CN114099654A - 一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用，所述单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物由肝癌细胞裂解液溶液及单核细胞组成，通过下述方法制备：制备肝癌细胞裂解液溶液；由外周血或骨髓分离获得单核细胞；将肝癌细胞裂解液溶液与单核细胞混合，制成疫苗组合物。本发明的单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用通过简化的单核细胞分离操作减少常规单核细胞分离及分化产生DC的操作步骤，极大程度地降低了疫苗制备成本；直接利用分离的单核细胞负载肝癌细胞裂解液抗原，达到显著的抗击肿瘤效果，为更广泛的临床试验提供了前期技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞治疗技术领域，具体来说，涉及一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)简称肝癌，是我国常见恶性肿瘤之一。目前，临床上进行肝癌治疗的主要手段是手术切除，很多患者发现时已为晚期，并由于HBV的慢性感染背景，肝脏功能衰竭而无法手术，因缺乏有效治疗手段，肝癌患者的5年生存率极低，且复发率高。这种复发主要是由于微小残留肿瘤灶的存在而无法采用手术和放疗进行治疗，针对肝癌的化疗药物(索拉菲尼)的临床治疗也没有显著的治疗效果。因此，有必要研发针对HCC发生极高危人群的其他相关干预手段。
肝癌疫苗是预防HCC发生或复发的潜在治疗手段。然而，既往的研究作为肝癌疫苗的主要免疫原为GPC3、AFP等肿瘤相关抗原，这类抗原在正常成人肝脏组织内不表达，在肝癌、组织内高表达。肿瘤相关抗原在机体免疫系统发育成熟过程中，能与之识别并以高亲和力结合的T细胞通过胸腺选择已被清除。因而，机体自身难以产生针对这一类蛋白的特异性T细胞免疫应答反应。
肿瘤细胞由于快速分裂导致的基因组不稳定性会产生许多突变，这类突变所引起的蛋白变异通常是机体所识别和耐受的，称之为肿瘤特异性新抗原，肿瘤特异性新抗原的发现提纯需要经过全基因组测序，验证耗时长久且成本高昂，故而直接纯化肿瘤新抗原为患者所难以接受。而肿瘤细胞本身理论上含有所有突变以及抗原表位，将肿瘤细胞裂解作为抗原是一直以来人们所关注并研究的。然后由于肿瘤细胞裂解液中新抗原丰度较低故而不易产生免疫反应。因而需要一种体外高效的富集肿瘤裂解液中抗原的手段。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物，所述疫苗组合物由肝癌细胞裂解液溶液及单核细胞组成，所述疫苗组合物通过下述方法制备：
S1制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
优选地，所述肝癌细胞裂解液溶液由肝癌细胞裂解液与PBS制得。
优选地，所述肝癌细胞裂解液溶液的浓度为1g/mL。
根据本发明的另一方面，提供了一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
优选地，所述单核细胞取自外周血或骨髓。
优选地，所述单核细胞采用淋巴分离液Ficoll密度梯度离心法制备。
进一步地，S3中将肝癌细胞裂解液溶液与单核细胞混合包括如下步骤：
S31收集肝癌细胞，计数，用RPMI 1640培养基重悬，超声100W破碎，待用；
S32将肝癌细胞裂解液溶解于含10％灭活FBS的RPMI 1640培养基中，使其浓度为1g/mL；
S33将单核细胞加入到S32得到的肝癌细胞裂解液溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2×107个细胞/mL；
S34将S33的细胞悬液放入恒温培养箱中，37℃，5％CO2孵育2h，每半小时振荡1次；
S35孵育结束后，将细胞悬液离心，弃上清，再加入适量PBS重悬，再离心，弃上清，得到负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞团块；
S36负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞用RPMI 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5×107个细胞/mL，得到疫苗组合物。
本发明还提供了上述单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物在制备用于治疗肝癌制品中的应用，所述疫苗组合物采用静脉注射的方式。
本发明的有益效果：本发明的单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物及其制备方法与应用通过简化的单核细胞分离操作减少常规单核细胞分离及分化产生DC的操作步骤，极大程度地降低了疫苗制备成本；直接利用分离的单核细胞负载肝癌细胞裂解液抗原，达到显著的抗击肿瘤效果，为更广泛的临床试验提供了前期技术基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的小鼠骨髓来源的单核细胞吞噬OVA-FITC的效率检测结果包括流式代表性图和统计数据条形图；
图2是单核细胞肝癌细胞裂解液肿瘤疫苗免疫A2受体鼠后第14天外周血抗体的检测结果；
图3是肝癌细胞裂解液单核细胞疫苗对QGY7703细胞系荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(预防性模型)，在第-21、-14、-7天注射疫苗，第0天接种肿瘤细胞；
图4是肝癌细胞裂解液单核细胞疫苗对QGY7703细胞系荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(治疗性模型)，在第0天接种肿瘤细胞，第7、14天注射疫苗。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
打破机体癌胚抗原的固有免疫耐受，需要将癌胚抗原主动递送给专职抗原提呈细胞，这类细胞包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，而近年来研究发现单核细胞也可以摄取抗原并直接加工成抗原肽形式在体内激活树突状细胞诱导特异性免疫反应打破免疫耐受，因而将肿瘤裂解液利用单核细胞负载抗原是值得开发的肿瘤治疗性疫苗形式。
本发明提供了一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物，所述疫苗组合物由肝癌细胞裂解液溶液及单核细胞组成，所述疫苗组合物通过下述方法制备：
S1制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
在一些实施例中，所述肝癌细胞裂解液溶液由肝癌细胞裂解液与PBS制得，所述肝癌细胞裂解液溶液的浓度为1g/mL。
根据本发明的另一方面，提供了一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
其中，所述单核细胞取自外周血或骨髓，采用淋巴分离液Ficoll密度梯度离心法制备。
在一些实施例中，S3中将肝癌细胞裂解液溶液与单核细胞混合包括如下步骤：
S31收集肝癌细胞，计数，用RPMI 1640培养基重悬，超声100W破碎，待用；
S32将肝癌细胞裂解液溶解于含10％灭活FBS的RPMI 1640培养基中，使其浓度为1g/mL；
S33将单核细胞加入到S32得到的肝癌细胞裂解液溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2×107个细胞/mL；
S34将S33的细胞悬液放入恒温培养箱中，37℃，5％CO2孵育2h，每半小时振荡1次；
S35孵育结束后，将细胞悬液离心，弃上清，再加入适量PBS重悬，再离心，弃上清，得到负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞团块；
S36负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞用RPMI 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5×107个细胞/mL，得到疫苗组合物。
实施例中涉及的原料生产厂家如表1所示。实施例中未注明具体条件的试剂和设备，通常为本技术领域常规市购的试剂、设备；实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。
表1.原料表
实施例1：单核细胞的分离，包括如下步骤：
(1)颈脱臼法处死小鼠，取其2只股骨，剪去股骨两头，用注射器吸入适量PBS反复冲洗股骨骨腔，得到骨髓冲出液，用40μM筛网过滤后，收集至PE离心管中。
(2)300-500g离心5min，获得骨髓细胞沉淀；加入4mL PBS重悬骨髓细胞；同时在另一PE离心管中加入3mL Ficoll淋巴分离液。将骨髓细胞悬液轻轻加入含Ficoll淋巴分离液的PE离心管中，注意不要破坏细胞悬液与淋巴分离液的接触界面。
(3)将PE离心管400g离心30min，因密度不同离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。用吸管小心吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一50ml离心管中，补加PBS，400g离心5～10min。
(4)弃上清，加PBS重悬，400g离心5～10min，弃上清，得到单核细胞团块，适量含10％灭活FBS的RPMI 1640培养基重悬，并计数。
实施例2：将上述获得的单核细胞负载肝癌细胞裂解液或OVA-FITC抗原，包括如下步骤：
(1)收集肝癌细胞，计数，每2×108细胞用10ml RPMI 1640培养基重悬，超声100W破碎，待用。
(2)将肝癌细胞裂解液或OVA-FITC溶解于含10％灭活FBS的RPMI1640培养基中，使其浓度分别为1g/mL和1mg/mL。
(3)将单核细胞加入到上述肝癌细胞裂解液溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2×107个细胞/mL。
(4)将步骤(3)的细胞悬液放入恒温培养箱中，37℃，5％CO2孵育2h，每半小时振荡1次。
(5)孵育结束后，将细胞悬液以400g离心5～10min，弃上清，再加入适量PBS重悬，再按400g离心5～10min，弃上清，得到负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞团块。
(6)上述负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞用RPMI 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5×107个细胞/mL，该混合液即肝癌疫苗组合物。用流式细胞仪检测单核细胞负载OVA-FITC情况，的单核细胞吞噬OVA-FITC的效率检测结果如图1所示。
实施例3：将上述获得的抗原疫苗组合物免疫小鼠模型，包括如下步骤：
(1)将负载肝癌细胞裂解液的单核细胞悬液按200μL的体积由尾静脉注射入A2小鼠体内，每只小鼠接种细胞量为1×107，对照组小鼠注射等体积PBS。连续接种3次，每隔7天接种1次。
(2)肿瘤接种后第7天开始，连续追踪测量小鼠肿瘤生长状况，并于第一次接种疫苗第14天分析血清中抗体产生情况，单核细胞肝癌细胞裂解液肿瘤疫苗免疫A2受体鼠后第14天外周血抗体的检测结果如图2所示。
(3)预防性模型：距第一次接种疫苗第14天，对每只小鼠接种肿瘤细胞。每只小鼠肿瘤细胞接种量为1×106，接种方式为皮下注射，小鼠肿瘤生长曲线如图3所示。
(4)治疗性模型：每只小鼠肿瘤细胞接种量为1×106，接种方式为皮下注射。分别在肿瘤接种后第7、14天接种肝癌细胞裂解液单核细胞疫苗，小鼠肿瘤生长曲线如图4所示。
该疫苗组合物具有克服抗原异质性、特异性强的高效的抵抗作用，能用于制备治疗实体肿瘤制品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物由肝癌细胞裂解液溶液及单核细胞组成，所述疫苗组合物通过下述方法制备：
S1 制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2 由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3 将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
2.根据权利要求1所述的单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物，其特征在于，所述肝癌细胞裂解液溶液由肝癌细胞裂解液与PBS制得。
3.根据权利要求1所述的单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物，其特征在于，所述肝癌细胞裂解液溶液的浓度为1g/mL。
4.一种单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1 制备肝癌细胞裂解液溶液；
S2 由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
S3 将S1获得的肝癌细胞裂解液溶液与S2获得的单核细胞混合，制成疫苗组合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单核细胞取自外周血或骨髓。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述单核细胞采用淋巴分离液Ficoll密度梯度离心法制备。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中将肝癌细胞裂解液溶液与单核细胞混合包括如下步骤：
S31 收集肝癌细胞，计数，用RPMI 1640培养基重悬，超声100W破碎，待用；
S32 将肝癌细胞裂解液溶解于含10%灭活FBS的RPMI 1640培养基中，使其浓度为1g/mL；
S33 将单核细胞加入到S32得到的肝癌细胞裂解液溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2×107 个细胞/mL；
S34 将S33的细胞悬液放入恒温培养箱中，37℃，5% CO2孵育2h，每半小时振荡1次；
S35 孵育结束后，将细胞悬液离心，弃上清，再加入适量PBS重悬，再离心，弃上清，得到负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞团块；
S36 负载肝癌细胞裂解液抗原的单核细胞用RPMI 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5×107 个细胞/mL，得到疫苗组合物。
8.如权利要求1所述的单核细胞负载肝癌细胞裂解液的疫苗组合物在制备用于治疗肝癌制品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗组合物采用静脉注射的方式。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| MIN-NUNG HUANG等: "Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses", J.CLIN.INVEST., vol. 130, no. 2, 6 January 2020 (2020-01-06), pages 774 - 788 * |
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