CN114099542B - 普鲁士蓝及其类似物在制备预防、延缓或治疗与程序性细胞坏死相关疾病药物中的应用 - Google Patents

普鲁士蓝及其类似物在制备预防、延缓或治疗与程序性细胞坏死相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明研究发现普鲁士蓝在预防、延缓或治疗程序性细胞坏死相关疾病方面具有显著的功效。细胞水平试验结果表明，普鲁士蓝能够抑制程序性细胞坏死介导的细胞死亡。动物水平试验结果表明，普鲁士蓝能够显著预防、延缓或治疗程序性细胞坏死相关疾病(皮瓣移植)。普鲁士蓝调节程序性细胞坏死特征信号分子的表达，包括RIP1、RIP3和pMLKL。作为一种程序性细胞坏死抑制剂，在预防、缓解和治疗感染性疾病、急性缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、胃肠道疾病、急性炎症性疾病、恶性肿瘤、骨质疏松、骨坏死以及骨髓相关疾病等程序性细胞坏死相关疾病的进展方面显示出显著的作用。

Description

普鲁士蓝及其类似物在制备预防、延缓或治疗与程序性细胞 坏死相关疾病药物中的应用
技术领域
本申请涉及医药领域，具体涉及疾病治疗领域，进一步涉及对程序性细胞坏死相关疾病治疗的技术领域。
背景技术
当细胞受到巨大损伤时会引发坏死。起初的研究认为，坏死是一种无序的、被动的细胞死亡进程，可不依赖于任何特定的信号通路而发生。然而，近十年的研究中，人们发现了一种同时表现出凋亡和坏死两种行为特征的细胞死亡形式。它像凋亡一样受特定的分子调控，又像坏死一样表现出细胞肿胀破裂的形态学特征，称为程序性细胞坏死(necroptosis，以下简称细胞坏死)。程序性细胞坏死最初是在使用TNFα和caspase抑制剂同时处理L929细胞时发现的。这种细胞死亡依赖于RIP1、RIP3，以及混合型连锁激酶样蛋白(MLKL)。现阶段，人们一般认为程序性细胞坏死是一种依赖于RIPK1和RIPK3激酶活性的细胞死亡方式。死亡信号诱导RIPK3激酶的激活，进而磷酸化细胞坏死的特异性执行蛋白MLKL。磷酸化的MLKL(p-MLKL)发生寡聚化并转位到细胞的膜结构上导致细胞膜和细胞器膜的破坏，以致细胞死亡和胞内物质的外漏。
程序性坏死参与了心肌梗死、中风、动脉硬化、感染性疾病、急性缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、胃肠道疾病、急性炎症性疾病、恶性肿瘤、骨质疏松、骨坏死以及骨髓相关疾病等多种疾病的发生发展，因此深入研究调控程序性坏死的分子机制，对寻找疾病治疗的新靶点具有重要意义。
普鲁士蓝及其类似物(亚铁氰化铁)早期主要用于涂料中。FDA于2003年批准普鲁士蓝及其类似物作为铊和铯的解毒剂，充分显示了普鲁士蓝及其类似物良好的生物安全性，引起了人们极大的研究兴趣，并在生物医学领域取得了许多进展。如普鲁士蓝及其类似物纳米颗粒作为高载药量的药物递送系统。在生物医学成像方面，普鲁士蓝及其类似物纳米颗粒兼具光声成像和磁共振成像，在干细胞示踪和多模态疾病诊断方面也有不少的研究。近年来发现的纳米酶活性，进一步促进了普鲁士蓝及其类似物纳米颗粒在抗炎、抗肿瘤及超声成像等方面的应用。
本课题组致力于普鲁士蓝及其类似物的药物活性研究，发现普鲁士蓝及其类似物具有抑制程序性细胞坏死抑的作用。
发明内容
发明人对普鲁士蓝及其类似物的药理作用进行了详细研究，结果发现普鲁士蓝及其类似物具有抑制程序性细胞死亡的作用，从而完成了本发明。
据此，本发明的目的是，提供通过抑制程序性细胞坏死来有效地预防和/或治疗与程序性细胞坏死相关的疾病的治疗药物。
普鲁士蓝及其类似物(PBzyme)是一种典型的配位框架材料，可用通式AxM1[M2(CN)6]y·zH2O来表示，其中M1、M2是由氰基连接的过渡金属如Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn，A是嵌入PBA框架间隙的阳离子，例如Li+、Na+、K+等碱金属离子。x、y、z分别代表相应原子、基团或分子数目。
第一方面，本发明提供一种预防、缓解和/或治疗与程序性细胞坏死相关的疾病的药物组合物，所述组合物含有有效量的普鲁士蓝及其类似物，其中普鲁士蓝及其类似物具有抑制程序性细胞坏死的作用。进一步，与程序性细胞坏死相关的疾病包括感染性疾病、急性缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、胃肠道疾病、急性炎症性疾病、恶性肿瘤、骨质疏松、骨坏死以及骨髓相关的疾病。其中感染性疾病包括皮瓣的感染或坏死。更进一步，其给予有治疗需求的患者，所述患者可以是人体或是动物体，动物体可以是犬类、猫等宠物或家畜类动物如马、驴、羊、牛、猪等。
进一步，本发明的预防、缓解和/或治疗与程序性细胞坏死相关的疾病的药物组合物，该组合物含有多种活性成分，其中普鲁士蓝及其类似物是第一活性成分，用于抑制程序性细胞坏死的发生。
和，第二活性成分可以是不同于普鲁士蓝及其类似物的抑制程序性细胞坏死发生的药物；或/或是
促进机体机能的活性物质；和/或是改善疾病的症状的药物。
进一步，本发明的预防、缓解和/或治疗与程序性细胞坏死相关的疾病的药物组合物，还含有药学上可接受的载体和/或辅料，所述载体或辅料可以为分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、抗结块剂、润滑剂、崩解剂、吸附剂等。特别地，可用于制剂的试剂或介质(液体和/或注射剂和/或固体)为：甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、环糊精、聚山梨酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油或动物油等。优选使用植物油。本发明药物组合物可制成以下形式：悬浮液或即用注射溶液或临时注射溶液、凝胶剂、油剂、片剂、栓剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、聚合物、纳米颗粒、微球、直肠用胶囊、灌肠剂、糊剂、软膏剂、硬膏剂、饮剂、埋植剂、喷雾剂、气雾剂等，可选地通过剂型或装置进行控释和/或缓释。施用可通过本领域技术人员已知的任何方法，优选口服施用或胃肠外施用，例如通过腹膜内注射、脑内注射、鞘内注射、静脉内注射、动脉内注射或肌内注射。口服施用或静脉内施用是优选的。对于长期治疗，优选施用途径为舌下、口服或经皮。对于注射，化合物通常包装为液体溶液或悬浮液，例如可使用注射器或输液器注射。
第二方面，本发明提供一种普鲁士蓝及其类似物的用途，用于通过抑制程序性细胞坏死来有效地预防、缓解和/或治疗与程序性细胞坏死相关的疾病，所述疾病包括感染性疾病、急性缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、胃肠道疾病、急性炎症性疾病、恶性肿瘤、骨质疏松、骨坏死以及骨髓相关的疾病，其中感染性疾病包括皮瓣的感染或坏死。
第三方面，本发明提供另一种普鲁士蓝及其类似物的用途，用于提高组织细胞对缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤的耐受性。在该用途中，普鲁士蓝及其类似物作为药物用于提高组织细胞对I/R损伤的耐受性，其中普鲁士蓝及其类似物以剂量依赖性的方式显著下调组织细胞中Rip1、Rip3和pMLKL的表达水平，从而提高细胞对I/R损伤的耐受。
第四方面，本发明进一步提供普鲁士蓝及其类似物的用途，用于提供对缺氧导致的疾病的预防、缓解和治疗，所述缺氧性疾病包括脑缺氧、心肌缺氧、组织器官的缺氧等疾病，其中普鲁士蓝及其类似物显著降低组织细胞内的ROS水平，尤其是缺氧损伤细胞的ROS水平。
第五方面，本发明进一步提供普鲁士蓝及其类似物的用途，用于提供对血管损伤性疾病的预防、缓解和治疗，所述血管损伤性疾病包括糖尿病足、视网膜血管病变等，其中普鲁士蓝及其类似物能够显著增加VEGFA的表达，促进愈合过程中的血管生成。
第六方面，本发明提供一种抑制细胞内ROS水平的试剂，所述试剂含有一定量的普鲁士蓝及其类似物，所述试剂作为试验制剂用于构建抑制细胞内ROS水平的细胞模型。
附图说明
图1：在H/R(6/1h)条件下，PBzyme预处理的HUVECs细胞中RIP1、RIP3和pMLKL蛋白表达的Western blot图像。
图2：(A)PBzyme(μg/mL)对HUVECs的细胞毒性作用。(B)HUVEC和RAW264.7细胞中针对FITC修饰的PBzyme(μg/mL)的细胞摄取的流式细胞仪图谱和荧光显微图。比例尺：10μm。(C)PBzyme(μg/mL)对H2O2(500μm)处理的HUVEC的保护作用。(D)荧光显微镜检测过氧化氢(1mM)刺激的HUVECs模型中PBzyme降低ROS水平。比例尺：50μm。(E-J)LPS刺激(500纳克/毫升)RAW264.7细胞，用或不用PBzyme(μg/mL)处理24小时：(E–g)TNF的ELISA评估-a,IL-1β和IL-6水平；(H)p65、p-p65和PPAR-γ蛋白表达的westernblot图像；(I，J)NF-κB和PPAR-γ基因的mRNA表达。(n＝3；*：P<0.05；***：P<0.001；***：P<0.0001；ns：无显著性差异)。
图3：普鲁士蓝及其类似物(PBzyme)对缺氧复氧损伤HUVECs模型的保护作用(缺氧/复氧时间：A-G，3/1小时；H-N，6/1小时)。(A)流式细胞分析显示在H/R(3/1H)处理下，PBzyme(μg/mL)对HUVEC的保护作用。(B)根据流式细胞术分析，每组中凋亡细胞的速率。(C)在H/R(3/1H)条件下，在PBzyme预处理的HUVEC细胞中切割的caspase-3、Bax、Bcl-2和VEGFA蛋白表达的蛋白质印迹图像。(D-G)切割的caspase-3、Bax、Bcl-2和VEGFA蛋白的相对表达的Western印迹分析。(H)通过流式细胞术检测降低H/R(6/1H)损伤的HUVEC模型中ROS水平的PBzyme。(I，J)在用PBzyme(μg/mL)H/R(6/1H)处理下HUVEC细胞的钙黄绿素-AM/PI荧光染色结果：每组中的死细胞率和荧光显微镜图像。比例尺：50μm。(K)在H/R(6/1H)条件下，在PBzyme预处理的HUVEC细胞中rip1、rip3和p MLKL蛋白表达的蛋白质印迹图像。(L-N)rip1、rip3和p MLKL蛋白相对表达的Western印迹分析。(n＝3；P＜0.05；***：P＜0.001；****：P＜0.0001；ns：无显著差异)
图4：PBzyme提高了I/R损伤皮瓣的存活率。(A)通过监测体内血管微循环系统对中远翼连接处微循环检测成像，对手术后第7天每组I/R损伤皮瓣进行激光散斑对比成像，拍摄实时血流图像并代表。(B)CD31阳性内皮细胞代表新的微血管(用红色开始标记)。(C)CD68阳性巨噬细胞/单核细胞表明炎症反应(用橙色开始标记)。比例尺：50μm。(D)皮瓣存活率，(E)每组中的平均微血管密度和(F)每组中的平均巨噬细胞密度。(n＝3；**：p＜0.05；***：p＜0.001；ns：无显著差异)(G-K)代表性的在中间和远端皮瓣接合处的皮肤组织中TUNEL、RIPl、RIP3和p MLKL的免疫组织化学染色显微照片。褐色染色表明阳性表达。比例尺：50μm。
具体实施方式
普鲁士蓝(PBzyme)的制备：
在磁力搅拌下，将铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮溶解在浓度为1M的盐酸溶液中，得到澄清的黄色溶液。然后将黄色溶液置于80℃的烘箱中20小时以获得蓝色溶液，将蓝色溶液离心并用水洗涤以获得PBzyme。
用于本实验的细胞模型
HUVEC和RAW264.7购自中国科学院(上海，中国)上海生命科学研究所，用于本实验的细胞模型：
雄性Balb/c小鼠购自上海第六人医院动物中心。动物在特定的无病原体条件下饲养并随意喂养。
实施例1：验证普鲁士蓝及其类似物的作用的实验方法
细胞培养方法：
HUVEC和RAW264.7购自中国科学院(上海，中国)的上海生物科学研究所。将细胞在37℃、5％CO2下温育，并在补充了1％青霉素-链霉素(Gibco，USA)和10％胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM(Gibco，USA)中培养。
细胞毒性和增殖分析试验方法
通过CCK8分析(Dojindo Molecular Technologies公司)测定HUVEC和RAW264.7的细胞毒性和增殖。对于细胞毒性试验，细胞以1×104细胞/孔的密度在96孔板中培养。附着后，向平板中加入PBzyme(普鲁士蓝及其类似物)(10-640μg/mL)，培养细胞24小时。对于增殖试验，培养细胞的密度为1000个细胞/孔。附着后，用含有PBzyme(10-640μg/mL)的培养基替换培养基。细胞培养1-4天，每天更换含有PBzyme的培养基。在测定之前，除去培养基，用PBS洗涤平板三次，然后将新鲜培养基加入平板中。对于细胞毒性和增殖试验，将10μl CCK8加入每个孔中并温育2小时。通过多模式读取器在450nm测量并记录溶液的吸光度。)
普鲁士蓝及其类似物的的细胞摄取行为
将HUVEC和RAW264.7种植在12孔板中，并使其粘附24小时。然后，加入FITC修饰的PBzyme(40μg/mL)，与细胞一起培养2-24小时。之后，收集细胞并在21℃下以1000rpm离心10分钟。将细胞重悬于300μl PBS中。流式细胞术用于检测荧光强度(525nm，AgilentNovoCyte，USA)。使用荧光显微术获得图像。(见图1)
普鲁士蓝及其类似物的抗炎活性
将RAW 264.7细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板中。细胞贴壁后，将培养基更换为含有PBzyme(0-40μg/mL)的培养基，然后将LPS(500ng/mL)添加到平板中。24h后，收集细胞培养上清液。根据制造商的说明(Beyotime Institute of Biotechnology，China)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量包括IL-6，IL-1β和TNF-a在内的促炎细胞因子的水平普鲁士蓝及其类似物保护细胞免受氧化损伤
HUVEC用于检测PBzyme对H2O2诱导的氧化损伤的保护作用。细胞在96孔板中以每孔2×104个细胞的密度培养。细胞附着后，在平板中加入PBzyme(0-40μg/mL)，培养细胞2小时。然后加入H2O2(1mM)，并将细胞培养4小时。使用CCK8分析，操作步骤与上述相同。
细胞低氧-复氧模型
为了体外模拟皮瓣缺血-再灌注损伤，设计了HUVEC低氧-复氧模型。细胞在6孔板中用不同浓度的PBzyme(0-40μg/mL)培养，并使其生长至80％的密度。在加湿的缺氧培养箱中(PH-1-A，Puhebio，Wuxi，中国)，在非葡萄糖、非FBS、低氧(1％氧)条件下培养不同缺氧/复氧组中的细胞。饥饿处理的持续时间分别为3和6小时。然后，将细胞再次暴露于具有正常培养基的正常氧条件(95％空气和5％二氧化碳)1小时，随后收集细胞用于进一步分析。将在正常氧条件下用正常培养基培养的细胞用作对照。
膜联蛋白V/PI测定
根据产品说明，使用FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences，SanJose，CA，USA)检查细胞凋亡。使用流式细胞术(Beckman，USA)测量荧光强度，并通过Cytexpert(Beckman，USA)分析结果。
细胞死亡率测定
HUVEC缺氧6小时再充氧1小时模型被使用。使用钙黄绿素AM和PI根据产品说明书的方法来证实可见的细胞活力。在Olympus BX-51光学系统上收集荧光图像。
普鲁士蓝及其类似物的细胞内ROS清除能力
用PBzyme(0-40μg/mL)处理的HUVEC低氧-复氧(6/1h)模型用于提高PBzyme的细胞内ROS清除能力。ROS水平用2’，7’-二氯f1荧光素-二乙酸酯(DCFHDA，中国江苏生物技术研究所Beyotime Institute)测定，f1荧光信号通过流式细胞术(Beckman，USA)测定。
蛋白质印迹分析
用PBS洗涤经过不同处理的HUVEC和RAW264.7细胞，并用混有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上匀浆30分钟，并通过超声破碎。离心分离细胞提取物，收集上清液。使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中国)定量总上清液蛋白。通过凝胶电泳分离总蛋白，然后转移到PVDF膜上。在用含有0.1％Tween-20(TBST)的TBS稀释的5％脱脂乳中封闭膜1小时，然后与一抗在4℃下孵育过夜。用TBST洗膜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体在室温下温育1小时。通过ECL在黑暗中显影复杂的免疫图像，并使用荧光成像分析系统检测。通过Image J软件进行蛋白质表达的定量。
缺血再灌注皮瓣模型
通过腹膜内施用2％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物。手术区域用碘伏消毒，并用无菌纱布覆盖。在大鼠的左胸侧标出1.5×3cm大小的轴向图案皮瓣并抬高，其中胸外侧动脉和静脉充当椎弓根。微血管夹完全阻断血流，夹住血管蒂6小时。移除夹具，并用6-0针将瓣缝合回到其原始位置。已经建立了I/R损伤模型。7天后，麻醉大鼠。通过体内血管微循环监测系统(Micro-VCC，Optoprobe Science LTD，Britain)对中远翼连接处的微循环检测成像。flap的代表性血液flow用激光散斑技术(SIMBFI-HRPRO，Simpoto，Wuhan，中国)检测。
将大鼠随机分为4组，如表1所示：
表1
Figure GDA0004202466870000081
苏木精和曙红染色
在手术后第7天，处死小鼠，并收集中部的三个组织样品(0.5×0.5cm)。用4％甲醛固定瓣片组织以进行石蜡包埋和切片，随后用H&E染色进行染色。在光学显微镜下评价组织的组织学特征；每个切片捕获5个视场。
CD31和CD68的免疫组织化学
对5μM厚的石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学分析。将切片脱蜡并用3％过氧化氢淬灭内源过氧化物酶活性10分钟，然后用来自第二抗体饲养的动物物种的相应血清封闭1小时。将切片与第一抗体(小鼠抗-CD31抗体，1∶100；Abcam，USA；小鼠抗-CD68抗体，1∶100；Abcam，USA)在4℃温育过夜，然后加入在PBS中1∶200稀释的抗-大鼠第二抗体，并在室温下温育30分钟。用PBS洗涤几次后，通过与DAB在PBS中孵育5～10分钟，然后苏木精复染，显示组织上的信号。在显微镜下观察切片。在100X放大率下评价微血管密度。从血管化最多的区域选择三个区域，并以200×放大倍数计数微血管。三个区域的平均计数被认为是微血管密度。
实施例2：实验结果
1、普鲁士蓝及其类似物对与程序性细胞坏死相关的蛋白质表达水平的影响
与程序性细胞坏死相关的蛋白质表达水平被量化，与未治疗组相比，PBzyme可以剂量依赖性的方式显著下调Rip 1、Rip 3和p MLKL的表达水平(图3K-3N)。
2、普鲁士蓝及其类似物对细胞内ROS水平的影响
程序性细胞坏死是由TNF家族细胞因子与膜靶向死亡受体结合并随后激活细胞内RIP家族激酶引起的。作为泛素修饰的支架蛋白，RIPl激活NK-κB和MAPK信号通路，促进炎症和细胞存活。一旦RIPl与RIP3结合，它们就会形成坏死小体。磷酸化的RIP3招募MLKL使其磷酸化。MLKL的激活标志着坏死小体的激活。p MLKL被寡聚并转移到细胞膜以改变膜通透性，从而促进细胞死亡的发生。实验结果表明，在H/R(6/1h)处理下，PBzyme能有效降低细胞内ROS水平，保护细胞免于程序性细胞坏死(见图2)。
3、普鲁士蓝及其类似物对细胞遭受I/R损伤的保护作用
为了探寻PBzyme是否能提高细胞对I/R损伤的耐受性，我们建立了缺氧-复氧(H/R)损伤的HUVECs模型，这是在细胞水平研究I/R损伤的理想模型。首先，进行3小时的缺氧处理，然后将细胞暴露于正常氧气条件下1小时以进行进一步分析。流式细胞术检测H/R(3/1h)下细胞凋亡水平。PBzyme以剂量依赖的方式在细胞中发挥保护作用：与未治疗组相比，PBzyme治疗组的早期凋亡明显受到抑制(73.52±2.4％)。PBzyme 5组的早期凋亡率为60.5±2.19％，而PBzyme 40组的早期凋亡率显著降低至26.7±1.07％(图3A，3B)。由于Bax/Bcl-2/caspase-3通路在细胞凋亡过程中的重要性，我们检测了相关蛋白的表达。与未治疗组相比，PBzyme可显著下调切割的caspase-3和Bax表达水平。同时，Bcl-2表达上调(图3C-F)。此外，在PBzyme处理组中，VEGFA表达以剂量依赖的方式显著增加(图3C、3G)。多种凋亡相关基因参与了I/R损伤过程中细胞凋亡的发生。caspase基因家族被激活后，通过caspase级联反应引起蛋白质分解并驱动细胞凋亡。Bcl-2是I/R损伤中最关键的抗凋亡基因，能抑制Bax诱导的细胞色素C释放，防止细胞凋亡。Bcl-2/Bax表达的比率决定了细胞对凋亡的敏感性。我们的研究结果表明，PBzyme通过参与Bax/Bcl-2/caspase-3通路，对H/R(3/1h)损伤的HUVECs具有保护作用。此外，在降低细胞凋亡率方面，PBzyme增加了VEGFA的表达水平，这对愈合过程中的血管生成至关重要。
为了进一步阐明PBzyme对H/R损伤细胞的保护作用，将缺氧处理时间延长至6小时。如图3H所示，在H/R(6/1H)处理下，活性氧水平显著增加，但随着PBzyme的加入，活性氧水平逐渐降低。同样，ROS阳性细胞随着PBzyme添加量的增加而减少：从95.98±2.06％降至58，16±2.17％。通过存活/死亡试验检测细胞存活水平。显然，与未治疗组相比，PBzyme有助于显著降低死亡细胞率(66.9±3.78％)：从PBzyme 5组的52.18±1.84％降至PBzyme 40组的22.22±0.77％(图3I，3J)。
4、PBzyme保护皮瓣免受I/R损伤
在观察到PBzyme能有效清除ROS并保护细胞免受H/R损伤后，我们继续研究其对I/R损伤皮瓣的保护作用。根据文献，提升小鼠左胸侧的轴向皮瓣模型。在I/R(6/1h)损伤治疗后第7天，检测并成像皮瓣中远侧交界处的微循环。
如图4A所示，PBzyme预处理皮瓣的微循环与对照组相似。然而，在I/R和I/R+盐水组中未观察到明显的微循环。使用激光散斑技术测量皮瓣的存活率(图4B)。PBzyme预处理皮瓣成活率为79.61±7.5％，与对照组(99.47±0.5％)无显著性差异。然而，I/R和I/R+盐水组的皮瓣存活率明显较低(图4E)。如HE染色结果所示，在I/R和I/R+生理盐水组中可以发现显著的坏死区域，而在对照组和I/R+PBzyme组中很少发现。考虑到I/R+PBzyme组皮瓣存活率的良好表现，采用CD31(内皮标志物)进一步评估PBzyme对I/R损伤皮瓣的新生血管作用。I/R和I/R+盐水组的平均微血管密度分别为1.33±0.58阳性染色/斑点和1.34±0.57阳性染色/斑点(图4C，4F)。相反，I/R+PBzyme组可见大量微血管(5±2阳性染色/点)。这与PBzyme增加H/R处理细胞中VEGFA表达的结果一致。由于PBzyme能够清除H/R损伤细胞中的ROS并减少炎症因子的释放，因此认为它可以减少I/R损伤皮瓣中的炎症反应。CD68免疫荧光染色用于标记巨噬细胞，以反映组织中的炎症水平。正如预期的那样，与I/R和I/R+盐水组相比，I/R+PBzyme组的巨噬细胞密度显著降低(图4D)。此外，对中远侧皮瓣交界处的皮肤组织进行TUNEL、RIPl、RIP3和p MLKL免疫组化染色所示，PBzyme组的TUNEL、RIPl、RIP3和pMLKL阳性水平低于I/R组和I/R+生理盐水组，这与细胞实验中的WB结果一致(见图4)。以上结果提示，PBzyme可通过促进血管生成和减轻炎症反应，有效降低I/R损伤皮瓣的坏死率。

Claims (4)

1.普鲁士蓝在制备治疗I / R 损伤的皮瓣的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，所述用途给予有治疗需求的患者，所述患者可以是人体或是动物体，动物体可以是宠物或家畜。
3.如权利要求 2所述的用途，所述药物还含有药学上可接受的载体和/或辅料。
4.如权利要求3所述的用途，所述药物可制备为口服施用或胃肠外施用的制剂。
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