CN114106094B - 一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽、多肽衍生物、纳米纤维及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽、多肽衍生物、纳米纤维及其应用，所述多肽衍生物可以模拟釉基质蛋白的生物活性，即促进人牙髓细胞的成牙本质分化相关基因和蛋白的表达，提高碱性磷酸酶的活性并诱导矿化结节的形成。所述多肽化学结构明确、分子量小、生产方法简单、产率高、成本低。所述多肽衍生物可以在水溶液中自组装形成水凝胶，微观结构为纳米纤维，可以有效诱导分化矿化。所述可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物序列为Nap‑Gly‑Phe‑Phe‑Tyr‑Lys‑Trp‑Tyr‑Gln‑Asn‑Met‑Ile‑Arg，其中Phe‑Phe‑Tyr为D构型，端基Nap代表2‑萘乙酸。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体来说涉及一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽、多肽衍生物、纳米纤维及其应用。
背景技术
牙本质-牙髓复合体是一种高度专业化的组织，用于保护重要的牙齿。它可能因龋齿、外伤等而损坏。牙本质-牙髓复合体的再生对于恢复牙齿的活力具有重要意义。目前的方法旨在通过刺激驻留或移植的干/祖细胞的分化来再生牙本质-牙髓复合体。最近，一些报道已经证实，包括蛋白质、生长因子和激素在内的生物活性分子在牙本质-牙髓复合物的再生中具有巨大的潜力。从猪牙芽中提取的牙釉质基质衍生物(EMDs)具有多种生物学功能，包括牙髓细胞(DPC)的牙源性分化和牙髓暴露后刺激牙本质桥的形成，使其广泛应用于再生工程和仿生矿化。然而，由于原材料和提取方法的不完全一致性，EMDs的结果通常是不稳定的。
牙釉蛋白家族占EMDs成分的90％，包含许多负责多种生物学功能的同种型。研究报道，富含亮氨酸的牙釉蛋白肽(LRAP)是牙釉蛋白的20kDa剪接产物，可作为信号分子诱导成牙骨质细胞和DPCs的分化。TRAP是一种N端富含酪氨酸的牙釉蛋白片段，具有牙齿修复、血管生成和仿生矿化活性，这可能有助于组织工程。因此，开发多肽及多肽衍生物的小分子来模拟牙釉蛋白甚至EMDs是一个很有前景的热点研究方向。
但是，短肽类生物活性分子通常易被各种酶水解，半衰期短、生物利用度低并且缺乏类似天然蛋白的空间结构，因此在实际模拟天然蛋白的生物学活性中存在较多的局限性，开发满足牙髓再生要求的新型材料有望解决这个难题。目前研究表明，载生物活性序列的水凝胶可能更适合构建牙髓再生所需要的微环境，并具有激活干细胞的分化潜力。生物活性多肽衍生物通过非共价相互作用自组装形成的超分子水凝胶可以显着增加其半衰期和生物利用度，甚至模拟蛋白质的生物功能，具有化学结构明确、易合成、成本低、生物相容性良好、生物稳定性强等优点，在再生医学等领域展示了广阔的应用前景。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽、多肽衍生物、纳米纤维及其应用，所述多肽衍生物可以模拟釉原蛋白的生物活性，即促进人牙髓细胞的成牙本质分化和矿化，制备方法简单、化学结构明确、成本低、产量高、生物相容性和稳定性良好。所述多肽衍生物能够在水溶液中发生自组装，形成微观结构为纳米纤维的超分子水凝胶，可有效促进牙本质-牙髓复合体的再生。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽，所述多肽序列为Lys-Trp-Tyr-Gln-Asn-Met-Ile-Arg(以下简称为AMG-P8:KWYQNMIR)。
该多肽的结构式如下：
AMG-P8:KWYQNMIR
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物，依据Phe-Phe-Tyr的不同构型包括L构型多肽衍生物和D构型多肽衍生物2种。
其中，所述L构型多肽衍生物的序列为Nap-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-Lys-Trp-Tyr-Gln-Asn-Met-Ile-Arg，其中Nap为2-萘乙酸。(根据本领域公知常识，所述氨基酸构型未作限定时，均视为L构型)其中为进行区分需要特别强调指出的，所述Phe-Phe-Tyr的构型为L构型，所述多肽衍生物简称Nap-GFFYGKWYQNMIR。
Phe-Phe-Tyr为L构型时，所述多肽衍生物的结构式如下：
Nap-GFFYGKWYQNMIR
其中，D构型多肽衍生物的序列为Nap-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-Lys-Trp-Tyr-Gln-Asn-Met-Ile-Arg，其中Nap为2-萘乙酸。其中，所述Phe-Phe-Tyr的构型为D构型，所述多肽衍生物简称Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR。
Phe-Phe-Tyr为D构型时，所述多肽衍生物的结构式如下：
Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物(Nap-GDFDFDY-KWYQNMIR为例)的合成方法，包括如下步骤：
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合，即R的羧基端与树脂连接；
(2)脱去氨基酸的Fmoc保护基，洗涤；
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上偶联的氨基酸N端偶联，洗涤；
(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；
(5)2-萘乙酸与树脂上多肽的N端偶联、洗涤；
(6)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；
(7)使用高效液相色谱仪对多肽粗产品进行提纯；
(8)冻干后得到多肽衍生物粉末。
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物的纳米纤维，该纳米纤维通过加热冷却成胶法制备得到。
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物的纳米纤维的制备方法，按照下述步骤进行：将所述多肽衍生物加入到PBS溶液中，加热至微沸化合物完全溶解，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至7.0～8.0，待冷却到室温即可形成微观结构为纳米纤维的水凝胶。
所述纳米纤维的使用步骤如下所述：将水凝胶用无菌水稀释后最终以1μM浓度加到细胞培养液中，现用现配；将人牙髓细胞接种在培养皿中，24小时后更换为含有水凝胶的培养液；每3天换一次液。细胞培养至14天后停止追加水凝胶，更换为含5mMβ-甘油磷酸钠的培养液；每3天换液，培养至第21天。
一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽、多肽衍生物及其纳米纤维在人牙髓细胞的成牙本质分化和矿化中的应用，该应用在于所述多肽、多肽衍生物及其纳米纤维可以促进牙髓细胞的增殖，促进牙髓细胞成牙本质分化和矿化相关基因和蛋白的表达，能够提高碱性磷酸酶的活性，促进矿化结节的形成。
本发明所具有的有益效果至少包括：
本发明多肽及衍生物化学结构明确、分子量小、成分单一、制备工艺简单、成本低、产率高、易保存。所述多肽衍生物自组装形成的纳米纤维生物稳定性强、生物相容性好。所述纳米纤维可以促进牙髓细胞的增殖，提高牙髓细胞成牙本质分化和矿化相关基因和蛋白的表达，提高碱性磷酸酶的活性并促进矿化结节的形成。发明人分析，所述水凝胶纳米纤维可以抵抗酶的降解，延长半衰期，在矿化初期提供发挥支架作用，纳米纤维的二级构象和机械强度在分化和矿化发挥重要作用。
附图说明
图1为Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的高分辨质谱图。
图2为Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的光学照片。
图3为Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的电子投射显微镜图，即微观结构为纳米纤维。
图4为Nap-GFFYGKWYQNMIR的高分辨质谱图。
图5为Nap-GFFYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的光学照片。
图6为Nap-GFFYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的电子投射显微镜图，即微观结构为纳米纤维。
图7为KWYQNMIR的高分辨质谱图。
图8为合成的KWYQNMIR多肽粉末。
图9为KWYQNMIR溶液的电子投射显微镜图。
图10为所述多肽及多肽衍生物纳米纤维促进牙髓细胞成牙本质分化和矿化相关基因表达结果。
图11为所述多肽及多肽衍生物纳米纤维促进牙髓细胞成牙本质分化和矿化相关蛋白表达结果。
图12为所述多肽及多肽衍生物纳米纤维促进矿化结节的茜红素染色图。
图13为所述多肽及多肽衍生物纳米纤维促进矿化结节的扫描电镜图。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
多肽衍生物Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR及其纳米纤维的合成与制备
(1)Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的固相合成
具体步骤如下：
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上溶胀10min；
2)用洗耳球把DCM从固相合成器中压除干净；
3)将0.75mmol Fmoc-Arg溶解在20mL的无水DCM里，加入1.5mmol的DIPEA，充分溶解后转移到上述固相合成器中，在室温下反应1h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗4次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIPEA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应20min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，洗涤4次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，洗涤4次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应30min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，洗涤4次；
6)称取Fmoc-Ile 1mmol、HBTU 2mmol、DIPEA2mmol，加入10mL的DMF超声溶解，把溶解好的溶液加入到上述固相合成器中，室温反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Met、Fmoc-Asn、Fmoc-Gln、Fmoc-Tyr、Fmoc-Trp、Fmoc-Lys、Fmoc-Gly、D构型Fmoc-Tyr、D构型Fmoc-Phe、D构型Fmoc-Phe、Fmoc-Gly、2-萘乙酸，然后依次用DMF洗涤5遍，DCM洗5遍，进行下步反应；
8)按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时，把产物从2-cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后使用高效液相色谱仪进行分离提纯，得到多肽衍生物Nap-GDFDFDYKWYQNMIR，图1为Nap-GDFDFDYKWYQNMIR的高分辨质谱图，所示主峰为半峰，分子量与理论计算分子量结果差距小于1证明多肽衍生物Nap-GDFDFDYKWYQNMIR的成功合成。
(2)多肽衍生物的纳米纤维的制备
称取1.8mg纯化后的多肽衍生物Nap-GDFDFDYKWYQNMIR，置于2mL的玻璃瓶中，加入500μLPBS溶液(pH＝7.4)，加热至化合物完全溶解，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，冷却到室温之后即得到可倒置水凝胶。图2为Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的光学照片。成胶与否通过本领域公知的方法判断，如采用倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的则为液体。经电镜照片显示水凝胶的微观结构均为纳米纤维。图3为Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR加热冷却形成水凝胶的电子投射显微镜图，即微观结构为纳米纤维。
实施例2
(1)参照制备实施例1，用Fmoc-短肽固相合成方法合成多肽衍生物Nap-GFFYGKWYQNMIR，图4为Nap-GFFYGKWYQNMIR的高分辨质谱图：区别仅在于(1)固相合成的步骤7中加入的D构型Fmoc-Tyr、D构型Fmoc-Phe、D构型Fmoc-Phe改为L构型。
(2)多肽衍生物Nap-GFFYGKWYQNMIR的纳米纤维的制备参照制备实施例1，区别仅在于所形成的水凝胶颜色与实施例1不完全相同。图5和图6分别为Nap-GFFYGKWYQNMIR的光学照片和电子投射显微镜下图。
实施例3
(1)参照制备实施例1，用Fmoc-短肽固相合成方法合成所述多肽KWYQNMIR：区别仅在于(1)固相合成的步骤7中加入Fmoc-Met、Fmoc-Asn、Fmoc-Gln、Fmoc-Tyr、Fmoc-Trp、Fmoc-Lys后即合成完毕，切割得到多肽粗产物，图7为多肽的质谱图。
(2)取1.1mg纯化后的多肽KWYQNMIR置于2mL的玻璃瓶中，加入500μLPBS溶液(pH＝7.4)，吹吸几次后化合物完全溶解，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4得到澄清透明的多肽溶液，图8和图9分别是多肽的光学照片和电子投射显微镜图。
对比例1
无菌1×PBS
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用碳酸钠和盐酸溶液调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容为1L即可。用高压灭菌锅灭菌后，保存于室温或4℃冰箱中。
对比例2
EMD
(1)选择6月龄猪颌骨,取出上、下颌骨内的恒牙胚,以生理盐水清洗净牙胚,用手术刀片刮除奶酪样牙釉质于研钵中，加液氮低温下研磨。将获得的牙釉质置于0.5M乙酸中,缓慢摇动,4℃条件下摇晃72h后离心取上清液。
(2)吸取上清液到处理过的透析袋中，扎紧后放入蒸馏水中4℃透析5天。将透析袋中的蛋白溶液放入离心管中-80℃冻结后，置于真空干燥机中干燥脱水，最后将获得的EMD-80℃保存。
多肽及多肽衍生物的纳米纤维在对人牙髓细胞成牙本质分化和矿化中的活性测试实验如下所述：
一、多肽及多肽衍生物的纳米纤维在基因和蛋白层面的活性测试实验
1)将状态良好的人牙髓细胞接种于6孔板(1×105个/孔)中，培养过夜使细胞完全贴壁；
2)弃去原有培养基，加入分别含有浓度为1μM的多肽KWYQNMIR、多肽衍生物Nap-GFFYGKWYQNMIR及Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的纳米纤维，同时使用对比例1作对照；
3)培养14天后使用qRT-PCR和western blot方法检测成牙本质分化特异指标DSPP、DMP-1和ALP基因和蛋白的表达。
结果与分析：图10为多肽及多肽衍生物的纳米纤维促进成牙本质分化特异指标DSPP、DMP-1基因表达的效果图。与对比例1比较，多肽KWYQNMIR及其衍生物均上调了DSPP、DMP-1基因的表达，其中Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR将DSPP、DMP-1的表达分别显著提高了8倍和20倍。
图11为多肽及多肽衍生物的纳米纤维促进成牙本质分化特异指标DSPP、DMP-1和ALP蛋白表达的效果图。与qRT-PCR实验结果基本一致，诱导14d后与对比例1比较，多肽KWYQNMIR、多肽衍生物Nap-GFFYGKWYQNMIR及Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的纳米纤维对成牙本质分化特异指标的蛋白表达均有促进作用。而多肽衍生物的表现更优，尤其是Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR，显著增强了DSPP、DMP-1和ALP的表达水平。由以上结果可得出Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR有很强的生物学活性，可诱导人牙髓细胞分化为成牙本质样细胞。
二、多肽及多肽衍生物的纳米纤维在矿化方面的活性测试。
1)将状态良好的人牙髓细胞接种于6孔板(1×105个/孔)中，培养过夜使细胞完全贴壁；
2)弃去原有培养基，加入分别含有浓度为1μM的多肽KWYQNMIR、多肽衍生物Nap-GFFYGKWYQNMIR及Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的纳米纤维，同时使用对比例1和对比例2作对照；
3)细胞培养至14天后停止追加多肽及多肽衍生物的纳米纤维，更换为含5mMβ-甘油磷酸钠的培养液，每3天换一次液，培养至第21天；
4)将细胞用4％多聚甲醛固定后，双蒸水漂洗干净后，用1％的茜素红染液染色10分中，再次漂洗去除浮色并拍摄光学照片；
5)使用扫描电镜拍摄矿化结节的细节图。
结果与分析：图12为实施例1，实施例2、3的纳米纤维以及对比例1、2促进矿化结节形成的茜红素染色图。对比例1和实施例3只诱导了少许矿化颗粒形成，而实施例1和2诱导形成的矿化结节在数量和面积则显著提高，尤其是实施例1，其形成的矿化结节可达天然EMD的80％左右，结果表明，Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR可发挥和EMD相似的活性，诱导人牙髓细胞形成矿化结节。
图13为实施例1，实施例2、3的纳米纤维以及对比例1、2促进矿化结节形成的扫描电镜图。图片显示，矿化晶体融合成小的钙球，在对比例1和实施例3组散在分布；实施例1和2组中钙球进一步以水凝胶为支架聚集形成结构紧密的钙团，其直径是对比例1组的几十倍甚至上百倍并且和EMD组的很相似。另外在Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR的周围有人牙髓细胞黏附生长，将细胞部分放大可见，HDPCs胞浆伸长，边缘伸出细小突起，相互交织呈三维结构。
综上，上述结果表明Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR在未来的牙髓再生工程中有非常广阔的应用前景，目前生物活性材料形成的矿化成分碎片化并且可渗透，这可能导致细菌再次进入牙髓组织再次引起感染。而该水凝胶以自身为支架，形成的的矿化结节结构紧密，尺寸较大；并且对人牙髓细胞有极佳的生物相容性，可诱导细胞黏附生长形成三维的细胞微环境，而细胞形成的三维微环境又进一步促进了矿化，即细胞间形成的矿化结节。这独特的优势表明Nap-GDFDFDYGKWYQNMIR可能是一种非常理想的生物活性材料。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种可诱导人牙髓细胞成牙本质分化和矿化的多肽衍生物，其特征在于：多肽衍生物的序列为Nap-Gly-Phe-Phe-Tyr-Gly-Lys-Trp-Tyr-Gln-Asn-Met-Ile-Arg，其中Phe-Phe-Tyr为D构型。
2.如权利要求1所述的多肽衍生物的应用，其特征在于：将所述多肽衍生物的水混合物经加热冷却的方法形成纳米纤维的方法为：将所述多肽衍生物加入到PBS溶液中，加热至微沸化合物溶解，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其pH值调节至7 .0～8 .0，待冷却到室温即可形成微观结构为纳米纤维的水凝胶。
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