CN114099564B - 具有增强神经营养因子功能的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有增强神经营养因子功能的组合物及其应用，该组合物包含沙棘提取物和花生壳提取物，沙棘提取物和花生壳提取物的重量比为1：(0.01‑100)，沙棘提取物包含沙棘总黄酮，花生壳提取物为花生壳的醇提物，醇提物为乙醇体积百分比为65％‑100％的乙醇溶液的提取物。该组合物可促进神经营养因子的功能，包括促进细胞突起生长、激活神经微丝编码基因表达，其可协同神经营养因子诱导神经细胞分化，能够用于制备治疗和/或预防抑郁症、阿兹海默病、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤等神经生长因子依赖性神经系统疾病的药物。

Description

具有增强神经营养因子功能的组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种具有增强神经营养因子功能的组合物及其应用。
背景技术
神经营养因子(neurotrophin,NT)是一类能促进神经细胞生长、发育和分化的多肽或蛋白质，能调节神经元存活，激活酶的活性，阻止成年神经元损伤后的死亡，具有促进神经元损伤修复以及轴突再生，调节突触可塑性和神经递质等功能。目前已鉴定的神经营养因子包括：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4/5(NT-4/5)。
随着人口老年化和工作压力增加，阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病以及抑郁症成为了世界性的公共卫生难题。神经营养因子已被证实和用于预防或治疗神经退行性疾病。神经营养因子也是参与机体情绪和认知功能至关重要的调节因子，能够促进脑内神经发生和突触发育，目前临床常见抗抑郁药的抗抑郁作用多依赖于神经营养因子及相关蛋白在抑郁患者及抑郁动物模型中的信号转导。然而，在临床应用，通常依赖高剂量的神经营养因子，低剂量的神经营养因子的临床治疗效果不明显。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的目的之一是提供一种包含沙棘提取物和花生壳提取物的组合物，该组合物能够协同神经营养因子使其发挥更好的功效。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种具有增强神经营养因子功能的组合物，所述组合物包含沙棘提取物和花生壳提取物，所述沙棘提取物和所述花生壳提取物的重量比为1：(0.01-100)，
所述沙棘提取物包含沙棘总黄酮，
所述花生壳提取物为花生壳的醇提物，所述醇提物为含乙醇的提取溶剂的提取物，所述提取溶剂含乙醇的体积百分比为65％-100％。
在其中一个实施例中，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(1-20)。
在其中一个实施例中，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(3-10)。
在其中一个实施例中，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(4-8)。
一种神经营养因子增效剂，所述增效剂包含所述的组合物以及药学上可以接受的辅料。
在其中一个实施例中，所述辅料包含填充剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、助悬剂和矫味剂中的一种或者多种。
在其中一个实施例中，所述增效剂的剂型为胶囊剂、片剂、微囊片剂、悬浮剂或者口服液。
在其中一个实施例中，所述增效剂的给药方式为口服给药。
一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述的组合物和神经营养因子。
在其中一个实施例中，所述神经营养因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5中的一种或者几种。
在其中一个实施例中，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病包含抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤。
一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的联合用药，其特征在于，所述联合用药包含所述的神经营养因子增效剂和神经营养因子。
在其中一个实施例中，所述神经营养因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5中的一种或者几种。
在其中一个实施例中，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病包含抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明首次发现沙棘提取物和花生壳醇提取物搭配使用，特别是进一步以合适的比例搭配沙棘提取物和合适种类的花生壳醇提取物，可以大幅促进神经营养因子的功能，包括促进细胞突起生长、激活神经微丝(Neurofilament,NF)编码基因表达。基于以上发现，本发明提供了一种具有增强神经营养因子功能的组合物，其可协同神经营养因子诱导神经细胞分化，能够作为制备用于治疗和预防抑郁症、阿兹海默病、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤等神经生长因子依赖性神经系统疾病的药物，临床应用前景良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为与单独的NGF相比，不同花生壳提取产物(水提物、70％乙醇提取物、100％乙醇提取物、花生壳黄酮提取物)与NGF协同诱导PC12细胞分化的结果图；
图2为不同浓度的沙棘提取产物(水提物、70％乙醇提取物、100％乙醇提取物、沙棘总黄酮)与NGF协同诱导PC12细胞分化的结果图；
图3为花生壳70％乙醇提取物的HPLC-DAD结果图；
图4为沙棘总黄酮的HPLC-DAD结果图；
图5为与单独的NGF相比，不同浓度配比的沙棘总黄酮与花生壳70％乙醇提取物的组合物在与NGF协同作用下诱导PC12细胞分化的结果图；
图6为不同浓度的沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)单独或协同不同浓度NGF诱导PC12细胞分化的结果图；
图7为不同浓度的沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物单独或协同不同浓度NGF诱导pNF200-Luc表达荧光素酶的结果图；
图8为沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)、木犀草素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素及上述四个黄酮单体混合物协同NGF诱导PC12细胞分化比例的结果图；
图9为与单独的NGF相比，不同浓度配比的木犀草素/异鼠李素协同NGF诱导PC12细胞分化比例的结果图；
图10为在SH-SY5Y细胞中，沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物与不同神经营养因子(BDNF、NT-3、NT-4/5)协同诱导pNF200-Luc表达荧光素酶的结果图；
图11为沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物的抗Aβ作用结果图；其中，图11A为与姜黄素相比，不同浓度沙棘/花生壳抑制β-淀粉样蛋白聚集的结果图；图11B为与姜黄素相比，不同浓度沙棘/花生壳组合物(1:5)保护PC12细胞活性、降低Aβ引起的神经毒性损伤的结果图；
图12为沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物的抗氧化结果图；其中，图12A示出与NAC相比，不同浓度沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物保护PC12细胞活性、降低tBHP引起的氧化损伤的结果图；图12B为与黄芩素相比，不同浓度沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物保护SH-SY5Y细胞活性、降低erastin诱导的铁死亡损伤的结果图；
图13为沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物的抗炎结果图；其中，图13A示出与地塞米松相比，不同浓度沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物在BV2神经胶质细胞中抑制LPS造成的炎性反应的结果图，表现为抑制的IL-1βmRNA表达水平；图13B示出与地塞米松相比，不同浓度沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物在免疫细胞RAW264.7细胞中抑制LPS造成的炎性反应的结果图，表现为抑制的NF-κB荧光素酶活性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
沙棘和花生同属药食同源类中药材，作为民族医药的应用已有很多年的历史，但现今对其的药理学研究大多局限在抗糖、抗炎和抗氧化作用等，较少有关于治疗神经退行性疾病的报道。花生壳作为食用油产业的主要副产物，富含黄酮和甾醇类化合物，年产量在400万吨以上，亟待利用。沙棘素有VC之王的称号，富含不饱和脂肪酸，同时也含有异鼠李素、槲皮素、山奈酚等黄酮化合物，是一种极具高营养价值和药用价值的经济作物。
本发明首次发现沙棘提取物和花生壳提取物联用可以大幅促进神经营养因子的功能，包括促进细胞突起生长、激活神经微丝(Neurofilament,NF)编码基因表达。因此能够作为神经营养因子功能增强剂(也可以称其为增效剂)使用。基于上述发现，本发明提供了沙棘提取物和花生壳提取物的组合物在制备用于增强神经营养因子功能的药物中的应用。
神经营养因子能够诱导神经细胞分化。在本发明中，术语“增强神经营养因子的功能”是指，组合物能够诱导神经细胞分化，使神经营养因子所发挥的功能提高。神经营养因子为人体内自身分泌的神经营养因子，身体机能正常时分泌量也极少，神经退行性疾病患者的分泌更少。当加入沙棘和花生壳组合物之后，即可明显诱导和促进神经细胞发挥神经营养因子样的功效。因此，增强神经营养因子的功能包括促进神经营养因子诱导神经细胞分化的作用。
第一方面，本发明提供一种具有增强神经营养因子功能的组合物，所述组合物包含沙棘提取物和花生壳提取物，所述沙棘提取物和所述花生壳提取物的重量比为1：(0.01-100)，
所述沙棘提取物包含沙棘总黄酮，
所述花生壳提取物为花生壳的醇提物，所述醇提物为含乙醇的提取溶剂的提取物，所述提取溶剂含乙醇的体积百分比为65％-100％。
本发明提供的上述组合物中，所述沙棘提取物和所述花生壳提取物的重量比为可以选自，包括但不限于如下值或之间的范围：1:0.001、1:0.01、1:0.1、1:1、1:2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100。
较优地，所述提取溶剂含乙醇的体积百分比为65％-75％。本发明提取溶剂含乙醇体积百分比为65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％的乙醇溶液的提取物。
较优地，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(1-20)。较优地，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(3-10)。较优地，所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：(4-8)。
本发明所述的花生壳的醇提物，其制备步骤包括：是以乙醇体积百分比为65％-75％的乙醇水溶液为提取溶剂对花生壳进行提取，收集提取液。
上述制备步骤中，所述花生壳为经过干燥处理的花生壳。
上述制备步骤中，为便于提取，可以对花生壳进行粉碎处理，粉碎处理的方式包括但不限于研磨。
上述制备步骤中，提取的方式可以采用超声提取，提取的次数为2次-4次(例如2次、3次、4次)，每次15-25分钟(例如15分钟、20分钟、25分钟)，超声提取的料液比为1：(18-22)，例如为1:18、1:19、1:20、1:21、1:22。收集提取液的方式可以为过滤。
上述制备步骤还包括将所述提取液制成干粉的步骤，例如所述提取液经浓缩、冷冻干燥制备成干粉。
本发明所述的花生壳的醇提物，主要单体化合物为圣草酚、木犀草素、5,7-二羟基色原酮。
本发明所述的沙棘总黄酮，其制备步骤包括：是以乙醇体积百分比为65％-75％的乙醇水溶液为提取溶剂对沙棘果实进行提取，收集提取液；调节所述提取液的pH为0.8-1.2，3℃-5℃下静置，收集沉淀。
上述制备步骤中，所述沙棘果实为经过干燥处理的沙棘果实。
上述制备步骤中，所述提取溶剂中含乙醇的体积百分比例如为65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％。
上述制备步骤中，提取的方式采用回流提取，回流提取的时长为1.5小时-2.5小时(例如为1.5小时、2.0小时、2.5小时)，回流提取的料液比为超声提取的料液比为1：(8-12)，例如为1:8、1:9、1:10、1:11、1:12。
上述制备步骤中，收集提取液的方式可以采用离心。
上述制备步骤中，所述提取液经浓缩后再调节所述pH。
上述制备步骤中，为充分沉淀，可以静置过夜后收集沉淀。
上述制备步骤中，沉淀可以经干燥制备成干粉，干燥的方式可以为冷冻干燥。
本发明制备的所述的沙棘总黄酮，其主要单体化合物为异鼠李素。
第二方面，本发明提供一种神经营养因子增效剂，所述增效剂包含所述的组合物以及药学上可以接受的辅料。
本发明所述的辅料，其种类可以选自，包括但不限于：填充剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、助悬剂、矫味剂等。辅料在所述增效剂中的含量可以根据实际需要在本领域常用的范围内调整。
本发明所述的增效剂，其剂型，可以选自，包括但不限于：囊剂、片剂、微囊片剂、悬浮剂或者口服液。
本发明所述的增效剂，其给药方式，可以选自，包括但不限于：口服给药。
所述神经营养因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5中的一种或者几种。例如1种、2种、3种、4种、5种。
第三方面，本发明提供一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述的组合物和神经营养因子。
本发明所述的神经营养因子，其种类可以选自，包括但不限于：神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5。例如为其中的1种、2种、3种、4种、5种。
在其中一个示例中，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病包含抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤。
第四方面，本发明提供一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的联合用药，所述联合用药包含所述的神经营养因子增效剂和神经营养因子。
本发明所述的神经营养因子，其种类可以选自，包括但不限于：神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5。例如为其中的1种、2种、3种、4种、5种。
在其中一个示例中，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病包含抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和脊髓损伤。
以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
实施例1：不同花生壳提取物制备
取干燥花生壳，粉碎研磨，分别用水、70％(v/v)乙醇水溶液和100％乙醇超声提取三次，每次20分钟，料液比为1:20。过滤、合并三次所得提取液，浓缩后冷冻干燥得到相应花生壳的水提物、70％乙醇提取物和100％乙醇提取物的干粉。
花生壳黄酮提取物制备：由于花生壳中的主要要用成分为黄酮苷元，故用乙酸乙酯对花生壳70％乙醇提取物进行萃取，取乙酸乙酯萃取物相蒸干得花生壳黄酮提取物。
实施例2：不同沙棘提取物制备
取干燥沙棘果实，研磨，分别用水、70％(v/v)乙醇水溶液和100％乙醇超声提取三次，每次20分钟，料液比为1:20。过滤、合并三次所得提取液，浓缩后冷冻干燥得到相应沙棘水提物、70％乙醇和100％乙醇提取物的干粉。
沙棘黄酮提取物：取干燥沙棘果实150克，加1500ml 70％(v/v)乙醇水溶液回流提取2小时，离心，取上清液，浓缩至600ml，调pH至1.0，放入4℃冰箱静置过夜，离心后取沉淀物，冷冻干燥得到沙棘总黄酮(也即“沙棘黄酮提取物”)。
实施例3：不同花生壳提取物与低浓度NGF(神经生长因子)协同作用
实验方法：将PC12细胞接种(2×104cells/mL)到6孔板中培养(DMEM培养基，6％胎牛血清+6％马血清，“％”为体积百分比)，24小时后，将培养基更换为低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清，“％”为体积百分比)继续培养24小时。随后加入不同浓度的实施例1制备的各种花生壳提取物，辅以终浓度1.5ng/mL NGF处理48小时，以单独加入终浓度50ng/mL NGF(阳性对照)、单独加入终浓度1.5ng/mL NGF以及不加药组作为阴性对照，观察细胞分化情况。用光学显微镜拍照分析神经突起的生长情况，每孔随机选择5个视野，观察每个视野至少100个细胞。细胞的一个或多个神经突起长度超过胞体直径则归类为分化细胞。
实验结果：图1所示为不同花生壳提取物与低浓度NGF协同作用下诱导PC12细胞分化的结果，以未经药物处理的PC12细胞为阴性对照组。可见，1.5ng/mL的低剂量NGF对PC12细胞分化几乎没有诱导作用，因此将该浓度NGF用于模拟神经退行性疾病患者脑组织中NGF缺乏的情况，也用于评价不同花生壳提取物与NGF的协同效应。如图1所示，花生壳70％乙醇提取物在与NGF协同作用下对分化的诱导作用显著，优于其他提取方式所得产物及花生壳所含黄酮单体。
表1
Figure BDA0003412634970000081
Figure BDA0003412634970000091
实施例4：不同沙棘提取物与低浓度NGF协同作用
试验方法：按照实施例3方法，采用PC12细胞，加入实施例2制备的不同的沙棘提取物。
结果如图2：沙棘黄酮提取物与NGF协同作用时对神经分化有显著诱导效果(最好)，70％沙棘乙醇提取物效果次之，沙棘水提取效果最差。
表2
Figure BDA0003412634970000092
Figure BDA0003412634970000101
实施例5：花生壳70％乙醇提取物与沙棘黄酮提取物HPLC图谱
分别取与NGF协同作用下诱导PC12细胞分化效果最佳的花生壳70％乙醇提取物与沙棘黄酮提取物，做进一步HPLC-DAD检测。
将10mg花生壳70％乙醇提取物和1mg沙棘黄酮提取物分别溶解于70％乙醇，用HPLC-DAD进行分析。色谱柱为安捷伦TC-C18(4.6×250mm,5μm)，进样体积为10μL，柱温30℃。溶剂A为0.2％(v/v)甲酸水溶液；溶剂B为乙腈。洗脱步骤(溶剂B)为10％-15％：0-10分钟；15％-25％：10-30分钟；25％-35％：30-55min；35％-40％：55-65分钟；40％-60％：65-90分钟；60％-100％：90-96分钟。
沙棘黄酮提取物的检测波长为360nm；花生壳70％乙醇提取物的检测波长为300nm。
花生壳70％乙醇提取物的HPLC-DAD结果如图3所示，花生壳70％乙醇提取物中的主要单体化合物为圣草酚、木犀草素、5,7-二羟基色原酮。
沙棘黄酮提取物的HPLC-DAD结果如图4所示，沙棘黄酮提取物中的主要单体化合物为异鼠李素。
实施例6：不同配比的花生壳70％乙醇提取物和沙棘总黄酮的组合物促进神经生长因子功能的比较
实验方法：将沙棘总黄酮和花生壳70％乙醇提取物按照不同配比进行混合，得到不同配比的组合物。
将PC12细胞接种(2×104cells/mL)到6孔板中培养(DMEM培养基，6％胎牛血清+6％马血清，“％”为体积百分比)，24小时后，将培养基更换为低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清，“％”为体积百分比)继续培养24小时。随后加入不同浓度配比的组合物(例如当浓度配比为1:5时，沙棘总黄酮终浓度为20μg/mL，花生壳70％乙醇提取物浓度为100μg/mL)，辅以终浓度1.5ng/mL NGF处理48小时，以单独加入终浓度50ng/mL NGF(阳性对照)、单独加入终浓度1.5ng/mL NGF、1.5ng/mL NGF+沙棘总黄酮(20μg/mL)、1.5ng/mLNGF+花生壳70％乙醇提取物(200μg/mL)以及不加药组作为阴性对照，观察细胞分化情况。用光学显微镜拍照分析神经突起的生长情况，每孔随机选择5个视野，每个视野观察至少100个细胞。细胞的一个或多个神经突起长度超过胞体直径则归类为分化细胞。
实验结果：图5所示为不同配比的组合物协同低浓度NGF诱导PC12细胞分化的结果，以未经药物处理的PC12细胞为阴性对照组。不同浓度配比的组合物与NGF协同作用时均显著促进了PC12细胞的分化；其中，当浓度配比为1:5，即沙棘总黄酮终浓度为20μg/mL、花生壳70％乙醇提取物浓度为100μg/mL时，对细胞分化的促进程度最为显著。沙棘总黄酮：花生壳70％乙醇提取物(1:5)为最佳配比。明显优于单独使用沙棘总黄酮和花生壳70％乙醇提取物。
表3
Figure BDA0003412634970000111
Figure BDA0003412634970000121
实施例7：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)协同NGF促进神经分化和神经微丝的表达
将8×104cells/mL大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12细胞)接种于24孔细胞培养板上，培养基为DMEM培养基+6％(v/v)胎牛血清+6％(v/v)马血清。24小时后，将含有神经微丝编码基因启动子的荧光素酶报告基因载体pNF200-Luc转染到PC12细胞中。4小时后，换成低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清，“％”为体积百分比)，随后加入不同浓度的所述组合物辅以不同浓度的NGF处理。24小时后，移除细胞培养液，并用PBS冲洗。裂解液(100mM PBS，1mM DTT，0.2％Triton X-100，pH 7.8)裂解后，12000g高速离心15分钟得到含有荧光素酶的细胞裂解液。将50μL细胞裂解液转移到不透光的96孔酶标板上，加入荧光素酶的底物，用化学发光仪(Promega Glomax 96孔化学发光仪)检测荧光素酶活性。各样本活性用总蛋白浓度做归一化处理。
结果：图6所示为不同浓度的组合物与不同浓度NGF在单独或协同作用下诱导PC12细胞分化的结果。不同浓度的组合物及1.5ng/mLNGF在单独使用时对PC12细胞分化的诱导作用不明显；当所述组合物与不同浓度NGF协同使用时，PC12细胞被诱导分化的程度均显著高于相应浓度NGF单独使用时的效果，分化细胞比例的提高百分比呈浓度依赖形式。
表4
Figure BDA0003412634970000122
Figure BDA0003412634970000131
图7所示为不同浓度的组合物与不同浓度NGF在单独或协同作用下诱导pNF200-Luc表达荧光素酶的结果(纵坐标以基线的倍数表示，以未加药的对照组的荧光素酶活性水平为基线，数值设为1)。不同浓度的组合物及1.5ng/mL NGF在单独使用时对pNF200-Luc表达荧光素酶的诱导作用不明显；当组合物与不同浓度NGF协同使用时，pNF200-Luc表达荧光素酶活性被诱导提高的程度均显著高于相应浓度NGF单独使用时的效果，荧光素酶活性的提高倍数呈浓度依赖形式。因此，组合物可协同NGF诱导神经微丝表达。
表5
Figure BDA0003412634970000132
实施例8：木犀草素和异鼠李素协同NGF促进神经分化
方法：将PC12细胞接种(2×104cells/mL)到6孔板中培养(DMEM培养基，6％胎牛血清+6％马血清“％”为体积百分比)，24小时后，将培养基更换为低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清，“％”为体积百分比)继续培养24小时。随后辅以终浓度为100μg/mL的沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物1:5的组合物以及对应浓度的木犀草素、异鼠李素、山奈酚、槲皮素、四个黄酮混合物(图8)，又或者不同配比的木犀草素/异鼠李素混合物(图9，例如当浓度配比为1:2时，木犀草素终浓度为5μM，异鼠李素终浓度为10μM)，辅以终浓度1.5ng/mL NGF处理48小时，以单独加入终浓度50ng/mL NGF、单独加入终浓度1.5ng/mLNGF、1.5ng/mL NGF+木犀草素(10μM)、1.5ng/mL NGF+异鼠李素(10μM)、以及不加药组作为对照，观察细胞分化情况。用光学显微镜拍照分析神经突起的生长情况，每孔随机选择5个视野，每个视野观察至少100个细胞。细胞的一个或多个神经突起长度超过胞体直径则归类为分化细胞。
结果：如图8所示，当与低剂量NGF协同使用时，100μg/mL的组合物以及对应浓度的木犀草素(2.1μM)、异鼠李素(10.8μM)、山奈酚(2.3μM)、槲皮素(4.1μM)、四个黄酮混合物均能够促进PC12细胞分化，其中组合物在与NGF联用时可实现约45％的细胞分化，仅略低于作为阳性对照的50ng/mL NGF促进神经分化的效果(约55％)；其次在与NGF联用时产生显著促进效果的分别为四个黄酮混合物(约35％)、异鼠李素(约25％)及木犀草素(约15％)；槲皮素及山奈酚在与NGF联用时对细胞分化的促进作用较弱。
由此得知，四个单体黄酮中，异鼠李素和木犀草素在与低剂量NGF协同使用时具有较好促进分化效果，且二者分别为花生壳70％乙醇提取物和沙棘黄酮提取物中的主要单体黄酮。因此，取木犀草素与异鼠李素，按不同浓度配比与低剂量NGF进行协同使用，其对PC12细胞分化的促进效果如图9所示。图9中，4:1组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为20μM和5μM，3:1组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为15μM和5μM，2:1组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为10μM和5μM，1:1组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为5μM和5μM，1:2组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为5μM和10μM，1:3组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为5μM和15μM 1:4组对应的木犀草素和异鼠李素浓度分别为5μM和20μM。可知，木犀草素与异鼠李素在浓度比为1:1时，在与NGF联用时可对PC12细胞分化产生最显著的促进作用。
实施例9：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)协同BDNF、NT-3、NT-4促进神经微丝的表达
实验方法：将8×104cells/mL人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)种于24孔细胞培养板上，培养基为DMEM培养基添加15％(v/v)胎牛血清。24小时后，将培养基换成分化培养基(DMEM培养基，2％胎牛血清，10μM全反式维生A酸，“％”为体积百分比)继续培养5天。将含有神经微丝编码基因启动子的荧光素酶报告基因载体pNF200-Luc转染到SH-SY5Y细胞中。8小时后，换成无血清的DMEM培养基，随后加入不同浓度的组合物辅以5ng/mL不同种类的神经营养因子处理。24小时后，移除细胞培养液，并用PBS冲洗。裂解液(100mM PBS，1mMDTT，0.2％Triton X-100，pH7.8)裂解后，12000g高速离心15分钟得到含有荧光素酶的细胞裂解液。将50μL细胞裂解液转移到不透光的96孔酶标板上，加入荧光素酶的底物，用化学发光仪(Promega Glomax 96孔化学发光仪)检测荧光素酶活性。各样本活性用总蛋白浓度做归一化处理。
实验结果：图10所示组合物与BDNF(脑源性神经营养因子)、NT-3(神经营养因子-3)及NT-4/5(神经营养因子-4/5)在单独或协同作用下诱导pNF200-Luc表达荧光素酶的结果(纵坐标以基线的倍数表示，以未加药的对照组的荧光素酶活性水平为基线，数值设为1)。沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物组合物(1:5)及低剂量(5ng/mL)神经营养因子在单独使用时，分别可诱导pNF200-Luc荧光素酶活性提高2-3倍。组合物与5ng/mL神经营养因子协同使用时，荧光素酶的活性显著提高，其中组合物(1:5)与BDNF联用时可使荧光素酶活性提高8倍。因此，组合物可协同神经营养因子(BDNF、NT-3、NT-4/5)诱导神经微丝的表达。
表6
Figure BDA0003412634970000151
实施例10：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物(1:5)组合物制剂的抗Aβ作用实验方法：
(1)分别将浓度梯度的组合物或姜黄素(阳性对照)与100μM Aβ(β-淀粉样蛋白)混合，37℃孵育。7天后分别与10μM Thioflavin T(ThT)混合，加入黑色不透光的96孔酶标板，使用FlexStation 3Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices)检测荧光读数，组合物对β-淀粉样蛋白聚集的抑制情况如图11A所示。
(2)将PC12细胞(5×104cells/mL)接种到96孔板中培养(DMEM培养基，6％胎牛血清+6％马血清)，24小时后，将培养基更换为低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清)，并使用浓度梯度的组合物及姜黄素(阳性对照)对细胞进行预保护4小时，后加入100μM Aβ处理细胞48小时。细胞活性采用MTT比色法进行检测，以不加药组为对照，组合物保护细胞活性、降低Aβ引起的神经毒性损伤的结果如图11B所示。
实验结果：
(1)Aβ(β-淀粉样蛋白)是淀粉样前体蛋白(APP)被β-和γ-分泌酶分解后形成的一系列蛋白肽，阿兹海默症的主要标志之一即为出现Aβ不溶性原纤维聚集体。ThT(Thioflavin T)是一种苯并噻唑染料，与淀粉样蛋白原纤维结合后显示增强的荧光，被用于诊断淀粉样蛋白原纤维。图11A所示为姜黄素(阳性对照)与浓度梯度的组合物对Aβ聚集的抑制效果，可见组合物在100-500μg/mL的浓度范围内均可显著降低Aβ的聚集。因此，组合物具有抑制Aβ聚集、从而治疗和预防阿兹海默症的潜在药用功能。
(2)Aβ在大脑中有神经毒性。图11B所示为姜黄素(阳性对照)与浓度梯度的组合物保护PC12细胞活性、降低Aβ引起的神经毒性损伤的结果，可见50μg/mL的组合物制剂可使得细胞活性恢复至50％，与阳性对照姜黄素具有几乎相同的保护效果。因此，组合物具有保护细胞、抑制Aβ造成的神经毒性损伤的潜在药用功能。
实施例11：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)制剂的抗氧化作用实验方法：
(1)将PC12细胞(5×104cells/mL)接种到96孔板中培养(DMEM培养基，6％胎牛血清+6％马血清，“％”为体积百分比)，24小时后，将培养基更换为低血清培养基(DMEM培养基，1％胎牛血清+1％马血清)，并使用浓度梯度的组合物或5mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)对细胞进行预保护4小时，后加入200μM叔丁基过氧化氢(tBHP)处理细胞24小时。细胞活性采用MTT比色法进行检测，以不加药组为对照，组合物保护细胞活性、降低tBHP引起的氧化损伤的结果如图12A所示。
(2)将SH-SY5Y(1×105cells/mL)细胞种于96孔板中培养(DMEM培养基，15％胎牛血清)。24小时后，将培养基换成低浓度培养基(DMEM培养基，2％胎牛血清)，并使用浓度梯度的组合物及10μM黄芩素(阳性对照)对细胞进行预保护4小时，后加入1μMerastin(铁死亡的诱导剂)处理细胞24小时。细胞活性采用MTT比色法进行检测，以不加药组为对照，组合物保护细胞活性、抑制铁死亡损伤的结果如图12B所示。
实验结果：
(1)tBHP(tert-butyl hydroperoxide，叔丁基过氧化氢)可诱导神经细胞的氧化损伤。图12A所示为NAC(N-Acetyl Cysteine，乙酰半胱氨酸，阳性对照)与浓度梯度的组合物保护PC12细胞活性、降低tBHP引起的氧化损伤的结果，可见随着浓度提高，组合物抑制tBHP氧化毒性的效果逐渐增强，且在浓度为100μg/mL时几乎可以使细胞活性恢复至对照组水平，优于阳性对照NAC的保护效果。因此，组合物具有保护细胞、抑制tBHP造成的氧化损伤的潜在药用功能。
(2)铁死亡是一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式，可表现为细胞脂质过氧化增高、ROS提高。Erastin是一种铁死亡诱导剂。图12B所示为黄芩素(阳性对照)与浓度梯度的组合物保护SH-SY5Y细胞活性、降低Erastin引起的铁死亡损伤的结果，可见随着浓度提高，组合物抑制铁死亡的效果逐渐增强，且在浓度为100μg/mL时可达到与阳性对照黄芩素相近的保护效果。因此，组合物具有保护细胞、抑制铁死亡损伤的潜在药用功能。
实施例13：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)的抗炎作用
实验方法：
(1)将BV2细胞(小鼠小胶质细胞，15×104cells/mL)种于24孔板中培养(DMEM培养基，10％热灭活胎牛血清)。24小时后，使用浓度梯度的组合物或地塞米松(阳性对照)对细胞进行预保护4小时，后加入100ng/mL LPS(脂多糖)处理细胞。24小时后，移除细胞培养液，并用PBS冲洗。随后用RNAzol行总细胞RNA提取，反转录后对cDNA进行荧光定量PCR，测定促炎因子IL-1β的表达水平。
(2)将RAW 264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞，10×104cells/mL)种于24孔板中培养(DMEM培养基，10％热灭活胎牛血清)。24小时后，将含有NF-κB基因启动子的荧光素酶报告基因载体pNF-κB-Luc转染到RAW 264.7细胞中。8小时后更换培养基(DMEM培养基，10％热灭活胎牛血清)，并使用浓度梯度的组合物及地塞米松(阳性对照)对细胞进行预保护4小时，后加入100ng/mL LPS(脂多糖)处理细胞。24小时后，移除细胞培养液，并用PBS冲洗。裂解液(100mM PBS，1mM DTT，0.2％Triton X-100，pH 7.8)裂解后，12000g高速离心15分钟得到含有荧光素酶的细胞裂解液。将50μL细胞裂解液转移到不透光的96孔酶标板上，加入荧光素酶的底物，用化学发光仪(Promega Glomax 96孔化学发光仪)检测荧光素酶活性。各样本活性用总蛋白浓度做归一化处理，pNF-κB-Luc表达荧光素酶的结果如图13B所示。
实验结果：
(1)炎症反应存在于大部分神经退行性疾病中，是研发神经保护药物的重要方向之一。LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)为常见的内毒素，激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等合成和释放多种细胞因子和炎性介质，可强烈诱导机体的炎症反应。小胶质细胞为中枢神经系统的主要免疫细胞，其过度激活会引起炎症反应。BV2细胞源于C57BL/6小鼠的小胶质细胞永生细胞系，保留了小神经胶质细胞多种形态、表征和功能特征。IL-1β是一种重要的促炎因子，其表达水平可用于表征细胞的炎性程度。图13A所示为地塞米松(阳性对照)与浓度梯度的沙棘花生壳保护BV2细胞活性、降低LPS引起的炎症损伤的结果，可见随着浓度提高，组合物抑制炎症损伤的效果逐渐增强，且在浓度为5μg/mL时抑制效果最佳。因此，组合物具有保护细胞、抑制炎症损伤的潜在药用功能。
(2)RAW 264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，同样为研究炎症反应时最常用的体外模型之一。NF-κB基因及其信号通路被广泛应用于研究炎症反应、免疫应答和抑制细胞凋亡等。图13B所示为地塞米松(阳性对照)与浓度梯度的沙棘花生壳保护RAW 264.7细胞活性、降低LPS引起的炎症损伤的结果，可见随着浓度提高，组合物抑制炎症损伤的效果逐渐增强。因此，组合物具有保护细胞、抑制炎症损伤的潜在药用功能。
实施例14：沙棘总黄酮/花生壳70％乙醇提取物的组合物(1:5)干混悬剂的制备
制备方法1：将组合物、助悬剂维聚酮K30以及润湿剂泊洛沙姆188以2：7：1的比例用三维混合机充分混合，小袋分装即可。
制备方法2：将组合物(1:8)、助悬剂维聚酮K30、润湿剂泊洛沙姆188以及甜味剂木糖醇糖醇以2：6.8：0.2的比例用三维混合机充分混合，小袋分装即可。
制备方法3：将组合物(1:10)、助悬剂维聚酮K30、润湿剂泊洛沙姆188以及甜味剂木糖醇糖醇以2：6：0.5的比例用三维混合机充分混合，小袋分装即可。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (11)

1.一种具有增强神经营养因子功能的组合物，其特征在于，所述组合物由沙棘提取物和花生壳提取物组成，
所述沙棘提取物为沙棘总黄酮， 其制备方法为取干燥沙棘果实，加70％v/v乙醇水溶液回流提取，离心，取上清液，浓缩，调pH至1.0，放入冰箱静置过夜，离心后取沉淀物，冷冻干燥得到沙棘总黄酮；
所述花生壳提取物为花生壳的醇提物，其制备方法为取干燥花生壳，粉碎研磨，70％v/v乙醇水溶液超声提取，过滤、合并所得提取液，浓缩后冷冻干燥得到70％乙醇提取物的干粉，
所述沙棘总黄酮和所述花生壳的醇提物的重量比为1：4-8。
2.一种神经营养因子增效剂，其特征在于，所述增效剂由权利要求1所述的组合物以及药学上可以接受的辅料组成。
3.根据权利要求2所述的神经营养因子增效剂，其特征在于，所述辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、助悬剂和矫味剂中的一种或者多种。
4.根据权利要求2所述的神经营养因子增效剂，其特征在于，所述增效剂的剂型为胶囊剂、片剂、悬浮剂或者口服液。
5.根据权利要求2所述的神经营养因子增效剂，其特征在于，所述增效剂的给药方式为口服给药。
6.一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1所述的组合物和神经营养因子组成。
7.根据权利要求6所述的预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述神经营养因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5中的一种或者几种。
8.根据权利要求6所述的预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病选自抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和/或脊髓损伤。
9.一种预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的联合用药物，其特征在于，所述联合用药物是将权利要求2至5任一项所述的神经营养因子增效剂和神经营养因子联合。
10.根据权利要求9所述的预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的联合用药物，其特征在于，所述神经营养因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4/5中的一种或者几种。
11.根据权利要求9所述的预防和/或治疗神经营养因子依赖性神经系统疾病的联合用药物，其特征在于，所述神经营养因子依赖性神经系统疾病选自抑郁症、阿兹海默症、帕金森氏症、脑损伤和/或脊髓损伤。
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