WO2007112730A1 - Wirkstofffraktionen für formulierungen zur therapie und prävention von entzündlichen erkrankungen - Google Patents

Wirkstofffraktionen für formulierungen zur therapie und prävention von entzündlichen erkrankungen Download PDF

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WO2007112730A1
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aqueous phase
ethyl acetate
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proliferation
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Kathrin Kabrodt
Ingo Schellenberg
Uwe Lendeckel
Carmen Wolke
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Hochschule Anhalt (Fh)
Esa Patentverwertungsagentur Sachsen-Anhalt Gmbh
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • Drug fractions for formulations for the treatment and prevention of inflammatory diseases are included in the formulations for the treatment and prevention of inflammatory diseases.
  • the invention relates to drug fractions for formulations for the therapy and prevention of inflammatory or autoimmune diseases and / or disorders with impaired keratinocyte proliferation, such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, atopic dermatitis and infections of the skin or gastrointestinal tract as well as wound healing disorders.
  • inflammatory or autoimmune diseases and / or disorders with impaired keratinocyte proliferation such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, atopic dermatitis and infections of the skin or gastrointestinal tract as well as wound healing disorders.
  • Extracts derived from rhubarb roots have been used for many years to prepare medical administrations. Generally known is the use as Laxans. In classical Chinese medicine, there are indications for the treatment of gastric ulcers, chronic kidney failure and pregnancy-related hypertension. Further fields of application are e.g. Attempts to treat cancer (Locock, R .: Herbai medicinaln: Essiac, Canadian Pharmaceutical Journal, 1997) and use as an ingredient in antipsychotic medicines for mental illnesses, such as acute and chronic schizophrenia (DE 3690104 T1). There have also been reported anti-inflammatory effects (Nonaka G. et al., Chem. Pharm. BuIi. 1981; 29: 2862 et seq.) And immunostimulatory effects of such preparations (Ma L. et al., Chinese Journal of Modern Developments in Traditional Medicine 1991; 418-9, 390).
  • Nonaka and coworkers carried out numerous analytical investigations from 1977 to 1983 over polyphenols in the Rhubarb root (merchandise). They were able to isolate (+) - catechin, (-) - epicatechin, (-) - epicatechin-gallate, procyanidin dimer gallate, lindleyin, and trigalloyl glucose.
  • Rhatannin which is composed of (-) - epicate-chin-3-gallate units, is also assigned to the rhubarb berries (Nonaka, G.-J., et al .: Chem. Pharm. Bull; 1977; 25 (9); 2300 -2305 and Kashiwada, Y. et al .: Chem. Pharm. Bull; 1986; 34 (10); 4083-4091).
  • the known extract formulations of Rheum species species show in the application a pronounced broadband effect, with individual drugs seem responsible for certain effects.
  • Drug fractions for formulations for the therapy and prevention of inflammatory or autoimmune diseases and / or disorders with impaired keratinocyte proliferation with specific Effect are not known for this purpose.
  • the aim of the invention is to provide drug fractions of Rheum species species with increased drug potential for the preparation of corresponding formulations.
  • the invention is based on the object to provide drug fractions for formulations for the treatment and prevention of inflammatory or autoimmune diseases and / or diseases with impaired keratinocyte proliferation, which are characterized by high efficacy and selectivity.
  • this object is achieved by drug fractions for formulations for the therapy and prevention of inflammatory or autoimmune diseases and / or diseases with disturbed keratinocyte proliferation from rheumatoid species, which are characterized in that the drug fractions obtained by extraction of the dried and ground root samples with methanol , with complete removal of methanol freed the aqueous phase formed from lipophilic accompanying substances, the purified aqueous phase extracted with ethyl acetate, the resulting aqueous phase and the combined ethyl acetate phase each separately worked up, separated by column chromatography in a limited number of drug fractions and drug fractions with the same content spectrum from the aqueous phase and from the ethyl acetate phase in each case be summarized.
  • immunostimulating induction of IL-1 ⁇ or IL-2 mRNA expression
  • immunosuppressive induction of TGF- ⁇ 1, suppression of IL-1 ⁇ or IL-2
  • TGF- ⁇ 1, suppression of IL-1 ⁇ or IL-2 immunosuppressive
  • Human T lymphocytes express mainly the type I receptor (p80) whose density can be increased by glucocorticoids and by IL-I itself.
  • the binding of IL-1 to the IL-1 receptor leads, inter alia, via the activation of adenylate cyclase, the cAMP-dependent protein kinase (PKA) and the transcription factor NF- ⁇ B to selective changes in gene expression in T lymphocytes.
  • Interleukin-1 has a stimulating effect on T cells by causing the induction of eg IL-2.
  • IL-2 is an essential growth and activation factor for T lymphocytes. Activation of T cells in the absence of IL-2 induces T cell activation and prevents their clonal expansion (proliferation).
  • T cell proliferation observed after administration of the superantigens TSST and SEC3 is also mainly mediated by IL-1.
  • IL-1 For a productive T-cell response and thus the full development of effector functions several signals are needed.
  • T cell receptor and CD28 dependent signals primarily cause activation and clonal expansion of the T cell
  • proinflammatory cytokines such as IL-1 ⁇
  • interleukin-1 plays an important role in the development and maintenance of inflammatory processes, autoimmune diseases and rejection reactions.
  • Antigen-dependent T-cell activation requires a number of other factors, including a correct balance of cytokine concentration in the immediate microenvironment.
  • cytokine concentration in the immediate microenvironment.
  • the inability of dendritic cells to induce an adequate immune response against chemically induced skin tumors is explained by the lack of (LI production of these cells: the delayed development and milder course of experimental autoimmune encephalitis of the rat as a result of the application of IL-1 receptor antagonist highlights, on the one hand, the key role of this cytokine for T-cell-dependent processes and, on the other hand, reflects current hopes for potential clinical intervention opportunities in related diseases.
  • IL-I acts synergistically with other cytokines.
  • IL-1 enhances the proliferation and IL-2 secretion of native T cells, however, this effect is about 11 fold stronger in the presence of IL-6.
  • the formation of effector cells is hardly affected by IL-1.
  • the production of all cytokines produced by already established Th 1 and Th2 cells is stimulated by IL-1.
  • combination with IL-6 or TNFa potentiates this effect of IL-1.
  • Th2 cells activation of the T cell receptor leads to the production of the Th2-typical cytokine IL-4, but not to the proliferation of these cells.
  • Co-stimulation via the T-cell receptor and the IL-1 receptor leads to the autocrine production of cell-like IL-I, which then autocrine (juxtakrin) and IL-4-independent induces the proliferation of Th2 cells.
  • interleukin-1 acts strongly antiproliferative on Th2 cells in the presence of the Th 1 -type cytokine IFNg.
  • TGF-ß1 causes growth inhibition in most cell types by arrest in the G1 phase of the cell cycle.
  • the antiproliferative effect of TGF- ⁇ 1 is based, at least in part, on an inhibition of the expression and activity of the cyclin-dependent kinases (CDK) CDK4 and CDK2.
  • CDK cyclin-dependent kinases
  • CDK4 / cyclin D1 phosphorylates T826.
  • CDK2 / cyclin A as well as CDK4 / cyclin D1 can phosphorylate p105Rb at position S608 in vitro, but the complex of CDK2 and cyclin E is not capable of this.
  • the phosphorylation of p105 Rb in position S795 is also by CDK4 but not through CDK2 or CDK3.
  • TGF- ⁇ 1-dependent inhibition of CDK4 / CDK2 activity thus causes hypophosphorylation of pRbl05, which in this state binds transcription factors of the E2F family. As a result of this binding, expression of specific genes whose products are required for transition to the S phase of the cell cycle is suppressed.
  • TGF-b1 the application of TGF-b1 to the culture medium of HaCaT cells (human keratinocyte line) induces the rapid formation of E2F4-Rb components and the formation of the functionally related E2F4-p107 and E2F4-p130 complexes.
  • E2F binding sites play an important role in TGF-b1-dependent repression of transcription.
  • genes regulated in this way are the kinase inhibitors p21 / Waf-1, p27 / kip and p15 / INK4B, the G1-cyclin activating phosphatase cdc25A and the anti-apoptotic proto-oncogene bcl-2.
  • TGF-ß1 TGF-ß1 mRNA levels in PHA-stimulated MNC by rheumatoid fractions shown in our experiments can be considered as an explanation for the pronounced anti-proliferative effect of these inhibitors on MNZ (Example 1).
  • Such a growth-inhibiting effect could also be demonstrated with respect to the human keratinocyte line HaGaT (Example 5).
  • Our invention shows that for the treatment and prevention of dermatological diseases with keratinocyte hyperproliferation and altered differentiation states (hyperkeratosis, psoriasis) and wound healing disorders, for the formation of which keratinocyte proliferation is of central importance, the application of defined polyphenolic Rheum extracts or corresponding Preparations and dosage forms thereof is suitable.
  • Figure 1 An extraction scheme for the processing of dried, ground
  • FIG. 2 The chromatographic separation of the obtained ethyl acetate fraction 4 from Rheum palmatum MAXIM.
  • the upper trace in each case shows the absorption at 280 nm, the lower one at 242 nm.
  • FIG. 3 The chromatographic separation of the obtained ethyl acetate fraction 4 from Rheum rhaponticum L. The upper trace shows the absorbance at 280 nm, the lower one at 242 nm.
  • FIG. 4 The chromatographic separation of the sc fraction 2 obtained from the separation of the water phase from Rheum palmatum MAXIM. The lower trace shows the absorbance at 280 nm, the upper trace the total ion current.
  • FIG. 5 Inhibition of the DNA synthesis of human PHA-stimulated MNCs by incubation with defined polyphenolic fractions from Rheum species.
  • FIG. 6 The dose-dependent induction (top) or inhibition (bottom) of FIG. 6
  • FIG. 7 The dose-dependent induction (top) or inhibition (bottom) of the IL-2 mRNA expression of human MNC by the Rheum fractions 4E or 8W. The determination was carried out as indicated under Example 2.
  • FIG. 8 The dose-dependent induction of IL-1 b mRNA expression of PHA-stimulated human MNC by Rheum fractions 8W and 25/5, respectively. The determination was made as indicated under Example 2.
  • FIG. 9 The dose-dependent induction of TGF-b1 mRNA expression of PHA-stimulated human MNZ by the Rheum fraction 8W. The determination was carried out as indicated under Example 2.
  • Figure 10 The influence of polyphenoic fractions from Rheum species on the proliferation (DNA synthesis) of the human keratinocyte cell line HaCaT.
  • methanol is used as the primary extractant instead of acetone / water, and these methanolic extracts are used further.
  • a preparative column chromatographic fractionation of the total ethyl acetate extract is carried out.
  • rhubarb root material For extraction of the rhubarb root material, 1 kg of a dried and ground root sample was subjected to a five-time vortex extraction with a total of about 8000 ml of methanol for 15 min each on the Ultra-Turrax. The collected extracts were then concentrated on a rotary evaporator under vacuum at 35 ° C, and after addition of 500 ml of water, the methanol was completely removed. To precipitate interfering lipophilic substances, the aqueous extract was stored overnight under nitrogen in the refrigerator at 5 0 C. The precipitates could be centrifuged off the next day. For the separation of further lipophilic Accompanying substances, the aqueous solution was then shaken out three times with 500 ml of petroleum ether.
  • the thus purified aqueous phase was then extracted by shaking four times with 750 ml of ethyl acetate each time, after which there should be an increase in the number of low-oligomerized compounds in the combined ethyl acetate phases and compounds with a higher degree of oligomerization in the remaining aqueous phase
  • the water phase were then concentrated on a rotary evaporator under vacuum at 35 0 C, taken up in a little water and then freeze-dried.
  • the freeze-dried gerbstoffangereicherten extracts were stored until further use under a nitrogen atmosphere at -21 0 C.
  • the ethyl acetate or water phase was dissolved in methanol or methanol / water, applied to the column (length 100 cm, diameter 5 cm) and treated in succession with ethanol, methanol and acetone / water (7: 3; v / v) eluted.
  • an MPLC system with sample feed pump was used.
  • both the fractions of the ethyl acetate phase and the fractions of the water phase with the same content spectrum were combined for the individual genotypes.
  • sc separation of the ethyl acetate phase resulted in e.g. in variant 11 (Rheum palmatum M.) 11 fractions, in variant 19 (Rheum rhaponticum L.) 12 fractions.
  • Figures 2 and 3 show the chromatograms of the two most effective fractions from the sc separation of the ethyl acetate / phase of Rheum patmatum MAXiM. and Rheum rhaponticum L.
  • the upper trace shows the absorbance at 280 nm, the lower trace at 242 nm. Both wavelengths were used for quantification, since epigaliocatechin and the two procyanidins had significantly higher absorption intensities at 242 nm. In the case of Rheum palmatum MAXIM, the following could be determined quantitatively: catechin procyanidin B1 procyanidin B2 epicatechingallate.
  • FIG. 4 shows by way of example the chromatogram of the fraction W2 from the separation of the water phase of Rheum palmatum MAXIM.
  • the lower trace shows absorbance at 280 nm, the upper trace total ion current (TIC).
  • the calibrated monomeric tannin precursors epigallocatechin, catechin, procyanidin B1, epicatechin, procyanidin B2, epigallocatechin gallate, epicatechingallate were no longer identified in this fraction as expected.
  • Rheum species is a plant that is found worldwide and has adapted to different species of its environment.
  • Variant 01 Rh. Officinale BAILL .
  • Variant 02 Rh. Officinale BAILL .
  • Variant 03 Rh. Officinale BAILL .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 04 Rh. Officinale BAILL .; Medicinal Rhubarb, Wisley (England)
  • Variant 05 Rh. Officinale BAILL .; Dolomites (Münster)
  • Variant 09 Rh. Palmatum L .; Orlando (USSR)
  • Variant 10 Rh. Rhabarbarum L.; The Sutton
  • Variant 11 Rh. Palmatum l.f. florc rubra MAXIM. Moscow (USSR)
  • Variant 12 Rh. Rhabarbarum L .; Holstein blood
  • Variant 13 Rh. Rhabarbarum L .; Utrecht (Holland)
  • Variant 14 Rh. Rhabarbarum L .; Uppsala (Sweden) Variation 15: Rh. Rhabarbarum L .; KVDR 1986
  • Variant 16 Rh. Rhaponticum L; Kirovsk (USSR)
  • Variant 17 Rh. Rhaponticum L .; Dnepropetrovsk (USSR)
  • Variant 18 Rh. Rhaponticum L .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 19 Rh. Rhaponticum L .; Uppsala (Sweden) variant 20: Rh. Rhaponticum L.; Petrograd (USSR)
  • Variant 21 Rh. Rhaponticum L .; Taplozek (Finland)
  • Variant 22 Rh. Rhabarbarum L .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 23 Rh. Rhabarbarum L .; China 1956
  • Variant 24 Rh. Rhabarbarum L .; KVDR 1987
  • Variant 26 Rh. Alexandra VEITCH .; Kirovsk (USSR)
  • Variant 27 Rh. Wittrockii LUNDSTR .; Petrograd (USSR)
  • Variant 29 Rh. Emod. WOOL .; Petrograd (USSR)
  • Variant 30 Rh. Leucorum; Wroclaw (Poland)
  • Variant 31 Rh. Leucorrhizum PALL .; Bucharest (Romania)
  • Variant 32 Rh. Maximowiczii LOSINSK .; Petrograd (USSR)
  • Variant 33 Rh. Tataricum I .f. lasi (Romania)
  • Variation 34 Rh. undulatum L .; Pruhonice (CSSR)
  • Variant 35 Rh. Altaicum LOSINSK .; Petrograd (USSR)
  • Variant 38 Rh. Old Landsorte (Germany)
  • Variant 39 Rh. Old Landsorte (Poland)
  • Variation 40 Bastard Rh. Rhab. x Rh. raponticum
  • Variant 41 Rh. Alexandra VEITCH .; Petrograd (USSR)
  • Variant 42 Rh. Officinale BAILL .; Country type, Slovak Ore Mountains
  • the starting material used was peripheral blood, which was treated with a sterile heparin / RPMI mixture for coagulation inhibition (200 ml of blood, 100 ml of mixture).
  • 20 ml of FicoLite H (Linaris) were placed in 50 ml Falcon tubes as a density gradient medium with a density of 1.077 g / cm 2. This was then gently overlaid with the blood / heparin / RPMI mixture. The centrifugation took place without a brake at 1800 U for 30 min (Megafuge 2.0R, Heraeus Instruments).
  • the cells of the interphase were transferred carefully and washed with RPM1 1640 medium (tubes made up to 50 ml). The centrifugation is carried out for 10 min at 1400 U. The resulting cell pellets were washed again with RPM1 1640 (made up to 50 ml) and then counted. To determine the cell number, which was carried out with the help of the Neubauer counting chamber, 380 ⁇ l of trypan blue were mixed with 20 ⁇ l of cell suspension. After that, all four squares were counted. The cell count results from the mean value multiplied by 2500 (chamber) x 20 (dilution).
  • the isolated MNZ were used in a cell culture flask (Nunc) with a concentration of 10 6 cells / 5 ml medium (Dulbecco 's MEM with glutamax-I with addition of 10 mg refobacin and 10% FCS, Gibco). MNZ was stimulated by 1 ⁇ g / ml phytohemagglutinin (PHA, Roche Diagnostics). The cells were then incubated for 24 hours in an incubator (Steri-Cult200, Labotect) at 37 ° C, 86%. relative humidity and 5% C02 content cultivated. In each case, a control was carried out in which cells were cultured without addition of mitogen under otherwise identical conditions.
  • PHA phytohemagglutinin
  • RNA was obtained from any DNA contained by DNAse treatment (RQ1 RNase-free DNase, 1 U / ⁇ l, Promega, 30 min at 37 ° C). Thereafter, RNA was again subjected to purification by the RNeasy column. The DNA-free RNA was quantified spectrophotometrically on GeneQuant (Pharmacia).
  • RNA was stored until further use at -70 0 C.
  • RNA-free RNA was transcribed into first-strand cDNA using AMV reverse transcriptase and random hexameric oligonucleotides.
  • a typical reaction batch (25 ⁇ l) consisted of the following components:
  • the principle of this method is based on the excitation of inserted fluorophores by short-wave light, as a result of higher-wave light is emitted.
  • the emission was read by optical detection units per PCR cycle and the fluorescence intensity was evaluated.
  • fluorescent molecule fluorophores
  • SYBRGreen I Molecular Probes
  • a typical 25 ⁇ l reaction mixture consisted of the following components:
  • 2x104 cells were cultured in 200 ⁇ l of Keratinocyte Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) in 96-well cell culture plates (Nunc) without (control) or with the addition of 100 ⁇ g / ml of the specified fractions over a period of 48 hours. Subsequently, 3 [H] -methyl-thymidine was added to the culture medium and, after a further 6 hours, the amount of 3 [H] -thymidine incorporated in the DNA was measured, as described by Reinhold et al. (Reinhold D et al .: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor ⁇ 1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells Immunology 1997; 91: 354-360).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen bzw. Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation aus Rheum species-Arten, wobei die Wirkstofffraktionen aus durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol erhalten, unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttelt, die resultierende wässrige Phase und die vereinigte Ethylacetatphase jeweils getrennt aufgearbeitet, säulenchromatografisch in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen aufgetrennt und Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhaltsspektrum aus der wässrigen Phase und aus der Ethylacetatphase jeweils für sich zusammengefasst werden.

Description

Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen Erkrankungen
Die Erfindung betrifft Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen bzw. Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinzytenproliferation, wie Rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, Psoriasis, Neurodermitis und Infektionen der Haut oder des Gastrointestinaltraktes sowie von Wundheilungsstörungen.
Aus Rhabarberwurzeln gewonnene Extrakte werden seit vielen Jahren zur Bereitung medizinischer Verabreichungen eingesetzt. Allgemein bekannt ist der Einsatz als Laxans. In der klassischen chinesischen Medizin gibt es Hinweise zur Behandlung von Magengeschwüren, chronischem Nierenversagen und schwangerschaftsbedingtem Bluthochdruck. Weitere Anwendungsfelder sind z.B. Versuche zur Krebs- behandlung (Locock, R.: Herbai medicin: Essiac, Canadian Pharmaceutical Jour- nal1997) und die Verwendung als Bestandteil antipsychotischer Arzneimittel für mentale Krankheiten, wie akute und chronische Schizophrenie (DE 3690104 T1 ). Berichtet wurde auch über entzündungshemmende Effekte (Nonaka G. u.a. in Chem. Pharm. BuIi. 1981 ;29:2862 ff.) sowie über immunstimulierende Wirkungen derartiger Aufbereitungen (Ma L. u.a. in Chinese Journal of Modern Developments in Traditional Medicine 1991 ; 11 :418-9, 390).
Bei der Isolierung von Einzelwirkstoffverbindungen aus Rhabarberwurzelextrakten konnten aus den Wurzeln von Rheum palmatum (+)-Catechin, (-)-Epicatechin-gallat und Glucogallin (1 -Mono-galloyl-glucose) gewonnen werden (Friedrich, H. und Höhle, J.: Arch Pharmaz.; 1966;10; 857-866).
Nonaka und Mitarbeiter haben von 1977 bis 1983 zahlreiche analytische Untersuchungen über Polyphenole in der Rhabarberwurzel (Handelsware) durchgeführt. Sie konnten (+)-Catechin, (-)-Epicatechin, (-)-Epicatechin-gallat, Procyanidindimergalla- te, Lindleyin und Trigalloylglucose isolieren. Auch Rhatannin, das aus (-)-Epicate- chin-3-gallat-Einheiten aufgebaut ist, wird den Rhabarbergerbstoffen zugeordnet (Nonaka, G.-J., u.a.: Chem. Pharm. Bull; 1977; 25 (9); 2300-2305 und Kashiwada, Y. u.a.: Chem. Pharm. Bull; 1986; 34 (10); 4083-4091).
Die bekannten Extraktformulierungen aus Rheum species-Arten zeigen in der Anwendung eine ausgesprochene Breitbandwirkung, wobei auch einzelne Wirkstoffe für bestimmte Effekte verantwortlich scheinen. Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen bzw. Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation mit spezifischer Wirkung sind für diesen Anwendungszweck nicht bekannt. Das Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Wirkstofffraktionen aus Rheum species-Arten mit gesteigertem Wirkstoffpotenzial zur Herstellung entsprechender Formulierungen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen bzw. Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation bereitzustellen, die sich durch hohe Wirksamkeit und Selektivität auszeichnen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen bzw. Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation aus Rheum- species-Arten gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Wirkstofffraktionen durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol erhalten, unter vollständiger Methanolentfernung die gebildete wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen befreit, die gereinigte wässrige Phase mit Ethylacetat ausgeschüttelt, die resultierende wässrige Phase und die vereinigte Ethylacetatpha- se jeweils getrennt aufgearbeitet, säulenchromatografisch in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen aufgetrennt und Wirkstofffraktionen mit gleichem Inhalts- spektrum aus der wässrigen Phase und aus der Ethylacetatphase jeweils für sich zusammengefasst werden.
Als außerordentlich überraschend hat sich herausgestellt, dass sowohl aus dem Ethylacetat-Gesamtextrakt als auch aus dem Wassergesamtextrakt von Rheum species durch chromatografische Auftrennung gewonnene einzelne Rhabarberfrak- tionen einen signifikanten Einfluss auf die Modulation der Zytokinproduktion sowie DNS-Synthese/Proliferation und damit der Effektorfunktion von mononukleären Zellen (MNZ) sowie auf die Hemmung der DNS-Synthese/Proliferation der humanen Keratinozyten-Zelllinie HaCaT ausüben.
Im Einzelnen wurden die Effekte von definierten polyphenolischen Rheum-Fraktio- nen auf die mRNA-Expression von lnterleukin-1 ß (IL-I ß), IL-2 und transforming growth factor 1 ß (TGF-ß1 ) in MNZ bestimmt. Es zeigte sich, dass die mRNA-Gehalte der entsprechenden Zytokine durch definierte Rheum-Fraktionen dosisabhängig verändert werden. Dabei wurden je nach verwendeter Fraktion sowohl - immunstimulierende (Induktion von IL-1 ß- bzw. IL-2-mRNA-Expression) als auch - immunsupprimierende (Induktion vonTGF-ß1 , Suppression von IL-1 ß oder IL-2) Effekte nachgewiesen. Die wichtige Rolle dieser drei Zytokine für die Regulation der Immunantwort ist seit längerem bekannt und kann zur Erklärung von antientzündlichen, immunsuppressi- ven, antiproliferativen Prozessen einerseits sowie entzündungsfördernder bzw. die Effektorfunktion humaner T-Zellen stärkender (immunstimulierender) Prozesse ande- rerseits herangezogen werden. lnterleukin-1 ß ist ein pleiotroper Faktor mit lokalen und systemischen Wirkungen. IL-1 -Rezeptoren werden auf einer Vielzahl von Zellen in unterschiedlicher Dichte exprimiert. Humane T-Lymphozyten exprimieren hauptsächlich denTyp-l-Rezeptor (p80), dessen Dichte durch Glucocorticoide und durch IL-I selbst gesteigert werden kann. Die Bindung von IL-I an den IL-1 -Rezeptor führt u.a. über die Aktivierung der Adenylatcyclase, der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und des Transkriptionsfaktors NF-κB zu selektiven Änderungen der Genexpression in T-Lymphozyten. lnterleukin-1 wirkt stimulierend auf T-Zellen, indem es die Induktion von z.B. IL-2 bewirkt. IL-2 ist ein unabdinglicher Wachstums- und Aktivierungsfaktor für T- Lymphozyten. Die Aktivierung von T-Zellen in Abwesenheit von IL-2 bewirkt die Aner- gie der T-ZeIIe und verhindert die klonale Expansion (Vermehrung) derselben. Auch die nach Applikation der Superantigene TSST und SEC3 beobachtete T-Zell-Prolife- ration ist hauptsächlich IL-1 -vermittelt. Für eine produktive T-Zell-Antwort und somit die volle Ausbildung der Effektorfunk- tionen werden mehrere Signale benötigt. Während einerseits T-Zell-Rezeptor- und CD28-abhängige Signale primär die Aktivierung und klonale Expansion der T-ZeIIe bewirken, ist andererseits die Anwesenheit und Wirkung proinflammatorischer Zytokine, wie z.B. IL-I ß, für das Überleben aktivierter T-Zellen erforderlich. Durch die aktivierende Wirkung auf T-Lymphozyten kommt dem lnterieukin-1 eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Erhaltung von Entzündungsprozessen, Autoimmunerkrankungen und Abstoßungsreaktionen zu. Die antigenabhängigeT-Zell-Aktivierung bedarf einer Reihe weiterer Faktoren, einschließlich einer korrekten Balance der Zytokinkonzentration in der unmittelbaren Mikroumgebung. So wird die Unfähigkeit dendritischer Zellen, eine adäquate Immunantwort gegen chemisch induzierte Hauttumore einzuleiten, mit der fehlenden (L-I -Produktion dieser Zellen erklärt. Die verzögerte Entwicklung und der mildere Verlauf der experimentellen Autoimmun-Enzephalitis der Ratte infolge der Applikation von IL-I -Rezeptorantagonist unterstreicht einerseits die Schlüsselrolle dieses Zytokins fürT-Zell-abhängige Prozesse und widerspiegelt andererseits gegenwärti- ge Hoffnungen auf potenzielle klinische Interventionsmöglichkeiten bei entsprechenden Erkrankungen.
In einer Reihe von Zellsystemen wirkt IL-I synergistisch mit anderen Zytokinen. Beispielsweise verstärkt IL- 1 die Proliferation und IL-2-Sekretion nativer T-Zellen, jedoch ist dieser Effekt in Gegenwart von IL-6 etwa 11 fach stärker. Die Bildung von Effektor-Zellen wird kaum durch IL-1 beeinflusst. Dagegen wird die Produktion aller Zytokine, die von bereits etablierten Th 1 undTh2-Zellen gebildet werden, durch IL-1 stimuliert. Wiederum verstärkt die Kombination mit IL-6 oder TNFa diese Wirkung von IL-I .
Bei Th2-Zellen führt die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors zwar zur Produktion des Th2-typischen Zytokins IL-4, nicht aber zur Proliferation dieser Zellen. Die Ko-Stimu- lation über T-Zell-Rezeptor und IL-1 -Rezeptor führt zur autokrinen Produktion von zellständigem IL-I , welches dann autokrin (juxtakrin) und IL-4-unabhängig die Proli- feration derTh2-Zellen induziert. Im Gegensatz dazu wirkt lnterleukin-1 in Gegenwart des Th 1 -typischen Zytokins IFNg stark antiproliferativ auf Th2-Zellen. Diese Beispiele aus einer nahezu unüberschaubaren Fülle von Literaturdaten zu den Effekten des IL-I veranschaulichen dessen wichtige Funktion im Prozess der T-ZeII- Aktivierung. Unsere überraschende Beobachtung, dass ausgewählte polyphenoli- sehe Fraktionen aus Rheum species dosisabhängig die IL- 1 ß- und IL-2-Produktion von MNZ bzw. T-Zellen modulieren, widerspiegelt daher deren starke immunmodu- latorische Aktivität, die gezielt zurTherapie und Prophylaxe von entzündlichen und anderen Erkrankungen des Immunsystems, insbesondere Autoimmunerkrankungen, ausgenutzt werden kann. Die vorliegenden Ergebnisse belegen weiterhin eine dosisabhängige Veränderung derTGF-ß1 -mRNA-Konzentration in ruhenden und PHA-stimulierten MNZ bzw. T- Zellen durch die Applikation definierter polyphenolischer Fraktionen aus Rheum species. Die drei Hauptwirkungen des TGF-ß1 sind die Auslösung bzw. Verstärkung von Fibrosierungsprozessen, die chemotaktische Aktivität gegenüber neutrophilen
Granulozyten sowie die Hemmung der Proliferation verschiedener Zelltypen. TGF-ß1 bewirkt in den meisten Zelltypen eine Wachstumshemmung durch einen Arrest in der G1 -Phase des Zellzyklus. Die antiproliferative Wirkung des TGF-ß1 beruht zumindest teilweise auf einer Hemmung von Expression und Aktivität der cyclin- abhängigen Kinasen (CDK) CDK4 und CDK2. Diese beiden Kinasen sind zumindest in vitro die für die Phosphorylierung und damit Inaktivierung des Retinoblastom- Suszeptibilität-Gen 1 -Produktes pRbl 05 hauptsächlich wirksame Kinasen. Die verschiedenen Komplexe aus Cyclin und Cyclin-abhängiger Kinase haben dabei unterschiedliche Substratspezifität. CDK2/Cyclin A phosphoryliert das p105Rb in Position T821 , wogegen CDK4/Cyclin D1 T826-phosphoryliert. Sowohl
CDK2/Cyclin A als auch CDK4/Cyclin D1 können in vitro p105Rb an Position S608 phosphorylieren, wozu jedoch der Komplex aus CDK2 und Cyclin E nicht befähigt ist. Die Phosphorylierung von p105 Rb in Position S795 wird ebenfalls durch CDK4 bewirkt, nicht aber durch CDK2 oder CDK3. DieTGF-ß1 -abhängige Hemmung der CDK4/CDK2-Aktivität bewirkt somit eine Hypophosphorylierung von pRbl 05, welches in diesem Zustand Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie bindet. Im Ergebnis dieser Bindung wird die Expression spezifischer Gene, deren Produkte für den Übergang in die S-Phase des Zellzyklus erforderlich sind, supprimiert. So induziert beispielsweise die Applikation von TGF-b1 zum Kulturmedium von HaCaT-Zellen, (humane Keratinozytenlinie) die rasche Formation von E2F4-Rb-Komp)exen sowie die Bildung der funktionell verwandten E2F4-p107- und E2F4-p130-Komplexe. E2F-Bindungsorte spielen eine wichtige Rolle für dieTGF-b1 -abhängige Repression der Transkription. Unter den auf diese Weise regulierten Genen finden sich die Kina- se-lnhibitoren p21 /Waf-1 , p27/kip und p15/INK4B, die G1 -Zyklin-aktivierende Phosphatase cdc25A sowie das anti-apoptotisch wirksame Protooncogen bcl-2. Neben der E2F-Familie der Transkriptionsfaktoren sind insbesondere Smad4 und DPC4 wichtige Mediatoren der TGF-ß1 -Wirkung. Die in unseren Experimenten gezeigte Erhöhung derTGF-ß1 -mRNA-Gehalte in PHA-stimulierten MNZ durch Rheum-Fraktionen kann als eine Erklärung für die ausgeprägte anti-proliferative Wirkung dieser Hemmstoffe gegenüber MNZ (Beispiel 1 ) angesehen werden. Eine solche wachstumshemmende Wirkung konnte auch gegenüber der humanen Keratinozytenlinie HaGaT nachgewiesen werden (Beispiel 5). Unsere Erfindung zeigt, dass zur Therapie und zur Prävention von dermatologischen Erkrankungen mit keratinozytärer Hyperproliferation und veränderten Differenzierungszuständen (Hyperkeratose, Psoriasis) sowie Wundheilungsstörungen, für deren Entstehung die Keratinozytenproliferation eine zentrale Bedeutung hat, die Applikation von definier- ten polyphenolischen Rheum-Extrakten bzw. entsprechender Zubereitungen und Darreichungsformen daraus geeignet ist.
Die Erfindung wird durch die Figuren 1 bis 10 ausführlich interpretiert. Im Einzelnen zeigen: Figur 1 : Ein Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener
Rhabarberwurzeln.
Figur 2: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Ethylacetat-Frakti- on 4 aus Rheum palmatum MAXIM. Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm. Figur 3: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Ethylacetat-Frakti- on 4 aus Rheum rhaponticum L. Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm. Figur 4: Die chromatografische Auftrennung der sc gewonnenen Fraktion 2 aus der Trennung der Wasserphase aus Rheum palmatum MAXIM. Die untere Spur zeigt die Absorption bei 280 nm, die obere den Totalionenstrom .
Figur 5: Hemmung der DNS-Synthese von humanen PHA-stimulierten MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species.
Figur 6: Die dosisabhängige Induktion (oben) bzw. Hemmung (unten) der
IL-2mRNA-Expression PHA-stimulierter humaner MNZ durch die Rheum- Fraktionen 2W bzw. 4E. Figur 7: Die dosisabhängige Induktion (oben) bzw. Hemmung (unten) der IL-2- mRNA-Expression humaner MNZ durch die Rheum-Fraktionen 4E bzw. 8W. Die Bestimmung erfolgte wie unter Beispiel 2 angegeben.
Figur 8: Die dosisabhängige Induktion der IL-1 b-mRNA-Expression PHA-stimulierter humaner MNZ durch die Rheum-Fraktionen 8W bzw.25/5. Die Bestim- mung erfolgte wie unter Beispiel 2 angegeben.
Figur 9: Die dosisabhängige Induktion derTGF-b1 -mRNA-Expression PHA-stimulierter humaner MNZ durch die Rheum-Fraktion 8W. Die Bestimmung erfolgte wie unter Beispiel 2 angegeben.
Figur 10: Den Einflussvon polyphenoihaltigen Fraktionen aus Rheum species auf die Proliferation (DNS-Synthese) der humanen Keratinozyten-Zelllinie HaCaT.
Das Extraktionsschema für die Aufarbeitung getrockneter, gemahlener Rhabarberwurzeln ist in der Figur 1 dargestellt. Zur Gewinnung der Wirkstoffe wird eine bekannte Extraktionsvorschrift, wie sie z.B. in Abb.8 der DE 101 32936 A1 darge- stellt wird, modifiziert.
Für die Erzeugung der wässrigen Ausgangsphase wird statt Aceton/Wasser, Methanol als Primär-Extraktionsmittel eingesetzt, und diese methanolischen Extrakte werden weiterverwendet. Nach der mehrstufigen extraktiven Aufarbeitung wird eine präparative säulenchromatographische Fraktionierung des Ethylacetat-Gesamtex- traktes durchgeführt.
Für eine Extraktion des Rhabarberwurzel-Materiais wurden 1 kg einer getrockneten und gemahlenen Wurzelprobe einer fünfmaligen Wirbelextraktion mit insgesamt etwa 8000 ml Methanol für je 15 min am Ultra-Turrax unterworfen. Die gesammelten Extrakte wurden dann am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35 °C eingeengt, und nach Zugabe von 500 ml Wasser wurde das Methanol vollständig abgezogen. Zur Ausfällung störender lipophiler Substanzen wurde der wässrige Extrakt über Nacht unter Stickstoffbegasung im Kühlschrank bei 50C aufbewahrt. Die Fällungen konnten am nächsten Tag abzentrifugiert werden. Zur Abtrennung weiterer lipophiler Begleitstoffe wurde diewässrige Lösung anschließend noch drei Mal mit je 500 ml Petrolether ausgeschüttelt. Die so gereinigte wässrige Phase wurde daraufhin vier Mal mit je 750 ml Ethylacetat ausgeschüttelt, wonach sich in den vereinigten Ethyla- cetat-Phasen vermehrt niedrig oligomerisierte Verbindungen befinden sollten und in der verbleibenden wässrigen Phase Verbindungen mit höherem Oligomerisierungs- grad. Sowohl die Ethylacetat- als auch die Wasser-Phase wurden dann am Rotationsverdampfer unter Vakuum bei 35 0C eingeengt, in wenig Wasser aufgenommen und anschließend gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten gerbstoffangereicherten Extrakte wurden bis zur weiteren Verwendung unter Stickstoffatmosphäre bei -21 0C aufbewahrt.
Die säulenchromatografische (sc) präparative Auftrennung der Ethylacetat sowie der Wasser-Phase erwies sich als unumgänglich, um das Gesamtspektrum an polyphe- nolischen Verbindungen auf eine begrenzte Anzahl an Substanzen einzuschränken. Zur präparativen Isolierung von Proanthocyanidinen wird schon seit langem dieTren- nung an Sephadex LH-20 eingesetzt. Als Elutionsmittel haben sich Ethanol oder Alkohol/Wasser-Gemische etabliert. Zur Trennung polymerer Substanzen sind Aceton/Wasser-Gemische (7 : 3; v/v) geeignet.
Die Ethylacetat- bzw. Wasser-Phase wurden in Methanol bzw. Methanol/Wasser gelöst, auf die Säule (Länge 100 cm, Durchmesser 5 cm) aufgegeben und nachein- ander mit Ethanoi , Methanol und Aceton/Wasser (7 : 3; v/v) eluiert. Hierfür wurde eine MPLC-Anlage mit Probenaufgabepumpe genutzt. Nach DC-Überprüfung der erhaltenen Reagenzglasfraktionen wurden für die einzelnen Genotypen sowohl die Fraktionen der Ethylacetat-Phase als auch die Fraktionen der Wasser-Phase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum zusammengefasst. Nach der sc Trennung der Ethylacetat-Phase resultierten z.B. bei Variante 11 (Rheum palmatum M.) 11 Fraktionen, bei Variante 19 (Rheum rhaponticum L.) 12 Fraktionen.
Für den erfindungsgemäßen Einsatz wurden maximal 12 Fraktionen hergestellt. Für die Charakterisierung der durch säulenchromatografische Vortrennung gewon- nenen und hinsichtlich ihrer Wirkung als besonders effektiv einzuschätzenden Fraktionen gelten folgende Bedingungen: Chromatographie
Stationäre Phase: Synergi Polar RP, 80Ä, 4 μm, 250 X 2,0 mm
Mobile Phase: A 0,1 %ige Ameisensäure B Methanol
Flow: 0,3 ml/min
Temperatur: 400C
Gradientenbedingungen: Time (min) %B 0 0
10 10
40 50
41 0 55 0 Detektion: DAD
Über Kalibration mit entsprechenden Standardsubstanzen konnten folgende
Substanzen in den sc vorgetrennten Fraktionen aus der Ethylacetatphase - soweit enthalten - quantifiziert werden: Epigaliocatechin
Catechin
Procyanidin B1
Epicatechin
Procyanidin B2 Epigallocatechingallat
Epicatechingallat
Die Figuren 2 und 3 zeigen die Chromatogramme der beiden wirksamsten Fraktionen aus der sc Trennung der Ethylacetat/Phase von Rheum patmatum MAXiM. und Rheum rhaponticum L.
Die obere Spur zeigt jeweils die Absorption bei 280 nm, die untere bei 242 nm. Es wurden beide Wellenlängen zur Quantifizierung verwendet, da Epigaliocatechin sowie die beiden Procyanidine deutlich höhere Absorptionsintensitäten bei 242 nm aufwiesen. Bei Rheum palmatum MAXIM, konnten quantitativ bestimmt werden: Catechin Procyanidin B1 Procyanidin B2 Epicatechingallat.
Bei Rheum rhaponticum L. konnten quantitativ bestimmt werden: Catechin Procyanidin B1 Epicatechin Procyanidin B2 Epicatechingallat.
Diese Daten wurden durch gleichzeitige Aufnahme des Totalionenstroms über Massenspektrometrie abgesichert. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte außerdem über den Vergleich der Massenspektren der Standardsubstanzen mit den Massenspektren der bei den Standardretentionszeiten detektierten Peaks. Im Vergleich mit allen anderen Fraktionen wiesen die Fraktionen 4 jeweils isoliert aus Rheum palmatum MAXIM, bzw. Rheum rhaponticum L. sowohl in der Summe die höchsten Gehalte an quantifizierbaren Substanzen auf als auch insbesondere die höchsten Gehalte an Epicatechingallat. Bei den weiteren im Chromatogramm sichtbaren Substanzen handelt es sich um typische in Rheum-Arten vorkommende Verbindungen. Analog wird die Charakterisierung der Substanzen aus der Wasserphase von Rheum species-Arten vorgenommen.
Die Figur 4 zeigt beispielhaft das Chromatogramm der Fraktion W2 aus der sc Trennung der Wasser-Phase von Rheum palmatum MAXIM. Die untere Spur zeigt die Absorption bei 280 nrn, die obere den Totalionenstrom (TIC).
Die kalibrierten monomeren Gerbstoffvorstufen Epigallocatechin, Catechin, Procyanidin B1 , Epicatechin, Procyanidin B2, Epigallocatechingallat, Epicatechingallat wurden in dieser Fraktion, wie erwartet, nicht mehr identifiziert. Die abgebildeten Peaks konnten anhand der massenspektrometrischen Daten qualitativ als die in Rheum beschriebenen Stilbenderivate: 3,5,4'-Trihydroxystilben-4'O-ß-D-Glucopyranosid (=Piceid) Piceatannol-3-O-ß-D-glucopyranosid Rhaponticiπ oder Isorhaponticin (bei gleicher Masse keine genauere Identifizierung möglich)
Desoxyrhaponticin
2-O-cinnamoyl-1 -O-galloyl-ß-D-Glucose
sowie die Anthrachinonderivate:
Aloe-Emodin- oder Emodinmonoglycosid (bei gleicher Masse keine genauere Identifizierung möglich)
Physcion- oder Rheinmonoglycosid (bei gleicher Masse keine genauere Identifizie- rung möglich) identifiziert werden.
Rheum species ist eine Pflanze, die weltweit vorzufinden ist und sich in verschiedenen Arten seiner Umwelt angepasst hat.
Nachfolgend angeführt ist eine Liste mit allen Rhabarberarten für die erfinderische Lösung.
Variante 01 : Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster) Variante 02: Rh. officinale BAILL.; Vacrutot (Ungarn)
Variante 03: Rh. officinale BAILL.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 04: Rh. officinale BAILL.; Medicinal Rhubarb, Wisley (England)
Variante 05: Rh. officinale BAILL.; Dolomiten (Münster)
Variante 09: Rh. palmatum L.; Petersburg (UdSSR) Variante 10: Rh. rhabarbarum L. ; The Sutton
Variante 11 : Rh. palmatum l.f. florc rubra MAXIM. Petersburg (UdSSR)
Variante 12: Rh. rhabarbarum L.; Holsteiner Blut
Variante 13: Rh. rhabarbarum L.; Utrecht (Holland)
Variante 14: Rh. rhabarbarum L.; Uppsala (Schweden) Variante 15: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1986
Variante 16: Rh. rhaponticum L; Kirovsk (UdSSR)
Variante 17: Rh. rhaponticum L.; Dnepropetrovsk (UdSSR)
Variante 18: Rh. rhaponticum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 19: Rh. rhaponticum L.; Uppsala (Schweden) Variante 20: Rh. rhaponticum L. ; Petrograd (UdSSR)
Variante 21 : Rh. rhaponticum L.; Taplozek (Finnland)
Variante 22: Rh. rhabarbarum L.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 23: Rh. rhabarbarum L.; China 1956 Variante 24: Rh. rhabarbarum L.; KVDR 1987
Variante 25: Rh. spec. Landsorte Polen 1976
Variante 26: Rh. alexandra VEITCH.; Kirovsk (UdSSR)
Variante 27: Rh. wittrockii LUNDSTR.; Petrograd (UdSSR) Variante 29: Rh. emod. WOLL.; Petrograd (UdSSR)
Variante 30: Rh. leucorum; Wroclaw (Polen)
Variante 31 : Rh. leucorrhizum PALL.; Bukarest (Rumänien)
Variante 32: Rh. maximowiczii LOSINSK.; Petrograd (UdSSR)
Variante 33: Rh. tataricum I .f. lasi (Rumänien) Variante 34: Rh. undulatum L.; Pruhonice (CSSR)
Variante 35: Rh. altaicum LOSINSK.; Petrograd (UdSSR)
Variante 36: Rh. altaicum LOSINSK.; Moskau (UdSSR)
Variante 37: Rh. alte Landsorte (Deutschland)
Variante 38: Rh. alte Landsorte (Deutschland) Variante 39: Rh. alte Landsorte (Polen)
Variante 40: Bastard Rh. rhab. x Rh. raponticum
Variante 41 : Rh. alexandra VEITCH.; Petrograd (UdSSR)
Variante 42: Rh. officinale BAILL.; Landsorte, Slovakisches Erzgebirge
Der Einsatz der erfindungsgemäßen Wirkstofffraktionen wird an folgenden Ausführungsbeispielen näher erklärt:
Beispiel 1
Hemmung der DNS-Synthese von humanen PHA-stimulierten MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species
Unsere Untersuchungen zeigten, dass die DNS-Synthese PHA-stimulierter humaner peripherer mononukleärer Zellen (MNZ) durch die Administration von polyphenolhal- tigen Fraktionen aus Rheum species verändert wird. Die Leukozyten wurden 72 h in Gegenwart der Rheum-Fraktionen inkubiert und anschließend über die Messung der 3[H]-Thymidin-lnkorporation die DNS-Synthese bestimmt, wie bei Reinhold etal. beschrieben (Reinhold, D. etal.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor ß1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells. Immunolo- gy 1997; 91 : 354-360). Figur 5 zeigt die Beeinflussung der DNS-Synthese. Ausgeprägt ist der Hemmungseffekt von Rheum-Fraktionen auf die Mitogen-indu- zierte DNS-Synthese humaner MNZ. Humane periphere MNZ wurden über drei Tage mit 1 μg/ml Phythohaemagglutinin (PHA, Roche Diagnostcs GmbH) jeweils 100 μg/ml der angegebenen Fraktionen inkubiert. Anschließend wurde dem Kulturmedium 3[H]-Methyl-Thymidin zugesetzt und nach weiteren 6 Stunden die in die DNS eingebaute Menge an 3[H]-Thymidin gemessen. Kontrolle = unstimulierte MNZ ohne PHA. Angegeben ist der Mittelwert aus 6 Messungen ±SD.
Beispiel 2
Modulation der IL-2-mRNA-Expression humaner PHA-stimulierter MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. Die angewandte Methodik ist nachfolgend detailliert beschrieben. Folgende Teilschritte sind dazu notwendig.
Isolierung der MNZ aus Venenblut
Als Ausgangsmaterial wurde peripheres Blut verwendet, welches mit einem sterilen Heparin/RPMI-Gemisch zur Gerinnungshemmung versetzt wurde (200 ml Blut, 100 ml Gemisch). In 50 ml Falcon-Röhrchen wurden 20 ml FicoLite H (Linaris) als Dichtegradientenmedium mit einer Dichte von 1 ,077 g/cm vorgelegt. Dieses wurde dann vorsichtig mit dem Blut/Heparin/RPMI-Gemisch überschichtet. Die Zentrifuga- tion fand ohne Bremse bei 1800 U für 30 min (Megafuge 2.0R; Heraeus Instruments) statt.
Die Zellen der Interphase (Ring) wurden vorsichtig überführt und mit RPM1 1640 Medium gewaschen (Röhrchen auf 50 ml aufgefüllt). Die Zentrifugation erfolgt für 10 min bei 1400 U. Die entstandenen Zellpellets wurden nochmals mit RPM1 1640 (auf 50 ml aufgefüllt) gewaschen und anschließend gezählt. Für die Ermittlung der Zellzahl, welche mit Hilfe der Neubauer Zählkammer erfolgte, wurden 380 μl Trypanblau mit 20 μl Zellsuspension gemischt. Danach wurden alle vier Quadrate ausgezählt. Die Zellzahl ergibt sich aus dem gebildeten Mittelwert multipliziert mit 2500 (Kammer) x 20 (Verdünnung).
Zellkulturen
Die isolierten MNZ wurden in einer Zellkulturflasche (Nunc) mit einer Konzentration von 106 Zellen/5 ml Medium (Dulbecco 's MEM mit Glutamax-I mit Zusatz von 10 mg Refobacin und 10 % FCS, Gibco) eingesetzt. Die Stimulation der MNZ erfolgte mittels 1 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA, Roche Diagnostics). Die Zellen wurden dann für 24 Stunden in einem Inkubator (Steri-Cult200, Labotect) bei 37 °C, 86 % relativer Luftfeuchte und 5 % C02-Gehalt kultiviert. Es wurde jeweils eine Kontrolle mitgeführt, bei der Zellen ohne Zusatz von Mitogen unter ansonsten gleichen Bedingungen kultiviert wurden.
RNA-Isolation
Zur Gewinnung der RNA wurde das RNeasy-Mini-Kit der Firma Qiagen nach Angabe des Herstellers verwendet. Die erhaltene RNA wurde durch DNAse-Behandlung (RQ1 RNase-free DNase; 1 U/μl; Promega; 30 min bei 37 °C) von eventuell enthaltener DNA befreit. Danach wurde die RNA nochmals einer Reinigung mit Hilfe der RNeasy-Säule unterzogen. Die DNA-freie RNA wurde spektrophotometrisch am GeneQuant (Pharmacia) quantifiziert.
Der Quotient aus der OD260 und OD280 war bei allen RNA- Präparationen zwischen 1 ,8 und 2,0. Die RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -700C gelagert.
Reverse Transkription
Für die nachfolgende enzymatische Amplifikation (RT-PCR) wurden 1 μg DNA-freie RNA mit Hilfe von AMV Reverser Transkriptase und random-hexameren Oligonu- kleotiden in Erststrang-cDNA umgeschrieben.
Ein typischer Reaktionsansatz (25 μl) bestand aus folgenden Komponenten:
1 μg RNA
5 μl AMV RT 5x Puffer (Promega)
2,5 μl AMV reverse Transkriptase (10 U/μl , Promega)
0,66 μl RNasin RNase Inhibitor (40 U/μl, Promega) i μl dNTP (1 mM, InViTek)
0,58 μl random-hexamere Oligonukleotide (500 ng/μl, Roche)
Aqua deionisata ad 25 μl
Die Proben wurden in einem Thermocycler (Eigenbau der Universität Hannover) bei 420C inkubiert. Nach einer Reaktionszeit von 45 min wurde die Reaktion durch Hitzedenaturierung (950C, 5 min) gestoppt. Bis zur Durchführung der PCR wurde die Erststrang-cDNA bei -20 °C gelagert. Quantitative RT-PCR
Zur Durchführung der quantitativen RT-PCR wurde der iCycler (Bio-Rad Laboratories) verwendet.
Das Prinzip dieser Methode basiert auf der Anregung eingesetzter Fluorophore durch kurzwelligeres Licht, als Folge wird höherwelligeres Licht emittiert. Die Emission wurde von optischen Detektionseinheiten pro PCR-Zyklus gelesen und die Fluoreszenzintensität ausgewertet. Als fluoreszierendes Molekül (Fluorophore) wurde das interkalierende doppelstrang-spezifische SYBRGreen I (Molecular Probes) eingesetzt. In Abhängigkeit der Quantität amplifizierter DNA steigt die Fluoreszenzintensität an.
Ein typischer 25 μl Reaktionsansatz bestand aus folgenden Komponenten:
12,5 μl HotStarTaqTM MasterMix (Qiagen) 0,4 μl SYBRGreen I (Molecular Probes) 0,25 μl Fluorescein Calibration Dye (Bio-Rad)
2,5 μl Primerpaar 1 μl cDNA Aqua deionisata ad 25 μl
Tabelle 1 : Für die quantitative RT-PCR verwendete Primer
Figure imgf000015_0001
In der Reaktion wurden parallel zur eigentlichen Probe definierte Standards eingesetzt. Der Bezug zu den Standards erlaubt eine verlässliche Aussage über die Anzahl spezifischer mRNA-Moleküle. Als Standard dienten die jeweils in Plasmiden Monierten PCR-Fragmente in seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen. Des Weiteren wurde bei jeder Reaktion die mRNA-Menge des „housekeeping-Gen" α-Tubulin mitbestimmt. Dieses dient als Referenz-RNA-Molekül zur Normalisierung der RNA-Gehalte der individuellen Proben.
Tabelle 2: RT-PCR-Programm
Figure imgf000016_0001
→ Schritt 2-4: 40 Zyklen
Beispiel 3
Modulation der IL-2-mRNA-Expression von humanen MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species. Die Ergebnisse sind in der Figur 7 dargestellt.
Beispiel 4
Modulation der IL-1 -mRNA-Expression humaner PHA-stimulierter MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species. Die resultierenden Ergebnisse sind der Figur 8 zu entnehmen. Beispiel 5
Dosisabhängige Induktion derTGF-1 -mRNA-Expression humaner PHA-stimulierter MNZ durch Inkubation mit definierten polyphenolischen Fraktionen aus Rheum species. Die detaillierte Darstellung der Resultate zeigt die Figur 9.
Beispiel 6
Einfluss von definierten polyphenolhaltigen Rheum-Fraktionen auf die Proliferation der HaCaT-Keratinozyten-Zelllinie.
2x104 Zellen wurden in 200 μl Keratinocyte Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) in 96-well-Zellkulturplatten (Nunc) ohne (Kontrolle) oder mit Zusatz von 100 μg/ml der angegebenen Fraktionen über einen Zeitraum von 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurde dem Kulturmedium 3[H]-Methyl-Thymidin zugesetzt und nach weiteren 6 Stunden die in die DNS eingebaute Menge an 3[H]-Thymidin gemessen, wie bei Reinhold et al. beschrieben (Reinhold D et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptida- se IV induce secretion of transforming growth factor ß1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells. Immunology 1997; 91 : 354-360).
Die grafische Auswertung ist der Figur 10 zu entnehmen.

Claims

Patentansprüche
1. Polyphenolische Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen beziehungsweise Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation aus Rheum-Arten, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol, b) Befreiung der gebildeten wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen unter vollständiger Methanolentfernung nach Zugabe von Wasser, c) Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat, d) säulenchromatografische Auftrennung der vereinigten Ethylacetatphase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen, e) Zusammenfassung der Wirkstofffraktionen aus der Ethylacetatphase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum, f) Abtrennung einzelner Wirkstofffraktionen zur Verwendung nach Durchführung eines Wirksamkeitsnachweises der Wirkstofffraktionen hinsichtlich des Einflusses auf die Modulation der Zytokinproduktion, DNS- Synthese/Proliferation von mononukleären Zellen (MNZ) sowie auf die Hemmung der DNS-Synthese/Proliferation der humanen Keratinozyten- Zelllinie HaCaT.
2. Polyphenolische Wirkstofffraktionen für Formulierungen zur Therapie und Prävention von entzündlichen beziehungsweise Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen mit gestörter Keratinozytenproliferation aus Rheum-Arten, erhält- lieh durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Extraktion der getrockneten und gemahlenen Wurzelproben mit Methanol, b) Befreiung der gebildeten wässrige Phase von lipophilen Begleitstoffen unter vollständiger Methanolentfernung nach Zugabe von Wasser, c) Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat, d) säulenchromatografische Auftrennung der nach dem Ausschütteln mit Ethylacetat erhaltenen wässrigen Phase in eine begrenzte Anzahl von Wirkstofffraktionen , e) Zusammenfassung der Wirkstofffraktionen aus der wässrigen Phase mit gleichem Inhaltsstoffspektrum, f) Abtrennung einzelner Wirkstofffraktionen zur Verwendung nach Durchführung eines Wirksamkeitsnachweises der Wirkstofffraktionen hinsichtlich des Einflusses auf die Modulation der Zytokinproduktion, DNS- Synthese/Proliferation von mononukleären Zellen (MNZ) sowie auf die Hemmung der DNS-Synthese/Proliferation der humanen Keratinozyten- Zθlllinie HaCaT.
3. Wirkstofffraktionen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Befreiung der gebildeten wässrigen Phase von lipophilen Begleitstoffen durch 'Ausfällung der lipophilen Begleitstoffe bei 5 °C unter Stickstoffbegasung erfolgt.
4. Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die wässrige Phase mit Petrolether ausgeschüttelt wird.
5. Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Ausschütteln der gereinigten wässrigen Phase mit Ethylacetat sowohl die vereinigten Ethylacetatphasen als auch die wässrige Phase unter Vakuum eingeengt, in wenig Wasser aufgenommen und anschließend gefriergetrocknet werden.
6. Wirkstofffraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in dem jeweiligen Schritt d) zur säulenchromatografischen Auftrennung als Elutionsmittel Ethanol, Methanol und ein Gemisch aus Aceton und Wasser eingesetzt werden.
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