CN114129714A - 一种药物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药物制剂，其包括凝胶基质、乙醇氧化酶和铁基催化剂。该药物制剂注射到治疗部位后，经交联形成水凝胶，水凝胶上负载有乙醇氧化酶和铁基催化剂，能够将乙醇氧化酶和铁基催化剂固定在治疗部位。本发明制备的药物制剂为多种治疗药物的制备提供了一种新的策略，尤其是作为肿瘤治疗药物，为杀伤肿瘤提供了一种新的方法，同时，其作为化学消融药物时治疗效果显著增强，在消融治疗方面具有巨大潜力。

Description

一种药物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药材料技术领域，尤其涉及一种药物制剂及其制备方法和应用。

背景技术

消融治疗是20世纪70-80年代兴起的针对肿瘤的一种微创治疗技术，是在影像引导下直接将化学物质或能量作用于肿瘤病灶以根除或实质性毁损肿瘤的局部疗法。消融治疗包括化学消融和能量消融。化学消融主要利用无水乙醇、乙酸等毁损肿瘤，能量消融包括射频消融、微波消融、冷冻消融、激光消融、超声消融和不可逆电穿孔。近20年来消融技术飞速的发展，消融治疗被广泛的应用于肝、肺、肾脏等实体肿瘤的治疗中。消融治疗具有微创、安全、可操作性高、重复性好、术后恢复快等优点，无论作为根治性治疗还是姑息性治疗手段，消融治疗在肿瘤的综合治疗中都取得了良好的疗效，已成为临床治疗的主要手段之一。

化学消融是在影像引导和监控下，经皮穿刺肿瘤，将破坏肿瘤蛋白的化学药物直接注入肿瘤内，使癌组织坏死，灭活癌细胞，消融癌组织，非手术“切除”肿瘤的治疗方法。常用的化学消融药物主要包括无水乙醇、冰醋酸、稀盐酸等。经皮乙醇注射疗法(PEIT)是一种微创的经皮局部消融技术，在超声成像或计算机断层扫描的引导下，将纯乙醇直接注射到肿瘤中，治疗包括小型肝细胞癌(HCC)在内的多种实体肿瘤。如袁天华(.CT引导下经皮碘化油/无水乙醇瘤体多点注射治疗肝癌技术在原发性肝癌微波消融联合经导管动脉化学治疗栓塞术术后的应用,实用医技杂志,2020,27(7):914-915.DOI:10.19522/j.cnki.1671-5098.2020.07.040.)经皮碘化油/无水乙醇瘤体多点注射治疗肝癌；钱俊等(经多功能导管化学消融犬左心室前组乳头肌,中国医学影像技术,2020,36(7):976-980.DOI:10.13929/j.issn.1003-3289.2020.07.004.)采用ICE导管注射低剂量无水乙醇可安全、有效消融左心室APM，有望为治疗左心室APM起源室性心律失常提供新的策略。有资料显示，这种高浓度的乙醇可以使肿瘤细胞快速脱水，蛋白质变性凝固，导致肿瘤细胞缺血、坏死。

然而，由于经皮注射的乙醇在瘤内的扩散效果有限，PEIT通常需要注射四到八个疗程才能达到满意的治疗效果。此外，在用于治疗HCC时，PEIT过程中乙醇会泄漏到肿瘤表面和腹腔，这将导致严重的疼痛和发烧，并通过填充邻近的胆管和主要血管系统损害正常的肝功能。因此，通常采用PEIT来完全消融边缘明显、体积小(直径<3厘米)、纤维包裹、深植于母体组织的HCC肿瘤。由于其成本低，可获得性广，因此，开发高效和减少副作用的深层乙醇基癌症治疗方法具有现实意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种药物制剂，该药物制剂含有乙醇氧化酶和铁基催化剂，通过凝胶形式将乙醇氧化酶(ALOD)和铁基催化剂固定在治疗部位，并结合乙醇来诱导肿瘤细胞发生铁死亡，实现更加安全、有效的肿瘤治疗。

本发明提供了一种含有乙醇氧化酶和铁基催化剂的药物制剂，该制剂还包括凝胶基质。当有乙醇存在时，乙醇氧化酶和铁基催化剂能够产生羟基自由基，从而将脂质底物氧化产生脂质过氧化，同时，铁基催化剂的存在能够引起肿瘤细胞铁死亡。

进一步地，铁基催化剂为血红素、硫酸亚铁、乳酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁、多糖铁复合物、低分子右旋糖酐铁、羧基麦芽糖铁、蔗糖铁和异麦芽糖酐铁中的至少一种。在此基础上，本领域技术人员可以根据实际需要更换恰当的铁基催化剂作为相同用途。

进一步地，凝胶基质为高分子，如可溶性海藻酸盐(如海藻酸钠或海藻酸钾)、纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠)、纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、明胶、葡聚糖或其硫酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸或其共聚物以及键合有高分子支链的天然多糖接枝共聚物等。本领域技术人员可以理解，上述凝胶基质的衍生物及其他形式形成的水凝胶、以及上述多种凝胶基质形成的复合水凝胶等也可实现本发明的技术方案，当然，本领域技术人员也可采用其他手段将乙醇氧化酶和铁基催化剂进行固定。

本发明中，将乙醇氧化酶和铁基催化剂与凝胶前体溶液混合为均相溶液，经交联后得到可注射水凝胶。该凝胶在体外形成时可以根据凝胶基质的不同选择不同的交联方式，如交联剂交联、酶交联或光交联。在肿瘤内形成时，部分水凝胶可以利用细胞内的钙离子作为交联剂进行交联(如海藻酸盐水凝胶)，部分水凝胶可以通过温度响应进行交联，如明胶水凝胶(60℃时为溶液状，温度降至37℃及以下时为凝胶)、

F-127水凝胶(4℃时为溶液状，温度升至20-30℃时为凝胶)。

现有技术中，无水乙醇注射术是肿瘤介入治疗的重要方法之一，是利用现代高科技技术进行的一种微创性治疗，在B超或CT的引导下，将特制的导管/导丝等精密器械引入人体，直接将乙醇等化学消融剂注入肿瘤中央，使肿瘤细胞及附近血管内皮细胞迅速脱水，蛋白质变性凝固，导致肿瘤细胞坏死/缺血，对体内病变进行诊断和局部治疗。其治疗效果可完全与手术治疗相媲美，且对患者造成的损伤小，不过，临床上无水乙醇注射会导致一系列并发症：(1)乙醇过敏：乙醇过敏相对比较少见，如果有过敏发生，常见的表现为全身皮疹；(2)内出血：内出血多发生于肿瘤在肝脏表面的患者，一般发生时间在注射后的24小时内，患者主要表现为腹痛，超声检查可见腹腔内有少量的液体，严重者有低血容量的表现，如心慌、眼前发黑、血压下降；(3)局部感染：由于乙醇引起肿瘤和周围肝组织的坏死，可继发感染，表现为发热，白细胞升高，超声或CT检查可见局部有液化等感染的征象，必要时需穿刺引流；(4)胸水：多数发生于肝脏表面靠近膈肌的肿瘤，一般认为是无水乙醇的刺激引起的，如胸水量少，则不需要处理，多逐渐吸收，如胸水量过多则需要胸腔穿刺抽水。

由此可见，在消融治疗中，瘤内注射无水乙醇不仅需要精密的操作，且极易引起不良反应及并发症，治疗时会引起剧烈疼痛。而本发明中并未对肿瘤注射无水乙醇等化学消融药物，而是首创性地注射一种含乙醇氧化酶和铁基催化剂的凝胶溶液，并通过口服乙醇的方式进行肿瘤治疗。具体地：

将上述均相溶液通过经皮穿刺注射的方式注射到肿瘤内，在肿瘤内形成凝胶的同时将乙醇氧化酶和含铁催化剂均匀固定在肿瘤内部。之后，乙醇口服后通过血液循环扩散到肿瘤部位，作为乙醇氧化酶的底物被氧化产生过氧化氢，后者在铁基催化剂的作用下被分解成具有更强氧化性的羟基自由基，进而引起肿瘤细胞发生脂质过氧化及铁死亡，实现对肿瘤生长的高效抑制。

本发明通过凝胶固定可以延长铁基催化剂和酶在肿瘤部位的滞留，若不以凝胶形式进行固定，铁基催化剂和酶会很快逃出肿瘤部位，对肿瘤的作用时间短，治疗效果变差。

进一步地，乙醇氧化酶的浓度为100-400U/mL，铁基催化剂的浓度为1-4mg/mL，凝胶基质的浓度为5-10mg/mL。

进一步地，口服乙醇时，乙醇的浓度为5-50mg/mL。

为进一步增强治疗效果，将无水乙醇和含乙醇氧化酶和铁基催化剂的凝胶溶液注射到肿瘤内，乙醇被乙醇氧化酶氧化产生过氧化氢，铁基催化剂将产生的过氧化氢催化产生更强氧化性的羟基自由基，产生的羟基自由基引起肿瘤细胞的脂质过氧化，从而引起肿瘤细胞铁死亡，进而抑制肿瘤生长。因此，本发明还提供了一种化学消融药盒，包括：含有上述药物制剂的制剂；含有无水乙醇的制剂。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明首次将乙醇氧化酶与铁基催化剂负载于水凝胶中，将含乙醇氧化酶和铁基催化剂的凝胶溶液注射到肿瘤内，实现该催化组合在肿瘤部位的长时间滞留，该口服乙醇的方式与传统的乙醇消融相比，疼痛感明显减少，且操作更加便捷，治疗时间缩短且治疗效果更好。

(2)将含乙醇氧化酶和铁基催化剂的凝胶溶液和无水乙醇注射到肿瘤内时，相对于现有技术中采用无水乙醇进行化学消融治疗有更好的治疗效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为乙醇氧化酶的催化活力评价图(a为乙醇氧化酶与不同浓度乙醇反应产生的过氧化氢曲线图，b为乙醇氧化酶与乙醇反应不同时间产生的过氧化氢曲线图)；

图2为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生羟基自由基的活力评价图(a为TMB与乙醇氧化酶、硫酸亚铁和乙醇混合溶液共孵育后的紫外吸收光谱，b为TMB与乙醇氧化酶、血红素和乙醇混合溶液共孵育后的紫外吸收光谱)；

图3为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生羟基自由基诱导脂质过氧化的催化活力评价图(乙醇氧化酶、血红素和乙醇混合溶液与亚油酸a或细胞裂解物b共孵育后脂质过氧化的产生)；

图4为实施例4制备的可注射水凝胶表征(a为将乙醇氧化酶和铁基催化剂混合液(左)乙醇氧化酶、铁基催化剂和海藻酸盐混合液(右)用注射器加入装有氯化钙溶液的血清瓶中的光学图片，b为本发明制备的可注射凝胶的流变曲线)；

图5为实施例5制备的可注射水凝胶表征(a为羧甲基纤维素钠可注射凝胶的光学图片，b为羧甲基壳聚糖可注射凝胶的光学图片，c为明胶可注射凝胶的光学图片，d为

F-127可注射凝胶的光学图片)；

图6为不同浓度的乙醇对细胞活性的影响；

图7为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生脂质过氧化及对肝癌肿瘤细胞的杀伤作用(a为经过不同处理的细胞中脂质过氧化的产生，b为经过不同处理后的细胞活性)；

图8为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对肝癌肿瘤细胞杀伤的机制(a为经过不同处理的细胞中脂质过氧化的产生，b为经过不同处理后的细胞活性)；

图9为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对乳腺癌肿瘤细胞杀伤的机制(a为经过不同处理的细胞中脂质过氧化的产生，b为经过不同处理后的细胞活性)；

图10为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对其他肿瘤细胞的杀伤作用(a为经过不同浓度乙醇氧化酶和铁基催化剂血红素处理的Hela人宫颈癌细胞的细胞活性，b为经过不同浓度乙醇氧化酶和铁基催化剂血红素处理的B16小鼠黑色素瘤细胞的细胞活性，c为经过不同浓度乙醇氧化酶和铁基催化剂血红素处理的A549人肺癌细胞的细胞活性，d为经过不同浓度乙醇氧化酶和铁基催化剂血红素处理的MCF-7人乳腺癌细胞的细胞活性)；

图11为经皮瘤内固定乙醇氧化酶水凝胶联合口服乙醇增强小鼠乳腺癌肿瘤治疗结果(a为乳腺癌模型不同治疗组的肿瘤生长曲线，b为不同治疗组的生存率曲线，c为不同治疗组的小鼠体重变化)；

图12为经皮瘤内固定乙醇氧化酶水凝胶联合口服乙醇增强大鼠原位肝癌治疗结果(a为大鼠原位肝癌实验过程的示意图，b为大鼠原位肝癌模型不同治疗组的肿瘤磁共振成像图片，c-e为不同治疗组的肿瘤生长曲线(PBS组c，无水乙醇消融组d，乙醇氧化酶和铁基催化剂水凝胶联合口服乙醇组e)，f为不同治疗组的肿瘤生长曲线)；

图13为经皮瘤内固定乙醇氧化酶水凝胶联合瘤内注射乙醇增强小鼠肝癌肿瘤治疗结果(a为小鼠肝癌模型不同治疗组的肿瘤生长曲线，b为不同治疗组的生存率曲线，c为不同治疗组的小鼠体重变化)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1乙醇氧化酶的催化性能

将乙醇氧化酶与不同浓度的乙醇室温共同孵育一小时，其中乙醇氧化酶浓度为2U/mL，乙醇浓度为0.125,0.25,0.5,1,2,5,10,20,50mg/mL。一小时后检测溶液中产生的过氧化氢浓度。硫酸氧钛为过氧化氢检测剂，与过氧化氢反应后在紫外光谱中410nm处会出现吸收峰。将硫酸氧钛加入上述反应液，硫酸氧钛浓度为0.03M，用紫外-可见分光光度计测量混合溶液在410nm处的吸收值。

配制系列浓度的过氧化氢溶液，加入硫酸氧钛溶液测量410纳米处吸收值，制作标准曲线。其中过氧化氢浓度为0.3125,0.625,1.25,2.5mM，硫酸氧钛浓度为0.03M。

将反应液的吸收值代入标准曲线中计算过氧化氢浓度，结果见图1a。结果表明乙醇氧化酶可将乙醇氧化为过氧化氢，在一定的乙醇氧化酶浓度下，产生的过氧化氢随乙醇浓度的增加而增加。

将不同浓度乙醇氧化酶与乙醇室温共同孵育0.5,1,5,8,24,48,72,120小时，其中乙醇氧化酶浓度为0.1,0.5,2U/mL,乙醇浓度为1mg/mL。加入硫酸氧钛测量紫外吸收，计算溶液中过氧化氢浓度，结果见于图1b。结果表明，乙醇氧化酶可将乙醇氧化为过氧化氢，且在一定乙醇浓度下，产生的过氧化氢随乙醇氧化酶浓度的增加和时间的延长而增加。

实施例2乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生羟基自由基的催化性能

将五组溶液与TMB室温孵育10min。第一组：对照组(去离子水)；第二组：乙醇溶液；第三组：乙醇氧化酶加乙醇溶液；第四组：硫酸亚铁加乙醇溶液；第五组：乙醇氧化酶加硫酸亚铁加乙醇溶液。其中TMB为羟基自由基检测剂，本身无吸收峰，被羟基自由基氧化后在630nm处有特征吸收峰，浓度为0.5mM。乙醇浓度为1mg/mL，乙醇氧化酶浓度为2U/mL，硫酸亚铁浓度为40g/mL。10min后用紫外分光光度计测量溶液在400-800nm的吸收。结果见于图2a。结果表明，相比对照组，第五组的TMB吸收最高，表明乙醇氧化酶和铁基催化剂组合在乙醇存在的条件下能够有效产生羟基自由基。

将五组溶液与TMB室温孵育30min，第一组：对照组(去离子水)；第二组：乙醇溶液；第三组：乙醇氧化酶加乙醇溶液；第四组：血红素加乙醇溶液；第五组：乙醇氧化酶加血红素加乙醇溶液。其中TMB浓度为0.5mM，乙醇浓度为1mg/mL,乙醇氧化酶浓度为2U/mL，血红素浓度为10g/mL。30min后用紫外分光光度计测量溶液在630nm处的吸收。结果见于图2b。结果表明，相比对照组，第五组的TMB吸收最高，表明乙醇氧化酶和铁基催化剂组合在乙醇存在的条件下能够有效产生羟基自由基。

将乙醇氧化酶、乙醇溶液与其他铁基催化剂如乳酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁、多糖铁复合物、低分子右旋糖酐铁、羧基麦芽糖铁、蔗糖铁、异麦芽糖酐铁等混合，均得到与上述相同的结果，表明乙醇氧化酶与多种铁基催化剂均可催化乙醇产生羟基自由基。

实施例3乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生脂质过氧化的催化性能

将五组溶液与亚油酸或细胞裂解物室温孵育2小时。第一组：对照组(去离子水)；第二组：乙醇溶液；第三组：乙醇氧化酶加乙醇溶液；第四组：血红素加乙醇溶液；第五组：乙醇氧化酶加血红素加乙醇溶液。其中乙醇浓度为1mg/mL,乙醇氧化酶浓度为2U/mL，血红素浓度为10g/mL，亚油酸浓度为450g/mL，细胞裂解物浓度为2x10⁶细胞/mL。将脂质过氧化探针BODIPY-C11与上述混合溶液共同孵育0.5小时，检测其荧光强度(激发488nm，发射530nm)，结果见于图3a&b。

结果表明，相比对照组，第五组的荧光强度最强，将上述血红素替换为其他铁基催化剂均可得到相同的结果，表明乙醇氧化酶和铁基催化剂在乙醇存在的情况下产生的羟基自由基能够将脂质底物氧化产生脂质过氧化。

实施例4海藻酸盐可注射水凝胶的制备

分别将(1)乙醇氧化酶和铁基催化剂混合液；(2)乙醇氧化酶、铁基催化剂和海藻酸盐混合液用注射器加入装有氯化钙溶液的血清瓶中。结果见于图4。

图4a为上述操作的光学照片，组(1)加入氯化钙溶液中后呈弥散溶液状，组(2)加入氯化钙溶液中呈凝胶状。表明海藻酸钠与钙离子混合会形成水凝胶。图4b为该凝胶的流变测试，其中G’为存储模量，G”为损耗模量，存储模量大于损耗模量，证明凝胶的形成。结果表明乙醇氧化酶、铁基催化剂和海藻酸盐混合液在遇到钙离子后会迅速形成水凝胶。

实施例5羧甲基纤维素钠，羧甲基壳聚糖，明胶和

F-127可注射水凝胶的制备

将(1)乙醇氧化酶、铁基催化剂和羧甲基纤维素钠混合液；(2)乙醇氧化酶、铁基催化剂和羧甲基壳聚糖混合液用注射器加入装有氯化钙溶液的血清瓶中。(3)将乙醇氧化酶、铁基催化剂和明胶混合液加热至60℃溶解，随后放至室温。(4)将乙醇氧化酶、铁基催化剂和

F-127混合液在4℃溶解，随后放至室温。

图5为上述操作的光学照片，图5a为组(1)加入氯化钙溶液中呈凝胶状，图5b为组(2)加入氯化钙溶液中呈凝胶状，图5c为组(3)60℃溶解为溶液状，室温呈凝胶状，图5d为组(4)4℃溶解为溶液状，室温呈凝胶状。结果表明羧甲基纤维素钠和羧甲基壳聚糖与钙离子混合后会形成凝胶(离子响应)，明胶和

F-127在室温时会形成凝胶(温度响应)。

实施例6不同浓度乙醇对细胞活性的影响

将4T1小鼠乳腺癌细胞与不同浓度乙醇(0,078,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100mg/mL)在细胞培养箱中共同孵育24h,用标准MTT细胞活性检测方法检测细胞活性。图6为细胞活性检测结果。结果表明，当乙醇浓度为1.56mg/mL时，仍有超过90％的细胞保持活性。最终选定乙醇浓度为1mg/mL用于下面的细胞实验。

实施例7乙醇氧化酶与铁基催化剂组合产生脂质过氧化及对肝癌肿瘤细胞的杀伤

将H22小鼠肝癌细胞与(1)生理盐水；(2)乙醇；(3)乙醇氧化酶+乙醇；(4)铁基催化剂+乙醇；(5)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇在细胞培养箱中共同孵育12h，加入脂质过氧化荧光探针BODIPY-C11继续孵育0.5h，用流式细胞仪检测各组细胞中BODIPY-C11的荧光强度。

图7a为流式检测统计结果，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇组的荧光强度最强，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的细胞脂质过氧化。

将H22小鼠肝癌细胞与(1)乙醇氧化酶+乙醇；(2)铁基催化剂+乙醇；(3)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇在细胞培养箱中共同孵育24h，用标准CCK8细胞活性检测方法检测细胞活性。

图7b为细胞活性检测结果。结果表明，随着乙醇氧化酶和铁基催化剂浓度升高细胞活性越来越低，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的小鼠肝癌肿瘤细胞死亡。

实施例8乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对肝癌肿瘤细胞杀伤的机制

脂质过氧化是细胞铁死亡的代表性特征，在实施例7中证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起细胞脂质过氧化，从而证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起细胞铁死亡。为了进一步证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇是通过铁死亡的方式引起细胞死亡，将H22小鼠肝癌细胞与(1)生理盐水+乙醇；(2)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇；(3)铁死亡抑制剂+乙醇；(4)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇+铁死亡抑制剂共同孵育12h，加入脂质过氧化荧光探针BODIPY-C11继续孵育0.5h，用流式细胞仪检测各组细胞中BODIPY-C11的荧光强度。

图8a为流式检测统计结果。结果表明，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇组的荧光强度最强，而加上铁死亡抑制剂后荧光强度降到了与对照组(生理盐水组)相当的水平，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的细胞脂质过氧化，而加入铁死亡抑制剂后产生的脂质过氧化被抑制。

将H22小鼠肝癌细胞与(1)生理盐水+乙醇；(2)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇；(3)铁死亡抑制剂+乙醇；(4)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇+铁死亡抑制剂在细胞培养箱中共同孵育24h，用标准CCK8细胞活性检测方法检测细胞活性。

图8b为细胞活性检测结果。结果表明，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇组的细胞活性最低，而加上铁死亡抑制剂后细胞活性增加，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的小鼠肝癌肿瘤细胞死亡，而加入铁死亡抑制剂后细胞活性得到恢复。

以上结果均表明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇通过铁死亡方式引起细胞死亡。

实施例9乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对乳腺癌肿瘤细胞杀伤的机制

将4T1小鼠乳腺癌细胞与(1)生理盐水；(2)乙醇；(3)乙醇氧化酶+乙醇；(4)铁基催化剂+乙醇；(5)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇；(6)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇+铁死亡抑制剂共同孵育12h，加入脂质过氧化荧光探针BODIPY-C11继续孵育0.5h，用流式细胞仪检测各组细胞中BODIPY-C11的荧光强度。

图9a为流式检测统计结果。结果表明，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇组的荧光强度最强，而加上铁死亡抑制剂后荧光强度降到了与对照组(生理盐水组)相当的水平，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的细胞脂质过氧化，而加入铁死亡抑制剂后产生的脂质过氧化被抑制。

将4T1小鼠乳腺癌细胞与(1)生理盐水+乙醇；(2)乙醇氧化酶+乙醇；(3)铁基催化剂+乙醇；(4)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇；(5)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇+铁死亡抑制剂在细胞培养箱中共同孵育24h，用标准CCK8细胞活性检测方法检测细胞活性。

图9b为细胞活性检测结果。结果表明，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇组的细胞活性最低，而加上铁死亡抑制剂后细胞活性增加，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇能够引起明显的小鼠乳腺癌肿瘤细胞死亡，而加入铁死亡抑制剂后细胞活性得到恢复。

以上结果均表明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇通过铁死亡方式引起细胞死亡。

实施例10乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对其他肿瘤细胞的杀伤作用

将Hela人宫颈癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞、A549人肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞与(1)乙醇氧化酶+乙醇；(2)铁基催化剂+乙醇；(3)乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇在细胞培养箱中共同孵育24h，用标准MTT细胞活性检测方法检测细胞活性。

图10为细胞活性检测结果。其中(a)为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对Hela人宫颈癌细胞的杀伤，(b)为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对B16小鼠黑色素瘤细胞的杀伤，(c)为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对A549人肺癌细胞的杀伤，(d)为乙醇氧化酶与铁基催化剂组合对MCF-7人乳腺癌细胞的杀伤。结果表明，随着乙醇氧化酶和铁基催化剂浓度的增加，乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇处理的以上四种细胞系的细胞活性也随之降低，证明乙醇氧化酶和铁基催化剂+乙醇对Hela人宫颈癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞、A549人肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞均能够引起明显的肿瘤细胞死亡。

实施例11经皮瘤内固定水凝胶联合口服乙醇增强肿瘤治疗

将带有乳腺癌皮下肿瘤模型的小鼠分为六组，其中包括：第一组，对照组(仅口服生理盐水)；第二组，口服乙醇组；第三组，瘤内注射乙醇氧化酶水凝胶联合口服乙醇组；第四组，瘤内注射血红素水凝胶联合口服乙醇组；第五组，瘤内注射乙醇氧化酶、血红素联合口服乙醇组；第六组，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组。对小鼠进行相应的治疗后，用游标卡尺测量其肿瘤的生长，当肿瘤体积超过1000mm³时认定小鼠死亡。结果见于图11。

图11a为不同治疗组小鼠的生长曲线，结果表明，相比较对照组，第六组的肿瘤生长得到了有效的抑制。图11b为不同治疗组的存活曲线，结果表明，相比较对照组，第六组小鼠的生存时间得到了有效的延长。图11c为不同治疗组小鼠的体重曲线，结果表明，各组小鼠体重没有明显变化，表明我们的治疗方式没有明显的毒副作用。

以上结果表明经皮瘤内固定乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇能够实现增强的肿瘤治疗，并且没有明显的毒副作用。

实施例12经皮瘤内固定水凝胶联合口服乙醇增强原位肝癌治疗

将带有原位肝癌肿瘤模型的大鼠分为三组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，经皮瘤内注射乙醇组；第三组，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组。对大鼠进行相应的治疗后，通过磁共振成像监测其肿瘤的生长，结果见于图12。

图12a为大鼠实验过程的示意图。首先将大鼠麻醉后剖开，漏出肝叶，在肝叶上注射N1S1肝癌肿瘤细胞，将剖开的伤口缝合。第七天时(Day0)开始治疗，将大鼠麻醉后剖开，漏出肝叶，此时肝叶上已长出N1S1肝癌肿瘤。瘤内注射水凝胶或乙醇，注射完毕后将剖开的伤口缝合。瘤内注射水凝胶组的大鼠从开始治疗起口服乙醇每天一次，共7天。所有大鼠从开始治疗起通过磁共振成像监测肿瘤的生长变化。

图12b为不同治疗组大鼠的肝部磁共振成像。白色虚线圆圈内为肝部的肿瘤，结果表明生理盐水组的肿瘤随时间在快速变大，瘤内注射乙醇组的肿瘤没有变大或在慢慢消退，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组的肿瘤几乎都在慢慢消退。图12c-e依次为对照组(仅注射生理盐水，PBS)、经皮瘤内注射乙醇治疗组、经皮瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组的肿瘤体积统计。图12f为不同治疗组大鼠的肿瘤生长曲线统计。结果表明，相比较对照组和经皮瘤内注射乙醇组，第三组的肿瘤生长得到了更加有效的抑制。表明经皮瘤内固定乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇能够实现增强的肿瘤治疗。

实施例13经皮瘤内固定水凝胶联合瘤内注射乙醇增强肝癌治疗将带有肝癌皮下肿瘤模型的小鼠分为六组，其中包括：第一组，对照组(不做任何处理)；第二组，经皮瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶组；第三组，口服乙醇组；第四组，经皮瘤内注射乙醇组；第五组，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组；第六组，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合瘤内注射乙醇组。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见于图8。

图13a为不同治疗组小鼠的生长曲线，结果表明对照组(第一组-第三组)的肿瘤生长都没有得到抑制，瘤内注射乙醇组(第四组)的肿瘤相比对照组生长较为缓慢，得到了一定程度的抑制，而相比瘤内注射乙醇组(第四组)，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合口服乙醇组(第五组)的肿瘤在前一个月的时间内比第四组得到了更加明显的抑制，瘤内注射乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合瘤内注射乙醇组(第六组)的肿瘤被全部治愈。图13b为不同治疗组的存活曲线，结果表明在20天左右，对照组(第一组-第三组)的小鼠已经全部死亡，第四组-第六组的小鼠的存活时间都得到了有效的延长，第六组的小鼠全部存活。图13c为不同治疗组小鼠的体重曲线，结果表明各治疗组的小鼠体重都没有明显变化，证明该治疗方式无明显毒副作用。

以上结果表明经皮瘤内固定乙醇氧化酶和血红素水凝胶联合瘤内注射乙醇能够实现增强的肿瘤治疗。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种药物制剂，其特征在于：所述药物制剂包括凝胶基质、乙醇氧化酶和铁基催化剂。

2.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于：所述铁基催化剂为血红素、硫酸亚铁、乳酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁、多糖铁复合物、低分子右旋糖酐铁、羧基麦芽糖铁、蔗糖铁和异麦芽糖酐铁中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于：所述凝胶基质为海藻酸盐、纤维素、纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、明胶、葡聚糖、葡聚糖硫酸盐、壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸或其共聚物、键合有高分子支链的天然多糖接枝共聚物和以上凝胶基质的衍生物中的一种或多种。

4.权利要求1-3任一项所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将乙醇氧化酶、铁基催化剂和凝胶基质混合为均相溶液，得到所述药物制剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述药物制剂中，乙醇氧化酶的浓度为100-400U/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述药物制剂中，铁基催化剂的浓度为1-4mg/mL。

7.一种化学消融药盒，其特征在于，所述药盒包括：权利要求1-3任一项所述的药物制剂；含有无水乙醇的制剂。

8.根据权利要求7所述的药盒，其特征在于：将权利要求1-3任一项所述的药物制剂和含有无水乙醇的制剂分别注射到肿瘤内。

9.根据权利要求7所述的药盒，其特征在于：给药方式为经皮穿刺注射。

10.根据权利要求7所述的药盒，其特征在于：所述化学消融药盒用于治疗实体肿瘤。

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