CN114107528A - 一种检测中华绒螯蟹螺原体的恒温快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组检测中华绒螯蟹螺原体的引物组，所述引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；所述外引物F3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:2所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如：SEQ ID NO:3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如：SEQ IDNO:4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如：SEQ ID NO:5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如：SEQ ID NO:6所示。本发明提供的检测中华绒螯蟹螺原体的检测试剂盒，可从基质复杂的样品中检测中华绒螯蟹螺原体，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好和操作便捷快速的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测中华绒螯蟹螺原体的恒温快速检测试剂盒。
背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、绒螯蟹属(Erioc heir)，俗称河蟹、大闸蟹，是一种高价值的经济水产品，是全国的主要经济蟹类之一。在我国淡水养殖业中所占的比重较大。随着集约型养殖业的发展，细菌、病毒以及寄生虫等病原体引发的疾病越来越多，给中华绒螯蟹养殖业带来严重的打击。
中华绒螯蟹螺原体属于细菌域(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、柔膜体纲(Mollicutes)、虫原体目(Entomoplasmatale)、螺原体科(Spiroplasmat aceae)，是目前报道的能感染水生动物的螺原体微生物之一，可侵染中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Li topenaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)以及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等多个水生甲壳动物宿主，是中华绒螯蟹颤抖病的病原菌，可侵染中华绒螯蟹机体所有器官的结缔组织，严重时可导致宿主死亡，给中华绒螯蟹养殖业造成了严重的损失。目前，关于中华绒螯蟹螺原体的检测方法研究很少。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，在传统PCR技术的技术上进行了改进，设计了4条或6条不同的特异性引物针对靶基因的6个或8个位点，在一种链置换活性DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，实现DNA在恒温条件下的快速扩增。该方法已在临场疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域得到广泛应用。但目前还有待开发特异性好、灵敏度高的中华绒螯蟹螺原体检测技术。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一组检测中华绒螯蟹螺原体的引物组和一种检测中华绒螯蟹螺原体的恒温快速检测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一组检测中华绒螯蟹螺原体的引物组。
本发明的第二个目的是提供所述引物组在制备检测中华绒螯蟹螺原体产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一组检测中华绒螯蟹螺原体的引物组，所述引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；所述外引物F3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:2所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如：SEQ ID NO:3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如：SEQ ID NO:4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如：SEQ ID NO:5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如：SEQ ID NO:6所示。
所述引物组在制备检测中华绒螯蟹螺原体产品中的应用。
一种检测试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物组。
优选地，所述试剂盒中还包含DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，阳性对照和阴性对照。
更优选地，所述的2×反应缓冲液由Buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，三者的体积比为9～11：7～9：5～7。
最优选地，所述的2×反应缓冲液由Buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，三者的体积比为10：8：6。
更优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为SYTO-9绿色荧光核酸染料，密封液为矿物油。
更优选地，所述阳性模板为含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。
优选地，所述试剂盒的反应体系为：所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB浓度分别为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、1.4～1.8μM、1.4～1.8μM、0.8～1.2μM和0.8～1.2μM，2×反应液12.4～12.6μL，DNA聚合酶6～10U，SYTO-9绿色荧光核酸染料0.3～0.7μL，待检样品2～3μL，加灭菌超纯水至25μL。
更优选地，所述试剂盒的反应体系为：所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、1.0μM和1.0μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.04mMSYTO-9绿色荧光核酸染料0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL。
更优选地，所述反应体系的反应条件为63～65℃反应30～45min。
最优选地，所述反应体系的反应条件为63℃反应45min。
所述试剂盒在检测中华绒螯蟹螺原体中的应用。
本发明根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有中华绒螯蟹螺原体；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有中华绒螯蟹螺原体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种检测中华绒螯蟹螺原体的恒温快速检测试剂盒，可直接从基质复杂(指检测中，背景基质对检测指标存在干扰，通常指宿主基因组核酸对检测靶标的干扰)的样品中检测中华绒螯蟹螺原体，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好和操作便捷快速的优点。
(1)特异性好：本发明用于引物设计的靶标基因是螺原体DNA的一段特异性片段(DQ917753.1)，针对该目的片段设计六条特异引物进行扩增，特异性强，对中华绒螯蟹常见细菌性疾病病原，如迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、点状气单胞菌、拟态弧菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌不存在扩增。
(2)灵敏度高：对于含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的阳性质粒，最低检出限可达到102copies/μL；
(3)实验重复性高：对阴性样本进行20次重复实验，引物没有扩增；对阳性对照(质粒浓度105copies/μL)进行20次重复实验，Ct值变异系数≤5％；
(4)操作便捷：不需要使用昂贵和精密的设备，对仪器要求低，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较简单。
(5)鉴定简单：可直接从复杂样品中检测中华绒螯蟹螺原体，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，适合现场快速、准确检测。
附图说明
图1为实施例1中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体引物组的实际样品结果示意图，其中1为中华绒螯蟹螺原体引物组1阳性对照，其中2为中华绒螯蟹螺原体引物组2阳性对照，3为中华绒螯蟹螺原体引物组1阴性对照，4为中华绒螯蟹螺原体引物组2阴性对照。
图2为实施例2中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体的实际样品结果示意图，其中1为阳性对照，2为样品4，3为样品5，4为样品1，5为样品2，6为样品3，7为阴性对照。
图3为实施例3中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体的阴性样本重复性结果示意图，其中1为阳性对照，2为阴性样本。
图4为实施例4中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体的质粒DNA灵敏度结果示意图，其中1为107copies/μL，2为106copies/μL，3为105copies/μL，4为104copies/μL，5为103copies/μL，6为102copies/μL，7为101copies/μL，8为阴性对照。
图5为实施例5中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体的阳性对照稳定性结果示意图，其中1为105copies/μL，2为阴性对照。
图6为实施例6中LAMP法检测中华绒螯蟹螺原体的实际样品特异性结果示意图，其中1为含中华绒螯蟹螺原体样品，2为含拟态弧菌样品，3为嗜水气单胞菌样品，4为含点状产气单胞菌样品，5为副溶血弧菌样品，6为迟缓爱德华氏菌样品，7为鳗弧菌样品，8为阴性样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物组对检测中华绒螯蟹螺原体的影响
一、设计引物
以中华绒螯蟹螺原体DNA特异片段基因(DQ917753.1)为靶基因，设计LAMP引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
中华绒螯蟹螺原体的引物组1：
外引物F3：AATACATAGGTGGCAAGCG(SEQ ID NO:1)；
外引物B3：CTTACACTAGCAGTCTCGTTAG(SEQ ID NO:2)；
内引物FIP：GCCTTCGCCACTGGTGTACTAGAGTGTAGGAGAGGTTG(SEQ ID NO:3)；
内引物BIP：ACCAAGGCTTGACATCCAGTGGCACGAGCTGACGAC(SEQ ID NO:4)；
环引物LF：TCACCGCTACACATGGAATT(SEQ ID NO:5)；
环引物LB：TAGAGGTTAACATTGAGACAGGTG(SEQ ID NO:6)。
中华绒螯蟹螺原体的引物组2：
外引物F3：GTGCGGCGTATTAGCTTGT(SEQ ID NO:7)；
外引物B3：TTCAGTCACGCGGCATTG(SEQ ID NO:8)；
内引物FIP：GGCCGATCACCCTCTCAGGTTGGTGGGGTAATGGCCTAC(SEQ ID NO:9)；
内引物BIP：CATCGGGACTGAGACACGGCAGGCTTTCGCCCATTGTG(SEQ ID NO:10)；
环引物LF：CGGCTACGTATCATCGCCTTG(SEQ ID NO:11)；
环引物LB：CCGAACTCCTACGGGAGGCA(SEQ ID NO:12)。
二、环介导等温扩增检测反应
反应体系为：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、1.0μM、1.0μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.04mM SYTO-9绿色荧光核酸染料0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；
反应条件为：63℃反应45min。
三、引物筛选结果
如图1所示，中华绒螯蟹螺原体的引物组1出峰时间早于引物组2，引物组1荧光值高于引物2，两组引物组均未出现非特异性扩增，应选择中华绒螯蟹螺原体引物组1作为检测中华绒螯蟹螺原体的引物组。
实施例2一种检测中华绒螯蟹螺原体的LAMP检测试剂盒
一、组成
一组实施1中检测中华绒螯蟹螺原体的LAMP引物组(SEQ ID NO:1～6)，DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，阳性对照和阴性对照。
具体地，检测中华绒螯蟹螺原体的LAMP引物组(SEQ ID NO:1～6)中，
外引物F3：AATACATAGGTGGCAAGCG(SEQ ID NO:1)；
外引物B3：CTTACACTAGCAGTICTCGTTAG(SEQ ID NO:2)；
内引物FIP：GCCTTCGCCACTGGTGTACTAGAGTGTAGGAGAGGTTG(SEQ ID NO:3)；
内引物BIP：ACCAAGGCTTGACATCCAGTGGCACGAGCTGACGAC(SEQ ID NO:4)；
环引物LF：TCACCGCTACACATGGAATT(SEQ ID NO:5)；
环引物LB：TAGAGGTTAACATTGAGACAGGTG(SEQ ID NO:6)。
2×反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，体积比为10：8：6。
DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为0.04mM SYTO-9，密封液为矿物油。
阳性对照为含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的质粒DNA，阴性对照为灭菌超纯水。
二、使用方法
1.待检样品的处理：
取中华绒螯蟹肌肉组织0.1g剪碎，转移到1.5mL离心管中。
2.DNA的制备：
向离心管中加入400μL裂解液，振荡混匀30s。室温放置5～10min，10000rpm离心3min去除杂质。取出试剂盒中的核酸吸附柱套管，尽可能多的转移上清液至柱子中，10000rpm离心1min。倒弃滤液后把核酸吸附柱套回收集管中，加入500μL洗涤液至吸附柱中，10000rpm离心1min。再加入400μL洗涤液，10000rpm离心1min，弃滤液，10000rpm空离3min，将核酸吸附柱转移至新的1.5mL离心管，加入100μL洗脱液至柱子的膜中央。室温静置1min，10000rpm离心1min。弃去柱子，完成提取于-20℃保存备用。
3.环介导等温扩增检测反应：
试剂盒的反应体系为：外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：8：5，具体地，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、1.0μM、1.0μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.04mM SYTO-9绿色荧光核酸染料0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；
反应条件为：63℃反应45min。
对提取的DNA进行检测，同时设置阴性对照。
三、结果判定
如图2所示，结果表明：对5个中华绒螯蟹螺原体阳性样品用建立的检测中华绒螯蟹螺原体的LAMP试剂盒进行检测，样品呈现典型的“S”型曲线扩增，为阳性结果，证明样品中检出中华绒螯蟹螺原体。反之，结果为阴性。
实施例3重复性实验
阴性样本设置20次平行，阳性对照设置2次平行。使用实施例2的试剂盒进行检测。
如图3所示，结果表明：阴性样本重复20次检测没有出现扩增，证明实施例2的试剂盒重复性良好。
实施例4灵敏度实验
将阳性对照质粒DNA进行10倍梯度稀释，分别以107copies/μL、106copie s/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL和101copies/μL七个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照(灭菌超纯水)，使用实施例2的试剂盒进行检测。
如图4所示，结果表明：将阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后，实施例2的试剂盒可检测浓度为102copies/μL的阳性质粒DNA。
实施例5稳定性实验
以浓度为105copies/μL的阳性质粒为模板DNA，设置20次平行，同时设置阴性对照(灭菌超纯水)，使用实施例2的试剂盒进行检测。
如图5所示，结果表明，阳性质粒浓度重复20次进行检测实验，重复性良好，Ct值变异系数≤5％，证明实施例2的试剂盒稳定性良好。
实施例6特异性实验
用实施例2中的试剂盒分别检测含拟态弧菌、嗜水气单胞菌、点状产气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌及中华绒螯蟹螺原体的样品。
如图6所示，结果表明，仅含中华绒螯蟹螺原体的样品出现扩增曲线，其余样品没有扩增，显示实施例2建立的检测中华绒螯蟹螺原体的LAMP试剂盒特异性良好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州双螺旋基因技术有限公司
黄埔海关技术中心
象山县水利和渔业局
<120> 一种检测中华绒螯蟹螺原体的恒温快速检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatacatagg tggcaagcg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttacactag cagtctcgtt ag 22
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttcgcca ctggtgtact agagtgtagg agaggttg 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accaaggctt gacatccagt ggcacgagct gacgac 36
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaccgctac acatggaatt 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagaggttaa cattgagaca ggtg 24
Claims (10)
1.一组检测中华绒螯蟹螺原体的引物组，其特征在于，所述引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；所述外引物F3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如：SEQ ID NO:2所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如：SEQ ID NO:3所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如：SEQ ID NO:4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如：SEQ IDNO:5所示，所述环引物LB的核苷酸序列如：SEQ ID NO:6所示。
2.权利要求1所述引物组在制备检测中华绒螯蟹螺原体产品中的应用。
3.一种检测中华绒螯蟹螺原体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液由Buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，三者的体积比为9～11：7～9：5～7。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为SYTO-9绿色荧光核酸染料，密封液为矿物油。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性模板为含有中华绒螯蟹螺原体检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。
8.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：权利要求1所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB浓度分别为0.1～0.3μM、0.1～0.3μM、1.4～1.8μM、1.4～1.8μM、0.8～1.2μM和0.8～1.2μM，2×反应液12.4～12.6μL，DNA聚合酶6～10U，SYTO-9绿色荧光核酸染料0.3～0.7μL，待检样品2～3μL，加灭菌超纯水至25μL。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：权利要求1所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、1.0μM和1.0μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.04mM SYTO-9绿色荧光核酸染料0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系的反应条件为63～65℃反应30～45min。
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2021
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