CN114129580A - 一种基于中药的成分组合物及其治疗抑郁症的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于中药的成分组合物及其治疗抑郁症的应用，所述组合物包含木兰花碱1.0‑3.0份、西红花苷I 0.8‑1.0份、丁苯酞0.8‑1.0份作为有效成分。本发明明确了“川芎‑栀子”和“酸枣仁‑川芎”药对中的活性成分，并对活性成分进行复配，得到了药效优异、成分明确、无明显毒副作用的药物组合物，有望开发作为新型改善和/或治疗抑郁症、焦虑症的药物。

Description

一种基于中药的成分组合物及其治疗抑郁症的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种基于中药的成分组合物及其治疗抑郁症的应用。
背景技术
抑郁症是以显著而持久的心境低落、思维迟缓和认知功能损害为主要特征，部分患者存在自伤、自杀，可伴有妄想、幻觉等精神病性症状。传统中药有着毒副作用小、抗抑郁效果显著等优点，被广泛应用于改善和治疗抑郁症。现代临床及药理学表明，“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对具有抗抑郁效果。然而中药组方成分复杂，存在大量无益或低害成分，因此，筛选出活性成分明确的组方显得尤为重要。
发明内容
本发明提供一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以治疗有效量的木兰花碱、丁苯酞和西红花苷I作为有效成分。该药物组合物还可包括药学上可接受的药用辅料。该药物组合物还可包括其他治疗抑郁症的活性成分或药物。
上述药物组合物，按重量份计，优选包含木兰花碱1.0-3.0份、西红花苷I0.8-1.0份、丁苯酞0.8-1.0份作为有效成分。
本发明的另一优选技术方案提供上述药物组合物，其特征在于，按重量份计，木兰花碱-西红花苷I-丁苯酞＝3:1:1或3:0.8:0.8或1:1:1。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体制剂，优选片剂、胶囊、注射剂，包括缓释片剂、缓释胶囊、缓释注射剂。
本发明的另一实施方案提供一种酸枣仁-川芎-栀子提取物，其特征在于其制备方法包括如下步骤：
(1)精密称取川芎药材1份，粉碎，过筛(20-40目)，加6-10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏6-10h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取酸枣仁3份、栀子药材1份与步骤(1)中川芎药渣混合，加6-10倍量水，浸泡0.5h，回流提取2-3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩后、冷冻干燥，即得所述酸枣仁-川芎-栀子提取物。所述份指重量份。
本发明的另一实施方案提供上述药物组合物、酸枣仁-川芎-栀子提取物作为改善和/或治疗抑郁症、焦虑症的药物的应用，以及在制备改善和/或治疗抑郁症、焦虑症的药物中的应用。
本发明上述药物组合物中的木兰花碱包括木兰花碱以及药学上可接受的木兰花碱盐；西红花苷I包括西红花苷I以及药学上可接受的西红花苷I盐；丁苯酞(又称丁基苯酞或正丁基苯酞)包括丁苯酞以及药学上可接受的丁苯酞盐。
本发明药物组合物涉及的各种剂型可按照制药领域技术规范和要求(例如药典、教科书或其他现有技术中的方法)分别制备成符合临床治疗和/或治疗抑郁症、焦虑症的需求的制剂及其适宜的各种规格与剂型(包括固体制剂、液体制剂和半固体制剂)如片剂、胶囊、注射剂，包括缓释片剂、缓释胶囊、缓释注射剂。
本发明药物组合物涉及到的剂型的制备方法，属于药剂学领域常规的制备方法，是本领域技术人员根据现有技术(例如药典、教科书及制药领域的其他技术规范)就可以实现制备，本发明对上述剂型的常规制备方法不再赘述。
与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明建立了Halo标签融合5-HT1AR、5-HTT和NET三种色谱模型，并对三种色谱固定相的特异性进行表征，表明固定后蛋白仍具有配体识别活性，并可用于药物和蛋白相互作用研究。(2)采用5-HT1AR、5-HTT和NET三种固定化色谱模型筛选“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对的活性成分，得到靶向5-HT1AR活性成分西红花苷I和木兰花碱；靶向5-HTT和NET活性成分木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞。(3)建立CUMS小鼠抑郁模型评价了活性成分的抗抑郁功效，表明5-HT1AR、5-HTT和NET三靶点筛选出的活性成分在体内可调节脑组织中单胺类神经递质的含量以及靶蛋白的表达发挥抗抑郁功效，体内药效实验充分证实了色谱模型筛选的准确性与特异性。(4)本发明首次对“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对中针对5-HT1AR、5-HTT和NET靶点的活性成分进行筛选；然后定量测定了药对中相关活性成分的比例，并且据此得出活性成分组方，随后通过动物实验、药理学实验等证明了本发明基于“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对获得的三单体复配药物组合物(A1、A2)治疗效果优于两两单体复配及单个单体单独给药的效果，同样优于“川芎-栀子-酸枣仁”三复方提取物(SCZ)的效果。即本发明明确了“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对中的活性成分，并对活性成分进行复配，得到了药效优异、成分明确、无明显毒副作用的药物组合物，有望开发作为新型改善和/或治疗抑郁症、焦虑症的药物。
附图说明
图1是Halo标签融合5-HT1AR(A)、5-HTT(B,C)和NET(B,C)诱导表达SDS-PAGE分析图，泳道M：标准蛋白分子量，泳道L：LB培养基中回收菌体细胞，泳道A：自诱导培养基中回收菌体细胞，泳道BS和AS分别为固定化反应前后自诱导培养基细胞裂解液上清溶液，泳道P：自诱导培养基细胞裂解液沉淀。
图2是固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱柱特异性考察图。
图3是活性单体在固定化5-HT1AR色谱柱保留行为图。
图4是活性单体在固定化5-HTT色谱柱保留行为图。
图5是活性单体在固定化NET色谱柱保留行为图。
图6是“川芎-栀子”药对在固定化5-HTR、5-HTT和NET色谱柱上的色谱图；(A：5-HT1AR色谱柱，B：5-HTT色谱柱，C：NET色谱柱)。
图7是“酸枣仁-川芎”药对在固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱柱上的色谱图；(A：5-HT1AR色谱柱，B：5-HTT色谱柱，C：NET色谱柱)。
图8是“川芎-栀子”药对提取物在5-HTT和NET色谱柱上保留峰2的总离子流图；(峰1：西红花苷I，峰2：丁基苯酞)。
图9是“川芎-栀子”药对提取物在5-HT1AR色谱柱上保留峰2的总离子流图；(峰1：西红花苷I)。
图10是“川芎-栀子”保留峰总离子流图峰1和峰2一级质谱图；(A：西红花苷I，B：丁基苯酞)。
图11是“酸枣仁-川芎”药对提取液在5-HTT和NET色谱柱上保留峰2的总离子流图；(峰1：木兰花碱，峰2：丁基苯酞)。
图12是“酸枣仁-川芎”药对提取液在5-HT1AR色谱柱上保留峰2的总离子流图；(峰1：木兰花碱)。
图13是“酸枣仁-川芎”药对保留峰总离子流图峰1和峰2一级质谱图；(A：木兰花碱，B：丁基苯酞)。
图14是木兰花碱和西红花苷Ⅰ在固定化5-HT1AR色谱柱上竞争洗脱保留行为色谱图。
图15是丁苯酞、木兰花碱和西红花苷Ⅰ在固定化5-HTT色谱柱上竞争洗脱保留行为色谱图。
图16是丁苯酞、西红花苷Ⅰ和木兰花碱在固定化NET色谱柱上竞争洗脱保留行为色谱图。
图17是混合标准品溶液(A)、“酸枣仁-川芎”(B)药对和“川芎-栀子”(C)药对提取物的色谱图。
图18是CUMS模型中各组对小鼠体重的影响图。
图19是各组小鼠糖水偏好率图。
图20是CUMS对各组小鼠强迫游泳不动时间图。
图21是CUMS模型对小鼠悬尾不动时间的影响图。
图22是各组对CUMS抑郁小鼠血清中5-HT、NE和DA含量的影响图；(A：5-HT，B：NE，C：DA；***p<0.001vs N；###p<0.001vs CUMS)。
图23是各组对CUMS抑郁小鼠大脑海马区5-HT、NE和DA含量的影响图；(A：5-HT，B：NE，C：DA；***p<0.001vs N；###p<0.001vs CUMS)。
图24是各组对CUMS抑郁小鼠大脑皮层区5-HT、NE和DA含量的影响图；(A：5-HT，B：NE，C：DA；***p<0.001vs N；###p<0.001vs CUMS)。
图25是药物干预后各组小鼠脏器系数图(A：心脏，B：肝脏，C：脾；D：肺；E：肾)。
图26是各组对CUMS抑郁小鼠大脑皮层5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白表达水平的影响图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱模型的建立及表征
1.1实验方法
1.1.1 Halo标签融合5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白诱导表达
根据发明人前期的工作，将已构建的含有pET15b-5-HT1AR-Halo载体的质粒采用热击法转入E.coli BL21(DE3)菌种中诱导表达；含有pET15b-5-HTT和NET-Halo载体的质粒采用热击法转入E.coli BL21(DE3)plysS菌种中诱导表达。
分别配制琼脂糖固体培养基、LB初级培养基，复合自诱导培养基，湿法灭菌，待灭菌锅温度降至60℃时，取出培养基，置于超净工作台待用。配制氨苄青霉素钠，浓度为100mg/mL，吸取适量加入至上述培养基中，至抗生素终浓度为100μg/mL，将琼脂糖固体培养基摇匀后快速倒入平板至其凝结为固体，分别吸取3μL大肠杆菌5-HT1AR-Halo(BL21(DE3))、5-HTT-Halo(BL21(Plyss))和NET-Halo(BL21(Plyss))至三个琼脂糖固体培养基中，划线培养，37℃培养12-18h。挑取单菌落至LB初级培养基(氨苄青霉素终浓度为100μg/mL)中过夜培养，培养条件：37℃，220rpm摇床孵育，12h。将其以培养基体积8％的比例分别转移至复合自诱导培养基中，培养条件为30℃，220rpm摇床孵育，9h。待OD值达到0.4-0.6时，降温至室温，4℃回收菌体，弃去培养基。取菌体适量，按照菌体湿重：破菌液1:10的比例悬浮菌体(破菌液为0.02mol/LPB，0.5mol/L NaCl，pH 7.4)，冰水浴超声破碎，破碎10s，间隔15s，25min，共破碎2次，分别收集上清液和沉淀备用。
1.1.2 5-HT1AR、5-HTT和NET色谱固定相的制备
采用一步固定化方法分别将Halo-5-HT1AR、Halo-5-HTT和Halo-NET固定至氨丙基硅胶表面。具体操作为：以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，按照氨丙基硅胶(1.0eq)、6-氯己酸(1.2eq)、HATU(1.2eq)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA，3.0eq)的比例投料，室温下机械搅拌4h。采用G4垂融漏斗抽滤，DMF、甲醇和20mmol/L PB溶液依次洗涤3次，即得6-氯己酸修饰的硅胶。将上述破菌后收集的上清与6-氯己酸修饰的硅胶混匀，室温下机械搅拌1.5h，采用G4垂融漏斗抽滤，滤饼使用20mmol/L PB洗涤3次，即得固定化5-HT1AR、5-HTT和NET三种色谱固定相，该固定相于4℃下保存在20mmol/L PB中。
分别取上述固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱固定相进行湿法装柱(柱标准为4.6mm×30mm，6μm)，选用20mmol/L PB为顶替液和匀浆液，400bar压力，冰浴下装柱40min即得固定化5-HT1AR、5-HTT和NET三种色谱柱。
1.1.3 5-HT1AR、5-HTT和NET色谱柱特异性表征
采用岛津高效液相色谱仪系统对制备的固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱模型的色谱保留行为进行表征，配制亚硝酸钠、YL0919、5-羟色胺、丁螺环酮溶液表征5-HT1AR色谱柱特异性，设置流速为0.2mL/min，检测波长分别为254nm、217nm、275nm和250nm；配制亚硝酸钠、氯米帕明、舍曲林和氟西汀溶液表征5-HTT色谱柱特异性，设置流速为0.6mL/min，检测波长分别为254nm、251nm、265nm和227nm；配制亚硝酸钠、多塞平、丙咪嗪、托莫西汀溶液表征NET色谱柱特异性，设置流速为0.6mL/min，检测波长分别为254nm、254nm、251nm和270nm。均以浓度为20mmol/L的乙酸铵(pH 7.4)为流动相，亚硝酸钠为不保留成分，可通过测定其保留时间，确定色谱系统死时间t0。
1.2实验结果
1.2.1 Halo标签融合5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白诱导表达
将Halo标签重组至5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白的C末端，以大肠杆菌作为宿主细胞，通过自诱导培养基获得重组5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白，SDS-PAGE结果见图1。图1A显示，Halo标签融合5-HT1AR、5-HTT和NET重组蛋白的自诱导培养基和细胞裂解液上清中均在标准蛋白分子量66.2kDa～116.0kDa之间有一条特别明显的条带，自诱导培养基细胞裂解沉淀中几乎看不到该条带，经进一步回归计算，其分子量大约分别为80.0kDa、104.3kDa和103.4kDa初步鉴定该条分别为诱导表达的Halo标签融合5-HT1AR、5-HTT和NET重组蛋白。由于5-HTT和NET两个转运体分子量较大，因此进一步选择接近100kDa蛋白分子量标准进行SDS-PAGE分析，结果如图1B，在100kDa上方有一条明显的条带，经回归分析计算其分子量大约为104.3kDa和103.4kDa，进一步确证Halo标签融合5-HTT和NET诱导表达成功。
1.2.2固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱固定相特异性表征
在同一色谱条件下，探索YL0919、5-羟色胺、丁螺环酮在固定化5-HT1AR色谱柱上的保留行为；氯米帕明、舍曲林、氟西汀在固定化5-HTT色谱柱上的保留行为以及丙咪嗪、多塞平、托莫西汀在固定化NET色谱柱上的保留行为对三种色谱柱进行特异性表征。通过亚硝酸钠的保留行为测定系统的死时间(t0)，配体和亚硝酸钠的保留行为如图2所示。可以看出不同配体在固定化5-HT1AR、5-HTT和NET色谱柱上的保留时间各不相同，表明固定化蛋白具有配体识别特异性，并且色谱峰存在一定的拖尾现象，原因在于配体与固定化的蛋白的作用过程为快结合慢解离。表1为保留时间tR与容量因子k’的测定结果，三种蛋白的配体在相应色谱柱上的保留时间均大于系统死时间且保留时间差异明显。这表明经过固定化后5-HT1AR、5-HTT和NET仍具有识别其特异性配体的生物活性。
表1配体在三种色谱模型上的色谱保留行为
Figure BDA0003431275760000071
实施例2抗抑郁活性单体在5-HT1AR、5-HTT和NET色谱模型保留行为研究
2.1实验方法
采用以上固定化5-HT1A R、5-HTT和NET色谱模型研究三种活性单体的保留行为。设置流动相为20mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；流速为0.2mL/min；检测波长：西红花苷I 440nm；木兰花碱238nm，丁基苯酞258nm；进样量：
5μL；柱温：25℃。
2.2实验结果
2.2.1单体在5-HT1AR色谱柱上的保留行为
图3为γ-氨基丁酸、京尼平苷、木兰花碱、四氢非洲防己碱、大麻二酚、京尼平、西红花苷I、丁基苯酞和L-茶氨酸在5-羟色胺受体(5-HT1AR)色谱柱的保留行为色谱图。由图可见γ-氨基丁酸、京尼平苷、四氢非洲防己碱、京尼平和丁基苯酞在固定化5-HT1AR色谱柱时候上的保留时间分别为1.983min，1.992min，2.023min，2.490min，1.983min均接近色谱系统死时间1.98min，表明这五种化合物在5-HT1AR色谱柱上不保留，不与5-HT1AR发生特异性结合。而木兰花碱(7.005min)、大麻二酚(7.841min)、西红花苷I(15.231min)、茶氨酸(7.081min)的保留时间均明显大与色谱系统死时间，表明这4种化合物于5-HT1A R有结合。
2.2.2单体在5-HTT色谱柱上的保留行为
图4为γ-氨基丁酸、京尼平苷、木兰花碱、四氢非洲防己碱、大麻二酚、京尼平、西红花苷I、丁基苯酞和L-茶氨酸在5-HTT色谱柱的保留行为色谱图。由图可见木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞在固定化5-HTT色谱柱上的保留时间分别为4.603min、23.986min和12.498min；三个活性单体在5-HTT色谱柱上的保留时间明显大于色谱系统死时间，表明其在5-HTT色谱柱上有保留，均可与5-HTT色谱柱发生特异性结合。而γ-氨基丁酸、京尼平苷、四氢非洲防己碱、大麻二酚、京尼平和L-茶氨酸保留时间均接近色谱系统死时间，表明这六种成分在5-HTT色谱柱上不保留，不与5-HTT发生特异结合。
2.2.3单体在NET色谱柱上的保留行为
图5为γ-氨基丁酸、京尼平苷、木兰花碱、四氢非洲防己碱、大麻二酚、京尼平、西红花苷I、丁基苯酞和L-茶氨酸NET色谱柱的保留行为色谱图。由图可见木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞在固定化NET色谱柱上的保留时间分别为5.166min、13.313min和14.695min；三个活性单体在NET色谱柱上的保留时间明显大于色谱系统死时间，表明三者在NET色谱柱上有保留，均可与NET色谱柱发生特异性结合。而γ-氨基丁酸、京尼平苷、四氢非洲防己碱、大麻二酚、京尼平和L-茶氨酸保留时间均接近色谱系统死时间，表明这六种成分在NET色谱柱上不保留，不与NET发生特异结合。
实施例3“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对活性成分筛选与鉴定
3.1实验方法
3.1.1川芎-栀子提取物的制备
(1)精密称取川芎药材5g，粉碎，过筛(20-40目)，加10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏8h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取栀子药材5g与步骤(1)中川芎药渣混合，加6倍量水，浸泡0.5h，回流提取3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩至相对密度为1.15～1.20(55℃)放冷，即得川芎-栀子提取物(HPLC图见图17C)，储存备用。
3.1.2酸枣仁-川芎提取物的制备
(1)精密称取川芎药材5g，粉碎，过筛(20-40目)，加10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏8h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取酸枣仁15g与步骤(1)中川芎药渣混合，加8倍量水，浸泡0.5h，回流提取3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩至相对密度为1.15～1.20(55℃)放冷，即得酸枣仁-川芎提取物(HPLC图见图17B)，储存备用。
酸枣仁-川芎-栀子提取物的制备
(1)精密称取川芎药材5g，粉碎，过筛(20-40目)，加10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏8h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取酸枣仁15g、栀子药材5g与步骤(1)中川芎药渣混合，加10倍量水，浸泡0.5h，回流提取3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩至相对密度为1.15～1.20(55℃)时喷雾干燥，即得酸枣仁-川芎-栀子提取物(简称三复方提取物)，储存备用。
3.1.3“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对提取物活性成分筛选
采用5-HT1AR、5-HTT和NET色谱模型分别对“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对中的活性成分进行筛选。色谱条件：色谱柱5-HT1AR、5-HTT和NET色谱柱(4.6×30mm，6μm)；流动相：20mM乙酸铵(pH＝7.4)；流速：0.2mL/min；检测波长：238nm；进样量：20μL；柱温：25℃，收集保留色谱峰进行进一步分析。
3.1.4“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对保留成分的质谱鉴定
采用高效液相色谱-离子阱质谱对收集的色谱峰进行鉴别。色谱条件为：色谱柱为安捷伦C18反相柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：千分之五甲酸水溶液和乙腈溶液(60:40，v:v)；流速：0.6mL/min；质谱条件：ESI电喷雾离子源；检测模式：负离子模式；雾化气流速：10L/min；干燥气温度：350℃；雾化器压力：35psi；质谱扫描范围：100-1500m/z。
3.2实验结果
3.2.1“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对中靶向5-HT1AR、5-HTT和NET活性成分筛选
川芎、栀子和酸枣仁均购自北京同仁堂药店，三者具有活血行气，泻火除烦、宁心安神等功效，现代药理研究表明该药对有抗抑郁的效果。5-HT1AR、5-HTT和NET是药物发挥药效的主要作用靶点。据此推断，“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对中可能有一些活性成分可与5-HT1AR、5-HTT和NET发生特异性结合。参照3.1.3项下色谱条件，采用固定化5-HT1AR、5-HTT和NET三种色谱模型对“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对提取物中的活性成分进行靶向筛选，结果见图6(A，B，C)，图7(A，B，C)药材提取物在固定化5-HT1A R、5-HTT和NET色谱柱上均有2个主要的色谱峰，根据色谱系统死时间分析峰1保留时间与死时间接近，认为该峰为不保留成分，即不含与5-HT1AR、5-HTT和NET发生特异性结合的成分；峰2保留时间明显大于色谱系统死时间，即峰2可能含有与固定化5-HT1A R、5-HTT和NET发生特异性结合的成分，因此，收集保留峰2对所含成分进一步分析鉴定。
3.2.2“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对5-HT1AR、5-HTT和NET靶向活性成分鉴定
采用3.1.4项下质谱分析条件，对三个色谱模型所收集保留峰2的主要成分进行鉴定分析。正负离子模式同时对保留峰2进行鉴定，结果发现负离子模式下质谱信号响应优于正离子模式，故在负离子模式下对保留成分进行定性分析。如图8-10所示，“川芎-栀子”药对中与固定化5-HT1AR发生特异性结合的成分为西红花苷I；与固定化5-HTT发生特异性结合的成分为丁基苯酞和西红花苷I；与固定化NET发生特异性结合的成分为丁基苯酞和西红花苷I，其色谱保留时间分别为西红花苷I 32.6min和丁基苯酞50.3min，其质核比分别为：m/z976.0和m/z 191.3。如图11-13所示，“酸枣仁-川芎”药对中与固定化5-HT1AR发生特异性结合的成分为木兰花碱；与固定化5-HTT发生特异性结合的成分为木兰花碱和丁基苯酞；与固定化NET发生特异性结合的成分为木兰花碱和丁基苯酞，其色谱保留时间分别为木兰花碱18.4min和丁基苯酞50.3min，其质核比分别为：m/z 342.0和m/z 191.5。对上述成分分别进行二级质谱鉴定分析并采用标准品进行对比。
表2“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对活性成分分析结果
Figure BDA0003431275760000111
实施例4活性成分与5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白相互作用研究
4.1实验方法
对以上筛选出与5-HT1AR有结合作用的化合物木兰花碱和西红花苷I，以及与5-HTT和NET有结合作用的木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞采用竞争洗脱法分别研究配体与三种靶蛋白之间的相互作用。以5-HT1AR工具药5-羟色胺；5-HTT工具药氟西汀；NET工具药托莫西汀为竞争剂，随着流动相中竞争剂浓度的增加，进样溶质的保留时间逐渐减小，说明竞争剂与溶质之间存在竞争关系，即作用于蛋白同类结合位点。
具体方法如下：5-HT1AR色谱柱在20mM磷酸盐缓冲盐流动相中加入不同浓度的5-羟色胺(0.2、0.5、1、2、5、10、20μm)、5-HTT色谱柱流动相中加入氟西汀(0.2、0.5、1、2、4、8、20μm)、NET色谱柱流动相中加入托莫西汀(0.2、0.5、1、2、4、8、20μm)作为竞争剂。在每种浓度下，分别进样5μL 0.01mM木兰花碱、0.01mM西红花苷I、0.01mM丁基苯酞作为进样溶质，流速0.2mL/min。
4.2实验结果
由图14可见在随着流动相中竞争剂浓度的增加西红花苷I和木兰花碱在5-HT1AR色谱柱上的保留时间明显减小。同样图15、图16可见木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞在5-HTT和NET色谱柱上的保留时间也随流动相中竞争剂浓度的增大而减小。其原因在于固定化受体柱上的药物特异性结合位点的数目固定，随流动相中竞争剂药物浓度增加，占据部分结合位点。若进样溶质与流动相中的竞争剂竞争同一结合位点，溶质则可快速占据药物结合位点，使得饱和色谱柱时间明显缩短。该结果表明在竞争剂与溶质西红花苷I和木兰花碱竞争固定化5-HT1A R相同位点，与溶质西红花苷I、木兰花碱和丁基苯酞竞争固定化5-HTT和NET相同结合位点。此外，采用竞争洗脱法测得有保留的三个单体与5-HT1AR的结合常数分别为木兰花碱：1.438×105(M-1)，西红花苷I：1.485×105(M-1)，其与5-HT1AR亲和力顺序为西红花苷I>木兰花碱(表3)；在5-HTT色谱柱上有保留的两个单体结合常数分别为木兰花碱：1.28×105(M-1)，西红花苷I：2.47×105(M-1)，丁基苯酞：1.54×105(M-1)，其与5-HTT亲和力顺序为西红花苷I>丁基苯酞>木兰花碱(表4)；在NET色谱柱上有保留的三个单体结合常数分别为木兰花碱：4.03×104(M-1)，西红花苷I：1.18×105(M-1)，丁基苯酞：8.55×104(M-1)，其与NET亲和力顺序为西红花苷I>丁基苯酞>木兰花碱(表5)。上述结果表明西红花苷I与三个靶点亲和力作用最强。
表3竞争置换法测定两种配体与5-HT1A R相互作用参数
Figure BDA0003431275760000131
表4竞争置换法测定三种配体与5-HTT相互作用参数
Figure BDA0003431275760000132
表5竞争置换法测定三种配体与NET相互作用参数
Figure BDA0003431275760000133
实施例5药对中三个活性单体含量测定
5.1实验方法
5.1.1色谱条件
色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱(4.6×250mm，5.0μm)；流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(洗脱程序见表)；流速0.8mL/min；检测波长238nm；柱温25℃。
表6梯度洗脱程序
Figure BDA0003431275760000141
5.1.4对照品溶液的制备
精密称取丁基苯酞对照品1.82mg、西红花苷I对照品0.82mg、木兰花碱对照品2.00mg，加甲醇分别配制成浓度为0.91mg/mL、0.43mg/mL、1.00mg/mL对照品溶液。分别取各对照品溶液适量，配制成浓度分别为91、215、250μg/mL的丁基苯酞、西红花苷I和木兰花碱混合对照品溶液。
5.1.5供试品溶液的制备
精密量“川芎-栀子”和“酸枣仁-川芎”药对提取物样品溶液1mL，置25mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。
5.2实验结果
图17为混合对照品溶液、栀子-川芎提取物和川芎-酸枣仁提取物色谱图，取“5.1.4”项下的混合对照品溶液1、3、5、8、10、12、1 5μL按上述色谱条件测定，以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程，结果见表7。依据所得线性方程计算出栀子-川芎提取液中西红花苷I和丁基苯酞含量分别为：0.121mg/g和0.098mg/g；酸枣仁-川芎提取液中木兰花碱和丁基苯酞含量分别为：0.27mg/g和0.101mg/g。含量测定可得木兰花碱、西红花苷I和丁基苯酞比例关系为：2.7:1.2:1，由此确定后续动物给药复配溶液配制比例(1.0-3.0﹕0.8-1.0﹕0.8-1.0)。
表7三种活性单体线性关系考察结果
Figure BDA0003431275760000151
实施例6慢性不可预知温和应激抑郁模型(CUMS)的建立及评价
6.1模型建立
在一定时间内让动物暴露于一系列重复的不可预知的温和刺激下，从而诱导出抑郁相关的行为。其主要模拟了人类抑郁症的核心症状，即快感缺乏，表现为运动活动性减少、兴趣快感缺乏、探索行为减少、易绝望等特点，具有高度的有效性，持续时间长。
将实验动物(C57BL/C小鼠，体重16～18g)予以夹尾1min、禁水24h、禁食24h、45热水游泳5min、昼夜颠倒24h、束缚1h、4℃冰水游泳5min等方法刺激。这7种刺激每天随机采取一种，共安排4周。即包括：4次24h禁食，4次24h禁水，4次昼夜颠倒，4次4℃冰水游泳5min，4次45℃热水游泳5min，4次1min夹尾，4次1h束缚。
每种刺激的操作方法如下：
(1)禁食：24h断料，即早8：00至次日早8：00不喂食。(2)禁水：24h断水，即早8：00至次日早8：00不喂水。
(3)昼夜颠倒：于早8：00将动物放入昼夜颠倒箱中，不开灯使动物处于黑暗状态；至晚20：00将昼夜颠倒箱的日光灯打开，使动物处于光照状态，直至次日早8：00取出。(4)冰水游泳：将动物放入盛有4℃冰水的桶中(水深15cm)，小鼠的后足尖刚能触及桶底，5min后将动物取出放回笼中。
(5)热水游泳：将动物放入盛有45℃热水的桶中(水深15cm)，小鼠的后足尖刚能触及桶底，5min后将动物取出放回笼中。
(6)夹尾：将小鼠放入固定笼中，露出尾部，用止血钳夹住距尾根1cm处(用力不要过大，使小鼠发出哀叫即可)持续1min后，将小鼠拉出放回笼中。
(7)束缚：将小鼠放入直径10cm的圆筒中，束缚1h。
6.2动物分组及给药
随机将C57BL/C小鼠分组(每组9只)，分别是正常对照组(C)、模型组(M)、木兰花碱组(Mag)、西红花苷I组(Cro)、丁基苯酞组(NBP)、木兰花碱+丁基苯酞(质量比3:0.8)组(简称Mag+NBP)、木兰花碱+西红花苷I(质量比3:0.8)组(简称Mag+Cro)、西红花苷I+丁基苯酞(质量比1:1)组(简称Cro+NBP)、木兰花碱+西红花苷I+丁基苯酞(质量比1:1:1)组(简称A1)、木兰花碱+西红花苷I+丁基苯酞(质量比3:0.8:0.8)组(简称A2)、酸枣仁-川芎-栀子提取物组(简称SCZ)、阳性药阿米替林组(简称Am)适应饲养一周，期间动物可自由摄食和饮水。饲养环境温度为22±2℃，湿度为45±2％。每天上午9:00-10:00。灌胃给药，C组和M组给予1.0mL生理盐水，SCZ组给药剂量为40mL(相当于原生药100g)/kg、Am组给药剂量为15mg/kg，其他组给药剂量均为15mg/kg，连续灌胃3周。
6.3行为学评价
6.3.1糖水偏好实验
测定前禁水、禁食24h，测定4h饮用1％蔗糖溶液的量，糖水偏好的计算公式为：糖水消耗量/总液体消耗×100％。
6.3.2强迫游泳实验
水温(23～25℃)的圆桶(桶高50cm，直径20cm)水深35cm，强迫游泳5min，记录小鼠的不动时间(s)，小鼠在水中处于被动漂浮，同时停止挣扎达到3s以上，则认为小鼠为不动状态。不动时间的计算公式为：不动时间/总时间×100％。
6.3.3小鼠悬尾实验
将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于支架上，头部距离台面15cm，进行摄像，C57BL/C小鼠采用白色背景。计时6min后停止，记录小鼠后4min不动时间。
6.4 CUMS模型小鼠血清及脑组织神经递质含量测定
行为学结束后，将小鼠断头取脑，取血，分离出前额叶皮层和海马，并用液氮冰冻，-80℃保存。按照ELISA说明书，对5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)含量进行测定。
6.5蛋白质印迹法检测小鼠脑部蛋白表达情况
用RIPA裂解液提取小鼠脑组织总蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，根据所测浓度加入Loading Buffer溶液，于100℃下变性煮沸7min，冷却到室温后样品保存在-80℃冰箱待测。根据5-HTR、5-HTT和NET的分子量选择相应浓度的SDS-PAGE胶(均为8％的分离胶)，以40μg上样量电泳进行蛋白质的分离，分离成功后湿法转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，将PVDF膜放入5％奶粉溶液中室温封闭1h，然后分别加入含有BDNF、5-HTR、5-HTT和NET一抗的抗体，于4℃冰箱过夜孵育。随后TBST缓冲液常温漂洗3次，加入羊抗兔二抗后常温孵育2h，ECL显影。采集条带灰度值，统计5-HT1AR、5-HTT和NET的灰度比值。
6.6实验结果
6.6.1 CUMS模型对C57BL/C小鼠体重的影响
图18为小鼠在4周造模及3周给药过程中体重变化，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的体质量呈缓慢下降趋势，表明CUMS刺激可能引起小鼠胃肠功能失调、食欲下降，导致小鼠个体生长迟缓；与模型小鼠相比给药组小鼠体重显著增加，A1、A2组小鼠体重变化趋势最接近Am组小鼠体重，呈缓慢上升趋势，说明药物干预影响了小鼠的体重消耗，并对快感缺失起到一定程度的改善。
6.6.2 CUMS模型对小鼠糖水偏好的影响
糖水偏好实验是慢性应激性抑郁模型最常用的评价指标。动物模型中出现蔗糖偏好下降的现象，是快感缺失的表现，为抑郁症的一个核心症状。如图19所示，与正常组相比抑郁模型组小鼠糖水偏好率显著降低，结果表明长期的应激刺激导致模型小鼠快感缺失，表明小鼠出现抑郁症状。而与模型组相比，给药之后小鼠糖水偏好率均有不同程度的回调，其中A1组(p<0.05)、A2组(p<0.001)糖水偏好率显著性升高，尤其是A2组与阳性药Am(p<0.001)组效果相当。
6.6.3 CUMS模型对小鼠强迫游泳的影响
强迫游泳实验反应动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，动物即表现出典型的“不动状态”，反映了一种“行为绝望状态”。实验通过观察CUMS模型小鼠的强迫游泳的静止时间(除维持其鼻子在水面上必要动作以外，没有任何其他动作)、挣扎时间(小鼠前爪剧烈运动)及游泳时间(前后爪有规律的上下划动)评价模型小鼠的绝望程度。如图20所示，与对照组相比，CUMS模型小鼠的游泳不动时间即静止时间更长，绝望状态更明显。在给药4周之后，对小鼠进行强迫游泳测试，结果显示，与模型组相比，给药组小鼠不动时间显著降低(p<0.05)，其中A1组和A2组(p<0.001)和阳性药Am(p<0.001)效果最显著。有趣地是单独给药NBP组(p<0.05)比联合给药组Mog+NBP组(p<0.05)及Cro+NBP组(p<0.05)，强迫游泳不动时间短。这说明单一Mog或Cro并不能增强NBP的效果，只有二者联合才能增强NBP的效果，例如A1组和A2组效果显著增强。
6.6.4 CUMS模型对小鼠悬尾不动时间的影响
利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态，抗抑郁药能明显地缩短改变其状态。如图21所示，与正常组相比，模型组小鼠悬尾不动时间显著增加(p<0.001)，表明CUMS抑郁小鼠出现抑郁核心症状；与模型组相比，给药组悬尾不动时间均显著降低，表明药物干预可缓解抑郁症状及小鼠绝望情绪。在各个给药组中A2组(p<0.001)与阳性药Am组(p<0.001)抗抑郁效果相当，A1组(p<0.05)与SCZ组(p<0.05)效果相当。
6.6.5 CUMS抑郁模型小鼠血清5-HT、NE和DA含量的变化
如图22所示，与正常组相比，模型组血清中DA、5-HT、NE含量显著降低(p＜0.001)；与模型小鼠相比治疗组小鼠血清中DA、5-HT、NE含量均显著升高，表面各给药组均具备上调血清中单胺类神经递质的作用。
6.6.6药物干预对小鼠大脑海马区和皮层区5-HT、NE和DA含量的影响
如图23，24所示，与正常组相比，模型组小鼠海马、皮层组织中DA、5-HT、NE含量显著降低(p＜0.001)。单胺类神经递质对脑神经元电化学信号的传导、神经元细胞的连接以及再生等过程起到积极的作用，共同调节着机体的记忆、情绪调节、认知等过程。因此脑内DA、5-HT、NE含量变化均表明慢性不可预知温和刺激可成功诱导小鼠抑郁模型。与模型小鼠相比治疗组小鼠海马和皮层组织中DA、5-HT、NE含量均显著升高。
6.6.7药物干预对小鼠脏器系数的影响
脏器指数是指实验动物脏器的重量与其体重之比值，正常时各脏器与体重的比值恒定。动物染毒后，受损脏器重量会发生改变，脏器指数也会发生变化。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。如图25所示，CUMS抑郁小鼠在3周连续口服治疗药物后，心脏、肝脏、脾、肺、肾组织脏器指数并未发生显著变化，表明筛选出的活性成分毒性较低，不会对小鼠脏器造成损伤。
6.6.8药物干预对小鼠脑部5-HT1AR、5-HTT和NET蛋白表达水平的影响
5-HT1AR如图26所示，与正常组相比，模型组小鼠脑组织中5-HT1AR相对表达量减少(p＜0.05)；5-HTT和NET相对表达量增加。与模型组相比，A2组与Am组小鼠脑组织中5-HT1AR相对表达量显著增加，表明A2组可能通过调节5-HT1AR表达，发挥抗抑郁作用。而治疗组中5-HTT和NET相对表达量显著降低(p＜0.05)，尤其是A2组、Mag+Cro组与阳性药Am组效果相当，表明A2组、Mag+Cro组可通过调节转运体表达抑制突出间隙对5-HT以及NET的再摄取，提高突出间隙5-HT和NET的浓度，从而发挥抗抑郁作用。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以治疗有效量的木兰花碱、丁苯酞和西红花苷I作为有效成分。该药物组合物还可包括药学上可接受的药用辅料。该药物组合物还可包括其他治疗抑郁症的活性成分或药物。
2.权利要求1所述的抗抑郁药物组合物，其特征在于按重量份计，优选包含木兰花碱1.0-3.0份、西红花苷I 0.8-1.0份、丁苯酞0.8-1.0份作为有效成分。
3.权利要求2所述的药物组合物，其特征在于按重量份计，该药物组合物由以下有效成分组成：木兰花碱1.0-3.0份、西红花苷I 0.8-1.0份、丁苯酞0.8-1.0份。
4.权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于按重量份计，木兰花碱:西红花苷I:丁苯酞＝3:1:1。
5.权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于按重量份计，木兰花碱:西红花苷I:丁苯酞＝1:1:1或3:0.8:0.8。
6.权利要求1-5任一项所述的抗抑郁药物组合物还可包括药学上可接受的药用辅料。该药物组合物还可包括其他治疗抑郁症的活性成分或药物。
7.权利要求6所述的药物组合物，其特征在于其剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体制剂，优选片剂、胶囊、注射剂，包括缓释片剂、缓释胶囊、缓释注射剂。
8.一种酸枣仁-川芎-栀子提取物，其特征在于其制备方法包括如下步骤：
(1)精密称取川芎药材1份，粉碎，过筛(20-40目)，加6-10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏6-10h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取酸枣仁3份、栀子药材1份与步骤(1)中川芎药渣混合，加6-10倍量水，浸泡0.5h，回流提取2-3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩后、冷冻干燥，即得所述酸枣仁-川芎-栀子提取物。
9.权利要求1-7任一项所述的药物组合物、权利要求8所述的酸枣仁-川芎-栀子提取物作为改善和/或治疗抑郁症、焦虑症的药物的应用。
10.权利要求8所述的抗抑郁酸枣仁-川芎-栀子提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)精密称取川芎药材1份，粉碎，过筛(20-40目)，加6-10倍量水，浸泡0.5h，水蒸气蒸馏6-10h，提取挥发油，蒸馏后的水溶液及药渣备用；
(2)精密称取酸枣仁3份、栀子药材1份与步骤(1)中川芎药渣混合，加6-10倍量水，浸泡0.5h，回流提取2-3次，每次1h。合并提取液及与步骤(1)中蒸馏后的水溶液，浓缩后、冷冻干燥，即得所述酸枣仁-川芎-栀子提取物。
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