CN111568924B

CN111568924B - 普鲁士蓝在制备治疗血管再狭窄的药物中的应用

Info

Publication number: CN111568924B
Application number: CN202010611514.6A
Authority: CN
Inventors: 蔡晓军; 郑元义; 高维; 窦超然; 李跃华; 王燕; 胡兵
Original assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111568924A

Abstract

本发明提供了普鲁士蓝在制备治疗血管再狭窄的药物中的应用以及普鲁士蓝纳米粒的制备方法。由于目前血管再狭窄并没有特效药物，因此提供一种对血管再狭窄的预防和治疗具有特效的药物具有一定的现实意义。本发明提供的普鲁士蓝能够抑制磷酸化信号转导子和转录激活子1(p‑STAT1)的激活，显著靶向巨噬细胞，使巨噬细胞极化为M2，从而有效缓解再狭窄的长期预后。此外，本发明提供的普鲁士蓝能显著降低促炎性细胞因子，加速内皮细胞的修复，减少血管平滑肌细胞的迁移和增殖，从而抑制再狭窄的进展。

Description

普鲁士蓝在制备治疗血管再狭窄的药物中的应用

技术领域

本申请涉及普鲁士蓝的应用，具体而言，涉及普鲁士蓝在制备治疗血管再狭窄的药物中的应用。

背景技术

心血管疾病是全球主要的死亡原因，每年约有1730万人死亡，包括动脉粥样硬化和冠心病，EIT术具有创伤小、见效快、适用范围广等独特优点。然而，EIT术后的主要并发症之一是再狭窄，严重影响患者的长期预后和生活质量。迄今为止，再狭窄仍然是一种EIT的主要缺点。目前临床上的预防和治疗方法主要有抗血小板和降血脂药物，主要集中在抑制血栓形成和控制血脂水平上，可减轻再狭窄的发生率。但对于有手术史的患者，治疗效果仍不理想，禁止使用近两周或凝血功能障碍。尽管药物洗脱支架/球囊部分降低了再狭窄的发生率，但晚期支架血栓形成、延迟再狭窄和长期安全性问题已经出现。因此，预防和治疗EIT后再狭窄的创新和有效的治疗仍然是迫切需要的。

血脂异常、高血压、吸烟、衰老等都是血管再狭窄的危险因素。目前，发明人已经发现纳米酶对类风湿关节炎和脑炎症模型有显著的治疗作用，EIT过程中内皮细胞的剥脱可以使纳米酶利用其机会及其微小的粒径通过受损的内皮细胞，靶向特定细胞，产生长期的作用，从而有力地提高防治效果。纳米酶可能是治疗/预防再狭窄的理想候选药物。根据这一概念，纳米酶有望彻底改变血管再狭窄创新治疗策略的发展。然而，几乎没有研究涉及纳米酶在治疗再狭窄中的独立作用。

世界上第一种铁蓝于1704年首先在德国合成，称为普鲁士蓝(Prussian Blue，PB)。由于色泽鲜艳，着色力强，广泛用于造漆、油墨、绘画颜料和蜡笔、涂饰漆布、漆纸以及塑料制品等着色。近年来，具有300年历史的普鲁士蓝又受到了人们的重视，由于其成本较低，是一种美国食品和药物管理局批准的，作为临床上治疗铊等放射性元素中毒的解毒剂，具有良好的生物相容性及生物安全性，因此关于普鲁士蓝在药物输运、分子影像、基因治疗、光热治疗肿瘤等生物医药技术领域的研究受到越来越多的关注。

在此基础上，发明人制备了普鲁士蓝纳米粒(PBzyme)，作为具有类酶活性的纳米材料，发明人在前期的研究中预测普鲁士蓝纳米粒也应具有纳米酶的相应活性，从而提供一种能够治疗和预防血管再狭窄的特效药物。

发明内容

研究发现，本发明提供的普鲁士蓝能够抑制磷酸化信号转导子和转录激活子1(p-STAT1)的激活，显著靶向巨噬细胞，使巨噬细胞极化为M2，从而有效缓解再狭窄的长期预后。此外，本发明提供的普鲁士蓝能显著降低促炎性细胞因子，加速内皮细胞的修复，减少血管平滑肌细胞的迁移和增殖，从而抑制再狭窄的进展。这一有效的治疗策略揭示了本发明提供的普鲁士蓝对血管再狭窄的显著防治作用，也为动脉粥样硬化、血栓形成等其他相关血管疾病的治疗方案的制定提供了新的视角。

本发明提供了普鲁士蓝在制备预防和治疗血管再狭窄的药物中的应用。

本发明还提供了普鲁士蓝类似物在制备预防和治疗血管再狭窄的药物中的应用。

本发明还提供了普鲁士蓝纳米粒在制备预防和治疗血管再狭窄的药物中的应用。

本发明还提供了普鲁士蓝类似物纳米粒在制备预防和治疗血管再狭窄的药物中的应用。

本发明还提供了纳米酶在制备预防和治疗血管再狭窄的药物中的应用。

所述普鲁士蓝的结构如下：Fe₄[Fe(CN)₆]₃·nH₂O；n＝0-25。

所述普鲁士蓝类似物的结构如下：

A_xB_y[M(CN₆]_a·n(H₂O)。

其中，A选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

B选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

M选自NH_4,Ca,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,In,Ga,Sr,lr,Nb,Li,Na,K,Rb,Cs,Fr,TI,Mo,Ru,Rh,Pd,Ag,Cd,In,Lu,Ba,Hf,Ta,W,Os,Pt,Hg,La,Eu,Gd,Tb,Dy或Ho；

x＝0-4；y＝0-4；n＝0-25；a＝0.8-4；x和y不同时为0。

所述普鲁士蓝的结构，n优选为0。

所述的普鲁士蓝类似物的结构，A优选K、NH₄、Na、Li、Rb、Se；B优选Fe；M优选Fe；n＝0。

普鲁士蓝或其类似物纳米粒的尺寸为2-400nm，空腔直径为5-90nm。

所述普鲁士蓝或其类似物纳米粒的比表面积为50-1500m²g^-1，孔容为0.3-5.5cm³g^-1。

本发明所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法包括如下步骤：

(1)将铁源和具有还原和稳定作用的有机物加入到酸性溶液S1中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲或者其他可调节压力和温度的容器中，在温度60-200℃范围，压力为0.1MPa-20MPa，反应4-72小时；

(3)取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即得。

本发明所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法还可以是如下步骤：

(1)将铁源和具有还原和稳定作用的有机物加入到酸性溶液S1中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

(2)将混合液转至温度为T1℃的烘箱中，陈化H1小时取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于酸性溶液S2中待用；

(3)将上述溶液转移至水热釜，置于温度为T2℃的电炉中，陈化适当时间H2小时，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-20nm范围内的尺寸为20-200nm普鲁士蓝纳米粒。

该方法所制备的普鲁士蓝纳米粒的比表面积为200-1000m²g^-1，孔容为0.5-5cm³g^-1。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述铁源选自铁氰化钾、铁氰化钠、铁氰化铵、亚铁氰化钠、铁氰化钠、亚铁氰化铵中的至少一种。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述铁源的浓度为0.005M-3M，优选0.05M-3M。

所述具有还原和稳定作用的有机物为聚乙烯吡咯烷酮，表没食子儿茶素没食子酸酯，壳聚糖及其衍生物或淀粉样蛋白中的一种或几种。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述有机物的浓度为0.1M-8M。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述酸性溶液选自柠檬酸、盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、碘酸、氯酸、溴酸、高铁酸、高氯酸、高溴酸、高碘酸、亚硝酸等；所述酸性溶液S1的浓度为0.00001M-8M，优选0.05M-6M；所述酸性溶液S2的浓度为0.05M-6M。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述时间H1为0.5-8小时；所述时间H2为4-72小时。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述温度T1为60-150℃。

进一步的，在所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法中，所述温度T2为25-200℃。

附图说明

图1：体内PBzyme治疗血管球囊损伤(Vascular balloon injury，VBI)后的再狭窄。VBI后6周每周静脉注射两次PBzyme或盐水。a)在VBI后0、2、4和6周用不同治疗的左侧CCA的超声图像。比例尺：1厘米。b)在来自各组的超声图像中测量的左CCA内径。n＝10/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过Student's t检验计算。(***P＜0.001，n.s，无显着性)。c)每组VBI后0、2、4和6周左CCA的HE染色。比例尺：200μm。d，e)新生内膜面积(d)和新生内膜面积与中间膜面积的比值(新生内膜/中间膜比值)(e)，这些比值是在来自各组的HE染色图像中测量的。n＝10/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过Student's t检验计算。(***P＜0.001，n.s，无显着性)。f-h)VBI后2周左CCA的Evans蓝染色(f)和CD31(绿)免疫荧光染色(h)。比例尺：100μm。比较各组之间再内皮化率的定量(g)。n＝10/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过单向ANOVA计算(***P＜0.001)。i)VBI后0、2、4和6周左CCA的α-SMA(红色)(平滑肌细胞标记)的免疫荧光染色。比例尺：100μm。

图2：比较每组之间的内腔面积和中间面积。在VBI+盐水组和VBI+PBzyme组之间比较在VBI后0、2、4和6周从左CCA的HE染色图像测量的内腔面积(a)和中间面积(b)。数据表示为平均值±SEM。n＝10/组。P值通过Student's t检验计算(***P＜0.001，n.s.，无显著性)。

图3：比较用或不用PBzyme处理VBI后左侧CCA中的α-SMA+细胞数。数据表示为平均值±SEM。n＝10/组。P值通过Student's t检验计算(***P＜0.001，n.s.，无显著性)。

图4：通过PBzyme处理的体内巨噬细胞极化诱导。a)VBI后0、2、4和6周左CCA中F4/80(红色)作为巨噬细胞标记物和CD206(绿色)作为M2巨噬细胞标记物的免疫荧光染色。比例尺：50μm。b)CD206+M2巨噬细胞与F4/80+巨噬细胞的比例的定量。n＝10/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过Student's t检验计算。(***P＜0.001，n.s，无显着性)。c)在VBI后0、2、4和6周，在左侧CCA中F4/80(红色)和iNOS(绿色)、M2巨噬细胞标记物的免疫荧光染色。比例尺：50μm。d)iNOS+M1巨噬细胞与F4/80+巨噬细胞的比例的定量。n＝10/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过Student's t检验计算。(***P＜0.001，n.s，无显着性)。e)VBI后4周左CCA的F4/80、CD206和CD16/32的Western印迹分析。f，g)组间CD206(f)和CD16/32(g)的蛋白质表达水平的定量。n＝4/组。数据表示为平均值±SEM。P值通过单向ANOVA(P＜0.01)算出。

图5：RAW264.7细胞(a)、HUVEC(b)和VSMCs(c)在与不同浓度的PBzyme一起温育24小时后的细胞生存力。数据表示为平均值±SEM。n＝3/组。P值通过单向ANOVA(P＜0.05，***P＜0.001)计算。

图6：不同处理后RAW264.7细胞中IL-6(a)、TNF-α(b)和iNOS(c)的相对mRNA表达。数据表示为平均值±SEM。n＝3/组。P值通过单向ANOVA(P＜0.05，P＜0.01，***P＜0.001)算出。

图7：伤口愈合测定是在不同浓度的PBzyme处理存在的情况下，用HUVEC与LPS(100ng/mL)一起或不与LPS一起温育24小时进行的。HUVEC迁移的代表性图像(a)。比例尺：200μm。比较组间的细胞迁移率(B)。n＝3/组。

图8：比较了Ki67(细胞增殖的标记物)和不同处理的HUVEC中DAPI的代表性免疫荧光图像(a)和Ki67阳性细胞的百分比(b)。数据表示为平均值±SEM。n＝3/组。P值通过单向ANOVA计算(***P＜0.0001)。比例尺：100μm。

图9：PBzyme浓度与HUVEC迁移率的相关性(a)，Ki67阳性细胞在总HUVEC中的百分比(b)被进行。P值通过双尾Pearson线性相关分析计算。

图10：在共培养24小时后进行VSMCs的跨孔迁移测定。在下部储存室中存在不同浓度的PBzyme处理剂的情况下，将RAW264.7与LPS(100ng/mL)一起或不与LPS一起温育，并在上部室中培养VSMC。VSMCs(a)中结晶紫染色的代表性图像。组(b)中迁移的VSMC的定量。n＝3/组。实验设计(c)的说明。数据表示为平均值±SEM。P值通过单向ANOVA(P＜0.01、***P＜0.001)算出。

图11：进行了PBzyme浓度与迁移的VSMC数的关联。P值通过双尾Pearson线性相关分析计算。

图12：测量不同处理大鼠的AST(a)、ALT(b)、BUN(c)和Scr(d)水平。数据表示为平均值±SEM。n＝6/组。P值通过单向ANOVA计算(***P＜0.0001，n.s，无显著性)。

图13：不同组静脉注射PBzyme，每周两次，共6周，主要器官HE染色。比例尺＝100μm。

图14：每周静脉注射两次PBzyme，共6周，主要器官的铁含量。数据表示为平均值±SEM。n＝6/组。P值通过单向ANOVA计算(***P＜0.0001，n.s，无显著性)。

图15：不同组大鼠的体重(a)、血糖(b)、甘油三酯(c)、总胆固醇(d)、LDL胆固醇(e)和HDL胆固醇(f)。P值通过单向ANOVA计算(***P＜0.001，n.s，无显著性)。

具体实施方式

实施例1

(1)2400mg的铁氰化钾和5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到60mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲中，在温度200℃，压力为10MPa，反应72小时；

(3)取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得尺寸为2-100nm的普鲁士蓝纳米粒。

实施例2

(1)300mg的铁氰化钾和3g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到50mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清溶液；

(2)将上述澄清溶液转移到电饭煲中，在温度100℃，压力为20MPa，反应48小时；

实施例3

步骤A)将3960mg的铁氰化钾和35g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到100mL浓度为2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

步骤B)将混合液转至80℃的烘箱中，陈化20h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于50mL浓度为1.5M的盐酸中待用；

步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，120℃陈化4h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-20nm范围内的尺寸为30-200nm介孔普鲁士蓝纳米粒。

实施例4

步骤A)将2560mg的铁青化钾和30g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到80mL浓度为的2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液；

步骤B)将混合液转至80℃的烘箱中，陈化15h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于20mL浓度为10M的盐酸中待用；

步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，60℃陈化8h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即可获得孔径为3-5nm范围内的尺寸为30-200nm介孔普鲁士蓝纳米粒。

实施例5

采用实施例1的方法制备了PBzyme，通过透射电子显微镜、元素图谱和X射线功率衍射证实了PBzyme的成功构建，该酶呈正方形，无角。

PBzyme在生理环境中具有良好的分散稳定性，对静脉给药防治血管再狭窄具有重要作用。研究了PBzyme在生理盐水中的水动力学直径、近红外区的特征吸光度和zeta电位，以显示其分散稳定性。PBzyme在生理环境中的分散稳定性良好，持续90天以上，适于静脉注射。

我们详细研究了PBzyme对血管再狭窄的防治作用。血管球囊损伤(Vascularballoon injury，VBI)是一种公认的模拟人体EIT的模型。如前所述，在Sprague-Dawley(SD)大鼠中建立了左颈总动脉(CCA)VBI动物模型，高胆固醇(HC)饮食通常用于动物模型中。为了确定体内实验的给药频率和浓度，测定了大鼠PBzyme的半衰期约为3.04h，表明PBzyme具有相对优良的血液学特性循环。为保证PBzyme在内皮损伤的前提下渗入血管内膜，每周注射两次，连续6周。

超声成像具有实时、无创、方便、准确、低成本等特点，目前已成为临床筛选和诊断血栓、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管疾病最常用的成像手段。在符合临床操作的前提下，对VBI和假手术后静脉注射PBzyme或生理盐水的大鼠进行常规复查和b超对左CCA的长期随访，以持续监测其再狭窄的进展，最长可达6周。如图1a、b所示，VBI使大鼠左CCA的内径从2周、4周逐渐减小到6周。在生理盐水处理的VBI大鼠中，这种作用更为显著，VBI后6周管腔几乎完全阻塞，PBzyme处理明显改善了这种情况。实时超声显像结果提示，PBzyme治疗可明显减轻VBI大鼠血管再狭窄的进展和程度。此外，苏木精和伊红(HE)染色的左CCA随后进行，以提供直接证据PBzyme治疗再狭窄。在生理盐水处理的VBI大鼠的左侧CCA中发现了广泛的新生内膜增生，管腔面积明显减少(图1c)。然而，在VBI后2、4和6周，PBzyme处理的VBI大鼠中发现明显的新生内膜增生区和较大的管腔区(图1c-e，图2)，这与体内超声显像结果一致。因此，从体内超声成像和病理学的数据证明，PBzyme治疗血管再狭窄有显著的疗效。

在生理条件下，血管内皮细胞构成血管内膜，沿血管壁内表面排列，为血液中的炎性细胞因子提供屏障。VBI过程中动脉的机械损伤必然导致血管内皮完整性的破坏，为血管平滑肌细胞的增殖和迁移提供了机会，最终导致血管再狭窄。因此，鉴于PBzyme在血管再狭窄发生中的重要作用，我们进一步研究了血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，以验证PBzyme对血管再狭窄的治疗作用。VBI后早期再内皮化对血管再狭窄的防治具有重要意义评价各组再内皮化程度，血管内皮标志物CD31(PECAM-1)的evans蓝染色和免疫荧光染色，术后2周行左颈动脉造影。如图1f、g所示，用PBzyme治疗的VBI大鼠与注射生理盐水的大鼠相比，可逆转损伤CCA的再上皮化率降低，如evans蓝染色面积减少所示。此外，在左侧CCA中CD31阳性细胞较少的盐水处理的VBI大鼠中发现明显脱落的内皮细胞，表明内皮细胞已恢复，在术后2周，PBzyme处理的VBI大鼠中几乎恢复到正常水平(图1h)。此外，用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体作为血管平滑肌细胞的特异性标志物，用免疫荧光法检测血管平滑肌细胞的增殖和迁移，作为血管平滑肌细胞增生的基础。如图1i所示，与生理盐水处理的大鼠相比，PBzyme处理的大鼠中VSMCs的增殖和迁移明显减少(图3)。提示PBzyme对VBI后血管再狭窄具有长期的保护作用。

VBI大鼠每周静脉注射PBzyme两次，持续6周后，左侧CCA的eosin(E)染色显示，静脉注射的PBzyme渗入损伤血管内皮，位于新生内膜，这表明PBzyme渗入到内膜可能为其显著的长期治疗效果提供了可能性(图4a，支持信息)。为了进一步确定PBzyme影响的特异性细胞，对PBzyme与FITC(绿色)和巨噬细胞特异性标记CD68(红色)或内皮细胞特异性标记CD31(红色)或血管平滑肌细胞特异性标记α-SMA(红色)进行免疫荧光双重染色。值得注意的是，PBzyme被发现以巨噬细胞(CD68+细胞)为靶点(图4b)，而注射的PBzyme均未与CD31阳性细胞(图4c)或α-SMA阳性细胞(图4d)共染色，表明PBzyme显著的体内治疗作用可能通过巨噬细胞发挥，而不是直接通过内皮细胞和血管平滑肌细胞。

在进一步的体外实验验证PBzyme对相关细胞的作用之前，我们评估了PBzyme对原始264.7细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和血管平滑肌细胞的毒性。用细胞计数试剂盒-8测定了不同浓度(从0到160μg/mL)的PBzyme处理后的细胞活力，结果表明，在0到40μg/mL的PBzyme浓度下没有诱导细胞毒性(图5)。

此外，已知M1巨噬细胞释放促炎细胞因子。为了进一步评价PBzyme对巨噬细胞表型极化影响的促炎细胞因子的影响，我们测量了几种相关的细胞因子，包括白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和iNOS(图6)。结果表明，100ng/mL LPS刺激24小时后，这些促炎细胞因子水平显著升高，而PBzyme处理后降低，说明PBzyme抑制了LPS处理巨噬细胞促炎细胞因子的产生。

此外，以往的研究证明，M1巨噬细胞分泌的促炎细胞因子对内皮细胞的迁移和增殖有抑制作用，对血管平滑肌细胞的积累有促进作用。与M1巨噬细胞不同，M2巨噬细胞促进内皮细胞的迁移和增殖，抑制血管平滑肌细胞通过减少促炎细胞因子的分泌。同样，我们的体内实验结果表明，PBzyme对VBI后内皮细胞和血管平滑肌细胞的保护作用可能是通过巨噬细胞的表型极化介导的。为进一步探讨PBzyme对两种关键细胞再狭窄的影响是否部分通过巨噬细胞极化介导，以LPS共培养24小时的巨噬细胞条件培养基(CM)为阳性对照，以载体处理的巨噬细胞条件培养基(CM)为阴性对照进行体外实验。为了验证PBzyme对内皮细胞的影响，进行了最常用的体内内皮修复体外模拟方法伤口愈合试验。从LPS处理的巨噬细胞中收集的CM与从载体处理的巨噬细胞中收集的CM相比，对内皮细胞的迁移具有强烈的抑制作用(图7)。随着PBzyme浓度从10μg/mL、20μg/mL提高到40μg/mL，内皮细胞的迁移能力逐渐增强，并用细胞增殖标志物Ki-67的免疫荧光染色评价内皮细胞的增殖能力。如图8所示，支持信息，从LPS处理的巨噬细胞收集的CM对内皮细胞(Ki-67+细胞)的增殖有显著的抑制作用，而在PBzyme处理后，内皮细胞的分裂有明显的飞跃，随着PBzyme浓度从10μg/mL增加而逐渐升高，20μg/mL至40μg/mL。进一步的相关性分析表明，至少在10至40μg/mL范围内，PBzyme的浓度与内皮细胞中的移行细胞或Ki-67+细胞呈正相关(图9)。提示PBzyme可能通过促进巨噬细胞向M2的极化和抑制炎症反应来促进内皮细胞的迁移和增殖。相应地，体内实验结果表明，PBzyme对VBI后新生内膜增生(VSMCs迁移)的显著抑制作用可能受巨噬细胞表型极化的调节。因此，采用跨井迁移实验进行体外实验，以测试血管平滑肌细胞的迁移。如图10所示，与来自载体处理的巨噬细胞的CM相比，从LPS处理的巨噬细胞收集的CM大大增强了VSMCs的迁移能力，而通过添加PBzyme以浓度相关的方式逆转，以40ug/mL的效果最强。此外，PBzyme的浓度与VSMCs的迁移呈负相关，如图11所示。以上结果表明，PBzyme对VSMCs的迁移有明显的抑制作用，可能是由于M2巨噬细胞分泌可溶性因子所致。结果表明，PBzyme可抑制巨噬细胞的破坏性M1反应，促进巨噬细胞的保护性M2反应，从而间接调节内皮细胞和血管平滑肌细胞的迁移和增殖。

为保证PBzyme治疗的生物安全性，取正常大鼠和VBI大鼠，分别给予PBzyme治疗6周和不给予PBzyme治疗6周后的血，进行肝、肾功能评价。如图12所示，肝功能指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)没有显著差异，与生理盐水组相比，PBzyme组大鼠的肾功能指标包括血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)，表明静脉注射PBzyme 6周对大鼠无明显的肝毒性和肾毒性。此外，不同组大鼠的主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的HE染色均未显示明显的组织异常(图13)，这进一步验证了PBzyme的优异体内生物相容性。此外，我们还通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测了PBzyme治疗6周后在主要器官中的分布(图14)。结果表明，PBzyme主要在肝和脾两个具有单核吞噬系统的器官中积累，表明PBzyme可能被两个器官中的吞噬细胞吞噬。

众所周知，代谢综合征，包括肥胖、血糖异常、血脂水平等，可能与血管内治疗后再狭窄的发生密切相关。探讨PBzyme对VBI的治疗是否部分是通过抑制HC饮食VBI大鼠的代谢综合征、血糖水平，检测体重、血糖、血脂等指标，包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。值得注意的是，与正常饮食假大鼠相比，生理盐水处理和PBzyme处理的HC饮食VBI大鼠的血脂水平和体重显著增加(图15)。提示PBzyme治疗对体重、血糖/血脂水平无明显影响，进一步说明PBzyme治疗VBI的远期疗效并非来自于血糖/血脂代谢的变化。

综上，巨噬细胞除了与生俱来的吞噬活性外，还通过调节M2的表型极化而参与组织修复和发挥抗炎作用。巨噬细胞极化的调节可能为调节血管炎症反应和促进血管修复提供新的机会，以预防和促进血管修复EIT后血管再狭窄的治疗。本研究旨在验证PBzyme是否能靶向巨噬细胞并影响其极化，从而利用其粒径小和VBI后内皮细胞受损的特点防治再狭窄，从而对血管再狭窄产生长期的治疗作用，这是当前临床医生面临的挑战，对高危因素患者极为重要。体内和体外实验结果均表明，PBzyme对再狭窄有显著的治疗作用，其作用机制可能是特异性的，提示这种纳米酶治疗策略将有助于提高长期疗效，并为今后炎症性疾病治疗方法的建立提供有价值的指导。未来的工作需要进一步提高PBzyme对特定细胞的靶向性，同时也为其在其他炎症相关疾病中的潜在应用提供了光明的前景。总之，本研究为PBzyme防治血管疾病提供了坚实的理论基础，也为PBzyme防治其他炎症相关疾病的机理研究开辟了新的天地。

Claims

1.普鲁士蓝或其类似物纳米粒在制备治疗血管再狭窄的药物中的应用；所述普鲁士蓝的结构如下：Fe₄[Fe(CN)₆]₃·nH₂O；n＝0-25；

所述普鲁士蓝类似物的结构如下：

A_xB_y[M(CN₆]_a·n(H₂O)；

其中，A选自K、Na、Li；B为Fe；M为Fe；n＝0，x＝0-4；y＝0-4； a＝0.8-4；x和y不同时为0。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的普鲁士蓝或其类似物尺寸为20-200nm，比表面积为200-1000cm²/g。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的普鲁士蓝纳米粒的制备方法采用以下步骤制备：

(3)取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥，即得，

其中铁源选自铁氰化钾、铁氰化钠、铁氰化铵、亚铁氰化钠、亚铁氰化铵中的至少一种；具有还原和稳定作用的有机物为聚乙烯吡咯烷酮，表没食子儿茶素没食子酸酯，壳聚糖或淀粉样蛋白中的一种或几种；酸性溶液S1选自柠檬酸、盐酸、磷酸、亚硝酸中的一种或几种。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于所述铁源的浓度为0.005M-3M。

5.权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机物的浓度为0.1M-8M。

6.权利要求3所述的应用，其特征在于所述酸性溶液S1的浓度为0.00001M-8M。