CN116421735B - 硝普钠缀合的载药普鲁士蓝及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝及其制备方法与应用，所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝为方形纳米粒子，方形纳米粒子的最大边长为60~80nm；制备过程包括：铁氰化钾与硝普钠以质量比为1:（1~9）的比例在反应溶液中反应得到硝普钠缀合的普鲁士蓝；将胆绿素载入所述硝普钠缀合的普鲁士蓝中，形成硝普钠缀合的载药普鲁士蓝，载药量为3~8.3%。发明提供的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝作为抗心肌缺血药物可定位在缺血损伤部位，发挥原位NO释放的作用，还可达到一个长效的药物覆盖作用，减少损伤部位氧化应激的同时释放NO，发挥促进缺血部位血管重构和血流恢复的作用，并能过氧亚硝酸盐累积和铁死亡作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别地，涉及一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝及其制备方法与应用。
背景技术
冠心病是因冠状动脉闭塞或狭窄导致心肌绝对或相对供血不足而引发的一系列综合征，目前尚无根治手段。针对其致病原因，及时的“血运重建”可以最大程度的缓解症状并挽救受损心肌细胞。血管介入和旁路移植手术的问世为早期“血运重建”治疗提供了突破口，极大的降低了冠心病的死亡率及其并发症的发生率，但是上述手术治疗窗口严苛，且对于施术者要求较高，多数患者常难以及时获得救治而延误最佳治疗时期。故寻找便利、有效的治疗方法仍是冠心病治疗学重要的研究课题。
硝酸盐类药物是经典的抗心肌缺血药物，已在临床上使用了150余年之久，目前仍是冠心病急救治疗的首选药物。其主要作用是通过释放一氧化氮(NO)与细胞内的鸟苷酸环化酶(sGC)反应，引起细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)的水平升高，从而诱导Ca2+外流并引起血管舒张。这个反应在极短的时间内发生，可以迅速扩张痉挛血管，缓解冠心病患者急性缺血症状，此外上述作用还可以降低外周血管阻力，降低心脏后负荷从而缓解心肌缺氧状态。更有研究发现，NO可以增加细胞内s-亚硝基硫醇水平，抑制血小板粘附、聚集，减少血栓形成；此外，适度的NO可通过抑制iNOS的表达抑制巨噬细胞炎性介质释放，并促进其向M2型巨噬细胞转化发挥炎症调控作用；同时，NO还可以协同VEGFR受体促进血管新生和动脉生成，并促进分水岭区域冠脉侧支血管的产生。临床研究表明在严格、持续的NO供给后可显著降低院内死亡率和远期（30天后）的心衰发生率。目前临床使用的硝酸盐药物剂型主要是口服和静脉制剂，但可惜的是口服药物常经过肝脏首关消除使血药浓度难以监控，并在连续使用24-48小时后即出现药物耐受，极大地限制了其长程疗效。而对于静脉输注药物，由于起效迅速且强大，需要床旁监测平均动脉压谨防过低血压的副作用。此外，研究表明，长期输注亚硝酸盐药物可以导致体内超氧亚硝酸盐的累积，而超氧亚硝酸盐呈级联的可将功能性的NO分子转化为OONO-，在破坏NO活性功能的同时，产生压倒性的氧化损伤，目前认为OONO-是包括循环休克、心肌坏死、大面积纤维化产生的关键机制。为此，根据NO供体药物的特性，开发在生物体内浓度稳定、生物利用率高、长效且低OONO-活性的的NO供体药物可能为冠心病治疗提供新的方法。
纳米颗粒的药物输送系统（DSS）通过将药物活性成分封装在纳米尺寸的包装中，在保留药物基本作用的同时，调整其体内分布状态并具有控制药物释放时机的作用，是目前最具有潜力的药物缓释、靶向的一种药物包装方式。如二氧化硅、金属氧化物和聚合物纳米粒子，以及脂质体和树枝状大分子，均已被用于药物包装的递送，并在抗菌、肿瘤杀伤等领域作用显著。基于传递NO的目的，目前已经设计多种NO供体DSS传递体，其中包括铜离子基底的球形包装体、NO供体贴片、红细胞发生型NO供体。其通过运载特定NO供体药物，在生物催化作用下释放NO。然而，上述任何一种材料都不能全面发挥药理作用，涵盖NO的持续释放、靶向和抗过氧亚硝酸盐作用。
发明内容
本发明提供了一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝及其制备方法与应用，以解决现有的抗心肌缺血药物无法兼具持续释放NO、靶向和抗过氧亚硝酸盐的技术问题。
根据本发明的一个方面，提供一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝，所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝为方形纳米粒子，所述方形纳米粒子最大边长为60~80nm；
所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝的制备过程包括：S1、铁氰化钾与硝普钠以质量比为1:（1~9）的比例在反应溶液中反应得到硝普钠缀合的普鲁士蓝，其中，硝普钠嵌入普鲁士蓝的骨架结构中；S2、将胆绿素载入所述硝普钠缀合的普鲁士蓝中，形成硝普钠缀合的载药普鲁士蓝，其中，载药量为3~8.3%。
硝普钠缀合的载药普鲁士蓝为方形纳米粒子，所述方形纳米粒子最大边长为60~80nm，上述尺寸的纳米粒子可以保证药物释放剂量在有效区间的同时可以顺利被细胞内吞。
载药量超过3.0%时，胆绿素（BV）可以被很好的负载并发挥作用，由于BV抗氧化的作用很强，载药量超过8.3%会导致细胞受到一定程度的损伤。
根据本发明的另一方面，还提供了一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝的制备方法，包括如下步骤：
S1、将络合剂和氧化剂混合，作为反应溶液；
S2、将铁氰化钾与硝普钠以质量比为1:（1~9）的比例溶于S1所得反应溶液中，在50~100℃下反应，去杂和干燥后得到硝普钠缀合的普鲁士蓝；
S3、将硝普钠缀合的普鲁士蓝与胆绿素以质量比为（1~10）：1的比例在溶剂中溶解，在25~85℃下反应，去杂和干燥后得到硝普钠缀合的载药普鲁士蓝。
进一步地，步骤S1中所述络合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、枸杞酸和马来酸中的一种或多种，所述络合剂在反应溶液中的浓度为0.05~0.10g/mL。
进一步地，步骤S1中所述氧化剂包括过氧化氢、盐酸和硝酸中的一种或多种，所述氧化剂在反应溶液中的浓度为0.005~0.01mol/L。
进一步地，步骤S2中，反应时间为10~16h。
进一步地，步骤S2中，去杂包括离心洗涤5~8次，去除未反应杂质。
进一步地，反应时间为20~28h。
进一步地，步骤S3中，去杂包括离心洗涤3~5次，去除未反应杂质。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝或上述方法制得的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在抗心肌缺血药物中的应用。
进一步地，将所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝溶于生理盐水中制成抗心肌缺血注射液，所述普钠缀合的载药普鲁士蓝的浓度为0.5~1.5mg/mL。
本发明具有以下有益效果：
近150余年来，一氧化氮供体类药物（硝酸甘油、硝普钠等）以其快速有效的扩张血管的效应，可以迅速缓解冠心病患者心肌缺血症状，一直是临床上冠心病急救的首选药物之一。此外，其非血管扩张的作用在近年来也得到了广泛的关注，包括减少血细胞中s-亚硝基硫醇水平，抑制血小板粘附、聚集，减少血栓形成；抑制巨噬细胞iNOS的表达减少炎性介质释放，并促进其向M2型巨噬细胞转化，减轻缺血区域炎症反应；协同VEGFR受体促进血管新生和动脉生成，并促进分水岭区域冠脉侧支血管的产生，减少远期心血管相关并发症和死亡率的发生，上述证据表明NO可以全方位的对缺血区域心肌发挥治疗作用，其治疗效应覆盖早期症状缓解至后期预后改善的全程。
然而，目前临床使用的硝酸盐药物存在显著弊端。对于口服药物，常在连续使用24-48小时后即出现药物耐受，无法继续发挥心肌保护作用。对于静脉输注药物，其多呈现剂量依赖性，极易发生低血压休克，需要床旁时刻监测血压。针对上述应用的瓶颈，缓释或长效的NO供体药物一直是临床药物开发的重点，但可惜的是，长效或缓释的NO-供体药物在临床实验中并不能降低CVD远期并发症发生率以及心血管事件发生率。对于这个现象的解释，可能与NO-供体药物导致的过氧亚硝酸盐累积和脂质过氧化有关。
过氧亚硝酸盐是NO和超氧化物迅速反应生成的有毒产物，ONOO在酸性环境下进一步裂解生成硝基化活性基团和羟基自由基，前者参与多种损伤性蛋白质修饰，后者则呈指数级放大氧化应激效应。不同于其他自由基分子，过氧亚硝酸盐结构稳定，可稳定存在细胞中，并与多种可溶性分子反应，破坏其结构稳定性并损害其功能。研究表明，过氧亚硝酸盐可与蛋白质中过渡金属反应形成超氧化物，直接损害细胞有氧及无氧呼吸链中关键分子，导致其失活，诱使呼吸链破坏，活性氧产生增加，增加的活性氧与脂质发生氧化还原反应，导致脂质过氧化物累积，最终诱发铁死亡的发生；过氧亚硝酸可以直接氧化还原型谷胱甘肽（GSH），导致细胞巯基耗竭，是循环休克以及慢性退行性病变的主要病理机制之一；过氧亚硝酸盐可以损伤细胞骨架蛋白及肌动蛋白，导致细胞结构稳定性下降，内皮屏障功能被破坏，血管功能减退；此外，过氧亚硝酸盐可以直接在核碱基和糖磷酸骨架中引入氧化修饰使DNA链断裂，并导致细胞死亡。因此，开发持续有效、应用便利且具有过氧亚硝酸盐抑制的NO-供体药物是我们针对冠心病治疗中的整体策略。
人工纳米材料因其催化活性可调、多酶样活性、稳定性高等突出优势，在过去十年中引起了广泛的关注。基于靶向NO投递和剂型应用便利的目的，近年来已经设计多种NO供体纳米材料，包括铜离子基底的球形包装体、NO供体贴片、红细胞发生型NO供体等。其通过运载特定NO供体药物，在生物催化作用下释放NO，可在原位发挥NO投递，并提供可持续性NO供给，解决了临床上NO药物使用的重要限制。但是，目前暂无针对过氧亚硝酸清除并发挥原位NO投递的研究。
普鲁士蓝是美国食品和药物管理局批准的铊和其他放射性元素中毒的解毒剂。普鲁士蓝纳米酶（PBzyme）不仅具有纳米材料特性，而且具有独特的内在酶模拟催化功能（清除ROS，如•OH，•OOH和H2O2)，在一系列氧化应激相关疾病中具有显著的治疗效果，如缺血性脑卒中，骨关节炎和血管再狭窄等。我们发现硝普钠（SNP）和PB单体结构类似，可在酸性条件下插入到生长的PB纳米模块中，其中SNP分子中心分子可以缓慢解离出气态NO分子并被空心PB纳米晶格捕获，通过PB的固有晶格孔隙缓慢释放。此外，PB单体的金属核心可以通过结合短肽分子与胆绿素晶体形成稳定的纳米结构，其中胆绿素分子作为老牌的氧自由基清除分子，可以消除活性氧并抑制羟基自由基的产生，具有抑制ONOO生成，发挥PB-NO的抗过氧亚硝酸盐能力。
本发明提供的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝作为抗心肌缺血药物不仅具有良好的细胞可及性可以清晰的定位在缺血损伤部位，并发挥原位NO释放的作用，而且可以长时程的停留在动物体内达到一个长效的药物覆盖作用，在功能上本申请可以改善线粒体功能，减少活性氧的产生，抑制过氧亚硝酸盐的产生，改善缺血区域的氧化应激状态，减少细胞凋亡；此外，可以改善缺血区域炎症状态，促进M2巨噬细胞转化，减少炎症介质释放，减少缺血区域纤维化水平；更重要的是，本申请具有显著的血管功能促进作用，可以增强梗死区域血管新生和动脉生成，促进心脏侧支血管的产生并改善心肌血流灌注。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的PB和PO的红外线检测图谱（其中SNP表示硝普钠）；
图2是本发明优选实施例的PB和PO的X射线衍射分析图谱；
图3是本发明优选实施例的POB和PO的紫外吸收峰；
图4是本发明优选实施例的透射电镜图像（A：PB、B：PO、C：POB）；
图5是本发明优选实施例的POB和PB的NO释放曲线；
图6是本发明优选实施例的PB、PO和POB对超氧阴离子清除的作用对比图；
图7是本发明优选实施例的PB、PO和POB（从上至下）对过氧亚硝酸清除的作用对比图；
图8是本发明优选实施例的溶血反应实验图谱（图中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）；
图9是本发明优选实施例的细胞活性实验图谱（A：心肌细胞；B：皮皮细胞；C：巨噬细胞，图中ns代表不存在统计学差异）；
图10是本发明优选实施例的组织器官的HE染色图像；
图11是本发明优选实施例的小鼠血浆肝肾生化检测图谱（A：谷草转氨酶；B：谷丙转氨酶；C：碱性磷酸酶；D：血肌酐；E：血浆尿素氮）；
图12是本发明优选实施例的POB-Bodipy505/515荧光强度及体外示意图；
图13是本发明优选实施例的POB-Bodipy505/515从注射前到注射后7天体内代谢示意图；
图14是本发明优选实施例的心脏TTC检测示意图（图A：染色情况；图B：染色面积，图中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）；
图15是本发明优选实施例在小鼠心肌梗死模型中，梗死交界区细胞凋亡检测代表性示意图；
图16是本发明优选实施例在蛋白印迹实验中与凋亡相关的蛋白显影图片；
图17是本发明优选实施例在小鼠心肌梗死模型中，梗死交界区心脏细胞透射电镜检测图（A：手术组；B：PB组；C：PO组；D：POB组）；
图18 是本发明优选实施例的POB心梗后术后21天的心动超声图（A：左室射血分数（LV-EF）；B：左室短轴收缩率（LV-FS）；C：左室舒张末期容积（LVIDd）；D：左室收缩末期容积（LVIDs），图中表明统计学差异小于0.05；/>表明统计学差异小于0.001；/>表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）；
图19是本发明优选实施例的对照组及其他剂量组心梗后心动超声图；
图20是本发明优选实施例的线粒体膜电位检测图谱；
图21是本发明优选实施例的POB在低氧环境下对活性氧的清除作用图（图中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）；
图22是本发明优选实施例的细胞过氧亚硝酸盐水平检测图谱（表明统计学差异小于0.05；/>表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）；
图23是本发明优选实施例在小鼠心肌梗死模型中，梗死交界区活性氧检测图谱；
图24是本发明优选实施例在小鼠心肌梗死模型中，梗死交界区过氧亚硝酸盐检测图谱；
图25是本发明优选实施例的心梗小鼠模型心脏过氧化脂质（丙二醛）检测图谱（图中表明统计学差异小于0.05； />表明统计学差异小于0.0001）；
图26是本发明优选实施例在蛋白印迹实验中与铁死亡相关的蛋白显影图片；
图27是本发明优选实施例的POB细胞可及性检测图谱（A：细胞骨架；B：POB；C：细胞核；D：合并）；
图28是本发明优选实施例的POB在小鼠梗死心脏中的定位图谱；
图29是本发明优选实施例的POB在小鼠梗死心脏中释放NO的图谱；
图30是本发明优选实施例的POB促进心梗后冠脉血管血运重建的图谱(A:小动物心脏血管造影结果；B：缺血区域心脏切片免疫荧光染色，白色三角形所示为新生动脉血管)；
图31是本发明优选实施例的POB促进心梗后血流灌注图谱；
图32是本发明优选实施例的POB促进下肢缺血模型中肌肉中新生血管的免疫荧光图片；
图33是本发明优选实施例的小鼠下肢多普勒血流图谱（A1：术前；A2：0天；A3：7天；B1：14天；B2：21天；B3：28天）；
图34是本发明优选实施例的血流恢复情况的统计图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及以上，“一个或多个”中的“多个”的含义是两个及以上。
实施例
一、普鲁士蓝-硝普钠（硝普钠缀合的普鲁士蓝，PO）的合成：
（1）精准称取3g聚乙烯比咯烷酮（PVP） 溶于40mL水，加入0.01M盐酸 为反应溶剂；
（2）精准称取不同比例下的铁氰化钾与硝普钠（铁氰化钾：硝普钠质量比例分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9）充分溶解于（1）中，并分别于不同温度梯度下（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）反应12h，收集不同反应条件下生成的产物PO溶液，水中离心洗涤5~8次（11000rpm/10min）去除未反应杂质并计算产物浓度；
（3）37℃恒温条件下，使用一氧化氮检测试剂盒测定（2）中不同反应条件下PO的NO持续释放水平，筛选出PO合成的最佳方案（见表1），结果表明铁氰化钾：硝普钠为1:4时NO的持续释放水平最高。
表1 药物合成比例与一氧化氮持续释放水平
二、普鲁士蓝-硝普钠-胆绿素（硝普钠缀合的载药普鲁士蓝，POB）的合成:
（1）以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，分别加入不同比例下的PO与胆绿素（PO：胆绿素质量比例分别为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1）充分溶解，并分别于不同温度梯度下（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃）反应24h，得到不同反应条件下生成的POB溶液，见表2-3，其中，表2中的反应温度为65℃，表3中PO与胆绿素的质量比为4:1；
（2）11000rpm/10min条件下离心（1）生成的POB溶液，取上清计算不同反应条件下的PO中胆绿素的装载率，筛选出POB合成的最佳方案（见表2-3）；
（3）选取最佳合成方案下生成的POB溶液，水中离心洗涤3~5次（11000rpm/10min）去除未反应杂质并计算溶液浓度。
表2 药物合成比例与载药量
表3 温度与载药量
三、荧光标记POB（POB-Bodipy505/515）的合成:
（1）以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，分别加入不同质量比例下的POB与荧光素BODIPY（POB：Bodipy505/515分别为40:1:、30:1、20:1、10:1、1:1）充分溶解，并分别于不同温度梯度下（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃）避光反应24h，得到不同反应条件下生成的产物POB-Bodipy505/515；
（2）将（1）中所得不同反应条件下的POB-Bodipy505/515溶液置于分子截留量为3.5KD的透析袋中避光透析24h，去除未反应杂质并计算产物浓度，见表4-5，其中，表4中合成温度为65℃，表5中POB与荧光素BODIPY的合成质量比例为10:1；
（3）荧光分光光度计测定PO及不同反应条件下生成的POB-BODIPY的荧光吸收，筛选出POB-BODIPY合成的最佳方案。
表4 药物合成比例与荧光素水平
表5 温度与荧光素水平
四、性能测试部分
1、POB合成检测。
普鲁士蓝（PB），是FDA批准的铯和铊中毒解毒剂，具有出色的生物安全性。PB相关的纳米颗粒早前已被开发为用于超声和磁共振，对复杂组织进行图像增强。此外，PB还被用作光热转化剂对肿瘤细胞实行靶向杀除。近年来，通过对PB纳米颗粒结构的表面积比进行改良，制备的PB纳米颗粒可以发挥优越和多样的过氧化物酶活性，已在多种氧化应激相关疾病（如缺血性脑梗死，动脉再狭窄和阿尔兹海默症等）中取得较好疗效。
然而， PB纳米材料的良好气态分子吸附能力确暂时未被重视，我们通过筛选和比较多种NO供体药物，发现硝普钠和PB单体结构类似，可在酸性条件下插入到生长的PB纳米模块中。其中POB中插入的亚硝基通过配位键与PB结构中的Fe3+连接，在溶液中会有微弱的解离，从而缓慢释放出NO。为此，我们在体外实验中采用红外线检测分析，发现在PB和PO曲线上观察到C≡N基团在2086 cm-1处的强烈拉伸振动。而SNP和PO曲线在1944 cm-1处出现N=O振动，进一步说明SNP可以嵌入PB骨架结构中形成PO （图1）。
此外，XRD分析显示，PO的X射线衍射分析（XRD）图显示出与PB相同的衍射峰，表明嵌入的SNP对PB的晶体结构没有影响（图2）。明确了SNP和PB单体对接的成功。
基于消除OONO-的目的，我们筛选了包括胆红素、胆绿素等在内的多种抗过氧亚硝酸的化合药物，通过对接实验胆绿素与PO的对接最为稳固 ，在紫外吸收峰检测中，相同浓度下，POB的紫外吸收峰值低于PO，表明胆绿素成功载入 PO中，推算载药量为8.3%（图3）。
最后我们通过透射电镜对POB进行了粒子表面特征检测，结果显示，POB呈现方形纳米粒子特征，颗粒直径在60-80nm左右（图4，A为PB、B为PO、C为POB）。
2、POB体外表征检测。
基于合成的原理，我们首先检测POB是否具有缓慢解离出NO的作用。使用NO检测试剂盒进行检测，结果显示随着时间推移，NO释放呈现非线性释放趋势（拟合曲线参数：Hillslope:0.5658，Top：~11.73，EC50：~3807，Span：~11.6，R2=0.9819），符合药物释放的一般趋势（图5）。
紧接着我们检测了POB及其单体对超氧阴离子及过氧亚硝酸盐的清除能力，通过紫外吸收峰值评估，我们发现POB和PO在超氧阴离子清除能力上没有显著差异，但均优于对照组及PB单体组（见图6，图中control为过氧化氢处理后超氧阴离子的吸收波长）。我们在体外反应体系中通过四唑蓝方法分析超氧阴离子清除能力，将各组分与四唑蓝混合后将比色皿暴露于紫外线下，并在560nm处检测吸光度，其中随着过氧亚硝酸盐的清除其吸收峰将逐渐下降，的确我们观察到了POB的下降幅度大于其他各组分，表明过氧亚硝酸盐的清除方面显著优于其他（见图7，图7为PB，PO和POB的对比图像）。我们使用邻苯三酚红检测过氧亚硝酸盐的清除能力，邻苯三酚红在540nm处有一个比吸收峰，而过氧亚硝酸盐可以猝灭邻苯三酚红并降低其比吸收峰。我们的结果表明，再添加硝普钠(SNP)的阳性对照里，吸收峰明显下降，而POB组则没有明显的下降，表明体外反应体系中过氧亚硝酸盐的水平受到了抑制。不同合成条件组合下的超氧阴离子清除率见表6，不同载药量的过氧亚硝酸盐清除速率见表7。
表6.药物合成比例与超氧阴离子清除力
表7.POB载药量与过氧亚硝酸盐清除率
综上所述，我们通过构建PB-NO纳米体系，提出了一种有效且持续的NO供体药物制备策略，并通过调节晶格孔隙大小，实现NO缓慢释放（长达7天），使其具备了人工“拟eNOS酶”效应。针对NO分子极易被氧化成OONO-的特性，我们创新性的将胆绿素(BV)分子插入PB晶格中构建了POB，实现原位的抗OONO-效应，在保证NO分子活性的同时，最大限度降低其可能的副反应。
3、POB药物毒理及体内代谢。
为了明确POB的生物相容性和潜在的毒理作用，我们获取外周血标本，通过溶血实验检测了不同药物浓度的溶血情况。结果表明，在多种范围内（0.5，0.75，1.0，1.25，1.5mg/ml，溶剂为0.9%的生理盐水溶液，溶质为POB）的浓度范围内均不会发生溶血反应（图8，其中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。
我们检测了POB的生物相容性，POB在多种浓度范围内（0.25，0. 5，1.0 mg/ml），使用CCK8试剂盒检测细胞活性，我们在多种细胞中（心肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞）均没有降低细胞活性（图9，其中ns代表不存在统计学差异）。
为了明确POB是否对动物组织器官有损伤，我们使用尾静脉注射的方法，使用不同剂量（0.25，0. 5，1.0 mg/ml）注射进入小鼠中，在药物注射7天后，通过HE染色进行形态学检测，并没有在包括肝、肾在内的多个组织器官中发现明显的形态学改变（图10，其中从上至下依次为肝、脾、肺和肾脏）。此外，我们收取了小鼠药物注射后的外周血标本，检测了其肝肾功能等血液生化指标，结果表明小鼠的各个生化指标均在正常范围内。结果如图11，其中，A：AST（谷草转氨酶）；B：ALT（谷丙转氨酶）；C：ALP（碱性磷酸酶）；D：CREA（血肌酐）；E：BUN（血浆尿素氮）。
随后为了明确药物在体内代谢的时间，我们使用构建并获得了荧光标记的POB（POB-Bodipy505/515）。在体外实验中，我们观察了其荧光活性，结果显示POB-Bodipy505/515可在 505~515激发波长上发出清晰明亮的荧光（图12）。使用尾静脉注射的方法将POB-Bodipy505/515注射进入小鼠体内后，对小鼠膀胱进行了连续观察，结果表明，随着观察时间延长，荧光强度逐渐累积并在6小时后达峰，随后荧光可在体内稳定存在，至第7天仍然有部分未被完全代谢（图13）。
4、POB抗心肌损伤，抑制细胞凋亡。
我们使用小鼠心肌梗死模型，对POB抗心肌损伤能力进行了检测。在心肌梗死早期，其TTC染色（一种细胞活性损伤检测的染料，其仅可在活性良好的细胞线粒体中被氧化从而呈现颜色，其颜色的深浅与细胞活性程度呈正相关。）显示POB及PO处理后，染色面积显著增加，表明心肌损伤减轻（图14，其中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。
在末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色（细胞凋亡水平检测的金标准方法之一）中，我们发现使用了PO和POB的小鼠，其心肌梗死边界区细胞凋亡也显著减少（图15），提取梗死交界区组织使用WB对凋亡相关蛋白进行检测，结果表明PO和POB组的caspase-3及Bax水平下降，而Bcl2水平升高（图13）。与我们材料构建思路一致，上述调控作用POB均要强于PO，表明POB抗梗死区域心肌凋亡的作用优于PO，这是因为胆绿素可以加强自由基的清除，因此远期效果更好。进一步证实PO和POB具有抗细胞凋亡的作用（图16）。
此外通过电镜对心肌细胞进行观察，可以发现，POB处理后的小鼠心肌细胞肌丝及线粒体完整，PO组的小鼠心肌细胞肌丝完整，但线粒体稍有肿胀，而PB及MI组（心梗手术）的肌肉和线粒体则表现出不同程度的溶解和破碎（图17，A：手术组；B：PB组；C：PO组；D：POB组）。上述证据从宏观和微观的角度均证实POB及PO具有抗缺血后心肌细胞损伤的作用。
5、POB维持心梗后心功能.
为了在形态学随后我们使用心动超声连续评估了小鼠心功能的变化，通过评估LVEF（用以评价心功能的金标准），在小鼠中当LVEF小于45%视为心力衰竭，通过测量左心室舒张内径（LVIDd）和收缩末期内径（LVID），通过Teichholz公式计算LVEF。结果显示POB组在小鼠心肌梗死造模的第21天后依旧可以维持较高的心功能水平，远高于手术造模组（78.08±4.08% vs. 34.57±4.09%）（图18，图中表明统计学差异小于0.05；/>表明统计学差异小于0.001；/>表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。为了进一步验证我们的效果，我们比较了不同剂量的POB和公认的临床使用的NO供体药物—硝普钠（SNP）对于心功能的影响，尽管SNP较单纯手术组仍有一定的心功能恢复促进作用，但是不存在统计学差异，而对于POB而言，随着使用剂量的增加其对于心功能的促进作用之间增强，并在我们的优选实例中达到最佳（图19，图中/>表明统计学差异小于0.001；表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。
6、POB抑制活性氧和过氧亚硝酸盐产生.
基于我们体外实验的结果，我们明确了POB具有消除过氧化物和超氧亚硝酸的作用，是否这样的作用在细胞和动物实验中均有效？线粒体膜电位下降是细胞缺氧后，氧化应激损伤的最先表现，为此，我们首先在细胞中检测了不同材料组分对缺氧低氧环境下线粒体膜电位的影响，我们使用1%O2氧气浓度的细胞培养条件模拟体内缺氧环境，随后使用JC-1试剂盒对线粒体膜电位进行了检测。结果显示，POB可以显著抑制线粒体膜电位下降，从而使试剂盒中检测到的JC-1复合体水平与常氧组水平一致，而低氧组以及其他组别则存在不同程度的JC-1单体（图20）。为了进一步检测细胞中活性氧的水平，我们使用活性氧检测试剂盒对低氧环境下不同加药组的细胞进行了检测，结果表明随着不同材料组分的加入细胞活性氧水平显著下降，而POB组下降水平最为显著，上述实验证实POB具有抗缺氧下细胞活性氧产生的能力（图21，图中表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。
随后，我们在细胞实验中对POB消除过氧亚硝酸盐的能力进行了检测。3-吗啉基-斯德亚胺盐酸盐(SIN)是目前公认的细胞及动物过氧亚硝酸盐损伤诱导的药物，我们在细胞实验中添加了50uM的SIN，并使用不同组分的材料对细胞中的过氧亚硝酸水平进行了检测，结果显示POB组可以显著抑制细胞中过氧亚硝酸盐的水平（图22，图中表明统计学差异小于0.05； />表明统计学差异小于0.0001；ns代表不存在统计学差异）。
上述细胞实验基本证实了POB具有抑制缺氧情况下细胞线粒体膜电位下降，从而抑制细胞活性氧产生并减少过氧亚硝酸盐在细胞中聚集的作用。为了进一步证实我们的结果，我们使用小鼠心肌梗死模型并在术后1天后获取小鼠心脏，通过活性氧试剂盒和香豆素硼酸（一种过氧亚硝酸盐检测染料）在动物组织层面上对POB抗氧化应激和消除过氧亚硝酸盐的能力进行了再次验证，结果显示POB具有良好的抗心肌活性氧产生（图23）和抗过氧亚硝酸盐损伤的作用（图24）。
铁死亡是心肌梗死后早期由氧化应激损伤引起的主要损伤之一，其中过氧亚硝酸盐可以加重细胞中脂质成分过氧化水平从而加重铁死亡程度。为此我们首先使用脂质过氧化检测试剂盒对心肌梗死后小鼠组织中的过氧化脂质进行了检测，结果表明使用POB的小鼠心脏中脂质过氧化程度最低（图25，图中表明统计学差异小于0.05； />表明统计学差异小于0.0001），此外我们对铁死亡相关分子进行了检测，结果显示与铁死亡相关的抑制性分子转铁蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶4的水平显著上调，表明POB的确具有抑制铁死亡发生的作用（图26）。
7、POB可在原位释放一氧化氮。
基于合成POB的目的，我们希望构建一种使用便利的并可在损伤位置定向释放NO的药物。为此我们首先在细胞实验中验明了POB药物的细胞可及性，通过激光共聚焦显示，我们可以清晰的观察到荧光标记的POB药物可以进入细胞内部（图27，A：细胞骨架；B：POB；C：细胞核；D：合并）。随后我们采用尾静脉注射的方法，使用单剂量注射的方法，观察到荧光标记的药物可以定位在心脏梗死小鼠模型心脏的损伤区域（图28，图a至图d中虚线框内区域代表心梗区域；图e的心梗区域为图中箭头所指区域）。随后我们使用NO特异性荧光探针（DAF-FM DA 可在活性细胞中被代谢成无法透过细胞膜的化合物并发出明亮的荧光），并通过小动物活体成像仪检测了心梗小鼠的根死区域中的荧光强度，用以反映小鼠心肌梗死模型中梗死区域内的NO富集情况，结果显示，在使用了POB以后，小鼠梗死区域中的NO探针荧光强度显著增加，见图29，其中使用一氧化氮检测探针: 4-氨基-5-甲基氨基-2‘,7’-二氟荧光素二乙酸盐（DAF-FM-DA），上述结果表明POB可以直接进入梗死的区域中，并进入细胞中，并在细胞中释放NO，发挥原位NO释放的效果。
8、POB可促进梗死区域心脏血管重构和血流灌注。
NO是经典的维护血管稳态和促进血管重构的分子，为此我们通过microCT的方法观察了梗死区域血管的情况造影情况（图30-A），并通过取材切片后通过免疫荧光观察了小鼠梗死交界区的新生动脉数目（图30-B），结果显示，在使用POB后小鼠梗死的心脏的血管密度和管径大小均显著增加。
此外，我们使用荧光微球进行小鼠活体注射，在体内循环30分钟后收取小鼠心脏，通过切片可以观察到在使用POB的小鼠心肌组织中荧光微球的含量最为丰富，表明POB可以促进心梗小鼠后的血流灌注水平（图31）。
通过体内及体外实验，我们证实了POB可以通过改善心肌细胞氧化应激反应，维持线粒体膜电位，减少ROS产生并减少细胞凋亡； POB通过“拟eNOS”活性，释放OONO-free的NO分子，促进内皮细胞增殖、迁移，在缺血区域产生新生血管并促进功能性血管开放，维持梗死区域下游血供，综上发挥三重冠心病治疗作用。这种新纳米NO供体药物策略成功解决了目前NO供体药物存在的缺点，并纳米材料治疗其他临床疾病提供了新的视角。
9、POB可改善下肢缺血疾病的血管密度和血流灌注。
外周血管疾病是另一种常见的由于血管功能损害导致的下肢功能减退，生活受阻的缺血性疾病，为了明确是否POB可以可应用于外周缺血性疾病治疗，明确POB是否具有广谱的缺血性疾病治疗作用，我们使用小鼠股动脉结扎术模拟外周血管缺血性疾病，并通过血管造影和免疫荧光染色的方法评估了POB对于下肢血管新生的作用。首先我们观察到了POB组的在下肢结扎后的第28天其缺血区域中的血管密度显著高于其他组（图32）。
通过多普勒血流成像仪器对小鼠下肢的血流灌注水平进行连续观察，结果显示POB组的小鼠下肢血流灌注恢复速度及水平显著高于其他组（图33-34）。
综上，我们的实验结果证实了POB具有良好的细胞可及性可以清晰的定位在缺血损伤部位，并发挥原位NO释放的作用。此外我们构建的POB药物，可以长时程的停留在动物体内达到一个长效的药物覆盖作用。在功能上我们设计合成的POB可以在减少损伤部位氧化应激的同时释放NO，发挥促进缺血部位血管重构和血流恢复的作用，并能有效抑制长时间NO供给导致的过氧亚硝酸盐累积，抑制脂质过氧化导致的铁死亡作用。
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
虽然已经参考优选实施例对本申请进行了描述，但在不脱离本申请的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (9)
1.一种硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝为方形纳米粒子，所述方形纳米粒子的最大边长为60~80nm；
所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝的制备过程包括：S1、铁氰化钾与硝普钠以质量比为1:（1~9）的比例在反应溶液中反应得到硝普钠缀合的普鲁士蓝，其中，硝普钠嵌入普鲁士蓝的骨架结构中；S2、将胆绿素载入所述硝普钠缀合的普鲁士蓝中，形成硝普钠缀合的载药普鲁士蓝，其中，载药量为3~8.3%。
2.根据权利要求1所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，包括：将所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝溶于生理盐水中制成抗心肌缺血注射液，所述普钠缀合的载药普鲁士蓝的浓度为0.5~1.5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，所述硝普钠缀合的载药普鲁士蓝的制备过程包括如下步骤：
S1、将络合剂和氧化剂混合，作为反应溶液；
S2、将铁氰化钾与硝普钠以质量比为1:（1~9）的比例溶于S1所得反应溶液中，在50~100℃下反应，去杂和干燥后得到硝普钠缀合的普鲁士蓝；
S3、将硝普钠缀合的普鲁士蓝与胆绿素以质量比为（1~10）：1的比例在溶剂中溶解，在25~85℃下反应，去杂和干燥后得到硝普钠缀合的载药普鲁士蓝。
4.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S1中所述络合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、枸杞酸和马来酸中的一种或多种，所述络合剂在反应溶液中的浓度为0.05~0.10g/mL。
5.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S1中所述氧化剂包括过氧化氢、盐酸和硝酸中的一种或多种，所述氧化剂在反应溶液中的浓度为0.005~0.01mol/L。
6.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S2中，反应时间为10~16h。
7.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S2中，去杂包括离心洗涤5~8次，去除未反应杂质。
8.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S3中，反应时间为20~28h。
9.根据权利要求3所述的硝普钠缀合的载药普鲁士蓝在制备抗心肌缺血药物中的应用，其特征在于，步骤S3中，去杂包括离心洗涤3~5次，去除未反应杂质。
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