CN114137194B - 一种基于补血效应的当归质量评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于补血效应的当归质量评价方法，包括：（1）将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度；（2）配制不同浓度的阿魏酸标准品浓度；（3）将K562细胞用专用培养基，传代培养至规定浓度；（4）将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，以各实验组的血红蛋白相对含量为实验检测指标计算待测样品补血效应因子，并以此评价当归质量。本发明可以从当归的补血药效的角度，评价当归的质量，具有与疗效直接挂钩的特点，同时，该方法可以同时测定多份待测样品，具有高通量的特点。

Description

一种基于补血效应的当归质量评价方法
技术领域
本发明属于中药质量和生物效应评价领域，特别提供以补血效应作为评价指标的当归质量评价方法。
背景技术
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，具有补血活血的功效，是补血要药，用于血虚萎黄，眩晕心悸等病症。
目前，当归质量评价的方法主要从外观性状或化学成分方面着手，如薄层色谱法、显微鉴别、高效液相色谱法，近年还创新开发出指纹图谱鉴定等方法，但这些方法与当归的疗效相关性较弱；而关于当归补血生物效应评价方法，尚属空白，这是因为常用的整体动物生物效应检测方法虽然具有模型成熟、指标明确等优势，但是普遍成本较高、操作复杂、稳定性低，作为质量评价方法便捷性、普适性较低；体外细胞生物效应检测方法，可以弥补以上整体动物实验的诸多不足，还可以解决检测样本缺乏等问题，实现多批次同时检测，但此类方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过测定补血效应来评价当归质量的方法。
本发明技术方案如下：
一种基于补血效应的当归质量评价方法，包括如下步骤：
(1)将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度，所述药效成分包括阿魏酸，相邻剂量组浓度比值r相等；
(2)配制三种不同浓度的阿魏酸标准品溶液，相邻剂量组浓度比值＝r；
(3)取K562细胞在专用培养基上传代培养至一定细胞浓度；
(4)将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，基于下式计算待测样品补血效应因子PT，作为当归质量的评价指标；
其中，T1、T2、T3分别为高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量；S1、S2、S3分别为高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量。
作为一种优选的实施方式，1＜r≤2。相邻剂量组浓度比值大于2或差值过大极易引起实验结果大幅跳跃，从而导致补血效应的剂量依赖性不明显或不成立，无法进行后续计算。将相邻剂量组浓度比值限制于1<r≤2，可以有效探究当归待测药物与其血红蛋白相对含量之间的关系，提升数据可靠性。
作为一种优选的实施方式，取K562细胞在专用培养基中传代培养至浓度为0.5～5×106个细胞/mL。一般的体外细胞实验中，接板时的细胞密度对实验成功与否至关重要。细胞密度过高时，在有限体积和有限培养基环境中，会极大程度地限制细胞的生长；且培养后期极有可能因为细胞数量过高、营养不足或代谢物过多，导致细胞破碎、变形等一系列不利影响。细胞密度过低时，由于悬浮细胞特性需要聚集生长，细胞分散于培养基中，无法聚集，最终导致细胞生长缓慢，分化不明显，实验无法进行，0.5～5×106个细胞/mL为可获得有效实验结果的最佳范围。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，高剂量组溶液中阿魏酸含量＜24μg/mL，当归多糖含量＜35μg/mL，藁本内酯含量＜250μg/mL。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(2)中，高剂量组溶液浓度为10～24μg/mL。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(3)中，K562细胞在添加富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素的RPMI 1640培养基中培养。富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素浓度根据其各自的毒性试验结果确定，添加的富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素浓度应尽量避免对细胞的毒性作用。
作为一种优选的实施方式，给药细胞培养4～8天后测定血红蛋白相对含量。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(3)中，所述血红蛋白相对含量指待测组相对于空白组的血红蛋白相对值，其计算方式如下：
血红蛋白相对含量(％)＝[A(实验组)-A(无细胞组)]/[A(空白组)-A(无细胞组)]*100％
其中，A表示联苯胺染色法酶标仪570nm处检测所得OD值，无细胞组仅为培养液，空白组含有细胞和培养液，实验组包括细胞、培养液及待测药物溶液/标准品溶液。
相对值不使用计量单位，使用相对值作为实验检测指标，含义明确、计算简单。
作为一种优选的实施方式，所述当归的干燥提取物的制备方法为：
取待测当归原料，加水后浸泡t1时间；之后武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮t2时间后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程；煎煮共三次，每次t2时间，合并煎液；将上述煎液预冷后，用冻干机冷冻干燥，即得当归的干燥提取物。
作为一种优选的实施方式，所述依据PT评价当归质量的方法为：
当归分为一等、二等、三等、统货四个等级，其中补血效应因子PT≥2.5为一等，2.5＞PT≥2为二等，2＞PT≥1.5为三等，1.5＞PT≥1为统货。
本发明基于实验确定的理论基础，改善当归质量控制以成分或性状为指标的现状，提供一种生物活性层面的当归质量评价方法，可与疗效直接挂钩，此外，该方法可以同时测定多份待测样品，具有高通量的特点，为进一步完善当归质量标准体系提供科学依据。
附图说明
图1是当归成分促进红系分化的流式细胞图。
图2是当归身实施结果图示。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
研究前期使用普通培养基进行实验，将当归待测物作用于K562细胞，培养后按照联苯胺染色法检测血红蛋白，发现其相对含量几乎无变化。经查阅文献，推测当归直接作用于体外培养的K562细胞，不能激活红系分化，需加入含铁试剂为体外造血微环境补充铁元素。因此选用加入富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素的RPMI 1640专用培养基，重复上述实验。结果发现，在专用培养基培养环境中，当归待测物作用于体外培养的K562细胞中，可以诱导分化产生血红蛋白。基于此，实验基于毒性试验探究了含铁试剂的选择及其最佳作用浓度。
当归补血作用主要体现在促进血液中红细胞生成，本发明基于体外诱导多能干细胞定向红系分化，测定当归补血生物效价因子，评价当归质量。前期物质基础研究中，当归待测物作用于K562细胞，培养后选择PI、CD45、CD44等抗体染色细胞，进行流式分析。结果显示，当归体外诱导模型可以分化得到一定数量的红系细胞(图1)。由于流式分析操作复杂，作为当归饮片质量评价的方法难度较大，而红系分化过程所产生的血红蛋白，与红细胞的使用价值近似，其水平可以指征红细胞的升降。因此，本方法选取血红蛋白相对含量作为生物效价方法的指标。
生物效价测定方法中为保证测定结果稳定、可靠，需选择作用稳定的中药单体成分作为标准品。因此前期对当归多种成分进行了考察，将阿魏酸、藁本内酯等8种成分作用于K562细胞，在专用培养基培养环境中，培养后按照联苯胺染色法检测血红蛋白变化。结果发现阿魏酸成分稳定、效应显著，且量效关系与当归具有指数平行关系，最终确定为本方法的标准品。
为了保证量效关系的稳定，避免药物对细胞的毒性作用，还需对给药剂量进行控制。首先，在探究当归补血效应之前，需要先保证药物的安全性，故需探究当归待测物的安全浓度。将当归单体成分或提取物作用于K562细胞，培养24h后用CCK-8法检测细胞存活率，根据显著性分析，当归待测药物对细胞生长无明显抑制作用的浓度为安全浓度。实验结果符合随着药物浓度减小，毒性变弱，细胞存活率逐步上升并逐渐稳定的趋势，所以安全浓度范围控制为最大安全浓度以下即可。如果待测药物中成分不加以控制，含量过高会对细胞产生毒性，导致细胞死亡或生长缓慢，一方面会直接影响细胞分化，另一方面对细胞数量的影响也会导致检测值不准确。综合上述实验结果得到，高剂量组溶液中须控制阿魏酸含量＜24μg/mL，当归多糖含量＜35μg/mL，藁本内酯含量＜250μg/mL。
其次，方法要求待测品和标准品的相邻剂量组浓度比值应满足1<r≤2，且保持一致。如果相邻剂量组浓度比值大于2或差值过大极易引起实验结果大幅跳跃，从而导致补血效应的剂量依赖性不明显或不成立，无法进行后续计算。要求待测品和标准品二者的r值保持一致，是本发明中计算方法的直接需要，也是平行线模型成立的必要条件，简化了不同比值下不平行关系的转化步骤。综上，将相邻剂量组浓度比值限制于1<r≤2，且保持待测品和标准品r值相等，可以有效探究当归待测药物与其血红蛋白相对含量之间的关系，提升数据可靠性。
本申请以上述研究作为理论基础，以含铁试剂为补充、阿魏酸为标准品、血红蛋白为指标，开发了一种用于评价当归质量的生物效价方法。
实施例2
本实施例基于实施例1研究的理论基础，提供一种用于评价当归质量的方法，其包括以下步骤：
步骤1：当归溶液的制备
取适量待测当归，按照一定比例加入水，浸泡30min。武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮3小时后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程。煎煮共三次，每次3h，合并煎液。将上述煎液预冷后，置冻干机冷冻干燥，即得当归的干燥提取物，用高效液相色谱法测定其中阿魏酸、藁本内酯的含量，用苯酚硫酸法测定其中当归多糖的含量。
将当归的干燥提取物，用培养基按高、中、低剂量组配制成3种浓度的溶液，相邻两浓度之比值相等且处于1:0.5～1:1之间；且高剂量组溶液浓度中阿魏酸含量为低于24μg/mL，当归多糖含量为低于35μg/mL，藁本内酯含量为低于250μg/mL，以保证后续结果中的效应和剂量具有指数线性关系。
步骤2：标准品溶液的制备
选取实验确定的具有补血作用，且量效关系与当归具有指数平行关系的阿魏酸作为参照，取阿魏酸标准品，用培养基按高、中、低剂量组配制成3种浓度的溶液，相邻两浓度之比值与当归溶液相等；且高剂量组溶液浓度处于10～24μg/mL之间。
步骤3：细胞培养
本发明选取具有多向分化潜能的人类红白血病细胞系K562悬浮细胞，正式检测前应调整细胞状态至较佳，以获得可靠性较高的检测结果。将K562较低代数的冻存细胞置于37℃水浴锅中快速复苏，接种至装有专用的RPMI 1640专用培养基(RPMI 1640空白培养基+10％胎牛血清+1％青霉素&链霉素+富马酸铁/琥珀酸亚铁/氯化血红素)的培养皿中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞出现抱团或细胞密度较高时，进行换液或传代培养，每2～3天传代一次，选取细胞浓度为0.5～5×106个细胞/mL进行实验。
步骤4：给药与检测
实验设置无细胞组(仅培养液)、空白组(细胞+培养液)、各浓度标准品组(细胞+培养液+各浓度标准品)及各浓度药物组(细胞+培养液+各浓度药物)，无细胞组和空白组以同等剂量加入空白培养基，其它组加入同等体积的不同浓度标准品或待测药物；以上各组保持每孔终体积相同。将上述给药共培养的细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行反应，每两天半量换液以保持细胞生长分化所需要的营养物质，培养4～8天。
分别配制1％H2O2溶液、0.5％乙酸溶液和10％乙酸溶液；精密称取联苯胺粉末，并用0.5％乙酸溶液配置成2mg/mL的联苯胺盐溶液；现配现用，必要时可保存在0～4℃备用。
混匀培养板内细胞悬液，转移至离心管内，按照1000rpm/min离心10分钟，弃上清收集细胞，每组加入60μL的联苯胺盐溶液和60μL的1％H2O2溶液混匀，常温避光反应30分钟。反应完成后，每组加入600μL的10％乙酸溶液混匀，充分反应，以每组3个复孔，每孔200μL转移至96孔板中，在570nm处测定吸光度值，并计算血红蛋白相对含量。高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量分别为T1、T2、T3，高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量分别为S1、S2、S3。
其中血红蛋白相对含量计算方式如下：
血红蛋白相对含量(％)＝[A(实验组)-A(无细胞组)]/[A(空白组)-A(无细胞组)]*100％
A表示联苯胺染色法酶标仪570nm处检测所得OD值。
以公式计算待测当归补血效价，评价待测样品质量。
实施例3
本实施例利用实施例2所述方法进行生当归饮片补血效应检测及质量评价
步骤1：生当归溶液的制备
取200g生当归饮片，按照1：10的比例加入水，浸泡30min。武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮3小时后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程。煎煮共三次，每次3h，合并煎液。将上述煎液预冷后，置冻干机冷冻干燥，即得生当归的干燥提取物，用高效液相色谱法测定其中阿魏酸、藁本内酯的含量，用苯酚硫酸法测定其中当归多糖的含量。
将生当归的干燥提取物，用培养基按高、中、低剂量组配制成62.5、31.25、15.63μg/mL的溶液(相邻两浓度之比值相等为1：0.5)；且62.5μg/mL组溶液中阿魏酸含量为0.08μg/mL，当归多糖含量为8.97μg/mL，藁本内酯含量为0.13μg/mL。
步骤2：标准品溶液的制备
取阿魏酸标准品，用培养基按高、中、低剂量组配制成3种浓度的溶液，相邻两浓度之比值相等为1：0.5；且高剂量组溶液浓度为16μg/mL。
步骤3：细胞培养
将5代K562冻存细胞置于37℃水浴锅中快速复苏，接种至装有专用的RPMI 1640专用培养基(RPMI 1640空白培养基+10％胎牛血清+1％青霉素&链霉素+40μmol/L氯化血红素)的培养皿中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养，选取细胞浓度为0.5～5×106个细胞/mL进行实验。
步骤4：给药与检测
实验设置无细胞组、空白组、各浓度标准品组及各浓度药物组，无细胞组和空白组以同等剂量加入空白培养基，其它组加入同等体积的不同浓度标准品或待测药物；以上各组保持每孔终体积相同。将上述给药共培养的细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行反应，每两天半量换液以保持细胞生长分化所需要的营养物质，培养4天。
分别配制1％H2O2溶液、0.5％乙酸溶液和10％乙酸溶液；精密称取联苯胺粉末，并用0.5％乙酸溶液配置成2mg/mL的联苯胺盐溶液；现配现用，必要时可保存在0～4℃备用。
混匀培养板内细胞悬液，转移至离心管内，按照1000rpm/min离心10分钟，弃上清收集细胞，每组加入60μL的联苯胺盐溶液和60μL的1％H2O2溶液混匀，常温避光反应30分钟。反应完成后，每组加入600μL的10％乙酸溶液混匀，充分反应，以每组3个复孔，每孔200μL转移至96孔板中，在570nm处测定吸光度值，并计算血红蛋白相对含量。高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量分别为332.76％、265.39％、198.04％，高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量分别为249.91％、182.60％、115.31％。
以公式计算待测生当归饮片的补血效应因子为1.895，质量评定为三等饮片。
实施例4
本实施例利用实施例2所述方法进行当归身饮片补血效应检测及质量评价
步骤1：当归身溶液的制备
取200g当归身饮片，按照1：8的比例加入水，浸泡30min。武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮3小时后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程。煎煮共三次，每次3h，合并煎液。将上述煎液预冷后，置冻干机冷冻干燥，即得当归身的干燥提取物，用高效液相色谱法测定其中阿魏酸、藁本内酯的含量，用苯酚硫酸法测定其中当归多糖的含量。
将当归身的干燥提取物，用培养基按高、中、低剂量组配制成125、100、80μg/mL的溶液(相邻两浓度之比值相等为1：0.8)；且125μg/mL组溶液中阿魏酸含量为0.15μg/mL，当归多糖含量为21.11μg/mL，藁本内酯含量为1.75μg/mL。
步骤2：标准品溶液的制备
取阿魏酸标准品，用培养基按高、中、低剂量组配制成3种浓度的溶液，相邻两浓度之比值相等为1：0.8；且高剂量组溶液浓度为15μg/mL。
步骤3：细胞培养
将5代K562冻存细胞置于37℃水浴锅中快速复苏，接种至装有专用的RPMI 1640专用培养基(RPMI 1640空白培养基+10％胎牛血清+1％青霉素&链霉素+0.3μg/mL富马酸铁)的培养皿中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养，选取细胞浓度为0.5～5×106个细胞/mL进行实验。
步骤4：给药与检测
实验设置无细胞组、空白组、各浓度标准品组及各浓度药物组，无细胞组和空白组以同等剂量加入空白培养基，其它组加入同等体积的不同浓度标准品或待测药物；以上各组保持每孔终体积相同。将上述给药共培养的细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行反应，每两天半量换液以保持细胞生长分化所需要的营养物质，培养6天。
分别配制1％H2O2溶液、0.5％乙酸溶液和10％乙酸溶液；精密称取联苯胺粉末，并用0.5％乙酸溶液配置成2mg/mL的联苯胺盐溶液；现配现用，必要时可保存在0～4℃备用。
混匀培养板内细胞悬液，转移至离心管内，按照1000rpm/min离心10分钟，弃上清收集细胞，每组加入60μL的联苯胺盐溶液和60μL的1％H2O2溶液混匀，常温避光反应30分钟。反应完成后，每组加入600μL的10％乙酸溶液混匀，充分反应，以每组3个复孔，每孔200μL转移至96孔板中，在570nm处测定吸光度值，并计算血红蛋白相对含量。高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量分别为352.09％、333.64％、314.58％，高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量分别为243.64％、221.97％、204.27％(图2)。
以公式计算待测当归身饮片的补血效应因子为2.609，质量评定为一等饮片。
实施例5
本实施例利用实施例2所述方法进行酒当归饮片补血效应检测及质量评价
步骤1：酒当归溶液的制备
取200g酒当归饮片，按照1：12的比例加入水，浸泡30min。武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮3小时后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程。煎煮共三次，每次3h，合并煎液。将上述煎液预冷后，置冻干机冷冻干燥，即得酒当归的干燥提取物，用高效液相色谱法测定其中阿魏酸、藁本内酯的含量，用苯酚硫酸法测定其中当归多糖的含量。
将酒当归的干燥提取物，用培养基按高、中、低剂量组配制成32、19.2、11.5μg/mL的溶液(相邻两浓度之比值相等为1：0.6)；且62.5μg/mL组溶液中阿魏酸含量约为0.06μg/mL，当归多糖含量约为3.78μg/mL，藁本内酯含量约为0.86μg/mL。
步骤2：标准品溶液的制备
取阿魏酸标准品，用培养基按高、中、低剂量组配制成3种浓度的溶液，相邻两浓度之比值相等为1：0.6；且高剂量组溶液浓度为20μg/mL。
步骤3：细胞培养
将5代K562冻存细胞置于37℃水浴锅中快速复苏，接种至装有专用的RPMI 1640专用培养基(RPMI 1640空白培养基+10％胎牛血清+1％青霉素&链霉素+100μg/mL琥珀酸亚铁)的培养皿中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养，选取细胞浓度为0.5～5×106个细胞/mL进行实验。
步骤4：给药与检测
实验设置无细胞组、空白组、各浓度标准品组及各浓度药物组，无细胞组和空白组以同等剂量加入空白培养基，其它组加入同等体积的不同浓度标准品或待测药物；以上各组保持每孔终体积相同。将上述给药共培养的细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行反应，每两天半量换液以保持细胞生长分化所需要的营养物质，培养8天。
分别配制1％H2O2溶液、0.5％乙酸溶液和10％乙酸溶液；精密称取联苯胺粉末，并用0.5％乙酸溶液配置成2mg/mL的联苯胺盐溶液；现配现用，必要时可保存在0～4℃备用。
混匀培养板内细胞悬液，转移至离心管内，按照1000rpm/min离心10分钟，弃上清收集细胞，每组加入60μL的联苯胺盐溶液和60μL的1％H2O2溶液混匀，常温避光反应30分钟。反应完成后，每组加入600μL的10％乙酸溶液混匀，充分反应，以每组3个复孔，每孔200μL转移至96孔板中，在570nm处测定吸光度值，并计算血红蛋白相对含量。高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量分别为271.35％、221.46％、170.37％，高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量分别为271.57％、221.97％、169.64％。
以公式计算待测酒当归饮片的补血效应因子为1.002，质量评定为统货。

Claims (8)

1.一种基于补血效应的当归质量评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度，所述药效成分包括阿魏酸，相邻剂量组浓度比值r相等；
（2）配制三种不同浓度的阿魏酸标准品溶液，相邻剂量组浓度比值=r；
（3）取K562细胞在添加富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素的RPMI 1640培养基上传代培养至细胞浓度为0.5～5×106个细胞/mL；
（4）将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，基于下式计算待测样品补血效应因子PT，并以此评价当归质量；
；
其中，T1、T2、T3分别为高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量；S1、S2、S3分别为高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，1＜r≤2。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，高剂量组溶液中阿魏酸含量＜24 μg/mL，当归多糖含量＜35 μg/mL，藁本内酯含量＜250 μg/mL。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，高剂量组溶液浓度为10~24 μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，给药细胞培养4~8天后测定血红蛋白相对含量。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白相对含量指待测组相对于空白组的血红蛋白相对值，其计算方式如下：
血红蛋白相对含量(%)=[A(实验组)-A(无细胞组)]/[A(空白组)-A(无细胞组)] *100%
其中，A表示联苯胺染色法酶标仪570 nm处检测所得OD值，无细胞组仅为培养液，空白组含有细胞和培养液，实验组包括细胞、培养液及待测药物溶液/标准品溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述当归的干燥提取物的制备方法为：
取待测当归原料，加水后浸泡t1时间；之后武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮t2时间后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程；煎煮共三次，每次t2时间，合并煎液；将上述煎液预冷后，用冻干机冷冻干燥，即得当归的干燥提取物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述依据PT评价当归质量的方法为：
当归分为一等、二等、三等、统货四个等级，其中补血效应因子PT≥2.5为一等，2.5＞PT≥2为二等，2＞PT≥1.5为三等，1.5＞PT≥1为统货。
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