CN114113222A - 基于固态纳米孔技术对脂多糖定性或菌种来源鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法以及利用所述的方法判定脂多糖菌种来源及同菌种不同亚型的方法。所述脂多糖的鉴定方法为：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。本发明创造性地将固态纳米孔应用于脂多糖检测，并联用化学共价修饰策略，能有效抑制脂多糖检测过程的非特异性吸附，所述方法操作简便、成本低、灵敏度高、准确性好，能够通过分析脂多糖穿过纳米孔的特征数据判定脂多糖的对应菌种来源及同菌种不同亚型。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法以及利用所述的方法判定脂多糖菌种来源及同菌种不同亚型的方法。
背景技术
脂多糖(LPS)又名内毒素，是大多数革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。细菌内毒素广泛存在于环境中，在食品领域及很多医疗行业中用到的器械、生产过程中的原辅料、产品等都有着不同程度的污染。当细菌病原微生物入侵机体时可引起机体发热、微循环障碍、内毒素休克、播散性血管内凝血乃至全身炎症反应综合症，是脓毒症的主要诱发因子之一。
鉴于细菌内毒素毒性，脂多糖检测对确保产品质量、保障使用安全具有重要的参考价值。而不同细菌菌种来源的内毒素生物活性相差很大，因此，实现不同菌种的LPS区分有重要临床生物学意义。
传统病原体检测技术如微生物技术、生化或血清学方法等，获得的结果只能定性且准确性不高，且操作繁琐、成本高，不能精确鉴别所检测的菌株种类。而大多商用测试基于特定标记物(如内毒素)的免疫化学检测，或脂多糖血清型测定、荧光分析、标记细胞，需要高浓度样品，价格昂贵。另外，这些方法仅限于实验室测试，需要专业技术操作员，限制了它们的普遍应用。单分子纳米孔检测技术是一种检测灵敏度高、可实现快速检测、对检测样品特异性十分明显的检测技术。该技术在DNA、RNA以及蛋白质分子的结构、序列和相互作用等的检测中已经占据了重要位置。目前尚无纳米孔检测脂多糖的技术相关的专利申请。
本发明建立了一种全新的脂多糖鉴定方法，创造性地将固态纳米孔应用于脂多糖鉴定，可实现对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测，并通过脂多糖穿过纳米孔的特征数据分析来精确判定所检测的细菌种类和同菌种不同亚型。同时通过外加电压的极性能判别穿孔脂多糖分子的荷电状态，也是除了物理尺寸外，对脂多糖分子在溶液中自组装构象态电荷分布差异的鉴别方式。另外，通过调节检测缓冲体系中不同双亲分子与LPS的结合情况，能提高对单分子LPS结构鉴别的准确度。本发明技术方案具有快速、灵敏、精准的技术优势。
发明内容
有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种鉴定脂多糖的方法，该方法具高灵敏度和高精确性，为实现上述目的，本发明的技术方案为：
基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法，其特征在于：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
优选的，所述待测样本中的脂多糖含量可以低至μg/mL级的。比如，在实施例中，我们采用的样本为10μg/mL。
优选的，在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖的菌种来源和/或同菌种不同亚型进行判定。
优选的，所述固态纳米孔用带末端羧基的硅烷分子进行修饰，所述纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜。
优选的，所述固态纳米孔的直径为3-4nm。
优选的，在外加电压下测试脂多糖在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比，并作为对应菌种来源和/或同菌种不同亚型的脂多糖的特征数据。
优选的，在外加电压下测试脂多糖的电荷分布对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
优选的，在外加电压下测试缓冲体系中脂多糖与不同双亲分子的结合情况对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
优选的，所述纳米孔用硅烷试剂进行化学修饰，所述修饰为在通氮气条件下，将活化处理后的纳米孔置于硅烷试剂的酸性水溶液中轻微震荡反应制得孔壁带硅烷分子的固态纳米孔。
优选的，所述活化处理方式为用体积比为H2SO4:H2O2＝3:1的食人鱼洗液浸泡。
优选的，食人鱼洗液的浸泡温度为80℃，浸泡时间为0.5-1h。
优选的，所述硅烷试剂酸性水溶液由等体积的硅烷试剂与乙酸加入到去离子水中稀释100倍制得。
优选的，纳米孔与硅烷试剂酸性水溶液在室温条件下反应1-2h。
优选的，所述纳米孔用电介质击穿薄膜的方式制备得到。
优选的，所述的介电击穿薄膜的具体方法为：将纳米孔载体材料经食人鱼洗液80度，0.5-1小时去污活化处理后再于溶液(VH2O：V乙醇＝1:1)浸泡，安置于测试池Flowcell中，对其施加电流脉冲，以介电击穿薄膜的方式，制备纳米孔孔道。
优选的，用体积比为去离子水：乙醇＝1:1溶液的浸泡中30min。
优选的，所使用的的击穿电压在13V以内，电导液为1M KCl,10mM Tris,1mM EDTA(pH 8)。
优选的，所述纳米孔载体材料为硅基氮化硅薄膜。
优选的，硅基氮化硅薄膜的膜厚为15nm，窗口大小为10μm2。
优选的，所述纳米孔直径为3-4nm。
本发明目的之二在于提供一种可以鉴定脂多糖菌种来源的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用前述方法来判定脂多糖菌种来源和/或同菌种不同亚型的方法，具体包括以下步骤：
(1)纳米孔制备：去除纳米载体材料表面的杂质后用食人鱼洗液浸泡，经清洗后用介电质击穿薄膜的方式制备纳米孔；
(2)硅烷分子的固定：在通氮气条件下，将步骤(1)所得纳米孔置于酸性硅烷试剂水溶液进行轻微震荡反应制得固定有硅烷分子的固态纳米孔；
(3)在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
优选的，步骤(1)中去除纳米孔载体材料表面的杂质的步骤为：用去离子水浸泡去除表面的无机杂质；用体积比为乙醇：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除表面的有机杂质。
优选的，步骤(2)中所述酸性硅烷试剂水溶液由等体积的硅烷试剂与乙酸加入到去离子水中反应制得。
优选的，纳米孔与硅烷试剂水溶液在室温条件下反应1-2h。
优选的，步骤(3)中在外加电压50mV下测试不同菌种来源的待测样本。
优选的，步骤(3)中待测样本的脂多糖的浓度为1-10μg/mL的LPS。
优选的，步骤(3)过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值储存于数据库中作为标准参考值。
优选的，将所述标准参考值的集合建立数据库。
优选的，所述食人鱼洗液的浸泡处理具体为：将硅基氮化硅薄膜用体积比为H2SO4:H2O2＝3:1的食人鱼洗液浸泡进行亲水性活化处理。
优选的，浸泡温度为80℃，浸泡时间为0.5-1h。
优选的，所述的介电质击穿薄膜的具体方法为：
将纳米孔载体材料薄膜经溶液(VH2O：V乙醇＝1:1)浸泡后，安置于测试池Flowcell中，对其施加电流脉冲，以介电质击穿薄膜的方式，制备纳米孔孔道。
优选的，在体积比为去离子水：乙醇＝1:1的溶液中浸泡30min.。
优选的，所使用的的击穿电压在13V以内，电导液为1M KCl,10mM Tris,1mM EDTA(pH 8)。
优选的，所述纳米孔载体材料为硅基氮化硅薄膜。
优选的，硅基氮化硅薄膜的膜厚为15nm，窗口大小为10μm2。
优选的，所述纳米孔直径为3-4nm。
本发明的有益效果在于：
1、本方法基于固态纳米孔电学检测技术，创造性地将固态纳米孔应用于细菌内毒素脂多糖鉴定，采集外加偏压脂多糖通过纳米孔通道的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比，可实现对待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测，并通过脂多糖的穿孔特征数据分析精确判定所检测的细菌种类及菌种亚型。
2、本发明构建的使用硅烷试剂修饰的固态纳米孔检测脂多糖，能够有效避免脂多糖检测过程的非特异性吸附。
3、相比于传统的脂多糖检测方法，本发明的检测方法具有快速、高灵敏性、高精准性、操作简便以及成本低的技术优势。
附图说明
图1为利用经硅烷分子修饰的固态纳米孔检测脂多糖的原理示意图；
图2为脂多糖(Escherichia coli 0111:B4)在外加电压50mV下穿过实施例的经硅烷分子修饰的纳米孔的过孔电流幅值与相应的过孔时间关系的统计散点图；
图3为浓度为10μg/mL的Escherichia coli 0111:B4在外加电压50mV下穿过实施例的经硅烷分子修饰的纳米孔的特征数据统计分布图，其中a为过孔时间柱状统计图，b为过孔电流幅值柱状统计图，c为过孔电流相对幅值比柱状统计图。
图4为浓度为10μg/mL的LPS salmonella在外加电压50mV下穿过实施例的经硅烷分子修饰的纳米孔的特征数据统计分布图，其中a为过孔时间柱状统计图，b为过孔电流幅值柱状统计图，c为过孔电流相对幅值比柱状统计图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整所获得的技术方案，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：硅烷分子修饰的固态纳米孔的制备方法
所述方法包括以下步骤：
(1)清洗硅基氮化硅薄膜
首先将硅基氮化硅薄膜(膜厚：15nm，窗口大小：10μm2)用去离子水浸泡5-10min，去除表面的无机杂质；然后用体积比丙酮：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡，去除表面的有机杂质；用去离子水清洗一遍烘干；再将烘干后的硅基氮化硅薄膜用食人鱼洗液(体积比H2SO4:H2O2＝3:1)在80℃条件下浸泡0.5-1.5h；随后置于去离子水(45℃)溶液中，三次浸泡(每次5min.)清洗去除氮化硅薄膜上的酸液备用。
(2)制备纳米孔
将清洗后的硅基氮化硅薄膜浸泡于溶液(体积比为去离子水：乙醇＝1:1)中30min；随后安置于测试池Flowcell中，对其施加电流脉冲，以介电质击穿薄膜的方式(击穿电压控制在13V以内)，制备直径为3-4nm的孔道，所使用电导液为1M KCl,10mM Tris,1mMEDTA(pH 8)；利用膜片钳测定I-V曲线得出纳米孔的电导G，再由模拟公式计算纳米孔的直径。
(3)硅烷链接分子的固定
在通氮气条件下，取等体积的硅烷试剂与乙酸试剂加入到5mL去离子水中，通过磁力搅拌台反应0.5-1h，得到酸性硅烷试剂水溶液。将上述亲水活化处理后的纳米孔放入此硅烷试剂中室温反应1-2h。反应后将基片用体积比为乙酸：去离子水＝1:100的溶液充分清洗3-5次，烘干后得到经硅烷分子修饰的固态纳米孔。实施例2：利用实施例1制得的经硅烷分子修饰的固态纳米孔检测脂多糖(LPS B4)
包括以下步骤：
(1)待检测样品的准备
使用无热原水配制脂多糖(LPS Escherichia coli 0111:B4)母液(1mg/mL)，涡旋振荡使其完全溶解，再用测试缓冲液(1M KCl,20mM MES,pH 6)稀释至浓度为1-10μg/mL。
(2)检测并采集特征数据
用去离子水清洗flowcell两腔室后，再注入测试缓冲液(1M KCl,20mM MES,pH6)，再将步骤(1)中准备好的待检测样品换注到膜端腔室。在外加电压50mV下，采集脂多糖穿过所述经硅烷分子修饰的纳米孔的过孔电流幅值与过孔时间，分析得到LPS的过孔电流幅值与相应的过孔时间关系，并绘制对应的统计散点图(见图2)。
实施例3：利用实施例1制得的经硅烷分子修饰的固态纳米孔检测不同菌种来源的脂多糖
包括以下步骤：
(1)待检测样品的准备
使用无热原水分别配制LPS Escherichia coli 0111:B4和LPS salmonella母液(1mg/mL)，涡旋振荡使其完全溶解，再分别用测试缓冲液(1M KCl,20mM MES,pH 6)稀释至浓度为1-10μg/mL。
(2)检测并采集LPS特征数据
去离子水清洗flowcell两腔室后，再注入测试缓冲液(1M KCl,20mM MES,pH 6),测试50mV电压下的空白电流，再将步骤(1)中准备好的LPS B4待检测样品分别换注到膜端腔室，采集LPS B4穿过所述纳米孔的过孔时间、过孔电流幅值及过孔电流相对幅值比作为特征数据，分析得到LPS B4特征数据统计分布图(见图3)，其中图3a为LPS B4过孔时间柱状统计图，图3b为LPS B4过孔电流幅值柱状统计图，图3c为LPS B4过孔电流相对幅值比柱状统计图。
(3)检测并采集LPS salmonella特征数据
去离子水清洗flowcell两腔室后，再注入测试缓冲液(1M KCl,20mM MES,pH 6),测试50mV电压下的空白电流，再将步骤(1)中准备好的LPS salmonella待检测样品分别换注到膜端腔室，采集LPS salmonella穿过所述纳米孔的过孔时间、过孔电流幅值及过孔电流相对幅值比作为特征数据，分析得到LPS salmonella特征数据统计分布图(见图4)，其中图4a为LPS salmonella过孔时间柱状统计图，图4b为LPS salmonella过孔电流幅值柱状统计图，图4c为LPS salmonella过孔电流相对幅值比柱状统计图。
通过统计图可以看出两种不同的菌种的脂多糖在纳米孔检测中，过孔时间、过孔电流幅值和过孔电流相对幅值比都有明显的差别，表明本发明的利用固态纳米孔检测脂多糖的方法能实现不同菌种的有效区分。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.基于固态纳米孔技术鉴定脂多糖的方法，其特征在于：在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖的菌种来源和/或同菌种不同亚型进行判定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔用硅烷分子进行修饰，所述纳米孔的载体材料为硅基氮化硅薄膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔的直径为3-4nm。
5.用权利要求1-4任一所述的方法来判定脂多糖菌种来源和/或同菌种不同亚型的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)纳米孔制备：去除纳米孔载体材料表面的杂质后用食人鱼洗液浸泡，经清洗后用介电质击穿薄膜的方式制备纳米孔；
(2)硅烷分子的固定：在通氮气条件下，将步骤(1)所得纳米孔放入酸性硅烷试剂水溶液进行反应制得固定有硅烷分子的固态纳米孔；
(3)在外加电压下测试待测样本在固态纳米孔中的过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值比对所述待测样本中的脂多糖进行定性检测和/或定量检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中去除纳米孔载体材料表面的杂质的步骤为：用去离子水浸泡去除表面的无机杂质；用体积比为乙醇：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除表面的有机杂质。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述酸性硅烷试剂水溶液由等体积的硅烷试剂与乙酸加入到去离子水中反应制得。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)中在外加电压50mV下测试不同菌种来源的待测样本。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤(3)中待测样本的脂多糖的浓度为1-10μg/mL的LPS。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:步骤(3)过孔时间和/或过孔电流幅值和/或过孔电流相对幅值储存于数据库中。
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