.20(t,J＝6.6Hz,2H)；13CNMR:δ151.5,150.4,148.7,145.3,141.8,141.4,137.7,133.1,128.9(2),128.6(2),126.6,125.3(2),125.1,123.8,121.5,119.9,118.9,111.3,108.8,74.4,57.1,56.2,55.9,55.5,26.0；HRMS:C28H25NO4F3Br[M–Br]+:计算值:496.1730,实测值:496.1733.
制备实施例5：2,3,10-三甲氧基-9-邻-氰基苄氧基原巴马汀溴化物(2j)的制备。
所使用的苄基卤为邻-氰基苄溴，加入后的反应时间为3h。
收率为47％；黄色固体；熔点为188–190℃。
1H NMR:δ9.80(s,1H),9.08(s,1H),8.24(d,J＝9.6Hz,1H),8.09(d,J＝9.0Hz,1H),7.96(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.93(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.81(td,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.73(s,1H),7.62(td,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.11(s,1H),5.55(s,2H),4.93(t,J＝6.6Hz,2H),4.06(s,3H),3.95(s,3H),3.88(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ152.1,151.0,149.3,145.6,141.8,140.1,138.2,134.0,133.6(2),130.8,129.9,129.1,127.1,124.6,122.0,120.5,119.3,118.0,111.8(2),109.3,73.3,57.5,56.7,56.4,56.1,26.5HRMS:C28H25N2O4Br[M–Br]+:计算值:453.1809,实测值:453.1813.
制备实施例6：2,3,10-三甲氧基-9-间-氰基苄氧基原巴马汀溴化物(2k)的制备。
所使用的苄基卤为间-氰基苄溴，加入后的反应时间为8h。
收率为39％；黄色固体；熔点为224–226℃。
1H NMR:δ9.84(s,1H),9.06(s,1H),8.24(d,J＝9.0Hz,1H),8.12(s,1H),8.07(d,J＝9.0Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),7.86(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(s,1H),7.65(t,J＝7.8Hz,1H),7.11(s,1H),5.40(s,2H),4.96(t,J＝6.6Hz,2H),4.08(s,3H),3.94(s,3H),3.88(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ151.5,150.5,148.7,145.3,141.6,138.2,137.7,133.3,133.1,132.1,131.9,129.7,128.6,126.5,123.9,121.6,119.9,118.9,118.7,111.4,111.3,108.8,74.0,57.1,56.2,55.9,55.5,26.0；HRMS:C28H25N2O4Br[M–Br]+:计算值:453.1809,实测值:453.1809.
制备实施例7：2,3,10-三甲氧基-9-环丙基甲氧基原巴马汀溴化物(化合物2p)的 制备。
所使用的卤代烃为溴甲基环丙烷，加入后的反应时间为6h。
收率为39％；黄色固体；熔点为222-224℃。
1H NMR:δ9.82(s,1H),9.05(s,1H),8.20(d,J＝9.0Hz,1H),8.04(d,J＝9.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.10(s,1H),4.98(t,J＝6.6Hz,2H),4.15(d,J＝7.2Hz,2H),4.05(s,3H),3.94(s,3H),3.87(s,3H),3.24(t,J＝6.6Hz,2H),1.41-1.33(m,1H),0.62–0.44(m,2H),0.37-0.32(m,2H)；13C NMR:δ151.5,150.5,148.7,145.4,142.5,137.6,133.0,128.6,126.5,123.3,122.0,119.9,118.9,111.3,108.7,78.5,57.0,56.2,55.9,55.529,26.0,10.7,3.1(2)；HRMS:C24H26NO4Br[M-Br]+:计算值:394.2013,实测值:394.2013.
制备实施例8：2,3,10-三甲氧基-9-异丁氧基原巴马汀溴化物(化合物2w)的制备。
所使用的卤代烃为1-溴异丁烷，加入后的反应时间为4h。
收率为47％；黄色固体；熔点为242–244℃。
1H NMR:δ9.67(s,1H),9.04(s,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),8.03(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.11(s,1H),4.96(t,J＝6.6Hz,2H),4.08(d,J＝6.6Hz,2H),4.05(s,3H),3.94(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H),2.32–2.16(m,1H),1.09(d,J＝6.6Hz,6H)；13C NMR:δ151.5,150.1,148.7,145.1,143.0,137.7,133.2,128.6,126.8,123.1,121.4,119.9,118.9,111.3,108.7,80.4,57.1,56.2,55.9,55.7,28.6,26.0,19.1(2)；HRMS:C24H28NO4Br[M–Br]+:计算值:394.2013,实测值:394.2013.
制备实施例9：2,3,10-三甲氧基-9-正庚氧基原巴马汀溴化物(2y)的制备。
所使用的卤代烃为1-溴正庚烷，加入后的反应时间为5h。
收率为35％；深红色固体；熔点为139–141℃。
1H NMR:δ9.71(s,1H),9.00(s,1H),8.18(d,J＝9.0Hz,1H),8.00(d,J＝9.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.07(s,1H),4.94(t,J＝6.6Hz,2H),4.26(t,J＝6.6Hz,2H),4.03(s,3H),3.91(s,3H),3.85(s,3H),3.20(t,J＝6.6Hz,2H),1.85(q,J＝7.2Hz,2H),1.52–1.10(m,8H),0.86(t,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR:δ151.5,150.3,148.7,145.3,142.8,137.7,133.1,128.6,126.7,123.2,121.6,119.9,118.9,111.3,108.7,74.2,57.0,56.2,55.9,55.5,31.3,29.5,28.5,26.0,25.2,22.1,14.0；HRMS:C27H34NO4Br[M-Br]+:计算值:436.2482,实测值:436.2482.
制备实施例10：2,3,10-三甲氧基-9-邻-甲基苯甲酰基原巴马汀氯化物(3b)的制 备和表征。
将化合物1(0.40mmol)和Et3N(1.80mmol)溶于无水CH3CN(6mL)中，然后加入邻-甲基苯甲酰氯(1.2mmol)进行酯化，在65℃下反应3h，将混合物冷却、过滤并通过快速色谱纯化得到产物3b。
收率为35％；粉红色固体；熔点为192–194℃。
1H NMR:δ9.99(s,1H),9.22(s,1H),8.41–8.28(m,3H),7.77(s,1H),7.68(td,J＝7.2,1.2Hz,1H),7.55–7.47(m,2H),7.10(s,1H),4.95(t,J＝6.6Hz,2H),4.05(s,3H),3.96(s,3H),3.88(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H),2.66(s,3H)；13C NMR:δ163.8,151.7,150.2,148.8,144.5,141.0,138.3,133.7,133.6,133.1,132.0,131.6,128.8,127.2,126.7,126.3,125.9,121.2,120.3,118.8,111.3,108.9,57.3,56.2,55.9,55.4,25.8,21.3；HRMS:C28H26NO5Cl[M–Cl]+:计算值:456.1806,实测值:456.1808.
制备实施例11：2,3,10-三甲氧基-9-苯基磺酰基原巴马汀苯磺酸盐(4a)的制备和 表征。
向化合物1(0.40mmol)和Et3N(1.80mmol)在无水CH3CN(6mL)中的搅拌溶液中加入磺酰氯(1.2mmol)进行酯化，在65℃下反应6h，将混合物冷却、过滤并通过快速色谱纯化得到产物4a。
收率为37％；橙色固体；熔点为158–160℃。
1H NMR:δ9.53(s,1H),9.16(s,1H),8.33–8.26(m,1H),8.22(d,J＝9.0Hz,1H),8.01–7.96(m,2H),7.95–7.88(m,1H),7.78–7.72(m,3H),7.63–7.57(m,2H),7.37–7.25(m,3H),7.13(s,1H),4.93(t,J＝6.6Hz,2H),3.95(s,3H),3.89(s,3H),3.72(s,3H),3.24(t,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR:δ152.4,152.1,149.3,149.0,144.4,139.3,136.1,135.1,134.0,131.4,130.2,129.4,129.1(2),128.9,128.8(2),128.0(2),126.6,125.9(2),122.1,121.1,119.1,111.8,109.4,57.4,56.7,56.4(2),26.3；HRMS:C32H29NO8S2[M–C6H5O2S]+:计算值:478.1319,实测值:478.1318.
制备实施例12：2,3,10-三甲氧基-9-对-氯苄基氨基原巴马汀氯化物(5e)的制备 及表征。
将巴马汀(1.0mmol)加入苄胺(15.0mmol)中，然后在100℃下加热8h。将混合物冷却并用乙酸乙酯(15mL)洗涤，使用快速柱色谱法纯化残余物以获得产物5e。
收率为41％；红色固体；熔点为252–254℃。
1H NMR:δ10.47(s,1H),8.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.66(s,1H),7.55–7.37(m,4H),7.37–7.27(m,2H),7.07(d,J＝7.2Hz,1H),4.82(t,J＝6.0Hz,2H),4.75(d,J＝6.6Hz,2H),3.92(s,3H),3.86(s,3H),3.83(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H)；13CNMR:δ151.2,148.7,146.6,146.2,139.7,136.0,135.8,133.2,131.2,129.3(2),128.2,128.1(2),125.0,119.4,119.0,117.4,116.6,111.3,108.5,56.7,56.1,55.8,55.0,49.0,26.3；HRMS:C27H26N2O3Cl2[M-Cl]+:计算值:461.1627,实测值:461.1629.
制备实施例13-17：化合物8e-g和8i-j的制备及表征如下：
将巴马汀(1.0mmol)与2,4-二甲氧基苄胺(10mmol)在105℃下反应7h，得到化合物6。然后，化合物6在HCl/CH3OH(体积比为1:1)溶液中搅拌24h获得具有9-NH2的化合物7。接下来，将化合物7(0.27mmol)和吡啶(1.22mmol)溶在无水CH3CN(6mL)中。相应的酰氯(0.81mmol)加入到上述反应体系中，在71℃下加热3-24h，然后冷却并过滤。所得残余物用CH2Cl2和80％EtOH洗涤以得到产物8e-g或8i-j，收率为31-59％。
制备实施例13：2,3,10-三甲氧基-9-环戊基甲酰氨基原巴马汀氯化物(8e)的制 备。
所使用的酰氯为环戊基甲酰氯，加入后的反应时间为3h。
收率为31％；黄色固体；熔点为250–252℃。
1H NMR:δ9.99(s,1H),9.52(s,1H),9.11(s,1H),8.29–8.11(m,2H),7.74(s,1H),7.11(s,1H),4.97(t,J＝6.6Hz,2H),4.03(s,3H),3.95(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H),3.10(t,J＝8.4Hz,1H),1.97(p,J＝7.2Hz,2H),1.90–1.80(m,2H),1.76–1.63(m,2H),1.64–1.52(m,2H)；13CNMR:δ175.7,154.2,151.5,148.7,146.1,137.5,133.3,128.6,127.1,125.3,123.9,122.1,120.4,118.9,111.3,108.8,57.0,56.2,55.9,55.6,44.4,30.0(2),26.0,25.7(2)；HRMS:C26H29N2O4Cl[M-Cl]+:计算值:433.2122,实测值:433.2125.
制备实施例14：2,3,10-三甲氧基-9-环己基甲酰氨基原巴马汀氯化物(8f)的制 备。
所使用的酰氯为环己基甲酰氯，加入后的反应时间为6h。
收率为39％；黄色固体；熔点为201–203℃。
1H NMR:δ9.95(s,1H),9.49(s,1H),9.11(s,1H),8.26–8.14(m,2H),7.74(s,1H),7.11(s,1H),4.97(t,J＝6.6Hz,2H),4.01(s,3H),3.95(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H),2.62(tq,J＝12.0,3.6Hz,1H),2.08–1.99(m,2H),1.81(dt,J＝12.6,3.6Hz,2H),1.69(dt,J＝12.6,3.6Hz,1H),1.48(qd,J＝12.6,3.6Hz,2H),1.34(qt,J＝12.6,3.6Hz,2H),1.24(tt,J＝12.6,3.6Hz,1H)；13C NMR:δ176.0,154.6,151.9,149.2,146.4,138.0,133.7,129.0,127.5,125.7,124.3,122.4,120.9,119.3,111.7,109.3,57.4,56.6,56.3,56.1,44.4,29.6(2),26.4,26.0,25.7(2)；HRMS:C27H31N2O4Cl[M-Cl]+:计算值:477.2278,实测值:477.2276.
制备实施例15：2,3,10-三甲氧基-9-环金刚烷基甲酰氨基原巴马汀氯化物(8g)的 制备。
所使用的酰氯为1-金刚烷甲酰氯，加入后的反应时间为24h。
收率为23％；绿色固体；熔点为199–201℃。
1H NMR:δ9.38(s,1H),9.28(s,1H),9.12(s,1H),8.23(q,J＝9.0Hz,2H),7.75(s,1H),7.12(s,1H),5.01(t,J＝6.6Hz,2H),4.01(s,3H),3.95(s,3H),3.87(s,3H),3.24(t,J＝6.6Hz,2H),2.08(s,9H),1.76(t,J＝3.0Hz,6H)；13C NMR:δ177.5,154.6,151.5,148.7,145.5,137.6,133.3,128.7,127.3,125.4,124.4,122.4,120.5,118.9,111.3,108.8,57.0,56.2,55.9,55.8,40.9,38.5(3),36.2(3),27.7(3),26.0；HRMS:C31H35N2O4Cl[M-Cl]+:计算值:499.2591,实测值:499.2592.
制备实施例16：2,3,10-三甲氧基-9-正丁酰氨基原巴马汀氯化物(8i)的制备。
所使用的酰氯为正丁酰氯，加入后的反应时间为6h。
收率为29％；棕色固体；熔点为230–232℃。
1H NMR:δ9.45(s,1H),8.81(s,1H),8.25(d,J＝9.0Hz,1H),8.07(d,J＝9.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.00(s,1H),4.95(t,J＝6.6Hz,2H),4.11(s,3H),4.05(s,3H),3.99(s,3H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),1.86(h,J＝7.2Hz,2H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR:δ176.1,155.6,153.3,148.1,146.7,142.4134.9,129.3,128.8,128.6,125.6,122.1,121.6,119.8,111.8,109.4,57.4,57.3,57.0,56.7,38.8,27.6,19.9,14.1；HRMS:C24H27N2O4Cl[M-Cl]+:计算值:407.1965,实测值:409.1971.
制备实施例17：2,3,10-三甲氧基-9-正戊酰氨基原巴马汀氯化物(8j)的制备。
所使用的酰氯为正戊酰氯，加入后的反应时间为5h。
收率为33％；棕色固体；熔点为146–148℃。
1H NMR:δ10.10(s,1H),9.64(s,1H),9.15(d,J＝6.0Hz,1H),8.23(q,J＝9.0Hz,2H),7.75(s,1H),7.10(s,1H),4.97(d,J＝6.6Hz,2H),4.02(s,3H),3.95(s,3H),3.87(s,3H),3.23(t,J＝6.6Hz,2H),2.55(s,2H),1.65(t,J＝7.8Hz,2H),1.41(q,J＝7.8Hz,2H),0.94(d,J＝7.8Hz,3H)；13C NMR:δ172.6,154.2,151.5,148.7,146.2,145.4,137.5,133.3,128.6,125.3,123.8,121.9,120.4,118.9,111.3,108.8,56.9,56.2,55.9,55.5,35.2,27.1,26.0,21.9,13.9；HRMS:C25H29N2O4Cl[M-Cl]+:计算值:421.2122,实测值:421.2127.
制备实施例18-24：化合物11b-f和11h-i的制备及表征如下：
将巴马汀(10mmol)和K2CO3(40mmol)溶于甲醇(60mL)中，然后滴加含有NaBH4(11mmol)的5％NaOH(5mL)溶液。3h后，将析出的产物过滤，然后用水和20％乙醇洗涤，得到中间体9，为深黄色固体，收率为81％。将化合物9(1.0mmol)和K2CO3(2.0mmol)溶于无水CH3CN(20mL)中，加入各种取代的溴代烃(4.0mmol)。回流3-24h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5-1h。然后将混合物过滤并用快速柱色谱纯化以获得11b-f和11h-i。
制备实施例18：2,3,10-三甲氧基-13-对-甲基苄基原巴马汀溴化物(11b)的制备。
所用的溴代烃为对-甲基苄溴，回流6h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为27％；暗黄色固体；熔点为103–105℃。
1H NMR:δ10.04(s,1H),8.10(d,J＝9.6Hz,1H),7.76(d,J＝9.6Hz,1H),7.23–7.16(m,3H),7.15–7.07(m,2H),7.04(s,1H),4.91(s,2H),4.71(s,2H),4.13(s,3H),4.03(s,3H),3.85(s,3H),3.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.07(s,3H),2.28(s,3H)；13C NMR:δ150.7,150.1,147.2,145.3,144.2,139.9,137.4,135.9,135.9,133.1,133.0,131.6,129.6,129.5(2),128.0,126.3,121.4,121.2,118.8,111.9,111.2；HRMS:C29H30NO4Br[M-Br]+:计算值:456.2169,实测值:456.2175.
制备实施例19：2,3,10-三甲氧基-13-3',5'-二甲基苄基原巴马汀溴化物(11c)的 制备。
所用的溴代烃为3',5'-二甲基苄溴，回流5h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为23％；褐色固体；熔点为109–111℃。
1H NMR:δ10.04(s,1H),8.12(d,J＝9.6Hz,1H),7.79(dd,J＝9.6,0.6Hz,1H),7.18(s,1H),7.08(s,1H),6.92(s,1H),6.85(s,2H),4.92(s,2H),4.67(s,2H),4.14(s,3H),4.04(s,3H),3.86(s,3H),3.19(t,J＝5.6Hz,2H),3.08(s,3H),2.21(s,6H)；13C NMR:δ150.6,150.1,147.1,145.3,144.1,138.9,138.1(2),137.5,133.2,131.6,129.4,128.0,126.3,125.7(2),121.4,121.1,118.8,111.9,111.2,62.0,57.1,56.9,55.8,54.2,35.8,26.7,20.9(2)；HRMS:C30H32NO4Br[M-Br]+:计算值:470.2326,实测值:470.2330.
制备实施例20：2,3,10-三甲氧基-13-(2'-甲氧基羰基乙烯基-1')-原巴马汀溴化 物(11d)的制备。
所用的溴代烃为2'-甲氧基羰基乙烯基-1'溴，回流6h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为29％；黄色固体；熔点为130–132℃。
1H NMR:δ10.07(s,1H),8.11(d,J＝9.0Hz,1H),7.78(dd,J＝9.6,0.6Hz,1H),7.76–7.73(m,2H),7.66(d,J＝16.2Hz,1H),7.35–7.24(m,2H),7.19(s,1H),6.96(s,1H),6.65(d,J＝16.2Hz,1H),5.03–4.66(m,4H),4.14(s,3H),4.04(s,3H),3.86(s,3H),3.72(s,3H),3.20(t,J＝6.0Hz,2H),3.08(s,3H)；13C NMR:δ166.6,150.7,150.1,147.2,145.5,144.3,143.9,141.6,137.6,133.0,132.6,131.7,128.88(4),128.8,126.3,121.3,121.2,118.7,117.8,111.9,111.2,62.1,57.0,56.9,55.9,54.4,51.4,35.7,26.7；HRMS:C32H32NO6Br[M-Br]+:计算值:526.2224,实测值:526.2222.
制备实施例21：2,3,10-三甲氧基-13-邻-氰基苄基原巴马汀溴化物(11e)的制备。
所用的溴代烃为邻-氰基苄溴，回流6h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为36％；棕色固体；熔点为206–208℃。
1H NMR:δ10.09(s,1H),8.10(d,J＝9.0Hz,1H),8.04(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.84(d,J＝9.0Hz,1H),7.63(td,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),7.21(s,1H),7.04(d,J＝7.8Hz,1H),6.76(s,1H),4.90(s,4H),4.14(s,3H),4.05(s,3H),3.87(s,3H),3.19(t,J＝6.0Hz,2H),3.11(s,3H)；13C NMR:δ150.9,150.3,147.2,145.8,144.3,142.2,137.9,134.0,133.7,132.9,132.2,128.9,127.9,127.5,126.4,121.3,121.2,118.6,117.4,111.8,111.4(2),62.1,57.0,57.0,55.9,54.4,35.1,26.7；HRMS:C29H27N2O4Br[M-Br]+:计算值:467.1965,实测值:467.1965.
制备实施例22：2,3,10-三甲氧基-对-硝基苄基原巴马汀溴化物(11f)的制备。
所用的溴代烃为对-硝基苄溴，回流8h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为25％；棕色固体；熔点为153–155℃。
1H NMR:δ10.09(s,1H),8.24(dd,J＝7.2,1.2Hz,2H),8.10(d,J＝9.6Hz,1H),7.76(dd,J＝9.6,0.6Hz,1H),7.52(dd,J＝8.4,1.2Hz,2H),7.20(s,1H),6.83(s,1H),4.95(s,2H),4.92(s,2H),4.14(s,3H),4.04(s,3H),3.86(s,3H),3.20(t,J＝6.0Hz,2H),3.12(s,3H)；13C NMR:δ150.7,150.2,147.2,147.1,146.4,145.8,144.4,137.7,132.8,131.9,129.5(2),128.2,126.4,123.9(2),121.2(2),118.6,111.8,111.3,62.1,57.1,57.0,55.9,54.6,35.7,26.7；HRMS:C28H27N2O6Br[M-Br]+:计算值:487.1864,实测值:487.1867.
制备实施例23：2,3,10-三甲氧基-13-(丁-2-烯-1-基)原巴马汀溴化物(11h)的制 备。
所用的溴代烃为丁-2-烯-1-基溴，回流5h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为31％；暗黄色固体；熔点为161–163℃。
1H NMR:δ9.96(s,1H),8.20(d,J＝9.6Hz,1H),8.02(d,J＝9.6Hz,1H),7.52(s,1H),7.19(s,1H),6.20–6.10(m,1H),5.37–5.27(m,1H),4.88(s,2H),4.13(s,3H),4.09(s,3H),3.99(s,2H),3.90(s,3H),3.77(s,3H),3.17(t,J＝6.6Hz,2H),1.71(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR:δ150.6,150.0,147.3,144.9,144.0,136.8,132.9,131.5,130.2,129.1,128.5,126.1,121.7,121.0,118.8,112.1,111.1,62.0,57.1,57.0,55.9,55.7,33.0,26.6,17.7；HRMS:C25H28NO4Br[M-Br]+:计算值:406.2013,实测值:406.1997.
制备实施例24：2,3,10-三甲氧基-13-(环庚-2-烯-1-基)原巴马汀溴化物溴化物 (11i)的制备。
所用的溴代烃为环庚-2-烯-1-基溴，回流8h后，加入NBS(1.0mmol)并继续回流0.5h。
收率为28％；暗黄色固体；熔点为107–109℃。
1H NMR:δ9.92(s,1H),8.41(d,J＝9.6Hz,1H),8.18(d,J＝9.6Hz,1H),7.21(s,1H),7.17(s,1H),5.97(s,2H),4.82(s,2H),4.62–4.46(m,1H),4.10(s,3H),4.07(s,3H),3.90(s,3H),3.82(s,3H),3.20–3.10(m,2H),2.41–1.92(m,5H),1.75–1.61(m,1H)；13C NMR:δ150.8,149.8,147.2,144.7,144.3,137.2,135.9,132.3,132.1,129.9,128.1,125.2,122.2,121.7,118.9,112.9,111.2,62.0,57.1,56.9,55.9,55.7,39.2,29.6,26.8,24.222.5；HRMS:C27H30NO4Br[M-Br]+:计算值:432.2169,实测值:432.2174.
II.生物学评价
兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗Akt、兔抗β-肌动蛋白(ACTB)单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗兔二抗购自Cell SignalingTechnology,Inc.(Danvers，MA，USA)。小鼠P-选择素(CD62P)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自Abcam(Cambridge，MA，USA)。
雄性C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，体重约18-20g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。小鼠用常规啮齿动物饮食喂养，并饲养在具有恒定湿度和昼夜循环的空调房中。动物实验经医药生物技术研究所伦理委员会审查批准；所有动物操作均符合中国医学科学院(CAMS)和北京协和医学院(PUMC)的指导方针。
对于体外实验，所得结果是3次重复实验的平均值±SD。对于离体和体内实验，所得结果是每组5或8只小鼠的平均值±SD。施用GraphPad Prism 6软件(GraphPadSoftware,Inc,La Jolla,CA,USA)进行统计分析。数据通过单向方差分析和Newman-Keuls检验进行多重比较分析，p<0.05被认为具有统计学意义。
实施例1-体外抗血小板聚集活性
1.1各化合物的最大聚集率(MAR)测定
C57BL/6J小鼠取血，并用3.8％柠檬酸钠抗凝。通过离心制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，用PPP调节PRP浓度。将所得PRP在37℃下用赋形剂(0.1％DMSO)、各研究化合物(10μM)、BBR(小檗碱，10μM)和Asp(阿司匹林，100μM)预处理10min。经10μMADP刺激血小板，并在血小板聚集分析仪(北京赛科希德科技股份有限公司，北京，中国)上测量各处理组的最大血小板聚集率。所得MAR如下表2所示。其中BBR和Asp为阳性药物。
表2：
Figure BDA0003352061220000201
Figure BDA0003352061220000211
由表2的结果可以看出，PMT本身无抗血小板聚集的能力。在PMT的9位的羟基上引入适当的苄基取代后，其抗血小板聚集的能力明显提高，如m-CH3O(化合物2e)、o-CN(化合物2j)、m-NO2(化合物2n)的MAR均小于35％。尤其化合物2j的MAR为30.5％。相比之下，引入p-CN取代的苄基的化合物2l没有活性。另外，在PMT的9位的羟基上引入不同的饱和脂肪环环取代(化合物(2p-t)也可提高化合物抗血小板聚集的能力。其中，在PMT的9-O处引入环丙基甲基的化合物2p表现出最有效的抑制活性，其MAR为30.4％。在PMT的9位的羟基上引入各种链状烷基或烯丙基，活性最好的化合物2v(正丙基)的MAR值(26.9％)与阳性药Asp(26.4％)相当，优于BBR(27.5％)。其他衍生物2w-z也具有较好的活性。相比之下，酯基衍生物3a-d和磺酸酯衍生物4a和4b的抗血小板聚集能力较PMT没有明显改善。
与此同时，在PMT的9位引入胺(氨)基取代，所得大多数化合物(5a-h、6)显示出适度的抗血小板聚集活性。其中，对氯苄胺化合物5e显示出较好的活性，其MAR为31.6％。另外，在PMT的9位引入不同取代的酰胺基团(化合物，所得化合物(8a-j)的活性均不理想。在PMT的13位引入不同取代基，所得衍生物(11a-h)的活性也没有明显改善。
其中，化合物2j、2p、2v和5e显示出较为有效的抗血小板聚集活性，值得进一步研究。
1.2化合物2j、2p、2v和5e抗血小板聚集活性的浓度依赖性
同2.1中所述操作，分离得到的PRP用赋形剂(0.1％DMSO)，以及2.5μM、5μM和10μM的不同浓度的化合物2j、2p、2v或5e进行处理。分别在37℃下孵育10min后，加入10μM ADP进行诱导。如图2所示，这些化合物均以浓度依赖性方式抑制ADP诱导的血小板聚集，其中化合物2p在所有的浓度下均能显著抑制血小板聚集(p<0.05)，化合物2v在2.5μM和5μM的浓度下显著抑制血小板聚集(p<0.05)，在10μM的浓度下非常显著的抑制血小板聚集(p<0.01)。
以血小板抑制率为表征，当化合物2j、2p、2v和5e的浓度达到10μM时，它们的血小板抑制率分别约为25.6％、24.2％、37.8％和20.7％，化合物2v显示出最强的抗血小板聚集的活性，与1.1的筛选结果一致。血小板抑制率＝[(MARADP-MAR测试化合物)/MARADP]*100％。
实施例2-细胞毒性
通过MTT法分别测定了化合物2j、2p、2v和5e对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性，结果如图1所示。由图1可以看出，它们的CC50值均超过100μM，表明此类化合物均具有较好的安全性。
实施例3-对Akt磷酸化的体外抑制作用
洗涤血小板(WP)的制备：
同2.1中所述的操作，将分离得到的PRP用1μM前列地尔(PGE1)处理并在1200g下离心8min以获得WP沉淀。沉淀用Tyrode缓冲液(含HEPES)重悬，通过血细胞计数器测定血小板浓度并进行适当调整。
蛋白质提取和蛋白质印迹：
血小板处理完成后，离心获得WP沉淀，并提取总蛋白。蛋白定量并进行10％SDS-PAGE电泳用特定的一抗和相应的二抗检测靶蛋白,并对蛋白条带进行扫描和量化。
本实施例验证了化合物2j、2p、2v或5e对ADP刺激的血小板中Akt磷酸化的体外抑制作用。
用不同浓度的赋形剂(0.1％DMSO)，Asp(100μM)，BBR(10μM)以及化合物2j、2p、2v和5e(均为10μM)分别对如上所述制备的WP进行预处理，然后用ADP刺激WP并裂解用于蛋白质提取和蛋白质印迹，以检测p-Akt(Ser473)、Akt和ACTB的蛋白水平(图3A)。归一化后，将p-Akt(Ser473)的蛋白质水平标准化为Akt的蛋白质水平，并绘制为单独赋形剂(指定为1)的倍数(图3B)。如图3A和3B所示，化合物2j、2p和5e对p-Akt(Ser473)水平的降低程度与阳性对照药Asp和BBR相当，化合物2v的活性优于BBR。图3B中***p<0.001与单独的赋形剂对比，##p<0.01与赋形剂+ADP对比。
接下来，对活性最好的化合物2v开展了体外ADP刺激的血小板中Akt磷酸化的剂量依赖性抑制试验，结果如图3C和3D所示，化合物2v以浓度依赖性方式抑制Akt磷酸化，并且在化合物2v的浓度低至0.5μM的情况下，p-Akt(Ser473)水平仍然显著降低。
实施例4-化合物2v的急性毒性试验
对化合物2v开展了急性毒性试验。C57BL/6J小鼠，雌雄各半，单次口服给药剂量分别为250,500,750,1000mg/kg。给药后密切观察7天，试验小鼠均存活。结果表明，化合物2v具有很好的体内安全性，致死剂量(LD50)值超过1000mg/kg。
实施例5-化合物2v对离体血小板聚集和Akt磷酸化的抑制作用
将C57BL/6J小鼠随机分为5组，分别进行如下处理：(1)赋形剂组，小鼠口服生理盐水(NS，0.1ml/10g)，血小板用0.1％DMSO孵育；(2)赋形剂+ADP组，小鼠口服NS，用ADP(10μM)刺激血小板；(3)Asp+ADP组，小鼠口服Asp(20mg/kg)，用ADP(10μM)刺激血小板；(4)BBR+ADP组，小鼠口服BBR(100mg/kg)，用ADP(10μM)刺激血小板；(5)2v+ADP组，小鼠口服化合物2v(100mg/kg)，用ADP(10μM)刺激血小板。每组5只小鼠，持续给药14天。实验后取血制备PRP，，将一部分PRP用于ADP诱导的血小板聚集测试，其余PRP用于制备WP，在ADP诱导用westernblot检测p-Akt(Ser473)、Akt和ACTB(C)的水平。
图4和5分别示出了Asp、BBR和化合物2v对血小板聚集和Akt磷酸化的抑制作用。由图4和5可以看出，ADP诱导强烈的血小板聚集(图4)和Akt磷酸化(图5)，而口服化合物2v后显著抑制了ADP诱导的血小板聚集和Akt磷酸化。口服治疗2周后，100mg/kg化合物2v抑制对ADP诱导的血小板聚集的效果与Asp和BBR相当(图4)，。类似的，2v对p-Akt水平的降低程度也与Asp和BBR相当(图5)。图5中，归一化后，将p-Akt(Ser473)的蛋白质水平标准化为Akt的蛋白质水平，并绘制为赋形剂组(指定为1)的倍数，其中***p<0.001与赋形剂组对比；##p<0.01，###p<0.001与赋形剂+ADP组对比。
这些结果与体外实验一致，验证了化合物2v对小鼠口服给药时的抗血小板聚集活性。
实施例6-化合物2v对角叉菜胶诱发的小鼠血栓形成的抑制作用
将40只BALB/c小鼠随机分为以下5组：(1)生理盐水(0.1ml/10g)对照组，(2)生理盐水(0.1ml/10g)+角叉菜胶组，(3)Asp(20mg/kg)+角叉菜胶组，(4)BBR(100mg/kg)+角叉菜胶组，以及(5)化合物2v(100mg/kg)+角叉菜胶组，持续灌胃14天。
于第12天，对照组小鼠腹腔注射生理盐水(50μl/10g)，其余组均注射0.5％角叉菜胶溶液(50mg/kg)于第14天，2％异氟烷麻醉小鼠。具体实验流程如图6所示。对小鼠尾部进行拍照，如图7A所示，其中尾部深色部分为血栓，所示线段表示血栓长度，用钢尺测量血栓长度和小鼠尾部全长。图7B示出了计算所得的血栓形成率并表示为血栓长度占整个尾长的百分比。
图7的结果表明腹腔内注射角叉菜胶在小鼠尾部形成了明显的血栓，如尾部深色部分所示(图7A)，平均占整个尾长的80％以上(图7B)，而化合物2v显著抑制了小鼠尾部的血栓形成，降低了血栓形成率，平均约为角叉菜胶模型组组的一半，血栓抑制效果与Asp和BBR相当，图7B中***p<0.001与赋形剂组对比，##p<0.01与赋形剂+角叉菜胶组对比。
拍照和测量后，取血分离血清并测定小鼠血清P-选择素水平。取小鼠尾巴和肺固定于4％多聚甲醛中。在距尾尖2cm、4cm和6cm处制备石蜡切片，行苏木精和伊红(H&E)染色，计算尾部血栓面积，结果以百分比表示，结果分别如图8和图9所示。
图8A示出了小鼠尾部切片的H&E染色的典型图像(×400，比例尺＝50μm)。如图8所示，模型组鼠尾血管腔在2cm处几乎完全被血栓占据(图8A)，血栓面积的平均百分比约90％(图8B)。4cm和6cm处，血栓面积的平均百分比仍然超过60％和40％。结果表明，化合物2v有效地减少了不同位置切片的血栓面积，在6cm处的效果尤其明显，效果与Asp和BBR相当。
除了尾部，还在肺中测定了血栓形成。图9A示出了小鼠肺切片的H&E染色的典型图像(×400，比例尺＝50μm)，其中外部方块表示肺血管，内部方块表示血栓。图9B示出了小鼠的血清P-选择素水平，模型组小鼠的P-选择素血清水平较对照组显著升高；口服化合物2v14天后，血清P-选择素水平降低，表明化合物2v可以抑制血栓形成，抑制程度与Asp和BBR相当。***p<0.001与赋形剂组对比，##p<0.01与赋形剂+角叉菜胶组对比。
本实施例结果证明，化合物2v的抗血小板聚集活性能够在体内显示出抗血栓形成活性。化合物2v还可以显著降低了血清P-选择素水平，这进一步支持了其抗血栓形成活性。值得一提的是，在所有的试验中，化合物2v均显示出优于BBR的活性。
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。

Claims (10)

1.一种化合物，其具有通式(1)的结构：
Figure FDA0004126326600000011
其中：
R1为卤素；
R2为氢；
R3为-OR4或-NHR6；
其中：
R4为邻位氰基取代的苄基、环丙基C1-C6烷基或-(CH2)2CH3；
R6为对位氯取代的苄基。
2.根据权利要求1的化合物，其中：
R1为-Cl或-Br；
R4为o-CNC6H4CH2、环丙基甲基或-(CH2)2CH3；
R6为p-ClC6H4CH2。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中所述化合物具有以下结构式：
Figure FDA0004126326600000012
4.一种制备根据权利要求1-3中任一项所述的化合物的方法，其采用以下路线之一制备：
路线I，其包括以下步骤：
(1)将巴马汀在195-210℃，30-40mmHg的条件下反应10min-1h，生成中间体化合物1，
(2)将化合物1、K2CO3和NaI溶于溶剂中，将反应体系加热至65-75℃，然后将相应的苄基卤或卤代烃加入到反应体系中，反应2-24h，得到目标化合物；或将化合物1和Et3N溶于溶剂中，然后加入酰氯和磺酰氯，或加入磺酰氯进行酯化，在60-70℃下反应3-8h，得到目标化合物；
路线II：将巴马汀与仲胺在95–120℃下反应4–72h，得到目标化合物。
5.根据权利要求4的方法，其中步骤(1)中反应进行30min。
6.根据权利要求4的方法，其中步骤(2)中将化合物1、K2CO3和NaI溶于溶剂中，将反应体系加热至71℃。
7.根据权利要求4的方法，其中步骤(2)中酯化反应在65℃下进行。
8.根据权利要求4的方法，其中：
在路线I中，所述苄基卤为3',5'-二甲氧基苄基溴、间-氟苄基溴、间-溴苄基溴、对-三氟甲基苄溴、邻-氰基苄溴或间-氰基苄溴，所述卤代烃为溴甲基环丙烷、1-溴异丁烷或1-溴正庚烷；所述酰氯为邻-甲基苯甲酰氯、环戊基甲酰氯、环己基甲酰氯、1-金刚烷甲酰氯、正丁酰氯或正戊酰氯；
在路线II中，所述仲胺为苄胺。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备用于抑制血小板聚集的药物中的用途。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备用于抗血栓的药物中的用途。
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