CN111632067B

CN111632067B - 普鲁士蓝在制备治疗骨关节炎的药物中的应用

Info

Publication number: CN111632067B
Application number: CN202010683929.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡晓军; 郑元义; 胡兵; 程婕; 高维; 赵永政; 郝俊年; 陈捷
Original assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN111632067A

Abstract

本发明提供了普鲁士蓝在制备治疗骨关节炎的药物中的应用以及普鲁士蓝纳米粒的制备方法。实验表明，普鲁士蓝能够减轻IL‑1β诱导的人软骨细胞炎症反应、抑制人软骨细胞ECM降解和细胞凋亡、通过下调Rac1来抑制IL‑1诱导的NF‑κB信号激活、并在体内延缓OA的进展，达到治疗骨关节炎的目的。

Description

普鲁士蓝在制备治疗骨关节炎的药物中的应用

技术领域

本申请涉及普鲁士蓝的应用，具体而言，涉及普鲁士蓝在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。OA是老年人致残的主要原因和社会成本的来源。随着人口的老龄化和肥胖，这种综合征变得比过去几十年更为普遍。在临床上，OA的早期治疗主要以基础治疗和药物治疗为主，如应用非甾体抗炎药、关节内注射透明质酸和皮质类固醇等。虽然它们能有效缓解疼痛和一些症状，但不能延缓疾病的进展。还有一些副作用，如对消化系统的潜在损害和心血管系统的风险，必须加以考虑。人工关节置换是治疗晚期OA的有效方法。但由于人工关节材料磨损、价格昂贵及手术侵入等并发症，目前主要适用于晚期OA症状严重的患者。对于早期和中期OA患者，仍然缺乏有效的方法来干预疾病进展。

因此，研究OA的发病机制和治疗方法具有重要的现实意义和价值。目前仍迫切需要副作用小的替代药物。

普鲁士蓝是美国食品和药物管理局批准用于放射性Cs+或非放射性Tl+中毒的解毒剂，具有良好的生物相容性和生物安全性。具有内在特性的普鲁士蓝已被证明可应用于癌症理论、生物传感器等。然而，很少有研究探讨普鲁士蓝在包括OA在内的关节炎中的作用。

我们先前的研究表明，普鲁士蓝对炎症性肠病和缺血性中风有保护作用，通过静脉注射或脑内注射没有明显的副作用。随着OA的发展，大量软骨细胞死亡，软骨细胞凋亡是导致软骨细胞减少的主要原因。本发明分别以人软骨细胞和创伤性OA大鼠为模型，观察了普鲁士蓝纳米粒对OA模型的治疗作用，并观察其对OA的治疗作用。普鲁士蓝纳米粒保护人软骨细胞，减轻炎症反应，防止软骨细胞ECM降解，显示体内治疗效果。因此普鲁士蓝可作为治疗骨关节炎的替代治疗药物。

同时，经过检索，目前现有技术中也没有记载采用普鲁士蓝治疗骨关节炎的报道。虽然“普鲁士蓝纳米颗粒的制备及用于类风湿性关节炎抗CCP抗体检测的研究，蔡天博，《东南大学学位论文》”公开了两方面内容：一是普鲁士蓝纳米粒的制备，二是其在类风湿性关节炎抗CCP抗体检测的研究，但是这和直接用普鲁士蓝进行治疗和预防存在较大差别。

发明内容

本发明通过大量实验研究表明，普鲁士蓝能够减轻IL-1β诱导的人软骨细胞炎症反应、抑制人软骨细胞ECM降解和细胞凋亡、通过下调Rac1来抑制IL-1诱导的NF-κB信号激活、并在体内延缓OA的进展，达到治疗骨关节炎的目的。

因此，本发明提供了普鲁士蓝在制备预防和治疗骨关节炎的药物中的应用。

所述普鲁士蓝的结构如下：Fe₄[Fe(CN)₆]₃·nH₂O；n＝0-25。

本发明还提供了普鲁士蓝类似物在制备预防和治疗骨关节炎的药物中的应用。

所述普鲁士蓝类似物的结构如下：

A_xB_y[M(CN₆]_a·n(H₂O)。

其中，A选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

B选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

M选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

x＝0-4；y＝0-4；n＝0-25；a＝0.8-4；x和y不同时为0。

本发明还提供了普鲁士蓝纳米粒在制备预防和治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还提供了普鲁士蓝类似物纳米粒在制备预防和治疗骨关节炎的药物中的应用。

普鲁士蓝或其类似物纳米粒的尺寸为2-400nm，空腔直径为1-90nm。

所述普鲁士蓝或其类似物纳米粒的比表面积为50-1200m²g^-1，孔容为0.2-1.5cm³g^-1。

本发明所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法包括如下步骤：

(1)将铁源和具有还原和稳定作用的有机物加入到酸性溶液S1中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲或者其他可调节压力和温度的容器中，在温度60-200℃范围，压力为0.1MPa-20MPa，反应4-72小时；

(3)取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得尺寸为2-400nm的普鲁士蓝纳米粒。

本发明所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法还可以是如下步骤：

(1)将铁源和具有还原和稳定作用的有机物加入到酸性溶液S1中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

(2)将混合液转至温度为T1℃的烘箱中，陈化H1小时取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于酸性溶液S2中待用；

(3)将上述溶液转移至水热釜，置于温度为T2℃的电炉中，陈化适当时间H2小时，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-20nm范围内的尺寸为20-200nm普鲁士蓝纳米粒。

该方法所制备的普鲁士蓝纳米粒的比表面积为200-1000m²g^-1，孔容为0.5-1.5cm³g^-1。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述铁源选自铁氰化钾、铁氰化钠、铁氰化铵、亚铁氰化钠、铁氰化钠、亚铁氰化铵中的至少一种。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述铁源的浓度为0.005M-3M，优选0.05M-3M。

所述具有还原和稳定作用的有机物为聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸，表没食子儿茶素没食子酸酯，壳聚糖及其衍生物或淀粉样蛋白中的一种或几种。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述有机物的浓度为0.1M-8M。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述酸性溶液选自柠檬酸、盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、碘酸、氯酸、溴酸、高铁酸、高氯酸、高溴酸、高碘酸、亚硝酸等；所述酸性溶液S1的浓度为0.00001M-8M，优选0.05M-6M；所述酸性溶液S2的浓度为0.05M-6M。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述时间H1为0.5-8小时；所述时间H2为4-72小时。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述温度T1为60-150℃。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述温度T2为25-200℃。

进一步的，普鲁士蓝或其类似物纳米粒还可以作为载体，用于包载具有治疗或预防骨关节炎作用的药物。

附图说明

图1：PBzyme可减轻IL-1β诱导的人软骨细胞炎症反应。(A)通过ELISA确定PBzyme对软骨细胞的细胞培养上清液中IL-6的影响。数据表示为平均值±标准偏差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(B)通过PCR确定PBzyme对软骨细胞中IL-6mRNA的影响。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(C)通过PCR确定PBzyme对软骨细胞中COX-2mRNA水平的影响。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(D)通过PCR确定PBzyme对软骨细胞中iNOS mRNA的影响。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(E)通过IL-1β诱导后的蛋白质印迹分析确定PBzyme对COX-2和iNOS蛋白表达的影响。将蛋白质表达水平相对于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)标准化。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(F)通过IF分析确定PBzyme对软骨细胞中COX-2的影响。bar＝100μm。

图2：PBzyme抑制软骨细胞中的ECM降解和细胞凋亡。(A)通过定量逆转录聚合酶链反应确定MMP3的mRNA表达。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(B)通过定量逆转录聚合酶链反应确定MMP13的mRNA表达。n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(C)通过定量逆转录聚合酶链反应确定COL2的mRNA表达。n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(D)通过定量逆转录聚合酶链反应确定Aggrean的mRNA表达。n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(E)通过IL-1β诱导后的蛋白质印迹分析确定PBzyme对MMP3和MMP9蛋白表达的影响。将蛋白质表达水平相对于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)标准化。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(F)免疫荧光染色显示在IL-1β处理后，PBzyme对MMP9的影响。bar＝100μm。(G)通过IL-1β处理后的番红O染色，确定PBzyme对软骨细胞蛋白聚糖的影响。(H)在IL-1β处理后确定PBzyme对软骨细胞中GAG的影响。n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(I-J)在H2O2处理后确定PBzyme对软骨细胞凋亡的影响。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。(K)在IL-1β诱导后，通过蛋白质印迹分析确定PBzyme对Caspase 3和Caspase 9蛋白表达的影响。将蛋白质表达水平相对于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)标准化。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.空白组(无PBzyme和IL-1β的软骨细胞)；^#，P<0.05vs.IL-1β组(仅具有IL-1β刺激的软骨细胞)。

图3：PBzyme可延缓体内骨关节炎的进展。(A)骨关节炎的组织学分析。HE，苏木精和曙红染色；FG，番红O和快速绿色染色，放大倍数×40。(B)Mankin的骨关节炎组织病理学评估分数。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.sham组(假手术组)，(无PBzyme和半月板切除术的大鼠膝关节)；^#，P<0.05vs.OA组(仅有半月板切除术的大鼠膝关节)。(C)OARSI评分以评估组织病理学中的软骨变性。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.假手术组(无PBzyme和半月板切除术的大鼠膝关节)；^#，P<0.05vs.OA组(仅有半月板切除术的大鼠膝关节)。(D-G)通过IF测定，PBzyme对体内COX-2和iNOS蛋白水平的影响。n＝3。*，P<0.05vs.假手术组(无PBzyme和半月板切除术的大鼠膝关节)；^#，P<0.05vs.OA组(仅有半月板切除术的大鼠膝关节)。bar＝100μm。(H)通过体内Western印迹分析确定PBzyme对BAX，iNOS，Caspase 3，MMP13，COL2，Rac1，p-p65和t-p65蛋白表达的影响。将蛋白质表达水平相对于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)标准化。数据表示为平均值±标准差(SD)，n＝3。*，P<0.05vs.假手术组(无PBzyme和半月板切除术的大鼠膝关节)；^#，P<0.05vs.OA组(仅有半月板切除术的大鼠膝关节)。bar＝100μm。

图4：使用Cell Counting Kit-8检测PBzyme对软骨细胞增殖的影响。数据表示为平均值±标准偏差(SD)，n＝3。*,P<0.05vs.没有使用PBzyme的软骨细胞。

具体实施方式

实施例1

(1)2400mg的铁氰化钾和5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到60mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲中，在温度200℃，压力为10MPa，反应72小时；

实施例2

(1)300mg的铁氰化钾和3g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到50mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲中，在温度100℃，压力为20MPa，反应48小时；

实施例3

步骤A)将3960mg的铁氰化钾和35g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到100mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

步骤B)将混合液转至80℃的烘箱中，陈化20h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于50mL浓度为1.5M的盐酸中待用；

步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，120℃陈化4h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-20nm范围内的尺寸为30-200nm介孔普鲁士蓝纳米粒。

实施例4

步骤A)将2560mg的铁青化钾和30g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到80mL浓度为的2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

步骤B)将混合液转至80℃的烘箱中，陈化15h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于20mL浓度为10M的盐酸中待用；

步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，60℃陈化8h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-5nm范围内的尺寸为30-200nm介孔普鲁士蓝纳米粒。

实施例5

PBzyme的特性。

扫描电镜和透射电镜(TEM)显示实施例2制备的PBzyme具有明显的中空结构和约65nm的大小。HRTEM图像、选区电子衍射图和X射线功率衍射图中的晶格条纹显示了良好的结晶度和PB衬底。各元素在PBzyme结构中分布均匀。PBzyme的UV-vis-NIR光谱显示了721nm处的特征吸收峰。波长2090nm^-1表示PBzyme结构中的化学基团Fe-CN-Fe。PBzyme的平均水动力学直径约为78nm。PBzyme的zeta电位约为-28.5mv。PBzyme的平均水动力学直径和zeta电位在7天以上保持不变。

实施例6

PBzyme可减轻IL-1β诱导的人软骨细胞炎症反应。

OA主要破坏软骨细胞、细胞外基质和合成的平衡，在生物和机械因素的共同作用下降解软骨下骨，导致关节软骨变性和纤维化、软骨下骨硬化、周围骨质增生、关节间隙狭窄和滑膜炎。OA最重要的环节是关节软骨的退变。许多研究证实，IL-1β可以阻断ECM成分中软骨细胞的合成，干扰关键结构蛋白的合成，如Ⅱ型胶原(COL2)和aggrecan。当IL-1β刺激软骨细胞时，它们会迅速老化或逐渐凋亡。可以观察到，IL-1β对软骨具有多种作用，包括抑制修复的可能性、通过酶促软骨退变和直接对软骨细胞产生副作用。因此，IL-1β作为一种诱导软骨细胞炎症的体外模型已被广泛应用。为了便于临床应用，我们选择IL-1β诱导的人软骨细胞炎症来研究PBzyme对OA炎症的抑制作用。采用CCK-8法检测不同浓度PBzyme对人软骨细胞活性的影响。不同浓度(0-3600μg/mL)的PBzyme作用24小时(图4)无显著差异。在随后的实验中，0.36μg/mL和36μg/mL的PBzyme被定义为低剂量组和高剂量组。OA已被证明是一种炎症性疾病。在OA微环境中，包括趋化因子、脂肪因子和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-17和IL-2、COX-2、iNOS)在内的炎症介质增加。IL-1β可诱导软骨细胞分泌IL-6、iNOS、COX-2等刺激性细胞因子，这些炎症因子可导致OA的加重。因此，我们用PCR方法检测软骨细胞上清液中IL-6、COX-2和iNOS的变化，以评价PBzyme是否具有抗炎作用。用不同剂量的PBzyme刺激人软骨细胞2小时，然后用IL-1β(10ng/mL)刺激软骨细胞24小时，检测相关mRNA和蛋白炎症反应。在关节细胞中，IL-1β可通过自分泌途径促进IL-6等细胞因子的合成。IL-6被认为是引起软骨下骨层改变的关键细胞因子。其作用主要是促进破骨细胞的形成，促进骨吸收，并与IL-1β和TNF-a协同作用。IL-1β刺激软骨细胞上清液中IL-6的分泌量显著增加。当人软骨细胞在IL-1β刺激前暴露于PBzyme(0.36μg/mL和36μg/mL)时，软骨细胞上清液中的IL-6分泌水平分别降低到4倍和6倍(图1A)。COX-2是一种炎性细胞因子，在蛋白多糖合成、基质降解和软骨细胞存活中起重要作用。iNOS催化软骨细胞合成NO，NO水平升高是促炎介质，通过上调MMPs活性，阻止aggrecan和COL2的生物合成，导致软骨细胞损伤。PBzyme预处理显著下调IL-1β诱导的COX2和iNOS的mRNA表达(图1B-D)。此外，iNOS和COX-2的蛋白表达与Western blot分析中的mRNA表达一致(图1E)。用免疫荧光法检测PBzyme对软骨细胞COX-2的影响。免疫荧光分析也显示类似的结果，即PBzyme抑制COX-2的蛋白表达(图1F)。这些结果表明PBzyme能有效减轻IL-1β诱导的人软骨细胞的炎症反应(图1)。

实施例7

PBzyme抑制人软骨细胞ECM降解和细胞凋亡。

关节软骨由较少的软骨细胞和较多的软骨细胞外基质组成。软骨细胞约占关节软骨的10％。软骨细胞的主要功能是分泌胶原、聚集蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分。而90％的软骨细胞外基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白多糖组成，其主要功能是保护和维持骨拉伸的完整性，保持软骨的张力，使软骨具有压缩性。软骨细胞凋亡和细胞外基质降解是OA最重要的病理改变。基质金属蛋白酶(MMPs)是一种中性蛋白酶超家族，其活性依赖于锌离子。MMP-3、MMP-9和MMP-13在关节软骨破坏中起重要作用。主要由软骨细胞、滑膜细胞、炎性细胞和巨噬细胞分泌。MMP-3、MMP-9和MMP-13都参与了软骨基质的破坏，导致胶原暴露于破坏胶原的酶中，激活酶的活性，导致胶原网络结构的破坏，最终分解。COL2和aggrecan是软骨基质的主要成分。它们的表达可作为软骨退变程度的指标。其活性的降低会导致ECM再生障碍，最终导致软骨的降解。

因此，我们研究了不同组的软骨细胞外基质和基质金属蛋白酶。MMP-3可降解软骨细胞中的aggrecan、adhesin、胶原和纤维蛋白，激活其他MMP。MMP-9能激活胶原酶活性，破坏胶原网络结构，主要降解变性间质胶原和基膜胶原。MMP-13是软骨基质的主要结构，可降解COL2。在OA的发病机制中，OA的表达将显著增加。然而，qRT-PCR结果显示PBzyme显著抑制IL-1β刺激的人软骨细胞MMP-3和MMP-13的表达，延缓aggrecan和COL2的降解，从而减缓OA的发展(图2a、b、c、d)。为了进一步验证上述结果的准确性，我们还提取软骨细胞蛋白进行western blot检测。western blot分析结果与qRT-PCR结果一致(图2e)。免疫荧光分析还显示，PBzyme治疗显著降低了IL-1β刺激的MMP3和MMP9的释放(图2f)。此外，IL-1β刺激导致人软骨细胞中藏红染色严重丢失(图2g)。然而，经PBzyme处理后，IL-1β诱导的人软骨细胞中严重藏红染色的丢失明显减少(图2g)，表明PBzyme可以挽救IL-1β刺激的细胞外基质和蛋白多糖的减少。类似地，PBzyme延迟IL-1β下调人软骨细胞GAGs水平(图2h)。PBzyme能有效抑制IL-1β诱导的软骨细胞外基质降解。

软骨细胞凋亡与软骨形态、功能和OA的发生发展有关。Caspase-3是软骨细胞凋亡的重要执行因子，Caspase-9是软骨细胞凋亡的启动子。核因子红系2相关因子2通过抑制Caspase-3防止软骨细胞凋亡。与空白对照组相比，24小时后过氧化氢处理软骨细胞凋亡率显著增加(图2I，J)。然而，PBzyme显著降低过氧化氢诱导的人软骨细胞凋亡(图2i，j)。此外，半胱天冬氨酸蛋白酶3和半胱天冬氨酸蛋白酶9通过WB分析检测(图2k)，显示出类似的结果，即PBzyme显著抑制IL-1β刺激的人软骨细胞半胱天冬氨酸蛋白酶3和半胱天冬氨酸蛋白酶9(图2k)。

实施例8

PBzyme在体内延缓OA的进展

为探讨PBzyme对软骨细胞的影响，采用内侧半月板切除术建立大鼠创伤性OA模型。组织病理学检查显示，假手术组关节软骨表面光滑完整，藏红染色未见明显减少，软骨结构和潮水线完整，表层为扁平软骨细胞，中层为圆形软骨细胞，软骨细胞增生，软骨细胞增生深层和钙化层的蛋白多糖含量更多(图3a)。在OA组中，观察到藏红染色减少，关节间隙明显缩小，软骨损伤，骨赘形成和软骨下骨硬化(图3a)。表面软骨肿胀、变圆，软骨细胞明显减少，软骨细胞聚集，局部细胞排列紊乱、不规则，可见裂纹，有多条潮线和不规则，蛋白多糖含量下降(图3a)。在PBzyme组中，软骨细胞和aggrecan明显增加(图3a)。此外，软骨细胞排列比OA组更规则(图3a)。高剂量组的疗效优于低剂量组(图3a)。采用Mankin评分法判断OA的严重程度。结果表明，用PBzyme治疗的大鼠膝关节OA的严重程度明显低于OA组(图6b)。OA组和PBzyme治疗组之间的差异具有统计学意义(图3b)，表明PBzyme延缓了OA的进展。与OA组相比，注射低/高剂量的PBzyme后，骨关节炎研究学会(OARSI)的得分较低(图3c)。此外，我们还研究了OA的相关标志物，包括炎症、分解代谢酶、细胞外基质(ECM)和软骨细胞凋亡的特异性标志物(图3d-h)。

免疫荧光分析显示，与OA组相比，经PBzyme处理的软骨中iNOS和COX-2的表达显著下调(图3d-g)。用western blot分析法测定PBzyme对BAX、iNOS、Caspase 3、MMP13、COL2、Rac1和p-p65/t-p65蛋白表达的影响(图3h)。结果表明，PBzyme对OA引起的大鼠关节软骨BAX、iNOS、Caspase 3、MMP13、Rac1和p-p65/t-p65蛋白表达增加有明显的保护作用。此外，注射PBzyme后，COL2的表达降低。可见，PBzyme延缓了OA在体内的进展(图3)，这与体外培养的人软骨细胞的结果一致。

总结：

OA是老年人致残的主要原因和社会成本的来源。研究OA的发病机制及治疗具有重要意义。研究人员揭示了OA合成和分解代谢紊乱的分子机制。到目前为止，相关的信号通路有Wnt、SDF-1/CXCR4等。细胞内信号通路相互独立、相互关联，形成一个复杂的网络。这项研究中，我们发现PBzyme可以减轻炎症、软骨细胞外基质的降解和细胞凋亡，增加COL2和aggrecan的表达，保护关节软骨，并延缓OA的发展，这已被证实内侧半月板切除建立大鼠创伤性OA模型。与其他治疗关节炎的纳米药物相比，本研究使用了FDA批准的成分，这些成分组成简单，在有效剂量范围内没有明显的副作用。重要的是，PBzyme利用其固有特性在疾病治疗中发挥治疗作用，与报道的多组分纳米药物有很大不同。所制备的PBzyme具有理化性质稳定、制备简单、易制备等优点，在关节炎的治疗中具有广阔的临床应用前景。

值得注意的是，OA的发病机制还涉及滑膜细胞、软骨下骨、半月板等组织和细胞。OA的病理生理发展主要由多种细胞因子和信号传导途径介导。我们的发现可以为OA的发病机制、预防和治疗提供新的契机，并为OA的有效治疗提供一种可供选择的治疗策略。PBzyme在骨质疏松、骨侵蚀、骨缺损等骨疾病中具有广阔的应用前景。同时，可以控制PBzyme的结构、大小和粒径。PBzyme作为药物载体，易与其他疗法结合，在治疗中发挥更大作用。

Claims

1.普鲁士蓝纳米粒在制备预防或治疗骨关节炎的药物中的应用，所述普鲁士蓝的结构如下:

Fe₄[Fe(CN)₆]₃·_nH₂O；n＝0-25。

2.如权利要求1所述的应用，所述的普鲁士蓝尺寸为20-200nm，比表面积为200-1000cm²/g。

3.如权利要求2所述的应用，所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法采用以下步骤制备:

(2)将上述澄清溶液转移到可调节压力和温度的容器中，在温度60-200℃范围，压力为0.1MPa-20MPa，反应4-72小时；

(3)取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即得，

其中铁源选自铁氰化钾、铁氰化钠、铁氰化铵、亚铁氰化钠、亚铁氰化铵中的至少一种；具有还原和稳定作用的有机物为聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸，表没食子儿茶素没食子酸酯，壳聚糖或淀粉样蛋白中的一种或几种；酸性溶液S1选自柠檬酸、盐酸、磷酸、亚硝酸中的一种或几种。

4.如权利要求3所述的应用，所述铁源的浓度为0.005M-3M。

5.权利要求3所述的应用，所述有机物的浓度为0.1M-8M。

6.权利要求3所述的应用，所述酸性溶液S1的浓度为0.01M-6M。