CN114146091A - 瑞德西韦在制备预防和治疗再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了瑞德西韦(Remdesivir)在预防和治疗再灌注损伤尤其是心脏再灌注损伤药物中的应用。本发明证实了瑞德西韦作为心脏缺血再灌注损伤预防和治疗药物的重大潜力，首次公开了瑞德西韦对心脏缺血再灌注的良好保护疗效，为再灌注损伤临床预防和治疗提供了有效的新型潜在备选药物，扩展了瑞德西韦的适应证，极大的提高了瑞德西韦的应用潜力及市场前景。

Description

瑞德西韦在制备预防和治疗再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及瑞德西韦在制备预防和治疗再灌注损伤尤其是心脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

Remdesivir(RDV，GS-5734)是吉利德科学公司(GILD)开发的一款通过抑制病毒核酸合成起作用的核苷类似物抗病毒药。

专利WO2009132123A1中首次提出瑞德西韦(Remdesivir)化合物结构的通式，用于治疗丙型肝炎病毒感染、登革热等黄病毒科病毒感染疾病。专利WO2012012776A1提出瑞德西韦治疗副黏病毒科病毒感染的疾病的作用。在后续专利中还提出RDV可作为抗丝状病毒、抗沙粒病毒及抗冠状病毒药物。根据文献信息，瑞德西韦预防和治疗再灌注损伤作用目前未有国内外文献公开。

缺血再灌注损伤指局部组织因血液循环发生障碍导致缺血、缺氧以及在后续血液恢复循环过程中组织发生损伤甚至坏死的现象。再灌注损伤几乎可在任何一种组织器官中发生。常见可能发生缺血再灌注的情况可包括：组织器官缺血后恢复血液供应如休克时微循环的疏通、冠状动脉痉挛的缓解、心脏骤停后心脑肺复苏、动脉搭桥术、PTCA、溶栓疗法等血管再通术后，心脏外科体外循环术、器官移植及断肢再植等。

心脏缺血后再灌注损伤常指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，在一定时间又重新获得再通时，缺血心脏虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。临床上，使用溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗是减少心脏梗塞面积和改善临床结果的最有效策略。但在此过程中，恢复缺血心脏的血流，称为再灌注，也可以诱发损伤。有研究表明，在急性心脏梗塞动物模型中，心脏缺血再灌注损伤占心脏梗塞最终大小的50％。因此，控制心脏缺血再灌注损伤，对减少最终梗塞面积的治疗至关重要。

发明内容

本发明目的在于提供瑞德西韦药物一类新的适应症。瑞德西韦作为预防和治疗心脏缺血再灌注损伤的药物能有效提高心脏功能、维持心脏正常结构，为缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了一种新的备选药物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了瑞德西韦在制备预防和治疗缺血再灌注损伤药物中的应用，所述瑞德西韦对心脏缺血再灌注损伤起到预防和治疗的作用。

本发明中预防和治疗除针对心脏缺血再灌注损伤外，还包括其他缺血再灌注损伤。因此，除对心脏缺血再灌注损伤的预防及治疗作用外，瑞德西韦对其他组织器官缺血再灌注损伤的预防及治疗应用也在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述药物包含瑞德西韦，所述瑞德西韦以游离形式或药学上可接受的化合物的形式存在。

在本发明的上述应用中，所述药物含有有效剂量的瑞德西韦。有效剂量为单位给药剂量形式(如一片、一针、一丸或一剂的药物中的含量)或治疗的患者的单位剂量(如单位体重剂量)。在本发明中，药物治疗对象范围为哺乳动物类，包括人、犬科、啮齿类动物等。不同动物有效剂量换算可根据本领域实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算。中国临床药理学与治疗学，2004Sep；9(9)：1069-1072”)，即可从实验动物的剂量推导出人的单位体重剂量。例如，对于常用的实验动物小鼠而言，根据上述文献，其与成人的换算关系约为12:1。

在本发明中，8周龄C57BL/6雄性小鼠中，明显治疗心肌缺血再灌注的有效剂量(以含量计)为2.5～40mg/kg，优选为20mg/kg。

优选的，根据小鼠与成人有效剂量换算关系，将成人体重标准设置为60kg，则成人有效剂量为每天12.5～200mg，优选为100mg。

优选的，所述药物还包含其他再灌注损伤后可保护组织的其他药物。

优选的，所述药物还含有药学上可接受的载体。

本发明所述的载体为药学上可以接受的载体，其指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

优选的，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

上述药物可以按照需要制作成医学上任何可用的剂型，优选的，所述药物的剂型适于口服或注射；优选的，所述剂型包括口服液、注射液、片剂、胶囊等。

有益效果：

本发明证实了瑞德西韦作为预防和治疗心脏缺血再灌注药物的重大潜力，首次公开了瑞德西韦对缺血再灌注心肌细胞的保护作用，为缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了有效的新型潜在备选药物，扩展了瑞德西韦的适应证，极大的提高了瑞德西韦的应用潜力及市场前景。

附图说明

图1小鼠心脏缺血再灌注模型心脏超声图。

图2小鼠心脏缺血再灌注模型心脏MASSOM染色图。

图3经不同浓度瑞德西韦处理后，小鼠心脏超声结果分析。

图4剂量20mg/kg瑞德西韦处理后，小鼠心脏超声图及结果分析。

图5剂量20mg/kg瑞德西韦处理后，小鼠心脏MASSOM染色图，n＝5。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例1心脏缺血再灌注小鼠模型构建

一、实验材料

1.实验动物：C57BL/6小鼠，8周龄雄性，体重20-24g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

2.实验试剂：Masson三色染色试剂盒(购于武汉赛维尔生物科技有限公司)。

二、实验步骤

通过结扎小鼠冠脉左前降支建立心脏缺血再灌注模型。打开小鼠胸腔将心脏挤出，在左心耳下缘2mm左右位置结扎冠脉左前降支，打活结，观察心尖处心脏变白，心电图呈现ST段抬高的变化可确定缺血发生，关胸后45min松开活结，心电图ST段恢复。手术后3天利用超声心动进行心功能检测，之后取材进行Masson三色染色。

三、实验方法

1.小鼠模型构建：选择8周龄左右，体重20-24g的雄性C57BL/6小鼠进行心脏缺血再灌注模型的构建。将小鼠置于预麻仓，使用3％体积比异氟烷(购于瑞沃德)，流量1000ml/min进行诱导麻醉，待小鼠翻正反射消失后取出置于37℃加热的手术台，并用2％异氟烷，流量1000ml/min进行维持麻醉，并连接心电图。将小鼠左胸前至左腋下区域脱毛，在第4-5肋间位置剪开皮肤，形成大约1cm的切口，经第4-5肋间打开胸腔，将心脏挤出，在左心耳下约2mm的位置，使用6-0丝线结扎冠状动脉左前降支，打活结，观察心尖处心脏颜色变白，将心脏放回胸腔内，将活结的线头留在胸腔外，并挤出胸腔内的空气，观察心电图发生ST段抬高样改变，则确认缺血成功。45min之后将活结松开，线留在心脏内不取出，再次观察心电图ST段回落，确认模型建立成功，将小鼠放回饲养笼内，等待苏醒。

2.超声心动检测：将小鼠置于预麻仓，使用3％异氟烷，1000mL/min进行诱导麻醉，待小鼠翻正反射消失后从预麻仓中取出，取仰卧位放置于37℃加热的检查台上，固定四肢，给予1-2％异氟烷，500ml/min维持麻醉，控制小鼠心率在400-500次/分。将小鼠胸骨前1-2cm2范围脱毛。使用小动物高分辨超声仪Vevo2100(Fujiflim Visualsonics，Canada)，以及30MHz线性传感器进行小鼠超声心动检测。探测胸骨旁左心室长轴切面，记录B型超声动态数据，然后将传感器旋转90°探测左心室平乳头肌层面的短轴切面，分别记录B型和M型超声动态数据。

3.组织取样：手术后3天经超声心动检测心功能后，在麻醉下经小鼠眼动脉取血，打开胸腔及腹腔暴露内脏，从小鼠左心室灌流预冷的PBS缓冲液，至肝脏颜色变浅(大约5ml)，剪下心脏，修剪主动脉及结缔组织，称重，在结扎点下方垂直于心脏长轴方向留取心脏中间节段组织进行固定及石蜡包埋，其余部分的组织直接冻存。

4.Masson三色染色：1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，75％酒精5min，自来水洗；2)切片浸入Masson A液中浸泡过夜，自来水洗；3)切片入Masson B液及Masson C液等比混合的染液，浸染1min，自来水洗，1％盐酸酒精分化，自来水洗；4)切片入Masson D液浸染6min，自来水漂洗；5)Masson E液浸染1min；6)不水洗，稍沥干直接入Masson F液染2-30s；7)切片用1％冰醋酸漂洗分化，两缸无水乙醇脱水；8)切片放入第三缸无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶封片；9)显微镜镜检，图像采集分析，Masson三色染色胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。

5.数据处理：对于超声心动数据，分别在左心室长轴B型超声以及短轴M型超声描记连续5个心动周期内左心室内膜的收缩末期及舒张末期图像，计算得到左心室射血分数，以及短轴缩短率；对于Masson三色染色的切片图像，使用分析软件(Image-Pro Plus 6.0版本)进行测量与分析，计算心脏纤维化(蓝色纤维)面积占左心室面积的百分比。

四、实验结果与结论

1.如图1所示，心脏超声结果说明小鼠心脏缺血再灌注模型构建成功，心功能明显下降。与假手术(sham)组相比，心脏缺血再灌注(I/R)组左室收缩功能(LVEF与FS)明显降低，并具有显著的统计学差异。如图2所示，Masson三色染色显示缺血再灌注模型建立后，心脏发生纤维化。图中着蓝色的部分为胶原纤维，与假手术(sham)组相比，心脏缺血再灌注(I/R)组的小鼠发生明显的心脏纤维化。

实施例2瑞德西韦对心脏缺血再灌注的保护作用

一、实验材料

1.瑞德西韦：购买于上海陶素生化科技有限公司，避光、密封、干燥4℃保存。药物先溶解于100％二甲基亚砜(DMSO，购于sigma)，之后用玉米油(corn oil，购于MCE)稀释至10％。

其余同实施例1。

二、实验分组

空白对照组(溶剂组)，瑞德西韦组(20mg/kg，po)，瑞德西韦组(30mg/kg，po)，瑞德西韦组(40mg/kg，po)，瑞德西韦组(50mg/kg，po)，瑞德西韦组(60mg/kg，po)。

三、实验步骤

选择C57BL/6(雄性，8周龄左右20-24g)小鼠，随机分组，每组10只(n＝10)，称重后给药，给药每天1次，连续灌胃给药3天后建立心脏缺血再灌注模型的建立。

手术后继续每天灌胃给药，3天后进行心脏超声检测，然后立即进行取材，心脏固定包埋后进行Masson三色染色。

四、实验方法

同实施例1。

五、实验结果与结论

图3为超声心动检测指标左室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS)分析结果图，表1为详细数据分析结果。根据数据分析结果发现，与溶剂组相比，瑞德西韦剂量在20mg/kg～40mg/kg对左室射血分数提高具有显著效果。

表1

综合分析左室射血分数与短轴缩短率，瑞德西韦剂量在20mg/kg时对心功能重要指标的改善效果最为明显，如图4所示，因此对剂量瑞德西韦20mg/kg组进行MASSON染色，进一步确认瑞德西韦对再灌注损伤的抑制作用。

对小鼠心脏切片进行Masson三色染色如图5所示，结果显示，与对照组小鼠相比，瑞德西韦组的心脏纤维化程度降低，提示瑞德西韦对心脏缺血再灌注造成的心功能降低有明显保护作用，对心脏重塑情况也有一定改善。

瑞德西韦对心脏缺血再灌注后的心脏功能及结构保护作用具体体现为：与对照组相比，瑞德西韦组的心脏功能提高，心脏整体纤维化水平下降。

瑞德西韦在20～40mg/kg/d剂量时具有预防和治疗再灌注损伤的作用，但不排除剂量<20mg/kg/d剂量(如：2.5～20mg/kg)对再灌注损伤的抑制作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.瑞德西韦在制备预防和治疗再灌注损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述再灌注损伤为心脏缺血再灌注损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中瑞德西韦以游离形式或药学上可接受的化合物形式存在。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述瑞德西韦在药物中的有效剂量为：将成人体重标准设置为60kg，则成人有效剂量为每天12.5～200mg。

5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述瑞德西韦在药物中的有效剂量为：将成人体重标准设置为60kg，则成人有效剂量为每天100～200mg。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服或注射给药剂型，所述口服或注射给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、乳剂或混悬剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其他辅料或其他再灌注损伤后保护组织药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体，所述载体包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

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