JP2019512486A - 官能化されたプルシアンブルーナノ粒子、組合せプルシアンブルーナノ粒子ベースのナノ免疫療法およびその適用 - Google Patents
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Abstract
プルシアンブルーナノ粒子と少なくとも1つの免疫療法処置の併用療法。アルカリ性条件下で増強された安定性を有するナノ粒子を含む安定で官能化されたプルシアンブルーナノ粒子、ならびに光熱処置および併用免疫療法処置を含む、プルシアンブルーナノ粒子を使用するがん、新生物、および腫瘍処置の方法。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる2016年3月8日出願の米国仮特許出願第62/305,253号の優先権を主張する。
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる2016年3月8日出願の米国仮特許出願第62/305,253号の優先権を主張する。
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる2014年3月14日出願の米国特許出願第14/213,380号、現在は米国特許出願公開第20140271487A1号、表題「PRUSSIAN BLUE−INSPIRED CONSTRUCTS FOR MULTIMODAL IMAGING AND THERAPY(マルチモーダルイメージングおよび療法のためのプルシアンブルー誘発構築物)」にも関連する。本明細書に引用される参考文献も、特に引用により参照される主題については参照により組み込まれる。
本発明は、免疫療法およびプルシアンブルーナノ粒子を利用する光熱療法の分野に属する。そのような併用療法の例は、プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートされ腫瘍および病原性微生物の抗原を標的にする抗原特異的T細胞の使用、神経芽細胞腫または他の種類のがん、腫瘍もしくは悪性腫瘍の処置のためのプルシアンブルー光熱療法と組み合わせた阻害剤、たとえば、MEK阻害剤またはチェックポイント阻害剤の使用を含む。本明細書で明らかにされるように、これらの療法を組み合わせれば、疾患の重症度を低減するのにより優れた驚くべき利点を提供する。
本明細書で提供される「背景」説明は、本開示の文脈を一般的に提示することを目的とする。現在名を挙げられている発明者の研究、それがこの背景の段落に記載される限り、ならびに提出時に他の点では先行技術としての資格がないことがある説明の側面は、明示または黙示を問わず、本開示に対する先行技術として認められていない。本発明の種々の側面および態様に関連する背景は、以下の段落および実施例において提供される。
本発明者らは、プルシアンブルーナノ粒子を安定化させ、神経芽細胞腫、他のがん、ならびに、免疫療法を用いた処置に適している他の疾患、障害または状態を処置する免疫療法と組み合わせて使用することが可能であることを本明細書で明らかにする。併用療法の1つの成分はプルシアンブルーナノ粒子であり、これは官能化してもよい。もう1つの成分は1つ以上の免疫療法剤、たとえば、免疫調節剤、たとえば、チェックポイント阻害剤、抗体、またはT細胞および他の免疫細胞を含む免疫療法剤である。本発明の特定の側面は、1つ以上の免疫療法剤およびその適用と組み合わせた多機能性セラノスティック(theranostic)プルシアンブルーナノ粒子からなる併用療法に向けられている。これらの併用療法は、ナノ免疫療法と呼ばれるが、2つの重要な成分:1)プルシアンブルーナノ粒子および2)少なくとも1つの免疫療法を含む。2つの療法は、同時に、逐次に(もう一方の前に1つを)、または2つの成分が互いに結合している(本明細書に記載されるコンジュゲーション技法を使用して)単一実体として投与することが可能である。
本発明のいくつかの態様に従ったプルシアンブルーナノ粒子はセラノスティックな特長を示す。これらの特長があるせいでナノ粒子は診断および治療用に同時に使用することができる。いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は:(1)小サイズ、たとえば、1〜400nmの範囲の直径、(2)ターゲティングリガンドのナノ粒子への結合を可能にする高表面積対体積比、(3)技法を使用して、たとえば、蛍光画像法もしくはMRIにより画像化もしくは視覚化される能力、(4)キャリーもしくは標的療法剤として機能する能力、たとえば、光熱療法剤としてのその使用、および/または(5)生物学的流体、たとえば、血液、血漿、組織液、リンパ液、CSF、等中で分解する能力を有することになる。
併用療法の第2の成分は1つ以上の免疫療法からなる。これらは、免疫応答を直接的にまたは間接的に調節するまたは影響を及ぼすことにより、たとえば、特定の細胞性、体液性、または他の免疫応答を抑制する、安定化する、誘導するまたは増強することにより、疾患を処置するように機能する。免疫療法の例は、免疫調節剤、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体、たとえば、抗CTLA−4、抗GD2を使用すること;または免疫細胞、たとえば、NK細胞もしくは抗原特異的T細胞の投与を含む。
本発明は、2つの別々であるが相乗的療法:療法、たとえば、プルシアンブルーナノ粒子を使用する光熱療法と少なくとも1つの免疫療法を組み合わせる。併用療法は、組合せ中の個別の療法よりも顕著に優れている処置成績を提供する。これらの優れた成績は2つの個別の療法の効果の加算としてだけでは説明できない。たとえば、併用療法は、併用療法の個別の成分を使用した場合のわずか12.5%生存および0%生存と比べて、侵襲性がんを有するマウスの55%での完全な腫瘍縮小および長期生存期間をもたらす。
本発明の種々の側面は、免疫療法と組み合わせたプルシアンブルーナノ粒子の組み合わせを使用する方法を含み、ナノ粒子はin vivoで投与された後に官能化され安定であってもよい。本発明のこれらのおよび他の側面は以下の開示および特許請求の範囲においてさらに詳細に説明される。
定義
「プルシアンブルー粒子(複数可)またはナノ粒子(複数可)」とは、好ましくは、光熱療法中対象への投与に適している量および形態でプルシアンブルーを含有する粒子のことである。この定義は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2014/0271487号により記載されるプルシアンブルー組成物を含むがこれらに限定されない。
「プルシアンブルー粒子(複数可)またはナノ粒子(複数可)」とは、好ましくは、光熱療法中対象への投与に適している量および形態でプルシアンブルーを含有する粒子のことである。この定義は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2014/0271487号により記載されるプルシアンブルー組成物を含むがこれらに限定されない。
これらの粒子は、化学式:AxByMz[M’(CN6]a・n(H2O)(式中、Aは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;Bは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;Mは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;M’は、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;xは、0.1〜約1であり;yは、0〜約1であり;zは、0.1〜約4であり;aは、0.1〜約4であり;nは、0.1〜約24である)成分を含有していてもよい。
これらの粒子は好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000または10,000nmを含む、約1ナノメートル〜約10ミクロンまたはこの範囲内の任意の中間値の範囲の平均直径を有する。
有利なことに、これらの粒子は、光熱変換過程または他の機構により、約600、700、800、900、1,000、1,100〜約1,200nm(ならびにこの範囲内のすべての中間値)の範囲の波長でのピーク光子吸収を示す。ナノ粒子は好ましくは、約600、700、800、900、1,000、1,100〜約1,200nm(ならびにこの範囲内のすべての中間値)の範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量は約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90〜約100℃ならびにこの範囲内のすべての中間値の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす。プルシアンブルーナノ粒子は、約0.1%〜約90%の範囲の光熱変換効率で、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換してもよい。
いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解、たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている。いくつかの態様では、配合されたまたは被覆されたナノ粒子は、血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間;および/またはナノ粒子が前記標的細胞に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間;および/またはナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分が分解されにくくなる。
プルシアンブルーナノ粒子は、血液、血漿、リンパ液または他の体液もしくは成分中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を有していてもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、ナノシェル、リポソーム、ミセル、もしくはリポソーム様合成粒子を含有するまたはこれらの形態でもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、コーティング、たとえば、生分解性、生体保護性(bioprotective)、持続性もしくは徐放性コーティング、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングを含んでいてもよい。保護層は、任意で、pH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、あるいは血液、血漿もしくはリンパ液中でまたはわずかにアルカリ性の生理的溶液中で安定であるように処方してもよい。
例となるコーティングは、ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−970、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウム塩(AOT)、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム塩(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTMA−Cl)、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、臭化デシルトリメチルアンモニウム(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む1つ以上のコーティングを含むがこれらに限定されない。
プルシアンブルーナノ粒子は、他の成分、たとえば、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤または他の活性(たとえば、薬物または生物学的に活性な薬剤)もしくは不活性成分を含有していてもよい。
プルシアンブルーナノ粒子は、ターゲティング薬剤、たとえば、T細胞または他の免疫細胞にコンジュゲートしている、または他の方法で結合もしくは会合していてもよく、あるいは細胞(たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に)、組織または他の解剖学的部位にターゲティングする少なくとも1つの薬剤に配合または被覆されていてもよい。ターゲティング薬剤は、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、または薬剤、たとえば、標的細胞、組織もしくは解剖学的部位上に天然に存在しているもしくは位置している相補的部分に結合するビオチン、(ストレプト)アビジン、もしくは他の成分を含む。いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は、二または多機能性であり、がん、新生物もしくは腫瘍細胞、または他の標的細胞、組織もしくは解剖学的部位に、あるいは標的細胞、組織もしくは部位の成分またはそこから放出される物質に結合する少なくとも1つの部分をさらに含有することが可能である。ターゲティング薬剤は、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的な天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、標的細胞中へのナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤を含有していてもよい。
「免疫細胞」は、リンパ球、たとえば、TおよびBリンパ球、ガンマ−デルタT細胞、およびNK細胞を含むがこれらに限定されず、これらの細胞は特定の抗原、たとえば、プリオン、ウイルス、細菌、酵母、真菌、寄生虫、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原、または特定の疾患、障害もしくは状態に関連する他の抗原を認識してもよい。他の免疫細胞は白血球を含むが、これは顆粒球でも無顆粒白血球(agranulocytes)でもよい。免疫細胞の例は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球およびマクロファージを含む。樹状細胞、ミクログリア、および他の抗原提示細胞もこの定義に含まれる。免疫細胞は、プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートされたもしくは組み合わされた養子療法(adoptive therapy)で使用するまたはプルシアンブルーナノ粒子の前に、同時に、もしくは後で投与してもよい。
「免疫療法」は、免疫系成分により、たとえば、抗体もしくは免疫細胞により、または免疫系を刺激する、阻害するもしくは他の方法で調節する薬物もしくは他の薬剤により媒介される療法を含む。これらは、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する、免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系に影響を及ぼす免疫調節剤、薬物または物質を含む。免疫調節剤、薬物または他の物質は、プルシアンブルーナノ粒子に結合している、組み込まれている、または他の方法で会合していてもよい。
免疫療法は、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスMarch 7,2017)またはhttps://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスMarch 7,2017)に記載されているケモカインおよびサイトカインを含む1つ以上のケモカインまたはサイトカインの投与を含んでいてもよく、これらの情報は両方とも参照により組み込まれる。免疫療法は、チェックポイント阻害剤を含むがこれに限定されない抗体媒介療法も含んでいてよい。そのような抗体は、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、および/または抗CD52抗体を含んでいてもよい。
「併用免疫療法」とは、本明細書に記載されるプルシアンブルーナノ粒子を用いた処置と少なくとも1つの免疫療法の組合せのことである。そのような併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象(複数可)と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減してもよく、あるいは、そのような併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象(複数可)の生存率と比べて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、もしくは60ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く平均生存期間を増やす。他の非腫瘍疾患、障害または状態の進行または症状の類似の低減は、持続性または再発性感染症を含む、非腫瘍疾患、障害または状態に向けられた併用免疫療法から生じてもよい。そのような非癌性状態は、異常な細胞増殖にまたはプリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母、もしくは寄生虫による感染に関連している過形成、疣贅、または他の状態を含む。
併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減してもよい。他の非腫瘍疾患、障害または状態の再発またはぶり返しの類似の低減は、持続性または再発性感染症を含む、非腫瘍疾患、障害または状態に向けられた併用免疫療法から生じてもよい。そのような非癌性状態は、異常な細胞増殖にまたはプリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母、もしくは寄生虫による感染に関連している過形成、疣贅、または他の状態を含む。
併用免疫療法は、プルシアンブルーナノ粒子を用いた処置とGaluzzi,et al.,Classification of current anticancer immunotherapies,Oncotarget 5(24):12472−12508(2014)により記載される免疫療法のうちの1つ以上を含んでいてもよく、前記文献は参照によりその全体を組み込まれる。
「チェックポイント阻害剤」は、抗CTLA−4チェックポイント阻害を含むがこれに限定されず、PD−1およびPD−L1の阻害剤を含む。そのような阻害剤の例は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびアテゾリズマブを含む。免疫チェックポイントの調節は、免疫系機能に影響を及ぼし、刺激性でも阻害性でも可能である。
「MEK阻害剤」は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素MEK1および/またはMEK2を阻害する化学物質または薬物である。これらはPD901、トラメチニブ(GSK1120212)、コビメチニブまたはXL518、ビニメチニブ(Binimetinib)(MEK162、ARRY−162)、およびセルメチニブを含むがこれらに限定されない。
「がん、新生物、腫瘍、または悪性腫瘍」は、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を含むがこれらに限定されない。
実施例で使用されるようにおよび他の方法ではっきりと明記されていない場合を含む、ここの明細書および特許請求の範囲で使用されているように、すべての数字は、用語「実質的に」、「約」または「おおよそ」が、たとえその用語がはっきりと表れていなくとも、前置きされているかのように読んでよい。語句「約」または「おおよそ」は、記載されている値および/または位置が値および/または位置の妥当な予想範囲内であることを示すために大きさおよび/または位置を記載する場合に使用してもよい。たとえば、数値は、表示値(または値域)の+/−0.1%、表示値(または値域)の+/−1%、表示値(または値域)の+/−2%、表示値(または値域)の+/−5%、表示値(または値域)の+/−10%、表示値(または値域)の+/−15%、表示値(または値域)の+/−20%、等である値を有していてもよい。本明細書で列挙される任意の数値域は、その中に包含される全てのサブレンジを含むことが意図されている。
用語「生体適合性の」とは、対象にとって実質的に無毒性である物質のことである。本明細書に記載されるように、「生体適合性の」が生物学的に適合する試料または移植片に関連して使用される場合、「生体適合性の」とは、患者に移植されその患者にとって無毒性である人工的なまたは外来性の試料または移植片のことである。本発明の大半の態様では、生体適合性のプルシアンブルーおよび免疫療法成分の使用を必要とする。
「生分解性の」は一般に、可溶性種にまで腐食するまたはそれ自体対象にとって無毒性(生体適合性)であり、対象が代謝する、排出する、または排泄することができるもっと小さな単位または化学種にまで生理的条件下で分解する材料と本明細書では呼ばれる。いくつかの態様では、本発明に従った組織は生分解性材料に接触している、または組織の上にもしくは中にこの材料を組み込んでいていてもよい。本発明の大半の態様では、生分解性のプルシアンブルーおよび免疫療法成分の使用を必要とする。
投与様式。併用療法はいかなる適切な適用様式によっても、たとえば、静脈内に(i.v.)、腹腔内に(i.p.)、筋肉内に(i.m.)、鼻腔内に、経口的に、皮下に(s.c.)、腫瘍内に、インサイチューに(たとえば、直視下手術部位に)、等、およびいかなる適切な送達デバイスで投与してもよい(O’Hagan et al.,Nature Reviews,Drug Discovery 2(9),(2003),727−735)。プルシアンブルーおよび免疫療法成分は、同じまたは異なる様式で投与してもよく、たとえば、プルシアンブルーナノ粒子は標的部位に注射し免疫療法免疫細胞または抗体は静脈内に投与してもよい。それぞれの製剤を入手するための手段および方法は当業者には公知である(たとえば、“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”,Sarfaraz Niazi,CRC Press Inc,2004参照)。
光/照射源/レーザー。当業者であれば光熱療法のための適切な照射源を選択することが可能である。そのような源の例は、約700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2000nm波長に及び、出力が約0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4〜5W/cm2の範囲のNIRレーザーまたはその等価物である。これらの範囲は中間の値およびサブレンジをすべて含む。
特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上」にあると呼ばれる場合、特徴もしくは要素はもう一方の特徴もしくは要素上に直に存在することが可能でありまたは介在する特徴および/もしくは要素が存在していてもよい。これとは対照的に、特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上に直に」あると呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。特徴または要素が別の特徴または要素に「接続」、「結合」または「連結」していると呼ばれる場合、特徴または要素はもう一方の特徴または要素に直接的に接続、結合または連結していることが可能であり、または介在する特徴もしくは要素が存在していてもよいことも理解されるであろう。これとは対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接的に接続」、「直接的に結合」または「直接的に連結」していると呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。1つの態様に関して記載されているまたは示されているが、そのように記載されているまたは示されている特徴および要素は他の態様に適用することが可能である。別の特徴に「隣接して」配置されている構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するまたはその下にある部分を有してもよいことも当業者であれば認識するであろう。
本発明の非限定的な態様は、以下の組成物および方法を含む。
態様
1.対象を処置するための組合せ方法であって、
(i)プルシアンブルーナノ粒子、ナノ粒子を含有する組成物、またはナノ粒子を含む細胞をそれを必要とする対象に投与すること、および
(ii)対象を光熱的に処置すること、および
(iii)対象を少なくとも1つの他の免疫療法で処置することを含み、任意で、前記方法が、プルシアンブルーナノ粒子を含む抗原特異的T細胞を投与することを含む、組合せ方法。
2.プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーを含む、態様1に記載の組合せ方法。
3.プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーから本質的になる、態様1または2のいずれか1つに記載の組合せ方法。
4.プルシアンブルーナノ粒子が、プルシアンブルーを前記光熱処置に関与させるのに十分な量でプルシアンブルーを含む、態様1から3のいずれか1つに記載の組合せ方法。
5.プルシアンブルーが、化学式:
AxByMz[M’(CN6]a・n(H2O)
(式中、
Aは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Bは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Mは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
M’は、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
xは、0.1〜約1であり;
yは、0〜約1であり;
zは、0.1〜約4であり;
aは、0.1〜約4であり;
nは、0.1〜約24である)
を有する化合物または組成物を含む、から本質的になる、またはからなる、態様1から4のいずれか1つに記載の組合せ方法。
6.プルシアンブルー成分が、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2014/0271487号により開示されるプルシアンブルー化合物のうちのいずれか1つ以上を含む、から本質的になる、またはからなる、態様1から5のいずれか1つに記載の組合せ方法。
7.ナノ粒子が、約1ナノメートル〜約10ミクロンの範囲の平均直径を有する、態様1から6のいずれか1つに記載の組合せ方法。
8.ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示す、態様1から7のいずれか1つに記載の組合せ方法。
9.ナノ粒子が、光熱変換過程または他の機構により、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様1から8のいずれか1つに記載の組合せ方法。
10.ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量が0.1〜100℃の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす、態様1から9のいずれか1つに記載の組合せ方法。
11.ナノ粒子が、約0.1%〜約90%の範囲の光熱変換効率で、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様1から10のいずれか1つに記載の組合せ方法。
12.ナノ粒子が、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、態様1から11のいずれか1つに記載の組合せ方法。
13.ナノ粒子が、血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様1から12のいずれか1つに記載の組合せ方法。本明細書に記載される方法は、組織の外科的除去、組織の外科的曝露、または光熱効果を誘導する放射線へのもしくは免疫療法で使用される薬剤への標的組織の曝露を促進する他の技法と併せて実行してもよい。
14.ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、態様1から13のいずれか1つに記載の組合せ方法。
15.ナノ粒子が、ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様1から14のいずれか1つに記載の組合せ方法。
16.ナノ粒子が、コーティングを含む、態様1から15のいずれか1つに記載の組合せ方法。
17.ナノ粒子が、ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−970、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩(AOT)、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)、セチルトリメチルアンモニウム塩化物(CTMA−Cl)、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、デシルトリメチルアンモニウム臭化物(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様1から16のいずれか1つに記載の組合せ方法。
18.ナノ粒子が、好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、態様1から17のいずれか1つに記載の組合せ方法。
19.ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、態様1から18のいずれか1つに記載の組合せ方法。
20.ナノ粒子が、血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングをさらに含む、態様1から19のいずれか1つに記載の組合せ方法。
21.ナノ粒子が、ナノ粒子を細胞に(たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に)ターゲティングする少なくとも1つの薬剤、たとえば、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、またはたとえば、ビオチン、(ストレプト)アビジン、もしくは標的細胞上に天然に存在するもしくは位置する相補的部分に結合する他の成分をさらに含む、態様1から20のいずれか1つに記載の組合せ方法。
22.ナノ粒子が二機能性または多機能性であり、前記ナノ粒子が、
光熱療法に適した波長で、たとえば、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示し、および/または
腫瘍、がん、悪性、もしくは新生物細胞もしくは他の標的細胞に特異的に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれる、および/または
免疫系の細胞成分に、たとえば、T細胞もしくはマクロファージに特異的に結合する、および/または
前記ナノ粒子が投与される対象の免疫系の少なくとも1つの成分と、たとえば、T細胞もしくはマクロファージと相互作用する少なくとも1つの受容体、リガンドもしくは他の部分を含む、態様1から21のいずれか1つに記載の組合せ方法。
23.ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、がん、新生物もしくは腫瘍細胞に、または他の標的細胞に、または標的細胞の成分、もしくはこれから放出される物質に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい、態様1から22のいずれか1つに記載の組合せ方法。
24.ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、非悪性細胞または血小板、たとえば、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマーまたは標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよく、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または非悪性細胞もしくは血小板上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよい、態様1から23のいずれか1つに記載の組合せ方法。
25.プルシアンブルーナノ粒子が、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、TNF、もしくは他のサイトカイン、抗体もしくは抗体断片、アプタマー、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または免疫細胞(T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞を含むがこれらに限定されない)を含むがこれらに限定されない、宿主免疫系と相互作用する1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤、たとえば、標的細胞に影響を及ぼす免疫応答を誘導または促進する、たとえば、がん、悪性、新生物、もしくは腫瘍細胞の成長、転移を阻害する、もしくは破壊する免疫療法応答を誘導する免疫調節剤をさらに含む、態様1から24のいずれか1つに記載の組合せ方法。
26.プルシアンブルーナノ粒子が、標的細胞中へのナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する、1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤をさらに含む、態様1から25のいずれか1つに記載の組合せ方法。
27.少なくとも1つの他の免疫療法が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する少なくとも1つの免疫調節剤、薬物、または物質で対象を処置することを含み、任意で、前記少なくとも1つの他の免疫療法が、ナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合している、免疫調節剤、薬物または物質により媒介されてもよい、態様1から26のいずれか1つに記載の組合せ方法。
28.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのケモカインまたは他のサイトカインで対象を処置することを含む、態様1から27のいずれか1つに記載の組合せ方法。
29.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのコロニー刺激因子で対象を処置することを含む、態様1から28のいずれか1つに記載の組合せ方法。
30.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターフェロンで対象を処置することを含む、態様1から29のいずれか1つに記載の組合せ方法。
31.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターロイキンで対象を処置することを含む、態様1から30のいずれか1つに記載の組合せ方法。
32.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのTNFまたは他のアポトーシス誘導サイトカインで対象を処置することを含む、態様1から31のいずれか1つに記載の組合せ方法。
33.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つの抗体または抗体断片、たとえば、腫瘍もしくはがん関連抗原に結合する抗体、またはたとえば、がん、新生物もしくは腫瘍に対する免疫応答を調節する抗体で対象を処置することを含む、態様1から32のいずれか1つに記載の組合せ方法。
34.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのアプタマー、センスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドで対象を処置することを含む、態様1から33のいずれか1つに記載の組合せ方法。
35.少なくとも1つの他の免疫療法が、細胞、たとえば、自家性または組織適合免疫細胞で対象を処置することを含む、態様1から34のいずれか1つに記載の組合せ方法。
36.少なくとも1つの他の免疫療法が、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞で対象を処置することを含む、態様1から35のいずれか1つに記載の組合せ方法。
37.少なくとも1つの他の免疫療法が、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、抗CD52)、チェックポイント阻害剤、または生物学的製剤(たとえば、必ずしもプルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしていない抗原特異的T細胞または抗原提示細胞)からなる群から選択される少なくとも1つ以上の薬剤で対象を処置することを含み、前記薬剤は、任意で前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合によって結合しているまたは会合しており、前記ケモカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインから選択してもよく、前記サイトカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインから選択してもよい、態様1から37のいずれか1つに記載の組合せ方法。
38.少なくとも1つの他の免疫療法が、その全体が参照により組み込まれる、Galuzzi,et al.,Classification of current anticancer immunotherapies,Oncotarget 5(24):12472−12508(2014)により記載される免疫療法の群から選択される免疫療法で対象を処置することを含む、態様1から37のいずれか1つに記載の組合せ方法。
39.ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減する、あるいは、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象(複数可)の生存率と比べて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、もしくは60ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、平均生存期間を増やす、態様1から38のいずれか1つに記載の組合せ方法。
40.ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減する、態様1から39のいずれか1つに記載の組合せ方法。
41.前記対象が、がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍、または過形成、疣贅、もしくは異常な細胞増殖に関連している他の状態を有する、あるいはウイルス、細菌、真菌、酵母、または寄生虫に感染している、態様1から40のいずれか1つに記載の組合せ方法。
42.前記対象が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を有する、態様1から41のいずれか1つに記載の組合せ方法。
43.前記対象が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がんを有する、態様1から42のいずれか1つに記載の組合せ方法。
44.前記対象が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がんを有する、態様1から43のいずれか1つに記載の組合せ方法。
45.前記対象が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア(hemihyperplasia)、乳房過形成(hyperplasia of the breast)、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成(compensatory liver hyperplasia)を有する、態様1から44のいずれか1つに記載の組合せ方法。
46.対象が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、または寄生虫感染を有する、態様1から45のいずれか1つに記載の組合せ方法。
47.プルシアンブルーナノ粒子および態様1のいずれか1つに記載の免疫療法を実施するのに適した少なくとも1つの免疫療法剤を含む組成物であって、前記免疫療法剤が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する免疫調節剤、薬物、または物質であり、前記免疫療法剤がプルシアンブルーナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合していてもよい、組成物。
48.プルシアンブルーナノ粒子と組み合わせて細胞または血小板を含む、態様1から46のいずれか1つに記載の方法を実施するのに適した組成物であって、前記細胞が、任意で、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、および樹状細胞からなる群から選択され、標的細胞、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞と選択的に相互作用する、認識する、または結合する、組成物。
49.プルシアンブルーナノ粒子および態様1から46のいずれか1つに記載の免疫療法を実施するための少なくとも1つの免疫療法剤を含むキットであって、任意で、ナノ粒子および免疫療法成分を投与するための、印刷された、コンピュータ可読のまたはリンクアドレスされた(link-addressed)説明書、たとえば、投与量、投与経路、レジメン、および投与部位を含んでもよく、ナノ粒子および免疫療法成分を組み合わせた形態で、または異なる容器中の別々の成分として含有していてもよく、そのような成分は乾燥したまたは濃縮された形態で存在し、適切な復元用媒体、緩衝剤または生理的希釈剤を伴っていてもよい、キット。
50.標的細胞に対して、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞に対して少なくとも1つの免疫療法作用を示す、または示すように操作もしくは処理されているプルシアンブルーナノ粒子を含み、それと共有結合または非共有結合によって会合している細胞。
51.生細胞、不活化非増殖性細胞(たとえば、放射線または化学剤により処理されている細胞)または死んだもしくは断片化した細胞である、態様50に記載の細胞。
52.悪性細胞または他の標的細胞である、態様50から51のいずれか1つに記載の細胞。
53.非悪性細胞、たとえば、免疫細胞または少なくとも1つのがん、新生物または腫瘍エピトープを特異的に認識する細胞である、態様50から52のいずれか1つに記載の細胞。
54.幹細胞、臍帯血細胞、または他の免疫的無感作細胞(immunologically naive cell)である、態様50から53のいずれか1つに記載の細胞。
55.少なくとも1種のヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、態様50から54のいずれか1つに記載の細胞。
56.ペプチド抗原(複数可)をパルスされているまたは曝露されている、自家性、同種、異種または合成抗原提示細胞に、たとえば、がん、新生物または腫瘍の1つ以上の抗原または病原体の1つ以上の抗原または1つ以上の自己抗原を表すオーバーラップペプチドライブラリーに曝露することにより刺激されている少なくとも1つのヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、態様50から55のいずれか1つに記載の細胞。
57.T細胞(細胞傷害性、ヘルパー、デルタ−ガンマ、およびNK細胞型を含む)、プレT細胞またはT細胞前駆細胞である、態様50から56のいずれか1つに記載の細胞。
58.マクロファージまたは単球である、態様50から57のいずれか1つに記載の細胞。
59.B細胞である、態様50から58のいずれか1つに記載の細胞。
60.好中球、好酸球、好塩基球または他の白血球である、態様50から59のいずれか1つに記載の細胞。
61.がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープ、あるいは過形成、疣贅、異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から60のいずれか1つに記載の細胞。
62.副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から61のいずれか1つに記載の細胞。
63.白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から62のいずれか1つに記載の細胞。
64.神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん
由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から63のいずれか1つに記載の細胞。
65.良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から64のいずれか1つに記載の細胞。
66.ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様50から65のいずれか1つに記載の細胞。
67.ナノ粒子を細胞に結合させる部分をさらに含み、前記部分がビオチンまたは(ストレプト)アビジンであり、ナノ粒子がそれぞれ(ストレプト)アビジンまたはビオチンを含む、態様50から66のいずれか1つに記載の細胞。
68.前記細胞に結合する部分および標的細胞に結合する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性ナノ粒子を含む、態様50から67のいずれか1つに記載の細胞。
69.少なくとも1つの検出可能マーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様50から68のいずれか1つに記載の細胞。
70.少なくとも1つ以上の非細胞性薬剤に共有結合または非共有結合によって会合しているプルシアンブルーナノ粒子を含むコンジュゲートであって、
前記非細胞性薬剤が、任意で、分子、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、酵素、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ポリエチレングリコール、一本鎖ポリマー、フラーレン;高次分子構造体、たとえば、四次タンパク質構造体、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様粒子、またはカプシド;架橋ポリマー、凝集体、ナノ粒子(金、銀、ニッケル、鉄、銅、亜鉛、またはその酸化物およびセラミックを含むナノ粒子;シリカナノ粒子;磁性ナノ粒子;放射性ナノ粒子;細胞傷害性ナノ粒子;重合体ミセルナノ粒子;ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子;タンパク質充填ナノ粒子、セリウム酸化物ナノ粒子;ならびに任意でタンパク質分子または化学療法剤に結合しているナノダイアモンドを含む)、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、または他の非細胞性構造物を含んでいてもよく;
前記コンジュゲートが標的細胞上で少なくとも1つの免疫療法作用を示す、たとえば、がん、悪性、新生物、または腫瘍細胞の成長、転移、代謝、アポトーシス、または増殖を阻害する、コンジュゲート。
71.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上の少なくとも1つ以上の決定基に結合する、態様70に記載のコンジュゲート。
72.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上または標的細胞周辺の免疫細胞上の少なくとも1つ以上の受容体と相互作用する、態様70または71に記載のコンジュゲート。
73.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、二機能性または多機能性であり、プルシアンブルーナノ粒子と標的細胞の両方に結合することができ、または標的細胞上と標的細胞に隣接する免疫細胞上の両方の決定基に結合することができる、態様70、71または72に記載のコンジュゲート。
74.非細胞性薬剤が、ケモカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインのうちのいずれかを含む、態様70から73のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
75.非細胞性薬剤が、サイトカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインのうちのいずれかを含む、態様70から74のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
76.非細胞性薬剤が、オリゴデオキシヌクレオチド、たとえば、標的細胞にまたはその成分に結合するアプタマー、核酸ベクターまたは構築物、センスまたはアンチセンスDNAまたはsi−RNAを含むRNAを含む、態様70から75のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
77.非細胞性薬剤が、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、および抗CD52)、二特異性抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合部分、または抗体のCDR;特に標的細胞または標的細胞特異的抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体または抗体成分あるいは標的細胞上または標的細胞近傍の細胞上の受容体と特異的に相互作用する抗体または抗体成分を含む、態様70から76のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
78.非細胞性薬剤がチェックポイント阻害剤である、態様70から77のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
79.非細胞性薬剤が、少なくとも1つのがん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞、抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様70から78のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
80.非細胞性薬剤が、過形成、疣贅、または異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしく寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに由来する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様70から79のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
81.非細胞性薬剤が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍または関連する状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から80のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
82.非細胞性薬剤が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から81のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
83.非細胞性薬剤が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から82のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
84.非細胞性薬剤が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から83のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
85.ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様70から84のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
86.プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が共有結合している、態様70から85のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
87.プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が、たとえば、ナノ粒子上のビオチンまたは(ストレプト)アビジンの非細胞性薬剤上の(ストレプト)アビジンまたはビオチンへのそれぞれの結合を介して、非共有結合している、態様70から86のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
88.非細胞性薬剤が、二機能性であり、前記非細胞性薬剤に結合する部分および標的細胞に結合するまたは相互作用する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性プルシアンブルーナノ粒子を含む細胞を認識するまたは相互作用する、態様70から87のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
89.抗がん剤、毒素または放射性薬剤を含むがこれらの限定されない、少なくとも1つの検出可能なマーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様70から88のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
90.被覆され、配合されまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、プルシアンブルーナノ粒子。
91.血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様90に記載のナノ粒子。
92.血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、態様90または91に記載のナノ粒子。
93.ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様90、91または92に記載のナノ粒子。
94.コーティングを含む、態様90から93のいずれか1つに記載のナノ粒子。
95.ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−990、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩(AOT)、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)、セチルトリメチルアンモニウム塩化物(CTMA−Cl)、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、デシルトリメチルアンモニウム臭化物(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様90から94のいずれか1つに記載のナノ粒子。
96.好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、態様90から95のいずれか1つに記載のナノ粒子。
97.血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、態様90から96のいずれか1つに記載のナノ粒子。
98.血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングを含む、態様90から97のいずれか1つに記載のナノ粒子。
99.態様90から98のいずれか1つに記載のナノ粒子を投与することを含む、光熱療法または組み合わされた光熱と免疫療法を必要とする対象を処置するための方法。
1.対象を処置するための組合せ方法であって、
(i)プルシアンブルーナノ粒子、ナノ粒子を含有する組成物、またはナノ粒子を含む細胞をそれを必要とする対象に投与すること、および
(ii)対象を光熱的に処置すること、および
(iii)対象を少なくとも1つの他の免疫療法で処置することを含み、任意で、前記方法が、プルシアンブルーナノ粒子を含む抗原特異的T細胞を投与することを含む、組合せ方法。
2.プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーを含む、態様1に記載の組合せ方法。
3.プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーから本質的になる、態様1または2のいずれか1つに記載の組合せ方法。
4.プルシアンブルーナノ粒子が、プルシアンブルーを前記光熱処置に関与させるのに十分な量でプルシアンブルーを含む、態様1から3のいずれか1つに記載の組合せ方法。
5.プルシアンブルーが、化学式:
AxByMz[M’(CN6]a・n(H2O)
(式中、
Aは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Bは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Mは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
M’は、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
xは、0.1〜約1であり;
yは、0〜約1であり;
zは、0.1〜約4であり;
aは、0.1〜約4であり;
nは、0.1〜約24である)
を有する化合物または組成物を含む、から本質的になる、またはからなる、態様1から4のいずれか1つに記載の組合せ方法。
6.プルシアンブルー成分が、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2014/0271487号により開示されるプルシアンブルー化合物のうちのいずれか1つ以上を含む、から本質的になる、またはからなる、態様1から5のいずれか1つに記載の組合せ方法。
7.ナノ粒子が、約1ナノメートル〜約10ミクロンの範囲の平均直径を有する、態様1から6のいずれか1つに記載の組合せ方法。
8.ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示す、態様1から7のいずれか1つに記載の組合せ方法。
9.ナノ粒子が、光熱変換過程または他の機構により、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様1から8のいずれか1つに記載の組合せ方法。
10.ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量が0.1〜100℃の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす、態様1から9のいずれか1つに記載の組合せ方法。
11.ナノ粒子が、約0.1%〜約90%の範囲の光熱変換効率で、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様1から10のいずれか1つに記載の組合せ方法。
12.ナノ粒子が、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、態様1から11のいずれか1つに記載の組合せ方法。
13.ナノ粒子が、血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様1から12のいずれか1つに記載の組合せ方法。本明細書に記載される方法は、組織の外科的除去、組織の外科的曝露、または光熱効果を誘導する放射線へのもしくは免疫療法で使用される薬剤への標的組織の曝露を促進する他の技法と併せて実行してもよい。
14.ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、態様1から13のいずれか1つに記載の組合せ方法。
15.ナノ粒子が、ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様1から14のいずれか1つに記載の組合せ方法。
16.ナノ粒子が、コーティングを含む、態様1から15のいずれか1つに記載の組合せ方法。
17.ナノ粒子が、ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−970、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩(AOT)、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)、セチルトリメチルアンモニウム塩化物(CTMA−Cl)、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、デシルトリメチルアンモニウム臭化物(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様1から16のいずれか1つに記載の組合せ方法。
18.ナノ粒子が、好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、態様1から17のいずれか1つに記載の組合せ方法。
19.ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、態様1から18のいずれか1つに記載の組合せ方法。
20.ナノ粒子が、血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングをさらに含む、態様1から19のいずれか1つに記載の組合せ方法。
21.ナノ粒子が、ナノ粒子を細胞に(たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に)ターゲティングする少なくとも1つの薬剤、たとえば、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、またはたとえば、ビオチン、(ストレプト)アビジン、もしくは標的細胞上に天然に存在するもしくは位置する相補的部分に結合する他の成分をさらに含む、態様1から20のいずれか1つに記載の組合せ方法。
22.ナノ粒子が二機能性または多機能性であり、前記ナノ粒子が、
光熱療法に適した波長で、たとえば、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示し、および/または
腫瘍、がん、悪性、もしくは新生物細胞もしくは他の標的細胞に特異的に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれる、および/または
免疫系の細胞成分に、たとえば、T細胞もしくはマクロファージに特異的に結合する、および/または
前記ナノ粒子が投与される対象の免疫系の少なくとも1つの成分と、たとえば、T細胞もしくはマクロファージと相互作用する少なくとも1つの受容体、リガンドもしくは他の部分を含む、態様1から21のいずれか1つに記載の組合せ方法。
23.ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、がん、新生物もしくは腫瘍細胞に、または他の標的細胞に、または標的細胞の成分、もしくはこれから放出される物質に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい、態様1から22のいずれか1つに記載の組合せ方法。
24.ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、非悪性細胞または血小板、たとえば、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマーまたは標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよく、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または非悪性細胞もしくは血小板上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよい、態様1から23のいずれか1つに記載の組合せ方法。
25.プルシアンブルーナノ粒子が、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、TNF、もしくは他のサイトカイン、抗体もしくは抗体断片、アプタマー、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または免疫細胞(T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞を含むがこれらに限定されない)を含むがこれらに限定されない、宿主免疫系と相互作用する1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤、たとえば、標的細胞に影響を及ぼす免疫応答を誘導または促進する、たとえば、がん、悪性、新生物、もしくは腫瘍細胞の成長、転移を阻害する、もしくは破壊する免疫療法応答を誘導する免疫調節剤をさらに含む、態様1から24のいずれか1つに記載の組合せ方法。
26.プルシアンブルーナノ粒子が、標的細胞中へのナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する、1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤をさらに含む、態様1から25のいずれか1つに記載の組合せ方法。
27.少なくとも1つの他の免疫療法が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する少なくとも1つの免疫調節剤、薬物、または物質で対象を処置することを含み、任意で、前記少なくとも1つの他の免疫療法が、ナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合している、免疫調節剤、薬物または物質により媒介されてもよい、態様1から26のいずれか1つに記載の組合せ方法。
28.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのケモカインまたは他のサイトカインで対象を処置することを含む、態様1から27のいずれか1つに記載の組合せ方法。
29.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのコロニー刺激因子で対象を処置することを含む、態様1から28のいずれか1つに記載の組合せ方法。
30.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターフェロンで対象を処置することを含む、態様1から29のいずれか1つに記載の組合せ方法。
31.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターロイキンで対象を処置することを含む、態様1から30のいずれか1つに記載の組合せ方法。
32.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのTNFまたは他のアポトーシス誘導サイトカインで対象を処置することを含む、態様1から31のいずれか1つに記載の組合せ方法。
33.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つの抗体または抗体断片、たとえば、腫瘍もしくはがん関連抗原に結合する抗体、またはたとえば、がん、新生物もしくは腫瘍に対する免疫応答を調節する抗体で対象を処置することを含む、態様1から32のいずれか1つに記載の組合せ方法。
34.少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのアプタマー、センスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドで対象を処置することを含む、態様1から33のいずれか1つに記載の組合せ方法。
35.少なくとも1つの他の免疫療法が、細胞、たとえば、自家性または組織適合免疫細胞で対象を処置することを含む、態様1から34のいずれか1つに記載の組合せ方法。
36.少なくとも1つの他の免疫療法が、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞で対象を処置することを含む、態様1から35のいずれか1つに記載の組合せ方法。
37.少なくとも1つの他の免疫療法が、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、抗CD52)、チェックポイント阻害剤、または生物学的製剤(たとえば、必ずしもプルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしていない抗原特異的T細胞または抗原提示細胞)からなる群から選択される少なくとも1つ以上の薬剤で対象を処置することを含み、前記薬剤は、任意で前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合によって結合しているまたは会合しており、前記ケモカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインから選択してもよく、前記サイトカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインから選択してもよい、態様1から37のいずれか1つに記載の組合せ方法。
38.少なくとも1つの他の免疫療法が、その全体が参照により組み込まれる、Galuzzi,et al.,Classification of current anticancer immunotherapies,Oncotarget 5(24):12472−12508(2014)により記載される免疫療法の群から選択される免疫療法で対象を処置することを含む、態様1から37のいずれか1つに記載の組合せ方法。
39.ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減する、あるいは、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象(複数可)の生存率と比べて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、もしくは60ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、平均生存期間を増やす、態様1から38のいずれか1つに記載の組合せ方法。
40.ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減する、態様1から39のいずれか1つに記載の組合せ方法。
41.前記対象が、がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍、または過形成、疣贅、もしくは異常な細胞増殖に関連している他の状態を有する、あるいはウイルス、細菌、真菌、酵母、または寄生虫に感染している、態様1から40のいずれか1つに記載の組合せ方法。
42.前記対象が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を有する、態様1から41のいずれか1つに記載の組合せ方法。
43.前記対象が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がんを有する、態様1から42のいずれか1つに記載の組合せ方法。
44.前記対象が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がんを有する、態様1から43のいずれか1つに記載の組合せ方法。
45.前記対象が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア(hemihyperplasia)、乳房過形成(hyperplasia of the breast)、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成(compensatory liver hyperplasia)を有する、態様1から44のいずれか1つに記載の組合せ方法。
46.対象が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、または寄生虫感染を有する、態様1から45のいずれか1つに記載の組合せ方法。
47.プルシアンブルーナノ粒子および態様1のいずれか1つに記載の免疫療法を実施するのに適した少なくとも1つの免疫療法剤を含む組成物であって、前記免疫療法剤が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する免疫調節剤、薬物、または物質であり、前記免疫療法剤がプルシアンブルーナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合していてもよい、組成物。
48.プルシアンブルーナノ粒子と組み合わせて細胞または血小板を含む、態様1から46のいずれか1つに記載の方法を実施するのに適した組成物であって、前記細胞が、任意で、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、および樹状細胞からなる群から選択され、標的細胞、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞と選択的に相互作用する、認識する、または結合する、組成物。
49.プルシアンブルーナノ粒子および態様1から46のいずれか1つに記載の免疫療法を実施するための少なくとも1つの免疫療法剤を含むキットであって、任意で、ナノ粒子および免疫療法成分を投与するための、印刷された、コンピュータ可読のまたはリンクアドレスされた(link-addressed)説明書、たとえば、投与量、投与経路、レジメン、および投与部位を含んでもよく、ナノ粒子および免疫療法成分を組み合わせた形態で、または異なる容器中の別々の成分として含有していてもよく、そのような成分は乾燥したまたは濃縮された形態で存在し、適切な復元用媒体、緩衝剤または生理的希釈剤を伴っていてもよい、キット。
50.標的細胞に対して、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞に対して少なくとも1つの免疫療法作用を示す、または示すように操作もしくは処理されているプルシアンブルーナノ粒子を含み、それと共有結合または非共有結合によって会合している細胞。
51.生細胞、不活化非増殖性細胞(たとえば、放射線または化学剤により処理されている細胞)または死んだもしくは断片化した細胞である、態様50に記載の細胞。
52.悪性細胞または他の標的細胞である、態様50から51のいずれか1つに記載の細胞。
53.非悪性細胞、たとえば、免疫細胞または少なくとも1つのがん、新生物または腫瘍エピトープを特異的に認識する細胞である、態様50から52のいずれか1つに記載の細胞。
54.幹細胞、臍帯血細胞、または他の免疫的無感作細胞(immunologically naive cell)である、態様50から53のいずれか1つに記載の細胞。
55.少なくとも1種のヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、態様50から54のいずれか1つに記載の細胞。
56.ペプチド抗原(複数可)をパルスされているまたは曝露されている、自家性、同種、異種または合成抗原提示細胞に、たとえば、がん、新生物または腫瘍の1つ以上の抗原または病原体の1つ以上の抗原または1つ以上の自己抗原を表すオーバーラップペプチドライブラリーに曝露することにより刺激されている少なくとも1つのヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、態様50から55のいずれか1つに記載の細胞。
57.T細胞(細胞傷害性、ヘルパー、デルタ−ガンマ、およびNK細胞型を含む)、プレT細胞またはT細胞前駆細胞である、態様50から56のいずれか1つに記載の細胞。
58.マクロファージまたは単球である、態様50から57のいずれか1つに記載の細胞。
59.B細胞である、態様50から58のいずれか1つに記載の細胞。
60.好中球、好酸球、好塩基球または他の白血球である、態様50から59のいずれか1つに記載の細胞。
61.がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープ、あるいは過形成、疣贅、異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から60のいずれか1つに記載の細胞。
62.副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から61のいずれか1つに記載の細胞。
63.白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から62のいずれか1つに記載の細胞。
64.神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん
由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から63のいずれか1つに記載の細胞。
65.良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、態様50から64のいずれか1つに記載の細胞。
66.ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様50から65のいずれか1つに記載の細胞。
67.ナノ粒子を細胞に結合させる部分をさらに含み、前記部分がビオチンまたは(ストレプト)アビジンであり、ナノ粒子がそれぞれ(ストレプト)アビジンまたはビオチンを含む、態様50から66のいずれか1つに記載の細胞。
68.前記細胞に結合する部分および標的細胞に結合する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性ナノ粒子を含む、態様50から67のいずれか1つに記載の細胞。
69.少なくとも1つの検出可能マーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様50から68のいずれか1つに記載の細胞。
70.少なくとも1つ以上の非細胞性薬剤に共有結合または非共有結合によって会合しているプルシアンブルーナノ粒子を含むコンジュゲートであって、
前記非細胞性薬剤が、任意で、分子、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、酵素、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ポリエチレングリコール、一本鎖ポリマー、フラーレン;高次分子構造体、たとえば、四次タンパク質構造体、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様粒子、またはカプシド;架橋ポリマー、凝集体、ナノ粒子(金、銀、ニッケル、鉄、銅、亜鉛、またはその酸化物およびセラミックを含むナノ粒子;シリカナノ粒子;磁性ナノ粒子;放射性ナノ粒子;細胞傷害性ナノ粒子;重合体ミセルナノ粒子;ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子;タンパク質充填ナノ粒子、セリウム酸化物ナノ粒子;ならびに任意でタンパク質分子または化学療法剤に結合しているナノダイアモンドを含む)、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、または他の非細胞性構造物を含んでいてもよく;
前記コンジュゲートが標的細胞上で少なくとも1つの免疫療法作用を示す、たとえば、がん、悪性、新生物、または腫瘍細胞の成長、転移、代謝、アポトーシス、または増殖を阻害する、コンジュゲート。
71.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上の少なくとも1つ以上の決定基に結合する、態様70に記載のコンジュゲート。
72.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上または標的細胞周辺の免疫細胞上の少なくとも1つ以上の受容体と相互作用する、態様70または71に記載のコンジュゲート。
73.少なくとも1つの非細胞性薬剤が、二機能性または多機能性であり、プルシアンブルーナノ粒子と標的細胞の両方に結合することができ、または標的細胞上と標的細胞に隣接する免疫細胞上の両方の決定基に結合することができる、態様70、71または72に記載のコンジュゲート。
74.非細胞性薬剤が、ケモカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインのうちのいずれかを含む、態様70から73のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
75.非細胞性薬剤が、サイトカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインのうちのいずれかを含む、態様70から74のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
76.非細胞性薬剤が、オリゴデオキシヌクレオチド、たとえば、標的細胞にまたはその成分に結合するアプタマー、核酸ベクターまたは構築物、センスまたはアンチセンスDNAまたはsi−RNAを含むRNAを含む、態様70から75のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
77.非細胞性薬剤が、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、および抗CD52)、二特異性抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合部分、または抗体のCDR;特に標的細胞または標的細胞特異的抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体または抗体成分あるいは標的細胞上または標的細胞近傍の細胞上の受容体と特異的に相互作用する抗体または抗体成分を含む、態様70から76のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
78.非細胞性薬剤がチェックポイント阻害剤である、態様70から77のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
79.非細胞性薬剤が、少なくとも1つのがん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞、抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様70から78のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
80.非細胞性薬剤が、過形成、疣贅、または異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしく寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに由来する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様70から79のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
81.非細胞性薬剤が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍または関連する状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から80のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
82.非細胞性薬剤が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から81のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
83.非細胞性薬剤が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から82のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
84.非細胞性薬剤が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様70から83のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
85.ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様70から84のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
86.プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が共有結合している、態様70から85のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
87.プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が、たとえば、ナノ粒子上のビオチンまたは(ストレプト)アビジンの非細胞性薬剤上の(ストレプト)アビジンまたはビオチンへのそれぞれの結合を介して、非共有結合している、態様70から86のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
88.非細胞性薬剤が、二機能性であり、前記非細胞性薬剤に結合する部分および標的細胞に結合するまたは相互作用する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性プルシアンブルーナノ粒子を含む細胞を認識するまたは相互作用する、態様70から87のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
89.抗がん剤、毒素または放射性薬剤を含むがこれらの限定されない、少なくとも1つの検出可能なマーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様70から88のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
90.被覆され、配合されまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、プルシアンブルーナノ粒子。
91.血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様90に記載のナノ粒子。
92.血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、態様90または91に記載のナノ粒子。
93.ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様90、91または92に記載のナノ粒子。
94.コーティングを含む、態様90から93のいずれか1つに記載のナノ粒子。
95.ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−990、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩(AOT)、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)、セチルトリメチルアンモニウム塩化物(CTMA−Cl)、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、デシルトリメチルアンモニウム臭化物(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様90から94のいずれか1つに記載のナノ粒子。
96.好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、態様90から95のいずれか1つに記載のナノ粒子。
97.血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、態様90から96のいずれか1つに記載のナノ粒子。
98.血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングを含む、態様90から97のいずれか1つに記載のナノ粒子。
99.態様90から98のいずれか1つに記載のナノ粒子を投与することを含む、光熱療法または組み合わされた光熱と免疫療法を必要とする対象を処置するための方法。
[実施例]
生理的に安定なプルシアンブルーナノ粒子
プルシアンブルーは、FeII−CN−FeIII結合からなる面心立体格子構造を有する混合原子価ヘキサシアノ鉄酸鉄ナノ粒子で構成された古くからの色素である。プルシアンブルーナノ粒子(PB NP)は撮像および治療能力を有するが、ヒドロキシルイオンはPB NP格子のFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、分解を引き起こす。この10年間にわたり、プルシアンブルーナノ粒子(PB NP)は、その合成およびその特性を目的に合わせるのが容易なので、生物医学研究において撮像および治療応用での使用について調査されることが増えてきている。撮像および治療応用でのPB NPの使用は、その固有の生理的安定性を暗黙のうちに示している。しかし、多くの生理液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液の特徴的性質である、わずかにアルカリ性の溶液中で行われた研究では、過剰なヒドロキシルイオンの存在下ではPB NPが不安定であることが示唆されており、ヒドロキシルイオンがPB NP格子のFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、その急速な分解を引き起こすからである。本発明者らは、生理溶液中でのPB NP安定性の根底にある機構を解明することによりこれら外見上は矛盾する所見を説明しようと努めた。
生理的に安定なプルシアンブルーナノ粒子
プルシアンブルーは、FeII−CN−FeIII結合からなる面心立体格子構造を有する混合原子価ヘキサシアノ鉄酸鉄ナノ粒子で構成された古くからの色素である。プルシアンブルーナノ粒子(PB NP)は撮像および治療能力を有するが、ヒドロキシルイオンはPB NP格子のFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、分解を引き起こす。この10年間にわたり、プルシアンブルーナノ粒子(PB NP)は、その合成およびその特性を目的に合わせるのが容易なので、生物医学研究において撮像および治療応用での使用について調査されることが増えてきている。撮像および治療応用でのPB NPの使用は、その固有の生理的安定性を暗黙のうちに示している。しかし、多くの生理液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液の特徴的性質である、わずかにアルカリ性の溶液中で行われた研究では、過剰なヒドロキシルイオンの存在下ではPB NPが不安定であることが示唆されており、ヒドロキシルイオンがPB NP格子のFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、その急速な分解を引き起こすからである。本発明者らは、生理溶液中でのPB NP安定性の根底にある機構を解明することによりこれら外見上は矛盾する所見を説明しようと努めた。
第一に、ヒト血液/リンパ液のモル浸透圧濃度/イオン濃度を模倣するのに使用されるわずかにアルカリ性の生理緩衝液である、リン酸緩衝食塩水中でのPB NPの分解が説明される。次に、血清の主成分であるアルブミンで被覆された場合の、ナノ粒子上でのタンパク質コロナの形成による保護効果を示す、PB NPの改善された安定性および遅くなった分解が実証される。したがって、生理溶液中での調節可能な分解動力学を与えるための生体適合性ポリマーでPB NPを被覆する交互積層(layer-by-layer)戦略が実行される。これらのin vitro研究により、in vivoでの撮像および治療応用における使用のための目的に適合可能な分解特性を有する安定なPB NPの設計が可能になる。生理溶液中のタンパク質はPB NPを分解から部分的に保護し、交互積層ポリマーコーティングアプローチを実行してPB NP分解を制御することが可能であることを発明者らは認識した。
プルシアンブルーナノ粒子(PB NP)は、多様な生物医学応用における使用について最近まで調査されてきた混合原子価鉄ベースのシアノ金属酸ナノ粒子である。PB NPはFeII−CN−FeIII結合からなる面心立体格子構造を有する。M.Shokouhimehr,E.S.Soehnlen,A.Khitrin,S.Basu and S.D.Huang,Inorg.Chem.Comm.,97(2010)58を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PB NPは、放射性被曝の処置のために米国食品医薬品局(FDA)の認可を受けており(ラディオガルダーゼとして市販されている)、臨床的に放射性セシウムおよびタリウム中毒を効果的に処置するのに使用されてきた。J.M.Verzijl,H.C.Joore,A.van Dijk,F.C.Wierckx,T.J.Savelkoul and J.H.Glerum,J.Toxicol.Clin.Toxicol.,31(1993)553;P.J.Faustino,Y.Yang,J.J.Progar,C.R.Brownell,N.Sadrieh,J.C.May,E.Leutzinger,D.A.Place,E.P.Duffy,F.Houn,S.A.Loewke,V.J.Mecozzi,C.D.Ellison,M.A.Khan,A.S.Hussain and R.C.Lyon,J.Pharm.Biomed.Anal.,47(2008)114;Y.Yang,P.J.Faustino,J.J.Progar,C.R.Brownell,N.Sadrieh,J.C.May,E.Leutzinger,D.A.Place,E.P.Duffy,L.X.Yu,M.A.Khan and R.C.Lyon,Int.J.Pharm.358(2008)187;およびH.H.Kamerbeek,A.G.Rauws,M.ten Ham and A.N.van Heijst,Acta Med.Scand.,189(1971)321を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。さらに、PB NPは、磁気共鳴画像(MRI)剤、光音響画像剤、およびマルチモーダイルイメージング剤、たとえば、組合せMRI/蛍光撮像法および組合せコンピュータ断層撮影(CT)/光音響撮像法を含む撮像剤としてのその使用を記載している公表された研究において実証されているように、撮像能力を有するように合成されてきた。M.F.Dumont,S.Yadavilli,R.W.Sze,J.Nazarian and R.Fernandes,Int.J.Nanomed.,9(2014)2581;M.Shokouhimehr,E.S.Soehnlen,J.Hao,M.Griswold,C.Flask,X.Fan,J.P.Basilion,S.Basu and S.D.Huang,J.Mater.Chem.,20(2010)5251;W.Zhu,K.Liu,X.Sun,X.Wang,Y.Li,L.Cheng and Z.Liu,ACS Appl.Mater.Interfaces,7(2015)11575;X.Liang,Z.Deng,L.Jing,X.Li,Z.Dai,C.Li and M.Huang,Chem.Commun.,49(2013)11029;M.F.Dumont,H.A.Hoffman,P.R.Yoon,L.S.Conklin,S.R.Saha,J.Paglione,R.W.Sze,and R.Fernandes,Bioconjug.Chem.,25(2014)129;J.M.Vojtech,J.Cano−Mejia,M.F.Dumont,R.W.Sze and R.Fernandes,J.Vis.Exp.,98(2015)e52621;およびL.Jing,X.Liang,Z.Deng,S.Feng,X.Li,M.Huang,C.Li and Z.Dai,Biomaterials,35(2014)5814を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PB NPは、治療応用にも使用されてきた。具体的に、PB NPはこれまで光熱療法(PTT)用に使用され、この療法は限定された近赤外線(NIR)波長(650〜900nm)での吸収ピークを示すPB NPの特性を利用する。G.Fu,W.Liu,Y.Li,Y.Jin,L.Jiang,X.Liang,S.Feng,Z.Dai,Bioconjug.Chem.,25(2014)1655;およびH.A.Hoffman,L.Chakrabarti,M.F.Dumont,A.D.Sandler and R.Fernandes R,RSC Adv.,4(2014)29729を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、PB NPは低出力NIRレーザーに曝露されると熱が上がる。PB NPベースのPTTを使用すれば、ナノ粒子の腫瘍内および静脈内注入後腫瘍を切除する(熱的に破壊する)ことが可能になる。L.Cheng,H.Gong,W.Zhu,J.Liu,X.Wang,G.Liu and Z.Liu,Biomaterials,35(2014)9844を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。他のグループは、磁気誘導化学療法、併用PTT/化学療法、光熱的に増強された遺伝子または薬物送達用におよびPB NPが治療と診断薬の両方として機能するセラノスティック使用のためにPB NPを同様に使用してきた。M.B.Zakaria,A.A.Belik,C.H.Liu,H.Y.Hsieh,Y.T.Liao,V.Malgras,Y.Yamauchi and K.C.Wu,Chem.Asian J.,10(2015)1457;P.Xue,K.K.Cheong,Y.Wu and Y.Kang,Colloids Surf.B.,125(2015)277;M.Wu,Q.Wang,X.Liu and J.Liu,RSC Adv.,5(2015)30970;X.D.Li,X.L.Liang,F.Ma,L.J.Jing,L.Lin,Y.B.Yang,S.S.Feng,G.L.Fu,X.L.Yue and Z.F.Dai,Colloids Surf B.,123(2014)629;およびP.Xue,J.Bao,Y.Wu,Y.Zhang and Y.Kang,RSC Adv.,5(2015)28401を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
撮像および治療応用のためにPB NPの利用に暗に含まれているのがその生理的(in vivo)安定性である。しかし、電気化学の分野での研究では、プルシアンブルーフィルムがセンサー用途で広範に使用されており、過剰なヒドロキシルイオンの存在下では不安定であることが示唆されている。F.Ricci and G.Palleschi,Biosens.Bioelectron.,21(2005)389;およびF.Ricci,A.Amine,G.Palleschi and D.Moscone D,Biosens.Bioelectron.,18(2003)165を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの過剰なヒドロキシルイオンはPB NPの格子構造を構成しているFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、その急速な分解を引き起こす。K.Itaya,H.Akahoshi and S.Toshima,J.Electrochem.Soc.,129(1982)1498;およびA.Karyakin,Electroanalysis,13(2001)813を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ちなみに、多くの生理溶液がわずかにアルカリ性のpH(たとえば、血液pH約7.4、リンパ液>7.4)を有する。したがって、PB NPはこれらのわずかにアルカリ性の生理溶液中では攻撃されて急速に分解されると考えられる。この情報の目標は、わずかにアルカリ性の生理溶液、すなわち、in vivoでの撮像および治療応用で典型的に遭遇する条件でのPB NPの安定性(または一過性の安定性)についてのこれら外見上は矛盾する所見を解明することである。発明者らは、生理溶液で観察されるPB NPの安定性は、ナノ粒子上の保護的タンパク質コーティングの形成に起因すること、および生体適合性ポリマーを用いたPB NPの事前コーティングにより、発明者らはその生理的安定性および分解を制御することが可能であると仮定した。
この仮説を試験するため、発明者らは先ずPB NPの安定性および分解特性を確定した。これらの研究はリン酸緩衝食塩水(PBS)で行われ、これは生理溶液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液のモル浸透圧濃度およびイオン濃度を模倣するために使用されるわずかにアルカリ性の緩衝液(PH7.4)である。具体的には、発明者らは、動的光散乱(DLS)、可視近赤外線(Vis−NIR)分光法、およびPTTを使用してPB NPの安定性を定量化した。DLSはナノ粒子のサイズ(流動力学的径)に関する情報を提供し、安定なPB NPが20〜300nmの範囲の単分散粒径分布を示すと予想されるように、コロイド安定性および凝集に関する情報を提供するのに使用することが可能である。Vis−NIR分光法はPB NP格子のFeII−CN−FeIII結合に関する情報を提供する。これらの結合は、PB NP格子のシアン化物架橋を通じたFeIIとFeIIIの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、650〜900nm波長の範囲でピーク吸収を生じる。ヒドロキシルイオンに攻撃されると、Vis−NIRスペクトルにおけるPB NPの特徴的な吸収ピークに減少が見られると予想される。さらに、発明者らはPTTにおいて使用するためのPB NPの能力を測定しようと努めた。分解したPB NP(ヒドロキシルイオンによる攻撃後)は、安定で機能的なPB NPと同じ温度まで熱くなるとは予想されない。したがって、発明者らは、PB NPのこのPTT能力をその機能性の尺度として使用する。
次に、発明者らは、アルブミン被覆PB NPの安定性および分解特性を試験する。これらの研究を行う理論的根拠は、生理溶液中でのPB NP保護が起こるのは、PB NP保護タンパク質コロナの形成に起因する可能性があることである。T.Cedervall,I.Lynch,S.Lindman,T.Berggard,E.Thulin,H.Nilsson,K.A.Dawson,and S.Linse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.,104(2007)2050;およびA.S.Pitek,D.O’Connell,E.Mahon,M.P.Monopoli,F.Baldelli Bombelli and K.A.Dawson,PLoS One,7(2012)e40685を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。概念実証として、発明者らはアルブミンを代表的なタンパク質として使用した。なぜならば、アルブミンがもっとも豊富な血清タンパク質であり血液中のナノ粒子上で作成されるタンパク質コロナの主成分であるからである。S.Tenzer,D.Docter,S.Rosfa,A.Wlodarski,J. Kuharev,A.Rekik,S.K.Knauer,C.Bantz,T.Nawroth,C.Bier,J.Sirirattanapan,W.Mann,L.Treuel,R.Zellner,M.Maskos,H.Schild and R.H.Stauber,ACS Nano,5(2011)7155を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、DLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して結果として得られるアルブミン被覆PB NPの安定性および分解特性を確定した。しかし、多様な組成物を有する生理溶液中のタンパク質コーティング(たとえば、血清タンパク質)に頼ると、変わりやすい予測不可能なPB NP分解動態をもたらすことがある。したがって、発明者らは、結果として得られたナノ粒子に調節可能な分解動態を与えるために、合成後生体適合性ポリマーをPB NPの表面に結合させる前述の交互積層(LbL)アプローチを使用することにより生理的に安定なPB NPを合成しようと努めた。ポリマーコーティング技法は文献によく説明されており、ナノ粒子の生体適合性および安定性を増加するのに役立ち、ならびに生体機能付与を支援する。W.G.Kreyling,A.M.Abdelmonem,Z.Ali,F.Alves,M.Geiser,N.Haberl,R.Hartmann,S.Hirn,D.J.de Aberasturi,K.Kantner,G.Khadem−Saba,J.M.Montenegro,J.Rejman,T.Rojo,I.R.de Larramendi,R.Ufartes,A.Wenk and W.J.Parak,Nat Nanotechnol.,10(2015)619;A.Quarta,A.Curcio,H.Kakwere and T.Pellegrino,Nanoscale,4(2012)3319;およびF.Zhang,E.Lees,F.Amin,P.Rivera Gil,F.Yang,P.Mulvaney and W.J.Parak,Small,7(2011)3113を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。我々のPB NPは、最初は相反する電荷の2つのポリマー、ポリアリルアミン塩酸塩およびポリ(アクリル酸)で、引き続いてポリエチレングリコール(PEG)で被覆される。ペグ化はナノ粒子合成では広く使用される。なぜならば、ペグ化はナノ粒子の血液循環時間を増やし、疎水性ナノ粒子成分の水溶性を増やし、その免疫原性および抗原性を減少させることによりナノ粒子を免疫系による攻撃から遮断するからである。J.V.Jokerst,T.Lobovkina,R.N.Zare and S.S.Gambhir,Nanomedicine(Lond).,6(2011)715を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。DLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して、発明者らは続けて、LbL被覆PB NPが非被覆PB NPよりも遅い分解動態を示すかどうか、LbL被覆PB NPが生理溶液中で安定のままであるかどうかを試験した。このアプローチは、生理溶液中でのPB NPの安定性および分解を制御するこの設計アプローチを利用するための基盤を提供した。
材料 すべての合成手順は、Milli−Qsystem(Millipore Corporation、Billerica、MA)から入手される18.2MΩcmの抵抗力を有する超純水を使用して行った。ヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム三水和物(MW422.39;K4[Fe(CN)6]・3H2O)、鉄(III)塩化六水和物(MW270.3;Fe(Cl)3・6H2O)、ウシ血清由来のアルブミン、ポリアリルアミン塩酸塩(PAH;MW15,000)、ポリ(アクリル酸)溶液(PAA;MW2,000)、およびN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N0−エチルカルボジイミド塩酸塩;EDC)はすべてSigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4はLife Technologies(Grand Island、NY)から購入した。808nm近赤外線(NIR)レーザーはLaserglow Technologies(Toronto、ON、Canada)から購入した。Neuro2a細胞はATCC(Manassas、VA)から購入した。最後に、アミノ(m)−PEG−NH2(MW5,000)はNanocs(New York、NY)から購入した。
PB NPの合成 前述のようにPB NPは室温(RT)で合成された。G.Fu,W.Liu,S.Feng and X.Yue,Chem.Commun.,48(2012)11567、N.W.Roehm,G.H.Rodgers,S.M.Hatfield and A.L.Glasebrook,J.Immunol.Methods,142(1991)257を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。手短に言えば、5mLのMilli−Q水中6.8mgのFeCl3・6H2O(2.5×10−5モル)の水溶液を、5mLのMilli−Q水中10.6mgのK4Fe(CN)6・3H2O(2.5×10−5モル)を含有する水溶液に激しい撹拌下で添加した。15分間の撹拌後、こうして得られた沈殿物を遠心分離(5分間20,000×g)により収集し、超音波処理を使用してMilli−Q水ですすぎ、ナノ粒子を懸濁した(マイクロチップ超音波処理器プローブModel Q125、QSonica、Newtown、CT)。粒子を最終的にMilli−Q水に再懸濁する前に収集およびすすぎ工程は少なくとも3回繰り返した。PB NPおよびPB NPを作成し使用するための方法も「PRUSSIAN BLUE−INSPIRED CONSTRUCTS FOR MULTIMODAL IMAGING AND THERAPY」という表題の米国特許出願公開第20140271487号を参照することにより組み込まれ、前記特許文献は参照によりその全体を組み込まれる。
ナノ粒子コーティング法 PB NPをアルブミンで覆うために、ウシ血清由来の0.3mgのアルブミンを1mLのMilli−Q水中1mgのPB NPに添加し、ボルテックスし、オービタルシェーカー上、室温で少なくとも2時間混合させておいた。PB NPとアルブミンの最適な相対比率は、我々が既に記載している方法を使用してPB NPのアルブミン結合能力に関する先行研究を行うことにより決定した。PB NPをアルブミンに接触させた後、20,000×gで5分間の遠心分離によりアルブミン被覆PB NPを収集し、上澄みを捨てることにより未結合アルブミンはすすぎ落とした。アルブミン被覆PB NPは短時間の超音波処理により0.5mLのMilli−Q水に再懸濁し、収集およびすすぎ工程は少なくとも3回繰り返した。最後の遠心分離後、粒子はMilli−Q水に再懸濁した。
Cheng et al.により記載されているLbLアプローチを少し修正を加えて使用し、PB NPを被覆した。手短に言えば、1mg/mLのPB NPを10mL、室温で30分間超音波処理下で4mg/mLのPAHの水溶液に液滴で添加した。次に、この溶液は少なくとも4時間激しく撹拌し、16,000×gで10分間遠心分離して、PAH被覆PB NP(PB−PAH)を収集し、上記の通りMilli−Q水に再懸濁した。次に、PB−PAHナノ粒子を、室温で30分間超音波処理下で4mg/mLのPAAに液滴で添加し、少なくとも4時間激しく撹拌し、上記の通りにすすいで、PAA被覆ナノ粒子(PB−PAH−PAA)を得た。次に、10mg/mLのm−PEG−NH2を、室温で30分間超音波処理下でPB−PAH−PAAナノ粒子の溶液に液滴で添加した。次に、10mgのEDCを添加して、溶液は撹拌しながら一晩インキュベートさせた。最終のLbL被覆ナノ粒子(PB−PAH−PAA−PEG)をすすぎ、上記の通りに再懸濁した。LbLコーティングのそれぞれの工程後のナノ粒子の表面電荷(ゼータ電位)は補足情報に記載されている(図5)。
動的光拡散(DLS)およびゼータ電位 すべてのナノ粒子のサイズおよびゼータ電位はZetasizer Nano ZS(Malvern Instruments、Worcestershire、U.K.)を使用して測定した。PB NP懸濁液はMilli−Q水またはPBSのいずれかで作成され、サイズおよび電荷解析は製造業者の仕様書を使用して実施した。
Vis−NIR分光法 種々のナノ粒子のVis−NIR吸光度スペクトルはVISIONliteソフトウェアを使用してGenesys10S分光光度計(Thermo Scientific、Waltham、MA)上で測定した。PB NP懸濁液はMilli−Q水またはPBSで作成され、解析は製造業者の使用説明書により実施した。
PTTおよび生存率研究 すべてのPTT研究は808nm NIRレーザーを使用し出力1.25W/cm2で実施した。100μLの総容積のナノ粒子および/または細胞を96ウェルプレートに蒔き、10分間照射した。経時的な温度測定は熱電対(Omega、Stamford、CT)を使用して行った。PTT後の細胞生存率は、代謝産物の吸光度が生存率の尺度として測定されるXTTアッセイ(Trevigen、Gaithersburg、MD)を使用して測定した。代謝的に活性な細胞のミトコンドリアはテトラゾリウム塩をホルマザンに切断することができ、ホルマザンは490nmでの吸光度により測定することが可能である。
PB NPはPTT剤として安定であり機能的であった
発明者らは、それに続く比較研究のベースラインとして、DLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して合成されたPB NP(すなわち、水中でのPB NP懸濁物質)の安定性および機能性を測定した。DLSにより測定した場合、合成されたPB NPは58.77nmの平均流体力学的径を示した(図1A)。PB NPのVis−NIRスペクトルは、PB NP格子(Amax=705nm)のシアン化物架橋を通じたFeIIとFeIIIの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、650〜900nmのその特徴的吸収帯を示した(図1B)。発明者らは、出力密度1.25W/cm2で10分間808nmレーザーを使用して96ウェルプレートにおいて変動する濃度のPB NP(0.01〜1.0mg/mL)上でPTTを実施した。PTTは濃度依存様式でPB NP加熱を生じ、1.0mg/mLのPB NPは10分後もっとも高い加熱(79.4℃)を示した(図1C)。さらに、発明者らは、in vitroでがん細胞を切除するPB NPの能力を評価した。0.1mg/mLのPB NPは、in vitroで神経芽細胞腫(neuro2a)細胞を光熱的に切除することができ、XTTアッセイにより測定した場合、細胞生存率の有意な70.6%減少を生じた(p<0.0001、図6)。非処置対照neuro2a細胞と比べた場合、NIRレーザー(p=0.65)もPB NP(p=0.13)も単独ではneuro2a細胞にいかなる細胞障害性も生じなかった。これらのデータは、水中でのPB NP懸濁物の固有の安定性を例示している。これらのデータは単分散粒径分布を示し、PB NPの格子構造を含む結合に応じて、NIR波長でのピーク吸光度を示している。さらに、PB NPはPTT用の効果的薬剤であり;PB NPは劇的に熱くなりがん細胞を切除することができる。
発明者らは、それに続く比較研究のベースラインとして、DLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して合成されたPB NP(すなわち、水中でのPB NP懸濁物質)の安定性および機能性を測定した。DLSにより測定した場合、合成されたPB NPは58.77nmの平均流体力学的径を示した(図1A)。PB NPのVis−NIRスペクトルは、PB NP格子(Amax=705nm)のシアン化物架橋を通じたFeIIとFeIIIの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、650〜900nmのその特徴的吸収帯を示した(図1B)。発明者らは、出力密度1.25W/cm2で10分間808nmレーザーを使用して96ウェルプレートにおいて変動する濃度のPB NP(0.01〜1.0mg/mL)上でPTTを実施した。PTTは濃度依存様式でPB NP加熱を生じ、1.0mg/mLのPB NPは10分後もっとも高い加熱(79.4℃)を示した(図1C)。さらに、発明者らは、in vitroでがん細胞を切除するPB NPの能力を評価した。0.1mg/mLのPB NPは、in vitroで神経芽細胞腫(neuro2a)細胞を光熱的に切除することができ、XTTアッセイにより測定した場合、細胞生存率の有意な70.6%減少を生じた(p<0.0001、図6)。非処置対照neuro2a細胞と比べた場合、NIRレーザー(p=0.65)もPB NP(p=0.13)も単独ではneuro2a細胞にいかなる細胞障害性も生じなかった。これらのデータは、水中でのPB NP懸濁物の固有の安定性を例示している。これらのデータは単分散粒径分布を示し、PB NPの格子構造を含む結合に応じて、NIR波長でのピーク吸光度を示している。さらに、PB NPはPTT用の効果的薬剤であり;PB NPは劇的に熱くなりがん細胞を切除することができる。
PB NPは、リン酸緩衝食塩水(PBS)において分解しその安定性および機能性を失う
PB NPは水中に懸濁させた場合の使用では安定で効果的であるが、わずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、PBSに遭遇すると急速に分解する。PBSは無機塩(タンパク質も細胞成分もない)で構成され、pH7.4で、血液およびリンパ液のpHを模倣する。発明者らは再びDLS、Vis−NIR、およびPTT経時的温度測定を利用して、PBS中でのPB NPの安定性および機能性を測定した。PB NPがPBS中に懸濁している場合、DLSはナノ粒子の流体力学的サイズの顕著な増加を示し(図2A)、PBS中でのナノ粒子の凝集および不安定性が示唆された。この凝集がコロイド不安定の結果ではなく、むしろナノ粒子分解の結果であることを確かめるため、発明者らはVis−NIR分光法を使用して構成要素FeII−CN−FeIII結合の安定性を評価した。予想通り、PBSとの接触時間が増えるに従って、PB NP特徴的NIRピークの顕著な減少(48時間後最初のピーク強度の25.6%まで減少する)が観察され、これはPBS中のわずかに過剰なヒドロキシルイオンによるFeII−CN−FeIII結合の攻撃に起因すると考えられる(図2B)。さらに、24時間PBSに接触したPB NPはPTTの10分後に水中のPB NPが達成したほどの高温を生じることができない(濃度依存性、図2C)。したがって、PB NPはわずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、PBS中ではPTT剤としてのその機能性を急速に失う。溶液のpHが10および12までさらに増加するとその効果ははるかに劇的になり、10分間のPTT(1.25W/cm2)はもはやPB NPを、PB NPなしで照射された水またはPBSの温度上昇と同一の35℃より上に加熱することはできない(図7)。これらのデータにより、生理的媒体に存在するヒドロキシルイオンがPB NPのFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、その分解を引き起こすこと、およびこの効果は溶液のpHが増加するに従って加速され著しくなることが示唆される。したがって、アルカリ性溶液でのPB NPのこのような分解挙動を考慮することが急務である。in vivoで遭遇する多くの生理溶液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性であり、予想通りに、PBSで観察される様式に類似する様式でPB NPを分解して、不定で予測できないナノ粒子特性をもたらすと考えられる。ここで注目すべきなのは、PB NPを使用する文献中の研究はPB NPのこの分解現象を記載していないことである。したがって、発明者らは、いかなる特定の解釈にも縛られることなく、それらの研究で観察されたPB NPの安定性は思いがけなくナノ粒子上の保護コーティングの形成から生じたと仮定する。この仮定された保護コーティングは、非被覆PB NP上に形成されるタンパク質コロナにより、またはPB NP(一般に使用されているクエン酸塩キャッピングされたPB NPを含む)を二機能化するのに使用されたコーティングにより作成することができると考えられる。
PB NPは水中に懸濁させた場合の使用では安定で効果的であるが、わずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、PBSに遭遇すると急速に分解する。PBSは無機塩(タンパク質も細胞成分もない)で構成され、pH7.4で、血液およびリンパ液のpHを模倣する。発明者らは再びDLS、Vis−NIR、およびPTT経時的温度測定を利用して、PBS中でのPB NPの安定性および機能性を測定した。PB NPがPBS中に懸濁している場合、DLSはナノ粒子の流体力学的サイズの顕著な増加を示し(図2A)、PBS中でのナノ粒子の凝集および不安定性が示唆された。この凝集がコロイド不安定の結果ではなく、むしろナノ粒子分解の結果であることを確かめるため、発明者らはVis−NIR分光法を使用して構成要素FeII−CN−FeIII結合の安定性を評価した。予想通り、PBSとの接触時間が増えるに従って、PB NP特徴的NIRピークの顕著な減少(48時間後最初のピーク強度の25.6%まで減少する)が観察され、これはPBS中のわずかに過剰なヒドロキシルイオンによるFeII−CN−FeIII結合の攻撃に起因すると考えられる(図2B)。さらに、24時間PBSに接触したPB NPはPTTの10分後に水中のPB NPが達成したほどの高温を生じることができない(濃度依存性、図2C)。したがって、PB NPはわずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、PBS中ではPTT剤としてのその機能性を急速に失う。溶液のpHが10および12までさらに増加するとその効果ははるかに劇的になり、10分間のPTT(1.25W/cm2)はもはやPB NPを、PB NPなしで照射された水またはPBSの温度上昇と同一の35℃より上に加熱することはできない(図7)。これらのデータにより、生理的媒体に存在するヒドロキシルイオンがPB NPのFeII−CN−FeIII結合を攻撃して、その分解を引き起こすこと、およびこの効果は溶液のpHが増加するに従って加速され著しくなることが示唆される。したがって、アルカリ性溶液でのPB NPのこのような分解挙動を考慮することが急務である。in vivoで遭遇する多くの生理溶液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性であり、予想通りに、PBSで観察される様式に類似する様式でPB NPを分解して、不定で予測できないナノ粒子特性をもたらすと考えられる。ここで注目すべきなのは、PB NPを使用する文献中の研究はPB NPのこの分解現象を記載していないことである。したがって、発明者らは、いかなる特定の解釈にも縛られることなく、それらの研究で観察されたPB NPの安定性は思いがけなくナノ粒子上の保護コーティングの形成から生じたと仮定する。この仮定された保護コーティングは、非被覆PB NP上に形成されるタンパク質コロナにより、またはPB NP(一般に使用されているクエン酸塩キャッピングされたPB NPを含む)を二機能化するのに使用されたコーティングにより作成することができると考えられる。
アルブミンコーティングはPBS中でのPB NPの安定性および機能性を改善する
PB NPを覆うタンパク質(タンパク質コロナ)は生理緩衝液中でPB NPを安定化するのに貢献するという仮説を試験するため、PB NPをウシ血清由来のアルブミンの層で被覆した。こうして得られたアルブミン被覆ナノ粒子の特性を前述のDLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して分析した。アルブミン被覆PB NPは多粒径分布を有する多分散を示し、91.28nmでの高強度ピークおよびもっと大きな粒径分布でのもっと低い強度ピーク(図3A)はPB NPを確実に安定化するのに血清タンパク質の使用に頼ることの固有の困難さを例証している。単分散アルブミン被覆PB NPを作成することが可能であることにここで言及するのは重要であるが、これには、in vivoでは起こらないタンパク質の濾過、超音波処理、および濃度最適化を含むかなりの後処理が必要である。さらに、Vis−NIRスペクトル上の特徴的なPB NPピークは48時間かけて57.1%まで減少し(図3B)、これは非被覆PB NPの分解動態(図2B)よりもささやかな改善である。同様に、PBS中のアルブミン被覆PB NPはPTTの10分後に水中で得た温度に類似する温度(それぞれ51.7対60.3℃)に到達できなかったが、それでも熱くなることはできた(図3C)。これらのデータは、in vivoでのPB NP安定性および機能性を実証した以前公表された研究に光を当てた。これらの環境にはおそらくヒドロキシルイオンが存在するにもかかわらず、ことによるとタンパク質、たとえば、アルブミンは偶発的にin vivoでPB NPを保護していたのであろう。これらのデータは、タンパク質コロナが生理的環境においていかにしてPB NPを保護しているのかの概念実証的説明を例証している。in vivo安定性を示していた研究は思いがけなくこの方法に頼っていた可能性がある。しかし、以前に述べたように、生理溶液中に存在するタンパク質(たとえば、アルブミン、もっとも豊富な血清タンパク質)を使用してin vivoで偶発的にPB NPを保護するこの方法は予測できず不完全である。したがって、発明者らは、確実で合理的に設計された安定なナノ粒子を作成するためにPB NPをバイオポリマーで被覆するLbLアプローチを実行した。
PB NPを覆うタンパク質(タンパク質コロナ)は生理緩衝液中でPB NPを安定化するのに貢献するという仮説を試験するため、PB NPをウシ血清由来のアルブミンの層で被覆した。こうして得られたアルブミン被覆ナノ粒子の特性を前述のDLS、Vis−NIR、およびPTTを使用して分析した。アルブミン被覆PB NPは多粒径分布を有する多分散を示し、91.28nmでの高強度ピークおよびもっと大きな粒径分布でのもっと低い強度ピーク(図3A)はPB NPを確実に安定化するのに血清タンパク質の使用に頼ることの固有の困難さを例証している。単分散アルブミン被覆PB NPを作成することが可能であることにここで言及するのは重要であるが、これには、in vivoでは起こらないタンパク質の濾過、超音波処理、および濃度最適化を含むかなりの後処理が必要である。さらに、Vis−NIRスペクトル上の特徴的なPB NPピークは48時間かけて57.1%まで減少し(図3B)、これは非被覆PB NPの分解動態(図2B)よりもささやかな改善である。同様に、PBS中のアルブミン被覆PB NPはPTTの10分後に水中で得た温度に類似する温度(それぞれ51.7対60.3℃)に到達できなかったが、それでも熱くなることはできた(図3C)。これらのデータは、in vivoでのPB NP安定性および機能性を実証した以前公表された研究に光を当てた。これらの環境にはおそらくヒドロキシルイオンが存在するにもかかわらず、ことによるとタンパク質、たとえば、アルブミンは偶発的にin vivoでPB NPを保護していたのであろう。これらのデータは、タンパク質コロナが生理的環境においていかにしてPB NPを保護しているのかの概念実証的説明を例証している。in vivo安定性を示していた研究は思いがけなくこの方法に頼っていた可能性がある。しかし、以前に述べたように、生理溶液中に存在するタンパク質(たとえば、アルブミン、もっとも豊富な血清タンパク質)を使用してin vivoで偶発的にPB NPを保護するこの方法は予測できず不完全である。したがって、発明者らは、確実で合理的に設計された安定なナノ粒子を作成するためにPB NPをバイオポリマーで被覆するLbLアプローチを実行した。
LbL被覆PB NPはPBS中で安定で機能的である 同じ特徴付け技法を使用してPBS中でのLbL被覆PB NPの安定性および機能性を分析した。DLSは、PBS中のLbL被覆PB NPが220.2nmの平均流体力学的径を有する単分散粒径分布を有することを示している(図4A)。さらに、PB NPのFeII−CN−FeIII結合に従ったVis−NIRスペクトル上のピークはPBS中での48時間後に吸光度のわずか25%の消失を例示しており(図4B)、非被覆およびアルブミン被覆PB NPよりも改善された安定性を示している。重要なことに、PBS中のLbL被覆PB NPは、水中のLbL被覆PB NPと水中の非被覆PB NPの両方と比べてPTT後の温度の減少を示さず(1mg/mLで76.0℃に到達)、LbLコーティング後のPB NPの改善された安定性および機能性を実証した(図4C)。確かに、ナノ粒子の安定性および機能性を改善するためにはさらなる研究、たとえば、ナノ粒子のサイズを制御する合成条件を最適化する、およびここに記載されるポリマーを用いたコーティングを変化させて(または異なる生体適合性ポリマーを使用して)in vivoでの応用ごとにナノ粒子分解動態を目的に合わせる、を実施する必要がある。にもかかわらず、これらの研究は、多様な生理条件下で安定しているPB NPを合成するための設計考慮事項の最初の概念実証としての役に立つ。
上記の研究結果により明らかにされるように、生理的環境(例えば、血液、リンパ液)は多くの場合わずかにアルカリ性であり、おそらく非被覆PB NPの分解を引き起すと考えられる。生理溶液、たとえば、ヒト血清(たとえば、アルブミン)に見いだされるタンパク質は、PB NPのFeII−CN−FeIII結合を遮蔽してそのような環境でのその分解を防ぐのに十分であることもあるが、この保護方法は予測不可能で信頼できないPB NP特性をもたらすことがある。臨床応用(撮像、治療、セラノスティック)のためのPB NPのロバスト設計を保証するため、分解動態はきちんと説明され一貫していなければならない。PB NPが生体適合性ポリマーで被覆される合理的に設計されたLbLコーティング法を利用すれば、生理溶液中でヒドロキシルイオン攻撃に対してPB NPを保護することが可能であり、もっと長期間依然としてPB NPが確実に安定し機能的であることが可能になる。これらの結果は、合理的に設計されたLbLアプローチを使用して調節可能な分解動態を有するPB NPに安定性および機能性を与える有用性を例示している。これらの研究は、臨床使用のための優れた性能特質を有するPB NPベースのナノ粒子を設計するのに重要な工程である。
がんの光熱免疫療法のためのプルシアンブルーナノ粒子およびチェックポイント阻害
ナノ粒子はその多様な治療および撮像能力のせいでがんの処置に広範に使用されてきた。最近、ナノ粒子はがん治療のための免疫療法と組み合わせた調査もされてきた。なぜならば、これらの組合せはより永続性のある応答を提供し免疫を与える可能性を有するからである。本明細書では、発明者らは、一般的で治療困難な小児がんである神経芽細胞腫の「光熱免疫療法」のための抗CTLA−4チェックポイント阻害と組み合わせたプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)ベースの光熱療法を説明する。光熱免疫療法は、近赤外線レーザーおよび近赤外線光吸収ナノ粒子を使用して腫瘍を破壊する迅速で低侵襲性法として役に立つ。抗CTLA−4は、免疫抑制を逆転させ抗腫瘍応答を誘発する免疫チェックポイント阻害剤である。発明者らのナノ粒子合成計画はpH依存安定性を示すPBNPを生じ、すなわち、このPBNPは、腫瘍間質を表すわずかに酸性のpHで安定であり血液およびリンパ液を模倣するわずかにアルカリ性の条件下では急速に分解する。マウス神経芽細胞腫モデルにおいて腫瘍内に投与されるPBNPを使用する光熱療法は腫瘍負荷および成長速度の急速な低減を誘発するが、その応答は不完全で腫瘍は再発する。しかし、PBNP併用抗CTLA−4ベースの光熱免疫療法により神経芽細胞腫保持マウスでは100日目で55%生存期間が得られる。これは、(i)抗CTLA−4単独、(ii)光熱療法単独、および(iii)無処置で処置された動物において100日目でそれぞれ12.5%、0%、および0%の生存期間と比べられている。最後に、光熱免疫療法で処置され長期間生存したマウスは、神経芽細胞腫腫瘍再チャレンジに対する保護を示し、これらの腫瘍に対する免疫の発現ががんの処置のための新規の併用療法としての光熱免疫療法の可能性を例証していることが示唆される。
ナノ粒子はその多様な治療および撮像能力のせいでがんの処置に広範に使用されてきた。最近、ナノ粒子はがん治療のための免疫療法と組み合わせた調査もされてきた。なぜならば、これらの組合せはより永続性のある応答を提供し免疫を与える可能性を有するからである。本明細書では、発明者らは、一般的で治療困難な小児がんである神経芽細胞腫の「光熱免疫療法」のための抗CTLA−4チェックポイント阻害と組み合わせたプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)ベースの光熱療法を説明する。光熱免疫療法は、近赤外線レーザーおよび近赤外線光吸収ナノ粒子を使用して腫瘍を破壊する迅速で低侵襲性法として役に立つ。抗CTLA−4は、免疫抑制を逆転させ抗腫瘍応答を誘発する免疫チェックポイント阻害剤である。発明者らのナノ粒子合成計画はpH依存安定性を示すPBNPを生じ、すなわち、このPBNPは、腫瘍間質を表すわずかに酸性のpHで安定であり血液およびリンパ液を模倣するわずかにアルカリ性の条件下では急速に分解する。マウス神経芽細胞腫モデルにおいて腫瘍内に投与されるPBNPを使用する光熱療法は腫瘍負荷および成長速度の急速な低減を誘発するが、その応答は不完全で腫瘍は再発する。しかし、PBNP併用抗CTLA−4ベースの光熱免疫療法により神経芽細胞腫保持マウスでは100日目で55%生存期間が得られる。これは、(i)抗CTLA−4単独、(ii)光熱療法単独、および(iii)無処置で処置された動物において100日目でそれぞれ12.5%、0%、および0%の生存期間と比べられている。最後に、光熱免疫療法で処置され長期間生存したマウスは、神経芽細胞腫腫瘍再チャレンジに対する保護を示し、これらの腫瘍に対する免疫の発現ががんの処置のための新規の併用療法としての光熱免疫療法の可能性を例証していることが示唆される。
ナノ医療の分野の進歩によりがんを処置するための多機能性治療および撮像(「セラノスティック」)能力を有するナノ粒子がもたらされ、いくつかのナノ粒子はFDAの認可を受けているまたは現在臨床評価を受けているのいずれかである。Schutz,C.A.;Juillerat−Jeanneret,L.;Mueller,H.;Lynch,I.;Riediker,M.,Therapeutic nanoparticles in clinics and under clinical evaluation.Nanomedicine(Lond)2013,8(3),449−67;およびRink,J.S.;Plebanek,M.P.;Tripathy,S.;Thaxton,C.S.,Update on current and potential nanoparticle cancer therapies.Curr Opin Oncol 2013,25(6),646−51を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。がんナノ医療での目的の新興領域は、免疫系を特異的に標的にするおよび/または活性化する免疫療法と組み合わせたナノ粒子の使用である。Bear,A.S.;Kennedy,L.C.;Young,J.K.;Perna,S.K.;Mattos Almeida,J.P.;Lin,A.Y.;Eckels,P.C.;Drezek,R.A.;Foster,A.E.,Elimination of metastatic melanoma using gold nanoshell−enabled photothermal therapy and adoptive T cell transfer.PLoS One 2013,8(7),e69073;Guo,L.;Yan,D.D.;Yang,D.;Li,Y.;Wang,X.;Zalewski,O.;Yan,B.;Lu,W.,Combinatorial photothermal and immuno cancer therapy using chitosan−coated hollow copper sulfide nanoparticles.ACS Nano 2014,8(6),5670−81;Wang,C.;Xu,L.;Liang,C.;Xiang,J.;Peng,R.;Liu,Z.,Immunological responses triggered by photothermal therapy with carbon nanotubes in combination with anti−CTLA−4 therapy to inhibit cancer metastasis.Adv Mater 2014,26(48),8154−62;およびZhang,P.;Chiu,Y.C.;Tostanoski,L.H.;Jewell,C.M.,Polyelectrolyte Multilayers Assembled Entirely from Immune Signals on Gold Nanoparticle Templates Promote Antigen−Specific T Cell Response.ACS Nano 2015,9(6),6465−77を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの組合せ「ナノ免疫療法」は、従来のがん療法(たとえば、化学療法、手術、放射線療法)に対して改善され持続性のある応答の可能性および処置を受けた対象に免疫を与えてがんの再発に対する長期の保護を提供する可能性を与える。本研究では、発明者らは、がんを処置するためにプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)ベースの光熱治療(PTT)を抗CTLA−4チェックポイント阻害と組み合わせる「光熱免疫療法」と名付けられた併用療法を説明する。
ナノ粒子ベースのPTTは、近赤外線(NIR)光吸収ナノ粒子および低出力NIRレーザーを使用して腫瘍負荷を低減するための迅速で低侵襲性の方法として機能する。Huang,X.;Jain,P.K.;El−Sayed,I.H.;El−Sayed,M.A.,Plasmonic photothermal therapy(PPTT) using gold nanoparticles.Lasers Med Sci 2008,23(3),217−28;およびLoo,C.;Lowery,A.;Halas,N.;West,J.;Drezek,R.,Immunotargeted nanoshells for integrated cancer imaging and therapy.Nano Lett 2005,5(4),709−11を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。いくつかの報告では、動物がんモデル、たとえば、乳がん、扁平上皮癌、および前立腺がんにおいて金ナノシェル、金ナノロッド、金ナノケージ(nanocages)、および炭素ナノチューブを含む多様なナノ粒子を使用するPTTの有効性が実証されている。Hirsch,L.R.;Stafford,R.J.;Bankson,J.A.;Sershen,S.R.;Rivera,B.;Price,R.E.;Hazle,J.D.;Halas,N.J.;West,J.L.,Nanoshell−mediated near−infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance guidance.Proc Nat Acad Sci USA 2003,100(23),13549−54;Lal, S.;Clare,S.E.;Halas,N.J.,Nanoshell−enabled photothermal cancer therapy:impending clinical impact.Acc Chem Res 2008,41(12),1842−51;Dickerson,E.B.;Dreaden,E.C.;Huang,X.;El−Sayed,I.H.;Chu,H.;Pushpanketh,S.;McDonald,J.F.;El−Sayed,M.A.,Gold nanorod assisted near−infrared plasmonic photothermal therapy(PPTT) of squamous cell carcinoma in mice.Cancer Lett 2008,269(1),57−66;Au,L.;Zheng,D.;Zhou,F.;Li,Z.Y.;Li,X.;Xia,Y.,Aquantitative study on the photothermal effect of immuno gold nanocages targeted to breast cancer cells.ACS Nano 2008,2(8),1645−52;Cobley,C.M.;Au,L.;Chen,J.;Xia,Y.,Targeting gold nanocages to cancer cells for photothermal destruction and drug delivery.Expert Opin Drug Deliv 2010,7(5),577−87;Kam, N. W.; O’Connell,M.;Wisdom,J.A.;Dai,H.,Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near−infrared agents for selective cancer cell destruction.Proc Nat Acad Sci USA 2005,102(33),11600−5;Yu,J.G.;Jiao,F.P.;Chen,X.Q.;Jiang,X.Y.;Peng,Z.G.;Zeng,D.M.;Huang,D.S.,Irradiation−mediated carbon nanotubes’ use in cancer therapy.J Cancer Res Ther 2012,8(3),348−54;Burke,A.R.;Singh,R.N.;Carroll,D.L.;Wood,J.C.; D’Agostino,R.B.,Jr.;Ajayan,P.M.;Torti,F.M.;Torti,S.V.,The resistance of breast cancer stem cells to conventional hyperthermia and their sensitivity to nanoparticle−mediated photothermal therapy.Biomaterials 2012,33(10),2961−70;Huang,N.;Wang,H.;Zhao,J.;Lui,H.;Korbelik,M.;Zeng,H.,Single−wall carbon nanotubes assisted photothermal cancer therapy:animal study with a murine model of squamous cell carcinoma.Laser Surg Med 2010,42(9),638−48;およびStern,J.M.;Stanfield,J.;Kabbani,W.;Hsieh,J.T.;Cadeddu,J.A.,Selective prostate cancer thermal ablation with laser activated gold nanoshells.J Urol 2008,179(2),748−53を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。本明細書では、発明者らは、その光熱特性がごく最近にしか記載されていない、PBNPをPTT剤として利用する。Fu,G.;Liu,W.;Feng,S.;Yue,X.,Prussian blue nanoparticles operate as a new generation of photothermal ablation agents for cancer therapy. Chem Commun 2012,48,11567−11569;およびHoffman,H.A.;Chakarbarti,L.;Dumont,M.F.;Sandler,A.D.;Fernandes,R.,Prussian blue nanoparticles for laser−induced photothermal therapy of tumors.RSC Adv 2014,4(56),29729−29734を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PTTに使用された一般的な別のナノ粒子と比べて、PBNPはいくつかの利点を提供し、すなわち、ワンポット合成計画を使用して単回のスケーラブルな工程で容易に合成され、高価な合成材料を必要とせず、放射性中毒を処置するためのヒト経口使用では既にFDA認可を受けている。Shokouhimehr,M.;Soehnlen,E.S.;Hao,J.;Griswold,M.;Flask,C.;Fan,X.;Basilion,J.P.;Basu,S.;Huang,S.D.,Dual purpose Prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery:a new generation of T1−weighted MRI contrast and small molecule delivery agents J Mater Chem 2010,20,5251−5259;Dumont,M.F.;Hoffman,H.A.;Yoon,P.R.;Conklin,L.S.;Saha,S.R.;Paglione,J.;Sze,R.W.;Fernandes,R.,Biofunctionalized Gadolinium−Containing Prussian Blue Nanoparticles as Multimodal Molecular Imaging Agents.Bioconjug Chem 2014,25(1),129−137;Dumont,M.F.;Yadavilli,S.;Sze,R.W.;Nazarian,J.;Fernandes,R.,Manganese−containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors.Int J Nanomed 2014,9,2581−95;Vojtech,J.M.;Cano−Mejia,J.;Dumont,M.F.;Sze,R.W.;Fernandes,R.,Biofunctionalized prussian blue nanoparticles for multimodal molecular imaging applications.J Vis Exp 2015,(98),e52621;Faustino,P.J.;Yang,Y.;Progar,J.J.;Brownell,C.R.;Sadrieh,N.;May,J.C.;Leutzinger,E.;Place,D.A.;Duffy,E.P.;Houn,F., et al.,Quantitative determination of cesium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue.J Pharm Biomed Anal 2008,47(1),114−25;Yang,Y.;Faustino,P.J.;Progar,J.J.;Brownell,C.R.;Sadrieh,N.;May,J.C.;Leutzinger,E.;Place,D.A.;Duffy,E.P.;Yu,L.X., et al.,Quantitative determination of thallium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue.Int J Pharm 2008,353(1−2),187−94;およびFDA:Radiogardase−ferric hexacyanoferrate(ii) capsule:http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021626s007lbl.pdf.(accessed March 7,2017)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
さらに、発明者らは、PBNPがpH依存的様式で安定であり、このためにナノ粒子は分解することが可能であり、PTT用に使用される非分解性ナノ粒子に対する利点となることを明らかにする。
がん治療のためにはナノ粒子ベースのPTTが有望であるにもかかわらず、PTT単独ではある特定の治療が困難なまたは進行がんを処置するには効果がないことがある。これらのがんは、改善された成績を達成するには典型的には組み合わせまたは多様式のアプローチを必要とする。この目的のために、発明者らは、抗CTLA−4チェックポイント阻害免疫療法と組み合わせたPBNPベースのPTTを調査した。チェックポイント阻害はモノクローナル抗体を使用して、キーとなる重要な免疫チェックポイント、たとえば、CTLA−4およびPD−1を標的にして、免疫抑制を逆転させ、内在性免疫細胞(たとえば、T細胞)を活性化することにより強力な抗腫瘍応答の制御を解く。Pardoll,D.M.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer 2012,12(4),252−64;Hodi,F.S.,Cytotoxic T−lymphocyte−associated antigen−4.Clin Cancer Res 2007,13(18 Pt 1),5238−42;およびChakrabarti,L.;Morgan,C.;Sandler,A.D.,Combination of Id2 Knockdown Whole Tumor Cells and Checkpoint Blockade:A Potent Vaccine Strategy in a Mouse Neuroblastoma Model.PLoS One 2015,10(6),e0129237を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。抗CTLA−4(たとえば、イピリムマブ)および抗PD−1(たとえば、ニボルマブ)を含むチェックポイント阻害剤は、進行がん、たとえば、転移性黒色腫の処置にFDAの認可を受けている。Hodi,F.S.;O’Day,S.J.;McDermott,D.F.;Weber,R.W.;Sosman,J.A.;Haanen,J.B.;Gonzalez,R.;Robert,C.;Schadendorf,D.;Hassel,J.C., et al.,Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.N Engl J Med 2010,363(8),711−23;およびWolchok,J.D.;Kluger,H.;Callahan,M.K.;Postow,M.A.;Rizvi,N.A.;Lesokhin,A.M.;Segal,N.H.;Ariyan,C.E.;Gordon,R.A.;Reed,K., et al.,Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.N Engl J Med 2013,369(2),122−33を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、これらのがんでのチェックポイント阻害剤に対する応答は患者の中程度のサブセットに限られており、これにより患者のもっと大きなグループで改善された処置成績を誘発することが可能である療法の必要性が示唆されている。Postow,M.A.;Chesney,J.;Pavlick,A.C.;Robert,C.;Grossmann,K.;McDermott,D.;Linette,G.P.;Meyer,N.;Giguere,J.K.;Agarwala,S.S., et al.,Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma.N Engl J Med 2015,372(21),2006−17を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
本研究では、発明者らは、PBNPベースのPTTを使用して腫瘍を局所的に切除し、したがって、腫瘍量を破壊し続いて抗CTLA−4を全身投与する新規の光熱免疫療法アプローチを提示する。具体的には、発明者の併用療法(図9)は、(1)PBNPが腫瘍内に投与されNIRレーザーを照射されて、最初の腫瘍切除の目的を果たすPTTのための生分解性PBNP、および(2)PTTを補完する頑強な抗腫瘍免疫応答を誘発する腹腔内(i.p.)投与による抗CTLA−4チェックポイント阻害剤を使用する。光熱免疫療法の有効性は、神経芽細胞腫の治療困難なマウスモデルにおいて試験された。Chakrabarti,L.;Abou−Antoun,T.;Vukmanovic,S.;Sandler,A.D.,Reversible adaptive plasticity:a mechanism for neuroblastoma cell heterogeneity and chemo−resistance.Front Oncol 2012,2,82;およびChakrabarti,L.;Wang,B.D.;Lee,N.H.;Sandler,A.D.,A Mechanism Linking Id2−TGFbeta Crosstalk to Reversible Adaptive Plasticity in Neuroblastoma.PLoS One 2013,8(12),e83521を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、この2つの療法、PBNPベースのPTTおよび抗CTLA−4チェックポイント阻害のこの新規の組合せは相乗的に作用していずれかのモダリティー単独を用いて得られる成績以上に成績を改善すると考えられると仮定した。我々の生分解性PBNPを使用するPTTにより、神経芽細胞腫マウスモデルでは腫瘍進行が遅くなり、腫瘍負荷が減少したが、これらの腫瘍は再発し、長期間生き残ったマウスはいなかった。これとは対照的に、抗CTLA−4免疫療法と併用したPBNPベースのPTTでは、抗CTLA−4単独(12.5%)、PTT単独(0%)、または非処置のまま(0%)で処置した対照と比べて、マウスの有意に高い比率(55%)で完全な腫瘍縮小および長期生存期間(>100日)が得られた。さらに、光熱免疫療法を用いて処置された長期生存マウスは、神経芽細胞腫腫瘍でチャレンジされた非処置の無感作マウスと比べて神経芽細胞腫腫瘍再チャレンジに対する保護を示し、光熱免疫療法処置マウスにおける免疫の発現が示された。我々の所見は、がんの処置のための新規の併用療法としての抗CTLA−4を併用したPBNPベースのPTT光熱免疫療法の有効性を実証している。
結果
PBNPはpH依存性分解および安定性を示す
PBNPがpH依存的様式で安定し分解するのかどうかを確定するために、発明者らは、可視NIR(Vis−NIR)分光法および動的光散乱(DLS)を使用して、時間の関数としてならびに腫瘍内、すなわち、腫瘍間質および腫瘍リンパ管/脈管構造に投与されたナノ粒子が典型的に遭遇する条件を模倣する種々のpHレベルでPBNPの分解および安定性を測定した。腫瘍間質は少し酸性pH(約5.5)を示し、血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性pH(約7.4)を示す。Meng,F.;Cheng,R.;Deng,C.;Zhong,Z.,Intracellular drug release nano systems.Mater Today 2012,15,436−442;およびSong,C.;Griffin,R.;Park,H.J.,Influence of Tumor pH in Therapeutic Response. In Cancer Drug Discovery and Development:Cancer Drug Resistance,Inc.,B.T.H.P.,Ed.Totowa,NJ,2006;pp 21−42を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、7日間にわたり、3つのpH、腫瘍間質pHを表す5.5、中性pHを表す7.0、および血液/リンパ液pHを表す7.4でPBNPのVis−NIRおよびDLS特性を測定した。
PBNPはpH依存性分解および安定性を示す
PBNPがpH依存的様式で安定し分解するのかどうかを確定するために、発明者らは、可視NIR(Vis−NIR)分光法および動的光散乱(DLS)を使用して、時間の関数としてならびに腫瘍内、すなわち、腫瘍間質および腫瘍リンパ管/脈管構造に投与されたナノ粒子が典型的に遭遇する条件を模倣する種々のpHレベルでPBNPの分解および安定性を測定した。腫瘍間質は少し酸性pH(約5.5)を示し、血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性pH(約7.4)を示す。Meng,F.;Cheng,R.;Deng,C.;Zhong,Z.,Intracellular drug release nano systems.Mater Today 2012,15,436−442;およびSong,C.;Griffin,R.;Park,H.J.,Influence of Tumor pH in Therapeutic Response. In Cancer Drug Discovery and Development:Cancer Drug Resistance,Inc.,B.T.H.P.,Ed.Totowa,NJ,2006;pp 21−42を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、7日間にわたり、3つのpH、腫瘍間質pHを表す5.5、中性pHを表す7.0、および血液/リンパ液pHを表す7.4でPBNPのVis−NIRおよびDLS特性を測定した。
PBNPのVis−NIRスペクトルは、PBNP格子(λmax=705nm)のシアン化物架橋を通じたFeIIとFeIIIの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、650〜900nmのその特徴的吸収帯を示した。分解したPBNPは無傷のPBNPと比べて減弱した吸収帯を示すと予想されるので、この特徴的吸収帯を使用してPBNPの分解を定量化した。pH5.5(腫瘍間質のpH)でインキュベートしたPBNPは7日間にわたりそのVis−NIRスペクトルにごくわずかな変化を示し(図10A)、PBNPは7日間にわたりpH5.5でわずかに分解したことを示している。同様に、中性pHの7.0でインキュベートしたPBNPではわずかな分解特性が観察された(図10B)。しかし、溶液のpHが7.0(中性)から7.4(血液およびリンパ液を模倣してわずかにアルカリ性)にわずかに増加するに従って、7日間の経過でVis−NIRスペクトルピーク強度の有意な(51%)低減(図10C)が観察され、pH7.4でのPBNPの分解が示された。これはおそらく、ヒドロキシルイオンのわずかな過剰によりPBNPの特徴的なFeII−CN−FeIII結合が攻撃されて引き起こされたのであり、以前観察されたように、もしかすると水酸化物が形成されシアノ鉄酸塩イオンが放出されたのであろう。Itaya,K.;Akahoshi,H.;Toshima,S.,Electrochemistry of Prussian Blue Modified Electrodes:An Electrochemical Preparation Method.J Electrochem Soc 1982,129(7),1498−1500;およびKaryakin,A.A.,Prussian Blue and Its Analogues:Electrochemistry and Analytical Applications.Electroanal 2001,13(10),813−819を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PBNP分解についてのこれらの所見は、680nmでの光学密度測定およびこの波長でのその測定された質量消散係数を使用して時間とpHの関数としてPBNP濃度を測定した研究により確証された。Vis−NIR所見に類似して、PBNP濃度は7日後、pH7.4でその開始濃度の約43%まで減少し、これらの条件下でのナノ粒子の分解を示し、一方で7日間にわたりpH5.5および7.0では本質的に無変化のままであった。ナノ粒子安定性の補完的な尺度として、発明者らは経時的DLS研究を実行し、この研究はナノ粒子粒径分布および安定性を評価するのに使用した。PBNPはpH5.5および7.0でインキュベートした場合安定であることが観察された(一定の平均流体力学的径;図10Dおよび10E)。
これとは対照的に、DLSはpH7.4で7日間インキュベートした場合、PBNPのナノ粒子集団を検出することはできず(図10F)、この血液/リンパ液模倣pHでのナノ粒子の攻撃を示している。総合すると、我々の所見は、我々のPBNPが、腫瘍間質(低いほうのpH)を模倣する条件下では安定しており、血液およびリンパ液を模倣する条件下では分解する固有のpH依存性分解および安定性を示すので腫瘍内投与に適していることを示している。図10G〜10Iは、pH5.5(図10G)、pH7.0(図10H)、およびpH7.4(図10I)での7日目のPBNPのTEM画像を示しており、わずかに酸性(5.5)および中性(7.0)pHで検出可能なPBNPを、わずかにアルカリ性pH(7.4)で検出不可能なPBNPを示している。
PBNPはin vitroでもin vivoでも酸性腫瘍pHにおいて改善されたPTT能力を示す
次に、in vitro(図11A)およびin vivo(図11B)でのそのPTT能力を評価することにより、PBNPのpH依存安定性がPTT剤としてのその機能に効果を及ぼすのかどうかを確定する研究を行った。発明者らは、PBNPのPTT能力を濃度(0.01〜1mg/mL)の関数として上記の2つのpH、5.5および7.4で測定した。発明者らは、PBNPが5.5対7.4のpHでインキュベートした場合にはより高い温度まで熱くなり、これは濃度依存的様式で起こることを観察した(図11A)。これはおそらく、高いほうのpHでは、PBNPがこれらの条件下ではその分解のせいでそのPTT能力の有意な低減を示すという事実に起因しており、我々の以前の知見と一致する。PTT能力の低減も濃度依存性であり、pH7.4でインキュベートした1mg/mLのPBNPは、pH5.5での1mg/mLのPBNPと比べて、PTT後温度が約16℃減少を示し、0.1mg/mLのPBNPはこれらのpHの間でPTT能力が約7℃減少を示した。
次に、in vitro(図11A)およびin vivo(図11B)でのそのPTT能力を評価することにより、PBNPのpH依存安定性がPTT剤としてのその機能に効果を及ぼすのかどうかを確定する研究を行った。発明者らは、PBNPのPTT能力を濃度(0.01〜1mg/mL)の関数として上記の2つのpH、5.5および7.4で測定した。発明者らは、PBNPが5.5対7.4のpHでインキュベートした場合にはより高い温度まで熱くなり、これは濃度依存的様式で起こることを観察した(図11A)。これはおそらく、高いほうのpHでは、PBNPがこれらの条件下ではその分解のせいでそのPTT能力の有意な低減を示すという事実に起因しており、我々の以前の知見と一致する。PTT能力の低減も濃度依存性であり、pH7.4でインキュベートした1mg/mLのPBNPは、pH5.5での1mg/mLのPBNPと比べて、PTT後温度が約16℃減少を示し、0.1mg/mLのPBNPはこれらのpHの間でPTT能力が約7℃減少を示した。
神経芽細胞腫の同系マウスモデルでのPBNPのPTT能力を測定した。PBNPの分解および安定性特性を考慮すると、本研究の目標は、腫瘍の熱アブレーションに適した温度(すなわち、50〜55℃)を達成するのに効果的なPBNPの腫瘍内用量を決定することであった。IRサーモグラフィーを使用して、1mg/mLのPBNPを50RL腫瘍内に注射された5mm腫瘍(約60mm3腫瘍量)を保持するマウスは、1.875W/cm2レーザー出力密度で808nmのNIRレーザーを照射されると2〜4分で切除温度まで熱くなれることが確定された(図11B)。これらの結果から、PBNPが血液およびリンパ液温度と比べて腫瘍内pHでさらに高い温度まで熱くなる場合pH依存性PTT能力を示すことが示される。
PTTは神経芽細胞腫のマウスモデルにおいて腫瘍負荷を低減し腫瘍がない日数を増やす
次に、PBNPベースのPTT処置が有効かどうかを神経芽細胞腫腫瘍モデルにおいて評価した。これらの研究では、発明者らは、皮下に注射された生物発光Neuro2a細胞を使用する神経芽細胞腫のNeuro2a同系マウスモデルを利用したが、このモデルは侵襲性腫瘍モデルであることが明らかにされている。腫瘍保持マウスは、1mg/mLのPBNPを50RL腫瘍内に注射され808nmレーザーを照射される(10分間1.875W/cm2)または非処置のままにしておく、のいずれかであった(図12Aおよび12B)。腫瘍生物発光は2日毎に測定されて、腫瘍進行および処置の有効性を評価した(図12A〜12B)。PTT処置群のマウスは、非処置対照群のマウスと比べて処置後すぐにほぼ完全な腫瘍根絶を示し(最小測定生物発光;図12A)、対照群は一貫して腫瘍進行および成長を示した(測定生物発光の漸進的増加;図12B)。複数の腫瘍進行研究の集計データによれば、腫瘍保持マウスがPTTで処置されると、その腫瘍は急速に縮み、この群のマウスは腫瘍が再発する前に平均で3日の腫瘍なし日があることが示された(図12C)。さらに、腫瘍進行は非処置対照群のマウスと比べてこれらのマウスは遅く、対照群は腫瘍量の顕著な増加による証拠として急速な腫瘍進行を示した。したがって、これらの結果によれば、この高度に侵襲性の神経芽細胞腫モデルにおいて、PBNPベースのPTTが腫瘍負荷を急速に低減し、腫瘍なしの日数を増やし腫瘍成長速度を減少することができることが示される。
次に、PBNPベースのPTT処置が有効かどうかを神経芽細胞腫腫瘍モデルにおいて評価した。これらの研究では、発明者らは、皮下に注射された生物発光Neuro2a細胞を使用する神経芽細胞腫のNeuro2a同系マウスモデルを利用したが、このモデルは侵襲性腫瘍モデルであることが明らかにされている。腫瘍保持マウスは、1mg/mLのPBNPを50RL腫瘍内に注射され808nmレーザーを照射される(10分間1.875W/cm2)または非処置のままにしておく、のいずれかであった(図12Aおよび12B)。腫瘍生物発光は2日毎に測定されて、腫瘍進行および処置の有効性を評価した(図12A〜12B)。PTT処置群のマウスは、非処置対照群のマウスと比べて処置後すぐにほぼ完全な腫瘍根絶を示し(最小測定生物発光;図12A)、対照群は一貫して腫瘍進行および成長を示した(測定生物発光の漸進的増加;図12B)。複数の腫瘍進行研究の集計データによれば、腫瘍保持マウスがPTTで処置されると、その腫瘍は急速に縮み、この群のマウスは腫瘍が再発する前に平均で3日の腫瘍なし日があることが示された(図12C)。さらに、腫瘍進行は非処置対照群のマウスと比べてこれらのマウスは遅く、対照群は腫瘍量の顕著な増加による証拠として急速な腫瘍進行を示した。したがって、これらの結果によれば、この高度に侵襲性の神経芽細胞腫モデルにおいて、PBNPベースのPTTが腫瘍負荷を急速に低減し、腫瘍なしの日数を増やし腫瘍成長速度を減少することができることが示される。
PTTにより腫瘍領域へのリンパ球およびT細胞の浸潤が増加する 次に、発明者らは、PBNPベースのPTTがこの神経芽細胞腫マウスモデルにおいて免疫刺激効果を誘発するかどうかを評価しようと努めた。この目的のため、PTT後の腫瘍浸潤リンパ球の相対比率を定量化する研究を行った。これらの研究では、神経芽細胞腫腫瘍保持マウスは、PTT処置と非処置対照の2つの群に分けられた。PTT後のリンパ球および特にT細胞の腫瘍発現レベルを測定するため、マウスは処置の24および96時間後に安楽死され、残りの腫瘍組織はいずれも単離された。腫瘍は処理されて単細胞懸濁液を得て、CD45(リンパ球)およびCD3(T細胞)発現についてフローサイトメトリーを使用して分析した。24時間後、処置対非処置腫瘍においてリンパ球とT細胞集団に有意差はなかった(p>0.05)。しかし、処置96時間後、PTT処置マウスの腫瘍はリンパ球(すなわち、CD45+の平均値;9.7PTT処置対4.1%非処置;図13A〜13C)およびT細胞(すなわち、CD3+の平均値;6.2PTT処置対2.2%非処置;図13D〜13F)浸潤の有意な(p>0.05)増加を示した。これらの結果により、適切な時間の尺度が与えられるとPTT後腫瘍部位へのT細胞の動員が増加することが示唆される。発明者らは、PTT処置マウスの脾臓T細胞が腫瘍細胞と共培養された場合、リコール応答(recall response)を示すかどうかを評価することによりPTTがT細胞の包括的活性化をもたらしたかどうかも確定した。IFNγ ELISpotアッセイはPTTと対照群の間でリコール応答に有意差を示さず、PTT単独では、腫瘍根絶の成功にとり重要である強いリコール免疫応答(recall immune response)を誘発することはできないことが示される。総合すると、これらの結果によれば、図12に示されるように、PTT単独でリンパ球およびT細胞の腫瘍領域への浸潤を刺激することは可能であるが、これらの効果は治療困難ながんを根絶するほど強くはないことが示唆される。
光熱免疫療法はマウスの腫瘍縮小および長期生存期間をもたらす 我々の神経芽細胞腫モデルで改善された治療成績のために抗腫瘍免疫応答を増やすために、発明者らはPBNPベースのPTTと組み合わせて抗CTLA−4免疫療法を使用して、内在性免疫細胞の免疫抑制を減少させ強力な抗腫瘍免疫応答を刺激した。神経芽細胞腫腫瘍保持マウスは、1)PTT+抗CTLA−4群(n=9):抗腫瘍PTTおよびi.p.抗CTLA−4、2)PTT群(n=6):抗腫瘍PTT、3)抗CTLA−4群(n=8):i.p.抗CTLA−4、および4)非処置群(n=10):処置なしの4群に分けた(表1)。マウスの生物発光撮像法を通じた腫瘍進行と長期生存期間がモニターされた。
腫瘍特異的生物発光を測定する代表的経時的画像は、光熱免疫療法で処置されたマウスで腫瘍サイズの漸減およびそれに続く腫瘍の消失を示した(図14A)。さらに、腫瘍進行は、非処置対照と比べた場合、PBNPベースのPTT+抗CTLA−4群では有意に(p=0.0002)遅かった(図14B)。もっとも重要なことに、光熱免疫療法が処置マウスの55.5%において完全腫瘍縮小および長期生存期間をもたらした(図14C)。長期腫瘍なし生存期間は、抗CTLA−4単独(12.5%)、PTT(0%)、または非処置のまま(0%)で処置されたマウスについて観測された生存期間よりも有意に高かった(対数順位検定により決定)(p<0.0001)。CD4+およびCD8+細胞を枯渇させると、治療応答を抑制した(図14D)。これらの結果によれば、PTTは腫瘍負荷の最初の低減を誘発し、これは残留腫瘍細胞を標的にして除去する抗CTLA−4処置により補完され、光熱免疫療法処置マウスで長期の腫瘍のない生存期間を与えたことが示唆される。したがって、我々の結果から、腫瘍保持マウスの有意に高い比率において完全腫瘍寛解および長期生存期間を確保する上での光熱免疫療法の可能性が示唆される。
光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは、無感作、非処置マウスと比べて腫瘍再チャレンジに対する保護を示す 理想的な腫瘍療法は、腫瘍を効果的に根絶するだけではなく、身体からの除去に成功した後の再発を防止する療法だと考えられる。したがって、発明者らは次に、光熱免疫療法が、最初の腫瘍細胞(Neuro2a)で再チャレンジされた長期生存マウスにおいて保護を与えたのかどうかを調べた(図15A〜15D)。我々の研究は2つの群:1)無感作群(n=3):マウスは106のNeuro2a細胞でチャレンジされたおよび2)再チャレンジ群(n=3):前に光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは少なくとも90日の腫瘍なし生存期間の後106のNeuro2a細胞で再チャレンジされた、からなっていた。注目すべきことに、長期生存マウスのすべてが腫瘍再チャレンジに対して保護を示した。なぜならば、これらのマウスは、急速な腫瘍進行が観察された対照マウス(図15Bおよび15D)と比べると、再チャレンジ腫瘍を急速に除去した(図15Aおよび15C)からであった。再チャレンジマウスは、チャレンジの12〜14日後に高い腫瘍負荷のせいで安楽死させなければならなかった無感作マウスと比べて腫瘍再チャレンジ後90日よりも長い間生存した。これらのデータによれば、長期生存マウスでの腫瘍免疫および腫瘍再チャレンジ/再発に対する保護を与える光熱免疫療法の可能性が示唆される。
上の結果は、がんの処置のためにPBNPベースのPTTと抗CTLA−4チェックポイント阻害を組み合わせる光熱免疫療法(図9)と名付けられた新規の併用療法の有効性を説明している。PBNPは固有のpH依存性分解および安定性(図10)を示し、腫瘍の間質で観察される条件を模倣する酸性pHで安定であり、血液/リンパ液を模倣するもっと高いpHでは初発分解および不安定性を示した。周囲の組織に対して腫瘍間質のpH勾配を利用するのは、腫瘍処置を選択的に始動させる/制御する興味深い戦略である。Madhusudhan,A.;Reddy,G.B.;Venkatesham,M.;Veerabhadram,G.;Kumar,D.A.;Natarajan,S.;Yang,M.Y.;Hu,A.;Singh,S.S.,Efficient pH dependent drug delivery to target cancer cells by gold nanoparticles capped with carboxymethyl chitosan.Int J Mol Sci 2014,15(5),8216−34;およびSaboktakin,M.R.;Tabatabaie,R.M.;Maharramov,A.;Ramazanov,M.A.,Synthesis and characterization of pH−dependent glycol chitosan and dextran sulfate nanoparticles for effective brain cancer treatment.Int J Biol Macromol 2011,49(4),747−51を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。腫瘍間質は、成長中の腫瘍で急速に起こる低酸素および乳酸蓄積のせいで、典型的には酸性である。Kato,Y.;Ozawa,S.;Miyamoto,C.;Maehata,Y.;Suzuki,A.;Maeda,T.;Baba,Y.,Acidic extracellular microenvironment and cancer.Cancer Cell Int 2013,13(1),89を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PBNPが環境のpHに強く依存している特性を示すことを実証している我々のin vitroデータによれば、腫瘍特異的療法を送達するのに使用するためのその可能性が示唆され、この療法ではPBNPは腫瘍内で無傷で安定したままであり、血流またはリンパ系に入ると急速に分解し、それによって、最終的な臨床解釈のためのナノ医療の分野での重要な考慮すべき事柄であるin vivoでのナノ粒子の長期の残留性に関連する潜在的な毒性を最小限に抑える。PBNPのpH依存特性はそのPTT能力に著しい効果を及ぼし、PTT能力は腫瘍内pHと比べて血液/リンパ液pHでは減少した(図12A)。これにより、我々は、腫瘍アブレーションをもたらすのに十分なナノ粒子が腫瘍内に存在するのを確実にする腫瘍内に投与されるPBNPの濃度を確立することにした(図12B)。PTTが施される条件が万一変更される場合、類似する最適化研究を実行しなければならなくなる可能性があり、たとえば、表面対深部腫瘍は異なるナノ粒子用量、レーザー出力密度、および/または照射持続時間を必要とする可能性がある。PBNPが観察される結果よりも長い経時的安定性および有意に遅い分解動態を示す必要性が万一生じた場合(特に、静脈内投与を必要とする適用では)、PBNPは、前記のように、生体適合性ポリマー、たとえば、ポリエチレングリコールで適切に表面被覆することが可能であることをここで述べておくのは重要である。Cheng,L.;Gong,H.;Zhu,W.;Liu,J.;Wang,X.;Liu,G.;Liu,Z.,PEGylated Prussian blue nanocubes as a theranostic agent for simultaneous cancer imaging and photothermal therapy.Biomaterials 2014,35(37),9844−52を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
成長速度は遅くなったが、治療困難ガンのマウスモデル(神経芽細胞種の同系Neuro2aモデル)でのPBNPベースのPTTは、非処置マウスと比べて腫瘍保持マウスでの不完全な応答を示した(図13)。前記のように、がん細胞はその上昇した代謝速度のせいで正常組織よりも熱に感受性であるという所見に基づいて、PTTは、がんの複数の動物モデルにおいて長期の腫瘍なしの生存期間を与える。Dewhirst,M.F.,Jr.,Roemer RB,Hyperthermia.Gunderson LL,Tepper JE:New York,2000;およびKapp,D.,GMCarlson,RW,Principles of Hyperthermia.5th Edition ed.;Hamilton,Ontario,2000を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、侵襲性のがん、たとえば、我々の神経芽細胞種モデルの場合、発明者らは、がん細胞が生物発光により検出不可能である場合でも、PTTがすべてのがん細胞を除去するわけではないと疑っている。新生がん細胞はおそらく、神経芽細胞種中の潜伏がん集団についての臨床所見に類似して、新しい腫瘍に成長する。London,W.B.;Castel,V.;Monclair,T.;Ambros,P.F.;Pearson,A.D.;Cohn,S.L.;Berthold,F.;Nakagawara,A.;Ladenstein,R.L.;Iehara,T., et al.,Clinical and biologic features predictive of survival after relapse of neuroblastoma:a report from the International Neuroblastoma Risk Group project.J Clin Oncol 2011,29(24),3286−92を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。残留がん細胞は完全寛解を示す他の腫瘍モデルでさえ残ることがありうる。発明者らは、その場合には、いかなる特定の説明に縛られることなく、残留腫瘍細胞は強い免疫応答により除去される可能性があると推測する。
PBNPベースのPTTにより、腫瘍領域へのリンパ球浸潤が増加した(図13)。腫瘍に見いだされるリンパ球は、腫瘍進行を遅らせるのに効果的であることが明らかにされており、患者予後の改善に対するその潜在的影響が示唆される。Boon,T.;Coulie,P.G.;Van den Eynde,B.,Tumor antigens recognized by T cells.Immunol Today 1997,18(6),267−8;Galon,J.;Costes,A.;Sanchez−Cabo,F.;Kirilovsky,A.;Mlecnik,B.;Lagorce−Pages,C.;Tosolini,M.;Camus,M.;Berger,A.;Wind,P., et al.,Type,density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.Science 2006,313(5795),1960−4;Lee,S.;Margolin,K.,Tumor−infiltrating lymphocytes in melanoma.Curr Oncol Rep 2012,14(5),468−74;およびZhang,L.;Conejo−Garcia,J.R.;Katsaros,D.;Gimotty,P.A.;Massobrio,M.;Regnani,G.;Makrigiannakis,A.;Gray,H.;Schlienger,K.;Liebman,M.N., et al.,Intratumoral T cells,recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer.N Engl J Med 2003,348(3),203−13を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、PTT処置マウスの残留腫瘍中のCD45+細胞の増加した集団(図13A〜13C)は腫瘍根絶のためにこれらの細胞を動員する機会を提供する。Chew,A.;Salama,P.;Robbshaw,A.;Klopcic,B.;Zeps,N.;Platell,C.;Lawrance,I.C.,SPARC,FOXP3,CD8 and CD45 correlation with disease recurrence and long−term disease−free survival in colorectal cancer.PLoS One 2011,6(7),e22047を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。リンパ球のこれらのサブセット内では、T細胞も数が増加して存在しており(CD3+細胞;図13D〜13F)、免疫エフェクター細胞のこのサブセットを動員してT細胞媒介抗腫瘍応答を生み出す機会を同様に提供する。Broere,F.,Sergi GSitkovsky,Michail Vvan Eden,Willem,T cell subsets and T cell−mediated immunity.3rd edition ed.;2011を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
抗CTLA−4免疫療法と組み合わせたPTTにより、抗CTLA−4単独で処置されたマウスで観察された、たった12.5%の生存期間およびPTT単独で処置された、または非処置のままの両マウスで観察された0%の生存期間と比べて腫瘍保持マウスの55.5%で完全腫瘍縮小および長期生存期間がもたらされた(図14)。発明者らは、光熱免疫療法処置マウスでのこの有意に高い長期生存期間の利点は抗CTLA−4によるT細胞消耗および免疫抑制の逆転に起因すると考えており、この逆転はPTTによる減量と免疫応答のプライミングにより補完される。Neuro2aマウスモデルを使用した以前の研究では、本研究で観察されたよりも抗CTLA−4単独を使用して高い長期生存期間が実証されている(約40〜50%対我々の研究での12.5%)。Williams,E.L.;Dunn,S.N.;James,S.;Johnson,P.W.;Cragg,M.S.;Glennie,M.J.;Gray,J.C.,Immunomodulatory monoclonal antibodies combined with peptide vaccination provide potent immunotherapy in an aggressive murine neuroblastoma model.Clin Cancer Res 2013,19(13),3545−55を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの所見間の差は、以前の研究ではマウスが約1mmの腫瘍サイズに達したときまたは腫瘍接種後一定数の日数(典型的には5〜6日)後に抗CTLA−4免疫療法が開始されたが、発明者らは腫瘍が約5mmに達してはじめて治療を開始し、したがって、我々の研究での有意に高い腫瘍負荷および疾患進行を潜在的に反映しているという事実にもしかすると起因する可能性がある。最後に、光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは腫瘍再チャレンジに対する保護を示しており、光熱免疫療法処置マウスではこれらの腫瘍に対して免疫が発現していることが示される(図15)。しかし、これらの保護的応答を誘発する根底にある免疫学的機構を解明するにはさらなる研究が必要である。要約すると、我々の研究は、PBNP(および他のナノ粒子プラットホーム)が来るべき歳月に免疫工学において果たす可能性がある重要な役割を指定しており、そこではナノ粒子が適切な免疫応答を操作するのに使用されて進行がんを処置する。Goldberg,M.S.,Immunoengineering:how nanotechnology can enhance cancer immunotherapy.Cell 2015,161(2),201−4を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
発明者らは、神経芽細胞腫の治療困難モデルのマウスを処置するための抗CTLA−4免疫療法と組み合わせて使用した生分解性PBNPを開示する。これらのPBNPはpH依存性分解および安定性を示し、このpBNPは腫瘍内環境を模倣するより低いpHでは安定であり、血液/リンパ液を模倣するわずかにアルカリ性のpHでは分解する。PTT単独では神経芽細胞腫を有するマウスにわずかな生存期間利点しか与えないことが観察され、腫瘍内へリンパ球が強く浸潤したが、腫瘍細胞に対しては不十分なリコール応答であった。最後に、併用PTTおよびチェックポイント阻害で処置されたマウスは有意に高い完全腫瘍縮小および長期腫瘍免疫を示した。これらの結果は、治療困難がんの処置でのチェックポイント阻害剤と組み合わせたPBNPベースのPTTが有用であることを明らかにし、臨床解釈に対する概念実証前兆としての役割を果たす。
上記研究を実施するのに使用された方法は以下に記載されている。すべての合成手順は、Milli−Qsystem(Millipore Corporation、Billerica、MA)から入手される18.2MV.cmの抵抗力を有する超純水を使用して行った。ヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム三水和物(MW422.39;K4[Fe(CN)6]・3H2O)、および鉄(III)塩化六水和物(MW270.3;Fe(Cl)3・6H2O)はSigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。
抗体および細胞 抗CTLA−4抗体(9D9)はBioXCell(West LeBanon、NH)から購入した。マウスCD45−FITCおよびCD3−FITC抗体はeBioscience(San Diego、CA)から購入した。マウス神経芽細胞腫細胞株Neuro2aは最初、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手し、推奨条件下で培養した。細胞は、10%のウシ胎仔血清(FBS、Gibco、Carlbad、CA)および1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)を含有するDMEM(Gibco、Carlbad、CA)で培養した。ルシフェラーゼ発現Neuro2a細胞は、Neuro2a細胞をホタルルシフェラーゼ発現レンチウイルス粒子(GenTarget Inc.San Diego、CA)で形質導入し、ピューロマイシン(Thermo Fisher、Waltham、MA)で選択することにより構築された。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison、WI)を使用してルミノメーターで生物発光を測定することにより決定した。
動物 生後4〜6週間の雌A/JマウスはJackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から購入した。動物は腫瘍接種に先立って3〜4日間順化させた。すべての手順はChildren’s National Health Systemの施設動物管理使用委員会(the Institutional Animal Care and Use Committee)、Washington、DC(Protocol#00030439)により承認された。
PBNP合成 プルシアンブルーナノ粒子は、前記の計画を使用して合成した。手短に言えば、5mLのMilli−Q水中6.8mgのFeCl3・6H2O(2.5×10−5モル)の水溶液を、5mLのMilli−Q水中10.6mgのK4Fe(CN)6・3H2O(2.5×10−5モル)を含有する水溶液に激しい撹拌下で添加した。15分間の撹拌後、沈殿物を遠心分離(5分間20,000×g)により単離し、超音波処理(5s、高出力)によりMilli−Q水ですすいだ。粒子を超音波処理によりMilli−Q水に再懸濁する前に単離およびすすぎ工程は3回繰り返した。
PBNP安定性および分解研究 すべての粒子のサイズおよびゼータ電位はZetasizer Nano ZS(Malvern Instruments、Worcestershire、U.K.)を使用して測定した。PBNP懸濁液は、pH5.5、7.0または7.4で溶液中に再懸濁した。これらの溶液は、所望のpHが得られるまで、Milli−Q水に適切な量の緩酸および塩基を使用して作成した。次に、分析は製造業者の仕様書を使用して実施した。種々のpHでのナノ粒子のVis−NIR吸光度スペクトルはVISIONliteソフトウェアを使用してGenesys10S分光光度計(Thermo Scientific、Waltham、MA)上で測定した。
in vitro PTT in vitroでのPTTは、1.875W/cm2の出力でLaserglow Technologies(Toronto、ON、Canada)製の808nmNIRレーザーを使用して実施した。0.01mg/mL、0.1mg/mL、および1mg/mLの濃度でのPBNPは7.4または5.5のpHで再懸濁し、96ウェルプレートに蒔き、10分間照射した。経時的な温度測定は熱電対(Omega、Stamford、CT)を使用して行った。
マウス神経芽細胞腫モデルの確立 原発腫瘍を確立するためおよび再チャレンジ研究のため、ルシフェラーゼでトランスフェクトした106のNeuro2a細胞をPBSに懸濁し、既に剪毛しているマウスそれぞれの背中に皮下注射した。腫瘍成長は、IVIS LuminaIII(PerkinElmer)を使用してマウスの腫瘍生物発光を撮像することにより腫瘍接種に続いて隔日でモニターした。この動物撮像装置は経時的な腫瘍量の定量的分析を可能にする。腫瘍量は前に記載したこの撮像装置を使用して計算された。Savoldo,B.;Rooney,C.M.;Di Stasi,A.;Abken,H.;Hombach,A.;Foster,A.E.;Zhang,L.;Heslop,H.E.;Brenner,M.K.;Dotti,G.,Epstein Barr virus specific cytotoxic T lymphocytes expressing the anti−CD30zeta artificial chimeric T−cell receptor for immunotherapy of Hodgkin disease.Blood 2007,110(7),2620−30を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。任意の次元での17mm径の腫瘍サイズはエンドポイントと名付けられ、マウスはその時点で安楽死された。安楽死はCO2麻酔後の頚椎脱臼を通じて達成された。腫瘍が動物の移動性を損ねた、潰瘍化した、もしくは感染したように思われた場合、またはマウスが疾患マウスの姿勢により苦痛の兆候を呈した場合、マウスは安楽死させた。
in vivo PTT in vivoでのPTTでは、神経芽細胞腫保持マウスは、腫瘍が生物発光測定を使用して測定された少なくとも5mmのサイズ(約60mm3体積)に達すると処置された。腫瘍生着の固有の変動のせいで、マウスは同じ日にではなく、むしろ3〜5日の範囲内で処置された。マウスは処置に先立っておよび処置中に2〜5%のイソフルランを使用して麻酔された。マウスは50RLのPBNP(1mg/mL)を腫瘍内注射され、腫瘍領域は1.875W/cm2で10分間、808nmNIRレーザー(Laserglow Technologies、Toronto、ON、Canada)で照射された。追加の予防措置として、マウスの眼は、レーザーによる眼の損傷を避けるために処置中は不透明な黒いボール紙で覆われた。PTT中に到達した温度は、FLIRサーマルカメラ(Arlington、VA)を使用して測定された。
抗CTLA−4注射 抗CTLA−4抗体(マウス1匹あたり150Rg)は、併用(PTT+aCTLA−4)群では1、4、および7日目に、抗CTLA−4のみの群では0、3、および6日目に腹腔内(i.p.)に投与された。
腫瘍浸潤研究 全腫瘍を実験および対照腫瘍保持マウスから抽出し、刻んで70Rmフィルターに通した。単細胞懸濁液が得られた後、腫瘍細胞は研究に先立って完全DMEM培地で培養した。腫瘍単離物を使用してフローサイトメトリーにより白血球浸潤物を評価した。細胞はFITC(BD Biosciences)にコンジュゲートされたCD45およびCD3抗体で染色し、試料は80,000の閾値でBD Accuri血球計数器に流した。フローサイトメトリー結果の分析はFlowJo7.6(TreeStar Inc.)で行い、目的の集団および平均蛍光強度(MFI)はアンゲート生試料から決定した。
IFNγ発現研究 T細胞は腫瘍保持マウスの脾臓から収穫し、CD5免疫磁気ビーズ(Ly−1、MiLtenyi Biotec.)で単離した。200,000マウスT細胞は、ex vivo腫瘍細胞と1対1でELISpotアッセイ(IFNγELISpot、Mabtech、Inc.)に含まれており、このアッセイは製造業者のプロトコルに従って行った。脾細胞および単離されたT細胞は完全RPMI培地で培養された。
統計分析 群間の統計的有意性はスチューデントt検定を使用して決定した。フローサイトメトリーデータの2つの群間の有意差は、カイ二乗検定を使用して決定した。動物研究での群ごとの最小試料サイズを決定するため、発明者らは、α=0.05(この帰無仮説のこの検定に関連する第一種過誤可能性)および検出力=0.8を使用して検定力分析(power analysis)を行った。t検定ごとのσ/δの値を入力後(PSパワーおよび試料サイズソフトウェアを使用して)、発明者らは。これらの試料サイズは文献で公表されている類似の研究中のサイズと一致している。対数順位検定を使用して種々の群間の生存期間における統計的有意差を決定した(α=0.05、χ2が検定の臨界値を超える場合は、個々の群間の生存期間に差はないという帰無仮説を棄却する)。生存期間結果はカプラン・マイヤー曲線に従って分析した。p値<0.05は統計的に有意であるとみなした。
併用光熱T細胞療法のためのT細胞上にプルシアンブルーナノ粒子をバックパックする
ナノ粒子はがんにおいて多くの有望な治療および撮像応用を有するが、ナノ粒子は循環から急速に除去され、不十分な体内分布を示し、腫瘍ターゲティング能力が低いので、制限される場合が多い。細胞バックパッキングは、ナノ粒子が免疫細胞に結合されるが、これらの限界を克服する戦略を提供する可能性がある。この概念は図16の概要図により例示される。
ナノ粒子はがんにおいて多くの有望な治療および撮像応用を有するが、ナノ粒子は循環から急速に除去され、不十分な体内分布を示し、腫瘍ターゲティング能力が低いので、制限される場合が多い。細胞バックパッキングは、ナノ粒子が免疫細胞に結合されるが、これらの限界を克服する戦略を提供する可能性がある。この概念は図16の概要図により例示される。
本明細書に記載される結果は、抗原特異的T細胞上へのプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)のバックパッキングが、腫瘍の光熱療法のために使用されるが、抗原発現細胞まで通行することが可能であることを示している。発明者らは、T細胞上にPBNPを頑強にコンジュゲートするための計画を詳細に述べ、こうして得られるバックパックドPBNP−Tc構築物の物理的、表現型的、および機能的特性を示している。in vitro実験では、PBNPまたはT細胞処置単独のいずれかと比べた場合、バックパックドTc構築物では細胞傷害性が改善されていることが実証され、併用光熱免疫療法がin vivoで抗腫瘍有効性を改善する可能性が示唆される。
ナノ粒子は、腫瘍血管系を通じて血管外遊出し、結合したリガンドを介して直接腫瘍または細胞を標的にし、撮像モダリティー、たとえば、MRI、CT、または蛍光を使用して腫瘍視覚化を増強し、治療剤を腫瘍領域に送達するので、がん療法としては魅力的である。Srikanth M,Kessler JA.Nanotechnology−novel therapeutics for CNS disorders.Nat Rev Neurol.2012 Jun;8(6):307−18;Veiseh O,Gunn JW,Zhang M.Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging.Adv Drug Deliv Rev.2010 Mar 8;62(3):284−304;Prabhakar U,Maeda H,Jain RK,Sevick−Muraca EM,Zamboni W,Farokhzad OC, et al.Challenges and key considerations of the enhanced permeability and retention effect for nanomedicine drug delivery in oncology.Cancer Res.2013 Apr 15;73(8):2412−7;Veiseh M,Gabikian P,Bahrami SB, Veiseh O, Zhang M,Hackman RC, et al.Tumor paint:a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.Cancer Res.2007 Jul 15;67(14):6882−8;およびVeiseh O,Sun C,Fang C,Bhattarai N,Gunn J,Kievit F, et al.Specific targeting of brain tumors with an optical/magnetic resonance imaging nanoprobe across the blood−brain barrier.Cancer Res.2009 Aug 1;69(15):6200−7を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの利点にもかかわらず、がん療法におけるナノ粒子の臨床解釈は、血流からの急速な除去、不十分な体内分布、および限られた腫瘍取込みにより制限されている。細胞バックパッキングは、ナノ粒子が細胞の表面に「バックパック」されて、がん療法におけるナノ粒子のこれら限界を克服する有無を言わさぬアプローチとして役立つ。なぜならば、ナノ粒子が疾患の部位まで積極的に通行する細胞の生得的な能力を利用するからである。ターゲティングの伝達手段として細胞を使用することに加えて、細胞バックパッキングは、細胞自体の生得の抗腫瘍細胞応答にてこ入れする可能性を有する。したがって、ナノ粒子と細胞の両方がその生得な特性を保持するまたはバックパッキング進行中に組み合わされると追加の特長を提供することが重大な意味を持つ。
ナノ粒子の細胞バックパッキング(ナノシェル、リポソームおよびリポソーム様合成ナノ粒子を含む)は多くの設定で使用されており、有望な結果をもたらしている。Choi MR,Stanton−Maxey KJ,Stanley JK,Levin CS,Bardhan R,Akin D, et al.A cellular Trojan Horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors.Nano Lett. 2007 Dec;7(12):3759−65;およびStephan MT,Moon JJ,Um SH,Bershteyn A,Irvine DJ.Therapeutic cell engineering with surface−conjugated synthetic nanoparticles.Nat Med.2010 Sep;16(9):1035−41を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。プラットフォームはin vivoで細胞を追跡するMRIのように、マクロファージおよびT細胞と結合して、および光熱療法(PTT)において撮像応用での使用のために利用されてきた。Kircher MF,Allport JR,Graves EE,Love V,Josephson L,Lichtman AH, et al.In vivo high resolution three−dimensional imaging of antigen−specific cytotoxic T−lymphocyte trafficking to tumors.Cancer Res.[Research Support,Non−U.S.Gov’t Research Support,U.S.Gov’t,P.H.S.].2003 Oct 15;63(20):6838−46;およびFlynn ER,Bryant HC,Bergemann C,Larson RS,Lovato D,Sergatskov DA.Use of a SQUID array to detect T−cells with magnetic nanoparticles in determining transplant rejection.Journal of magnetism and magnetic materials.2007 Apr;311(1):429−35を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PTTは、近赤外線(NIR)光応答ナノ粒子を使用して腫瘍を熱的に切除するが、魅力的なアプローチである。PTTは低侵襲性様式で腫瘍を局所的に切除する能力、およびもしかすると内在性免疫応答の刺激を提供する。Hoffman HA,Chakarbarti L,Dumont MF,Sandler AD,Fernandes R.Prussian blue nanoparticles for laser−induced photothermal therapy of tumors.RSC Advances.2014;4(56):29729−34;Bear AS,Kennedy LC,Young JK,Perna SK,Mattos Almeida JP,Lin AY, et al.Elimination of metastatic melanoma using gold nanoshell−enabled photothermal therapy and adoptive T cell transfer.PLoS One.2013;8(7):e69073;およびWang C,Xu L,Liang C,Xiang J,Peng R,Liu Z.Immunological responses triggered by photothermal therapy with carbon nanotubes in combination with anti−CTLA−4 therapy to inhibit cancer metastasis.Adv Mater.2014 Dec 23;26(48):8154−62を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、発明者らは、免疫細胞上にバックパックされたナノ粒子は、はるかに増強された抗腫瘍応答を生じる可能性を有すると仮定した。不運なことに、このように有望な応用にもかかわらず、Choi et al.による先駆的な例の後でこの概念を組織的に調査せる研究はほとんどなかった。Choi MR,Bardhan R,Stanton−Maxey KJ,Badve S,Nakshatri H,Stantz KM, et al.Delivery of nanoparticles to brain metastases of breast cancer using a cellular Trojan horse.Cancer nanotechnology.2012 Dec;3(1−6):47−54を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
本明細書で発明者らは、抗原特異的T細胞上へのプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)、PTT用に使用することができるナノ粒子のバックパッキングを説明する概念実証研究を説明している。Fu G,Liu W,Feng S,Yue X.Prussian blue nanoparticles operate as a new generation of photothermal ablation agents for cancer therapy.Chem Commun 2012;48:11567−9を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PBNPは、合成することが可能である混合原子価鉄シアノ金属酸ナノ粒子でありセラノスティック特性を有し、これは同時に治療および診断特性を有することを意味する。以前、発明者らは、in vivoでの腫瘍の光熱療法(PTT)のためのPBNPの使用を示していた。別々の研究では、発明者らは、in vitroとin vivo設定の両方でのマルチモーダル造影剤としてのPBNPの使用を示した。Dumont MF,Hoffman HA,Yoon PR,Conklin LS,Saha SR,Paglione J, et al.Biofunctionalized gadolinium−containing Prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents.Bioconjug Chem.2014 Jan 15;25(1):129−37;Vojtech JM,Cano−Mejia J,Dumont MF,Sze RW,Fernandes R.Biofunctionalized prussian blue nanoparticles for multimodal molecular imaging applications.J Vis Exp.2015(98):e52621;およびDumont MF,Yadavilli S,Sze RW,Nazarian J,Fernandes R.Manganese−containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine.2014;9:2581−95を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。他のいくつかのグループもがんのためのセラノスティック応用にPBNPを利用し、さらに他のいくつかのグループは他のナノ粒子を免疫細胞と結合させた。Swiston AJ,Gilbert JB,Irvine DJ,Cohen RE,Rubner MF.Freely suspended cellular “backpacks” lead to cell aggregate self−assembly.Biomacromolecules.2010 Jul 12;11(7):1826−32;Fu G,Liu W,Li Y,Jin Y,Jiang L,Liang X, et al.Magnetic Prussian blue nanoparticles for targeted photothermal therapy under magnetic resonance imaging guidance.Bioconjug Chem.[Research Support,Non−U.S.Gov’t].2014 Sep 17;25(9):1655−63;Huang X,Jain PK,El−Sayed IH,El−Sayed MA.Plasmonic photothermal therapy(PPTT) using gold nanoparticles.Lasers in medical science.[Research Support,N.I.H.,Extramural Review].2008 Jul;23(3):217−28;Cho NH,Cheong TC,Min JH,Wu JH,Lee SJ,Kim D, et al.A multifunctional core−shell nanoparticle for dendritic cell−based cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol.2011 Oct;6(10):675−82;Cruz LJ,Tacken PJ,Fokkink R,Figdor CG.The influence of PEG chain length and targeting moiety on antibody−mediated delivery of nanoparticle vaccines to human dendritic cells.Biomaterials.2011 Oct;32(28):6791−803;Tomuleasa C,Braicu C,Irimie A,Craciun L,Berindan−Neagoe I.Nanopharmacology in translational hematology and oncology.Int J Nanomedicine.2014;9:3465−79;Sheen MR,Lizotte PH,Toraya−Brown S,Fiering S.Stimulating antitumor immunity with nanoparticles.Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol.2014 Sep−Oct;6(5):496−505;およびBerciano−Guerrero MA,Montesa−Pino A,Castaneda−Penalvo G,Munoz−Fernandez L,Rodriguez−Flores J.Nanoparticles in melanoma.Curr Med Chem.2014;21(32):3701−16を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、我々の知る限りでは、免疫細胞との細胞バックパッキング状況でPBNPおよびそれが提供する独特の特性を使用したグループはない。PTTについて一般に調査されてきた他のナノ粒子(たとえば、金ナノシェル、炭素ナノチューブ、金ナノロッド)と比べた場合、PBNPはいくつかの利点を与え、すなわち、PBNPはFDA認可されており(放射性汚染の内部排除のため)、ならびにPBNPは単回工程(ワンポット合成)および低コストで容易に合成され、これらのナノ粒子のスケーラブルな製造を促進するが、こうした点は臨床解釈にとって重要な2つの特長である。FDA:.Radiogardase−ferric hexacyanoferrate(ii) capsule:http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfdadocs/label/2008/021626s007lbl.pdf.[最後にアクセスしたのはMarch 7,2017]を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。我々の構築物の第2の成分、T細胞は、PBNPを腫瘍環境にまで輸送するビヒクルとして役立つ。等しく重要なのが、これらの免疫細胞が特定の抗原を標的にして抗原特異的応答を生じる能力である。この能力は、がんと日和見感染の両方のための免疫療法としての抗原特異的T細胞の使用を既に可能にしている。
本報告では、発明者らは、ナノ粒子と免疫細胞の両方の追加の撮像および治療機能は将来の研究に組み込まれるまたは利用することが可能であることに注目しつつ、抗原特異的T細胞上にバックパックされたPBNPのPTT能力を探求する。発明者らは、最初に、抗原特異的T細胞の表面にPBNPを頑強に結合させ、得られたPBNP−Tc構築物を視覚化するのに使用される手軽なコンジュゲーション計画を説明する。次に、発明者らは、サイズ、Vis−NIR光吸収特性を測定し、PTTにとって重要な特性である、T細胞に結合した場合のPBNPの光熱変換効率を計算する。続いて、発明者らは、PBNPのバックパッキング後の抗原特異的T細胞の表現型的および機能的評価を実施する。最後に、発明者らは、得られた腫瘍生存率を評価することによりバックパックドPBNP−Tc構築物の抗腫瘍効果を測定する。これらPBNP−Tc構築物は、in vitroでのPBNP媒介PTTの切除効果と抗原特異的T細胞の標的抗腫瘍効果を組み合わせる。これらの結果がタンデムPBNP−Tc細胞構築物の実現可能性および機能性についての洞察を与え、悪性腫瘍の処置のためのこの光熱免疫療法(PTI)の抗腫瘍有効性を改善する将来の研究への道を開くことが我々の希望である。
以下の方法および材料が用いられた。
化学物質および細胞培養補給物 化学物質は、他の方法で明記されていなければ、すべてSigma−Aldrich(St Louis、MO)から購入した。研究で使用した超純水は、≧18.2MΩcmの抵抗力を有するMilli−Qsystem(MQ;Millipore Corporation、Billerica、MA)から入手した。
ナノ粒子合成およびバイオコンジュゲーション PBNPは前記の通り室温で合成された。Volz HG.Pigments,Inorganic.Encyclopedia of Industrial Chemistry.Weinheim:Wiley−VCH;2006を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。手短に言えば、5mLのMQ中10.6mgのK4[Fe(CN)6]・3H2O(2.5×10−5モル)を含有する水溶液を、10mLのMQ中6.8mgのFe(Cl)3・6H2O(2.5×10−5モル)を含有する激しく撹拌される水溶液に添加した。PBNPを含有する得られた青の沈殿物はすすいで、遠心分離および超音波処理により非反応成分を取り除いた。PBNPは、静電気的自己組織化を介して1mgのPBNPあたり0.1mgのアビジンの比率で、濾過された非蛍光−またはAlexaFluor488コンジュゲートアビジン(1mg/ml、Life Technologies、Grand Island、NY)で被覆された。Jaiswal JK,Mattoussi H, Mauro JM,Simon SM.Long−term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nat Biotechnol.2003 Jan;21(1):47−51を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。この混合物は光から保護され、フルオロフォアコンジュゲートアビジンは、4℃、オービタルシェイカーで3時間にわたりPBNPを被覆させておいた。
ナノ粒子特徴付け 製作に続いて、PBNPまたはアビジン被覆PBNPのサイズおよびゼータ電位が、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments、Malvern、UK.)を使用して決定された。500〜1100nmの範囲でのPBNPおよびPBNP−Tc構築物のVis−NIRスペクトルはVISIONliteソフトウェアを使用してGenesys10S分光光度計(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)上で測定した。
細胞源 ジャーカット細胞 ヒトジャーカットT細胞はATCC(ジャーカットクローンE6−1、ATCC TIB−152)から入手し、一般的なT細胞部分を用いた細胞バックパッキングの実現可能性を調べるために使用した。ジャーカット細胞は、10%のウシ胎仔血清および1%のGlutaMaxを有するRPMI1640で維持した。
一次細胞PBMC ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)は、Children’s National Health Systemおよびベイラー医科大学の施設内審査委員会承認プロトコル下で、告知に基づく同意を得た健康なボランティアまたは未確認の破棄血液製剤から入手した。全血は無菌PBS(Cellgro、Manassas、VA)で洗浄し、PBMCはフィコール密度勾配分離により単離した。赤血球は溶解し(ACK溶解バッファー)、残りのPBMCは、2mmol/L GlutaMAX TM−1およびウシ胎仔血清を補充されたRPMI1640培地で培養した。PBMCを使用して、PHA芽細胞、リンパ芽球様細胞株(LCL)、および抗原特異的T細胞株を作成した。
CMV T細胞 CMV特異的T細胞では、PBMCは、前記の通り、CMVpp65タンパク質にまたがる重複ペプチドライブラリーでパルスした自家抗原提示細胞を用いて刺激することにより拡大させた。細胞増殖および共培養での使用に先立って、細胞は、IL2(100U/mL)の存在下で同じ重複ペプチド混合物でパルスされた照射PHA芽細胞(30Gy)で凍結アリコートから再刺激された。PHA芽細胞は、植物性血液凝集素(5μg/mL)およびIL2(100U/mL)での刺激によりPBMCから作成された。T細胞は45%クリック培地(Click's medium)(Irvine Scientific、Santa Ana、CA)、2mmol/L GlutaMAX TM−1、および5%ヒトAB血清(Valley Biomedical、Winchester VA)を補充されたRPMI1640で維持された。
EBV T細胞 EBV特異的T細胞では、PBMCは、前記の通り、EBV BZLF1、LMP2、およびEBNA1タンパク質にまたがる重複ペプチドライブラリーでパルスした自家抗原提示細胞、または自家照射LCLのいずれかを用いて刺激することにより拡大させた。細胞増殖および共培養での使用に先立って、細胞は、照射自家リンパ芽球様細胞株で凍結アリコートから再刺激された。LCLは先ずシクロスポリン(1μg/mL)の存在下でEBV B95−8ウイルスでの感染により成長させ、4週間にわたり拡大させた。T細胞は45%クリック培地(Irvine Scientific、Santa Ana、CA)、2mmol/L GlutaMAX TM−1、および5%ヒトAB血清(Valley Biomedical、Winchester VA)を補充されたRPMI1640で維持された。
T細胞上へのPBNPのバックパッキング ジャーカットTc、EBV Tc、またはCMV Tcは、以前記載された通りに(Jaiswal 2003)、4℃、オービタルシェイカー上で1mg/mLのビオチン化試薬(EZ−Link(商標)スルホNHS−LC−Biotin)と共インキュベートすることによりビオチン化した。ビオチン化試薬のスルホNHS基は細胞表面タンパク質の遊離のアミンに共有結合する。次に、ビオチン化T細胞は蛍光性アビジン被覆PBNPの溶液(10−7〜10−8mg PBNP/T細胞)に添加した。混合物は光から保護し、オービタルシェイカー上4℃で0.5〜1時間アビジン−ビオチン相互作用を生じさせておいた。次に、細胞はすすいで、遠心分離により非結合ナノ粒子を取り除いた。これに続いて、PBNPをT細胞上に効果的に「バックパック」し、構築物はPBNP−Tcと同定された。バックパッキングの効率は、共焦点顕微鏡、およびフローサイトメトリーを使用して評価した。
撮像に先立って、T細胞は製造業者の仕様書通りにバイアビリティー色素(DAPI、CFSE、カルセインブルーAMまたはカルセインレッド/オレンジ)で染色した。画像は、Children’s National Medical Center/George Washington University Core MicroscopyのOlympus BX61、Zeiss Apotome、およびOlympus FV100共焦点顕微鏡で入手し、スケールバーは20μmを示している。
フローサイトメトリー 裸のおよびバックパックドT細胞の表現型は、T細胞マーカー、たとえば、CD3(145−2C11)、CD4(Gk1.5)、CD8(53−6.7)、CD19、CD25、CD45RO、CD45RA、およびFITC、PE、PerCP、APC、APC−Cy7、またはPE−Cy7(BD Biosciences)にコンジュゲートされたPD−1(CD279、RMP1−30、Biolegend)のパネルに対する抗体で染色することにより特徴付けをした。上記の通りに、T細胞をカルセインブルーバイアビリティー色素またはCD3抗体で染色し、Alexa Fluor488−アビジン被覆PBNPに結合させた後、T細胞バックパッキングの試験を実施した。ゲートは非染色細胞に基づいて設定した。試料はFACSCaliburおよびBD Accuriフローサイトメーター上で取得し、結果はFlow Jo7.6.5(Tree Star Inc.、Ashland、OR)を使用して分析した。
光熱療法 in vitroでのPTT有効性を評価するため、PBNPまたはPBNP−Tc構築物を標的細胞と共培養した。共培養物は96ウェルプレートで確立され、個々のウェルは、2.5W/cm2で10分間、NIRレーザー(808nm Collimated Diode Laser System、Laserglow Technologies)を使用してPTTを受けさせた。PTT中のそれぞれのウェルの温度は熱電対またはFLIR熱画像システム(FLIR、Billerca、MA)を使用してモニターした。それぞれの実験条件の光熱変換効率は、以前記載された方法論(Roper 2007,Hoffman 2014)を使用して決定した。光熱変換効率のこの定式決定は、細胞および細胞培養培地成分の存在下でPBNPまたはPBNP−Tcの効果的な光熱変換効率を測定した。
細胞増殖 T細胞の増殖能力を確定するため、細胞は製造業者のプロトコルに従ってCFSEで標識し、その対応する標的で刺激した。増殖は24時間後に測定した。
ELISPOTによるIFNγ分泌 Millipore Multi Screen HTSフィルタープレート(Millipore)を、4℃で4時間または一晩10μg/mLの濃度でIFN−g捕捉抗体(Mabtech)で被覆した。プレートはPBSで洗浄し、37℃で1時間遮断した。次に、細胞は1×106/mLの濃度で蒔き、アクチン、CMV抗原、またはEBV抗原を含有するペプチド標的に曝露した。発現のため、プレートはPBS/.05%Tween20(Sigma−Aldrich)で洗浄し、37℃で2時間ビオチン化IFN−g検出抗体(.5μg/mL;Mabtech)と一緒にインキュベートし、続いて室温で1時間ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ複合体(Vectastain;Vector Laboratories)と一緒にインキュベートし、スポットは、3−アミノ−9−エチルカルバゾール基質(Sigma)溶液と一緒にインキュベートすることにより発現させた。スポット形成細胞(SFC)は計数し、自動プレート読取りシステム(Karl Zeiss)を使用してZellnet Consultingにより評価した。
共培養実験 標的細胞に対するその有効性を評価するため、PBNP−Tc構築物は2対1の比率で標的細胞(LCLまたはPHA芽細胞)に添加し、4〜8時間RPMI培地で培養し、その時点の後PTTは上記の通りに投与された。標的細胞は、アッセイに含める前に製造業者のプロトコルに従ってCFSE/Cell Trace Far Redで標識した。共培養および/またはPTTの完了に続いて、フローサイトメトリーを使用して標的細胞上のCFSE/Cell Trace Far Red発現を調べて細胞生存率を決定した。結果は、DMSOにより人為的に死滅させた標的細胞単独の負の対照、照射標的細胞、および標的細胞の正の対照と比べた。実験群は;(i)標的細胞単独、(ii)照射標的細胞(30Gy)、(iii)無関係な細胞株(EolまたはPhx)と一緒の標的細胞、(iv)DMSOと一緒の標的細胞、(v)Tcと一緒の標的細胞、(vi)PBNPと一緒の標的細胞、(vii)PBNP−Tc構築物と一緒の標的細胞、(viii)レーザーと一緒の標的細胞、(ix)Tcおよびレーザーと一緒の標的細胞、(x)PBNPおよびレーザーと一緒の標的細胞、ならびに(xi)PBNP−Tc構築物およびレーザーと一緒の標的細胞、の通りであった。T細胞の特異性および活性化を評価するため、EBV Tc(裸のまたはPBNPでバックパックされた)は2対1の比率で照射LCL細胞で刺激され、CMV Tc(裸のまたはPBNPでバックパックされた)は2対1の比率で抗原負荷PHA芽細胞で24時間刺激され、IFNγELISpotアッセイは製造業者のプロトコル(Mabtech、Cincinnati、OH)通りに実施した。
統計値 統計分析はPrism V5.00(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して行った。統計的有意性は両側スチューデントt検定から決定し、p<0.05を有する値は統計的に有意である資格があり、2つの特定の群間の比較を示すアステリスク(*)または他のすべての群との比較を示すポンド記号(#)で示される。
PBNPは抗原特異的T細胞上に頑強にバックパックすることが可能である
PBNPは合成され、合成されたままで(裸で)またはAlexaFluor488コンジュゲートしてもしくは非蛍光性アビジンで被覆される、のいずれかで使用された。動的光散乱を使用して、得られた非被覆またはアビジン被覆PBNPの流体力学的径および表面電荷(ゼータ電位)を測定した。発明者らは、裸とアビジン被覆PBNPの両方について単分散粒径分布(0.308対アビジン付きの0.387;データは示されず)およびゼータ電位約−40mVを実証した。ジャーカットT細胞は、PBNPを用いたバックパッキング一般T細胞の実行可能性を確かめるためのこれらの実験に使用した。PBNPは、示された計画(図17A)に従ってアビジン−ビオチン相互作用(Kd約10−15)を介してTc上にバックパックされ、結果としてのPBNP−Tc構築物を作り出した。共焦点蛍光顕微鏡は、裸のTc(図17B、左)と比べてこのプロトコルを使用してTc上へのPBNPのバックパッキングの成功(図17B、右)を示していた。PBNP−Tc構築物はフローサイトメトリーによっても同定可能であり、Alexa Fluor488についても陽性であったCD3+細胞上でのゲーティングは、3日間までのTcへのPBNPの安定なコンジュゲーションを示していた(図17C、17D)。
PBNPは合成され、合成されたままで(裸で)またはAlexaFluor488コンジュゲートしてもしくは非蛍光性アビジンで被覆される、のいずれかで使用された。動的光散乱を使用して、得られた非被覆またはアビジン被覆PBNPの流体力学的径および表面電荷(ゼータ電位)を測定した。発明者らは、裸とアビジン被覆PBNPの両方について単分散粒径分布(0.308対アビジン付きの0.387;データは示されず)およびゼータ電位約−40mVを実証した。ジャーカットT細胞は、PBNPを用いたバックパッキング一般T細胞の実行可能性を確かめるためのこれらの実験に使用した。PBNPは、示された計画(図17A)に従ってアビジン−ビオチン相互作用(Kd約10−15)を介してTc上にバックパックされ、結果としてのPBNP−Tc構築物を作り出した。共焦点蛍光顕微鏡は、裸のTc(図17B、左)と比べてこのプロトコルを使用してTc上へのPBNPのバックパッキングの成功(図17B、右)を示していた。PBNP−Tc構築物はフローサイトメトリーによっても同定可能であり、Alexa Fluor488についても陽性であったCD3+細胞上でのゲーティングは、3日間までのTcへのPBNPの安定なコンジュゲーションを示していた(図17C、17D)。
PBNPは、PBNP−Tc構築物中にある間その機能特性を保持する 前述のように、細胞バックパッキングの主要な目標の1つが、T細胞療法とナノ医療の両方から提供される利点を利用することである。したがって、我々の構築物の重要な設計考慮事項は、ナノ粒子と細胞の両方がバックパッキング後その特性を保持していることである。発明者らはPBNPを主に光熱療法の薬剤として使用しているので、近赤外線光を吸収し周囲の組織を切除するその能力に関係するPBNPの特性を評価する。発明者らは、Vis−NIRスペクトル、光熱加熱および冷却動態、ならびにPBNP単独と比べたPBNP−Tc構築物の光熱変換効率を測定した。PBNP−Tc構築物のVis−NIR分光学は、遊離のPBNPについて観察された特徴的吸収ピークに類似して650〜750nmの間にピークを示し、Tc単独ではこれらの波長ではピーク吸収を示さなかった(図18A)。光熱加熱および冷却動態に対するバックパッキングの効果を研究するため、遊離のPBNP、PBNP−Tc、およびTcの試料を96ウェルプレートで培養し、前記のように、808nm NIRレーザーで照射した。10分間の照射続いて室温での10分間に続いて、PBNPおよびPBNP−Tc試料は類似する加熱(約60℃まで)および冷却動態を示したが、群間には有意差はなかった(p=0.275;図18B)。到達した最高温度は、PTTを受けたTc単独の対照試料が到達した温度、またはNIRレーザー照射なしのTcもしくはPBNP単独いずれか(p<0.0001)よりも有意に高かった(p=0.0002)。温度は照射中およびこれに続いてモニターし、冷却動態は、前記の通りに、遊離のおよびバックパックドナノ粒子の光熱変換効率を計算するのに利用された。発明者らは、遊離のPBNPと比べた場合、PBNP−Tcの匹敵する光熱変換効率を見た(5.6%対4.9%、図18C)。我々の結果は、PBNPがPBNP−Tc構築物においてPTTの薬剤として機能するその能力を保持することを示している。
PBNP−Tc構築物はCMVおよびEBV抗原発現標的に対する機能性を維持し、併用光熱免疫療法において最適な機能をする
PBNPがバックパッキング後その機能特性を保持することを実証したので、発明者らは次に、抗原特異的T細胞の機能性がナノ粒子バックパックの存在により損なわれるのかどうか確定しようと努めた。一次T細胞でのプラットフォームの適応性を確定するため、発明者らは:pp65抗原にまたがる15アミノ酸ペプチドでパルスされた細胞に対して試験されたCMV特異的T細胞、およびEBV抗原をT細胞に天然に提示する照射EBV形質転換リンパ芽球様細胞株に対して試験されたEBV特異的T細胞という抗原特異的T細胞の2つのモデルを選んだ。
PBNPがバックパッキング後その機能特性を保持することを実証したので、発明者らは次に、抗原特異的T細胞の機能性がナノ粒子バックパックの存在により損なわれるのかどうか確定しようと努めた。一次T細胞でのプラットフォームの適応性を確定するため、発明者らは:pp65抗原にまたがる15アミノ酸ペプチドでパルスされた細胞に対して試験されたCMV特異的T細胞、およびEBV抗原をT細胞に天然に提示する照射EBV形質転換リンパ芽球様細胞株に対して試験されたEBV特異的T細胞という抗原特異的T細胞の2つのモデルを選んだ。
第1のアプローチはCMV特異的T細胞を使用し、発明者らはPBNPでのバックパッキングに続くその表現型および機能を評価した。CMV特異的T細胞増殖は12時間にわたるCFSE希釈により測定し、その時点の後細胞はフローサイトメトリーにより分析した。発明者らは、T細胞単独およびPBNP−Tc構築物の増殖能力は、pp65負荷PHA芽細胞により刺激されて、匹敵しており、両群とも非刺激T細胞対照よりも有意に増殖する(p=0.002、n=3;図19A、19B)ことを観察した。さらに、フローサイトメトリーによる表現型分析では、PBNP−Tcと比べた場合、T細胞中のCD8+およびCD4+T細胞のサブセットに変化がないことが示された(図19C)。次に、T細胞およびPBNP−Tcは、アクチン(非特異的)、PHA(汎特異的)、またはpp65(CMV特異的)で刺激され、ELISpotを実施して刺激の24時間後T細胞によるインターフェロンガンマ(IFNγ)分泌を定量化した(図19D)。発明者らは、T細胞単独群と比べてPBNP−Tc群中の減少したIFNγ分泌細胞を同定し、サイトカイン放出に対するPBNPバックパックのありそうな効果が示唆された。この所見にもかかわらず、発明者らは、PBNP−Tc構築物に含まれるT細胞がそれでも機能的であることを見出した。なぜならば、T細胞はpp65負荷標的細胞に対してin vitroで細胞溶解性機能を示し、表現型分析ではエフェクターおよび記憶T細胞のサブセットが維持され、バックパックド構築物でのT細胞消耗マーカーの発現が減少していることが明らかにされたからであった。
発明者らは次に、PBNP−Tcは相乗効果を示し、いずれかの処置モダリティー単独と比べた場合、特定の標的の死滅が改善されていると仮定した。PHA芽細胞(pp65パルス標的)はCell Trace Far Redバイアビリティー色素で染色され、in vitroでT細胞、PBNP、またはPBNP−Tcと1対2の比率で共培養された。4〜8時間の培養に続いて、試料の半分は0.98Wの出力で10分間PTTを受けた。個々のウェル由来の標的細胞蛍光のフローサイトメトリー分析により、腫瘍生存率の顕著な減少が示された(図19E、19F)。具体的に、発明者らは、負の対照(標的細胞単独)と比べて、標的細胞生存率はT細胞単独で44.9%減少し(+/−0.45%)(p<0.0001)、PBNPおよびレーザーベースのPTTで85+/−6.1%減少し(p<0.0001)、PBNP−Tc群では両方の処置の組合せで93.7+/−1.4%減少した(p<0.0001)ことを見出した。とりわけ、我々の結果では、いずれかの療法単独と比べた場合、PBNPバックパックドT細胞を使用するタンデム療法群での腫瘍生存率の優勢な減少が示された(p=0.0002、図19F)。
PBNP−Tc構築物はEBV抗原発現標的に対する機能性を維持し、併用光熱免疫療法において最適な機能をする
T細胞機能性の維持の成功およびCMV特異的PBNP−Tc構築物を用いた改善された治療可能性を実証したので、発明者らは、この機構がさらに適切な抗原プロセッシング系において有効かどうかを確定しようと努めた。発明者らは、健康なドナー由来のEBV特異的T細胞を作成し、PBNPを用いたバックパッキングに続いてその表現型および機能を評価した。前に実行した通りに、EBV特異的T細胞増殖は12時間にわたるCFSE希釈により測定し、その時点の後細胞はフローサイトメトリーにより分析した。発明者らは、Tc単独およびPBNP−Tc構築物の増殖能力は、LCLにより刺激されて、匹敵しており、両群とも非刺激CTL対照よりも有意に増殖する(p<0.0001、n=3;図20A、20B)ことを見出した。PBNPバックパックドT細胞の表現型分析では、予想通り、CD8+T細胞の著しい集団が明らかにされ、これは非バックパックド対照と比べた場合、PBNP−Tc構築物において変化していないように思われた(図20C)。次に、T細胞およびPBNP−Tcは、アクチン(非特異的)、PHA(汎特異的)、または照射LCL細胞(EBV特異的)で刺激され、ELISpotを実施して24時間の刺激に続くIFNγ分泌を確定した(図19D)。上と類似して、パルスペプチドモデルでは、発明者らはPBNP−TcにおいてIFNγ分泌の減少を観察し、これらの細胞ではサイトカインプロファイルが損なわれている可能性が示唆された。IFNγの減少にもかかわらず、PBNP−Tc構築物中のEBV特異的T細胞がそれでも機能的であることが確定され、T細胞はLCL標的細胞に対してin vitro実験では機能を示し、さらなる表現型分析では、エフェクターおよび記憶T細胞のサブセットが維持され、バックパックド構築物でのT細胞消耗のマーカーが維持されたまたは減少したことが明らかにされた。
T細胞機能性の維持の成功およびCMV特異的PBNP−Tc構築物を用いた改善された治療可能性を実証したので、発明者らは、この機構がさらに適切な抗原プロセッシング系において有効かどうかを確定しようと努めた。発明者らは、健康なドナー由来のEBV特異的T細胞を作成し、PBNPを用いたバックパッキングに続いてその表現型および機能を評価した。前に実行した通りに、EBV特異的T細胞増殖は12時間にわたるCFSE希釈により測定し、その時点の後細胞はフローサイトメトリーにより分析した。発明者らは、Tc単独およびPBNP−Tc構築物の増殖能力は、LCLにより刺激されて、匹敵しており、両群とも非刺激CTL対照よりも有意に増殖する(p<0.0001、n=3;図20A、20B)ことを見出した。PBNPバックパックドT細胞の表現型分析では、予想通り、CD8+T細胞の著しい集団が明らかにされ、これは非バックパックド対照と比べた場合、PBNP−Tc構築物において変化していないように思われた(図20C)。次に、T細胞およびPBNP−Tcは、アクチン(非特異的)、PHA(汎特異的)、または照射LCL細胞(EBV特異的)で刺激され、ELISpotを実施して24時間の刺激に続くIFNγ分泌を確定した(図19D)。上と類似して、パルスペプチドモデルでは、発明者らはPBNP−TcにおいてIFNγ分泌の減少を観察し、これらの細胞ではサイトカインプロファイルが損なわれている可能性が示唆された。IFNγの減少にもかかわらず、PBNP−Tc構築物中のEBV特異的T細胞がそれでも機能的であることが確定され、T細胞はLCL標的細胞に対してin vitro実験では機能を示し、さらなる表現型分析では、エフェクターおよび記憶T細胞のサブセットが維持され、バックパックド構築物でのT細胞消耗のマーカーが維持されたまたは減少したことが明らかにされた。
次に、発明者らは、T細胞療法(EBV特異的T細胞を用いて)または光熱療法(PBNPおよびレーザーを用いて)単独のいずれかと比べて、特定の標的の死滅に関してPBNP−Tc構築物の相乗効果の可能性を調べることに努めた。LCL細胞(標的細胞、EBV特異的)はCell Trace Far Redバイアビリティー色素で染色され、T細胞、PBNP、またはPBNP−Tcと1対2の比率で共培養され、4〜8時間後指示されたウェルでPTTを実施し、試料は上記の通りフローサイトメトリーにより分析した。標的細胞蛍光の分析により、腫瘍生存率の減少に成功したことが示された(図20E、20F)。標的細胞単独の負の対照と比べて、生存率はT細胞で25.4+/−0.9%減少し(p=0.007)、PBNPおよびレーザーベースのPTTで50.5+/−0.8%減少し(p=0.007)、EBV特異的PBNP−Tc群での組合せで79.8+/−0.3%減少した(p<0.0001)。これらの結果では、いずれかのモダリティー単独と比べた場合、PBNP−Tcを使用する併用光熱免疫療法では標的細胞生存率の有意な減少が示された(p=0.003、図20F)。
アビジン−ビオチンコンジュゲーションはCTL上へのPBNPの結合を成功させることができた
PBNPをT細胞に結合させるため、発明者らは、アビジン被覆PBNPをビオチン化T細胞に接触させることにより頑強なアビジン−ビオチン相互作用の利点を利用した(図17A)。動的光拡散を使用して、非被覆またはアビジン被覆PBNPの流体力学的径および表面電荷(ゼータ電位)を測定した。我々の合成およびコーティング計画から、ナノ粒子の単分散粒径分布、言い換えると、平均流体力学的径約80〜90nmが得られ、非被覆とアビジン被覆PBNPの両方について多分散インデックス約0.2およびゼータ電位約−40mVであった。発明者らはジャーカットT細胞を利用して、T細胞にPBNPをコンジュゲートさせる実現可能性を確かめて、指示された計画に従ってCTL:PBNP構築物を作り出した(図17A)。共焦点蛍光顕微鏡により、コンジュゲーション後直ちに(1日目)評価した非被覆T細胞と比べて(図17B、左)このプロトコルを使用してT細胞上へのPBNPの結合が成功したことが確かめられた(図17B、右)。CTL:PBNP構築物はフローサイトメトリーでも同定し、Alexa Fluor488に対しても陽性であったCD3+T細胞のゲーティング、それにより3日までの間CTL上へのPBNPのコンジュゲーションの成功が確かめられた(図17C&17D)。CTLに結合したPBNPの平均蛍光強度(MFI)は3日間にわたり有意でなく減少し、細胞1個あたりのナノ粒子の量はおそらく経時的に減少することが示された。これらの所見は5日間にわたって実行された共焦点顕微鏡で実証され、これにより細胞1個当たりのPBNPの数が3日目までに減少したことが示された。表面結合ナノ粒子のこの「希釈」はもしかすると、CTLの増大および/または細胞によるPBNPの内部移行に起因する可能性がある。所見により、アビジン−ビオチン親和性に基づいてCTLに結合したPBNPの細胞−ナノ粒子コンジュゲーション計画の実現可能性が例証された。CTL表現型&機能はPBNPコンジュゲーションによる影響を受けない。細胞上へのナノ粒子の安定なコンジュゲーションを達成した後の重要な設計考慮事項は、ナノ粒子とT細胞の両方がハイブリッド構築物への組込み後にその特性を保持していることを保証することである。したがって、発明者らは、抗原特異的T細胞の表現型および機能性がナノ粒子コーティングの存在によって損なわれるのかどうかを確定しようと努めた。発明者らは、CTL単独およびCTL:PBNP構築物の増殖能力が、EBVペプチド負荷PHA芽細胞により刺激されると、匹敵し、両方の群が非刺激CTL群よりも有意に増殖したことを観察した(p=0.002、n=7;図21A&21B)。フローサイトメトリーによる表現型分析では、CTL:PBNPと比べた場合、CTL単独中のCD8+およびCD4+T細胞のサブセットに変化がないことが示された(図21C&21D)。他のサブセット、CD45RAおよびCD45RO、ならびに消耗のマーカー、TIM3、LAG3、PD1の追加の分析により、CTLとCTL:PBNPの間には有意差がないことが示された。非被覆およびPBNP被覆CTLの機能的能力を評価するため、発明者らは、CTLをEBV陽性標的細胞と共培養し、上澄みのサイトカイン濃度ならびに標的細胞の生存率を測定した。刺激されたCTL対変動する濃度のPBNPにコンジュゲートされたCTLによるサイトカイン産生の試験により、サイトカイン産生には顕著な効果がなかったことが示された(図21E)。指示された条件内での標的細胞蛍光のフローサイトメトリー分析により、EBV特異的CTLを用いた処置に続くEBV抗原パルス標的細胞の生存率の顕著な減少が示され、この生存率はPBNP被覆EBV−CTLでは維持された(p=0.15、図21F)。したがって、我々の結果は、EBV特異的CTLがCTL:PBNP構築物内でナノ粒子にコンジュゲートされている間はその表現型ならびに抗原依存性増殖および機能的能力を維持することを示している。CTL上にコンジュゲートされたPBNPはPTTの薬剤として機能的である。本研究では、PBNPはPTTの薬剤として主に利用される。したがって、PBNPの基本的特性(すなわち、近赤外線(NIR)光を吸収し周囲の組織を切除するその能力)がCTL上への結合後損なわれないよう保証することが必要不可欠であった。発明者らは先ず、CTL、PBNPおよびCTL:PBNPの可視NIR吸収スペクトルを500〜1100nm波長範囲で調べて、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後650〜750nmの範囲でその特徴的な吸収ピークを保持したかどうかを試験した。発明者らは、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその可視NIR吸収特徴を保持することを見出した(図22A)。次に、発明者らは、光熱加熱および冷却動態を評価して、PBNP単独と比べた場合のCTL:PBNPの光熱変換効率を評価した。加熱および冷却プロファイルでは、この効率はNIRレーザーで直接照射された標的細胞およびCTLと共培養されその後NIRレーザーを受けた標的細胞と比べた(図22B)。我々の所見では、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその光熱変換能力を保持することが示されている。最後に、発明者らは、CTL上へのPBNPのコンジュゲーションが一次標的細胞を切除する能力に影響を及ぼすかどうかを確定した。細胞生存率(EBVペプチドでパルスされた蛍光標識された一次PHA芽細胞)のフローサイトメトリー分析では、CTL:PBNPプラスNIRレーザーを用いた処置に続いて標的細胞の生存率の減少が示された(すなわち、標的細胞+CTL:PBNP+レーザー群;図21C&21D)。これとは対照的に、NIRレーザー単独またはPBNP単独のいずれかで処置された標的細胞の負の対照は標的細胞生存率に影響を与えなかった。標的細胞単独および標的細胞+DMSOの内部標準を使用して、細胞傷害性アッセイの精度を保証した。とりわけ、我々の結果は、「標的細胞+CTL:PBNP」と「標的細胞+PBNP+レーザー」群の両方と比べて「標的細胞+CTL:PBNP+レーザー」群では標的細胞生存率が有意に減少していた(両比較でp<0.05)ことを示しており、これはおそらく、いずれかの死滅モダリティー単独と比べて、CTL:PBNP構築物に保持されているPBNPの切除能力を構築物中のCTLそれ自体の細胞傷害能力を組み合わせた有利な効果に起因する。総合すると、我々の結果は、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその固有の吸収特性、光熱加熱/冷却プロファイルおよびPTT能力を保持していることを実証している。
PBNPをT細胞に結合させるため、発明者らは、アビジン被覆PBNPをビオチン化T細胞に接触させることにより頑強なアビジン−ビオチン相互作用の利点を利用した(図17A)。動的光拡散を使用して、非被覆またはアビジン被覆PBNPの流体力学的径および表面電荷(ゼータ電位)を測定した。我々の合成およびコーティング計画から、ナノ粒子の単分散粒径分布、言い換えると、平均流体力学的径約80〜90nmが得られ、非被覆とアビジン被覆PBNPの両方について多分散インデックス約0.2およびゼータ電位約−40mVであった。発明者らはジャーカットT細胞を利用して、T細胞にPBNPをコンジュゲートさせる実現可能性を確かめて、指示された計画に従ってCTL:PBNP構築物を作り出した(図17A)。共焦点蛍光顕微鏡により、コンジュゲーション後直ちに(1日目)評価した非被覆T細胞と比べて(図17B、左)このプロトコルを使用してT細胞上へのPBNPの結合が成功したことが確かめられた(図17B、右)。CTL:PBNP構築物はフローサイトメトリーでも同定し、Alexa Fluor488に対しても陽性であったCD3+T細胞のゲーティング、それにより3日までの間CTL上へのPBNPのコンジュゲーションの成功が確かめられた(図17C&17D)。CTLに結合したPBNPの平均蛍光強度(MFI)は3日間にわたり有意でなく減少し、細胞1個あたりのナノ粒子の量はおそらく経時的に減少することが示された。これらの所見は5日間にわたって実行された共焦点顕微鏡で実証され、これにより細胞1個当たりのPBNPの数が3日目までに減少したことが示された。表面結合ナノ粒子のこの「希釈」はもしかすると、CTLの増大および/または細胞によるPBNPの内部移行に起因する可能性がある。所見により、アビジン−ビオチン親和性に基づいてCTLに結合したPBNPの細胞−ナノ粒子コンジュゲーション計画の実現可能性が例証された。CTL表現型&機能はPBNPコンジュゲーションによる影響を受けない。細胞上へのナノ粒子の安定なコンジュゲーションを達成した後の重要な設計考慮事項は、ナノ粒子とT細胞の両方がハイブリッド構築物への組込み後にその特性を保持していることを保証することである。したがって、発明者らは、抗原特異的T細胞の表現型および機能性がナノ粒子コーティングの存在によって損なわれるのかどうかを確定しようと努めた。発明者らは、CTL単独およびCTL:PBNP構築物の増殖能力が、EBVペプチド負荷PHA芽細胞により刺激されると、匹敵し、両方の群が非刺激CTL群よりも有意に増殖したことを観察した(p=0.002、n=7;図21A&21B)。フローサイトメトリーによる表現型分析では、CTL:PBNPと比べた場合、CTL単独中のCD8+およびCD4+T細胞のサブセットに変化がないことが示された(図21C&21D)。他のサブセット、CD45RAおよびCD45RO、ならびに消耗のマーカー、TIM3、LAG3、PD1の追加の分析により、CTLとCTL:PBNPの間には有意差がないことが示された。非被覆およびPBNP被覆CTLの機能的能力を評価するため、発明者らは、CTLをEBV陽性標的細胞と共培養し、上澄みのサイトカイン濃度ならびに標的細胞の生存率を測定した。刺激されたCTL対変動する濃度のPBNPにコンジュゲートされたCTLによるサイトカイン産生の試験により、サイトカイン産生には顕著な効果がなかったことが示された(図21E)。指示された条件内での標的細胞蛍光のフローサイトメトリー分析により、EBV特異的CTLを用いた処置に続くEBV抗原パルス標的細胞の生存率の顕著な減少が示され、この生存率はPBNP被覆EBV−CTLでは維持された(p=0.15、図21F)。したがって、我々の結果は、EBV特異的CTLがCTL:PBNP構築物内でナノ粒子にコンジュゲートされている間はその表現型ならびに抗原依存性増殖および機能的能力を維持することを示している。CTL上にコンジュゲートされたPBNPはPTTの薬剤として機能的である。本研究では、PBNPはPTTの薬剤として主に利用される。したがって、PBNPの基本的特性(すなわち、近赤外線(NIR)光を吸収し周囲の組織を切除するその能力)がCTL上への結合後損なわれないよう保証することが必要不可欠であった。発明者らは先ず、CTL、PBNPおよびCTL:PBNPの可視NIR吸収スペクトルを500〜1100nm波長範囲で調べて、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後650〜750nmの範囲でその特徴的な吸収ピークを保持したかどうかを試験した。発明者らは、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその可視NIR吸収特徴を保持することを見出した(図22A)。次に、発明者らは、光熱加熱および冷却動態を評価して、PBNP単独と比べた場合のCTL:PBNPの光熱変換効率を評価した。加熱および冷却プロファイルでは、この効率はNIRレーザーで直接照射された標的細胞およびCTLと共培養されその後NIRレーザーを受けた標的細胞と比べた(図22B)。我々の所見では、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその光熱変換能力を保持することが示されている。最後に、発明者らは、CTL上へのPBNPのコンジュゲーションが一次標的細胞を切除する能力に影響を及ぼすかどうかを確定した。細胞生存率(EBVペプチドでパルスされた蛍光標識された一次PHA芽細胞)のフローサイトメトリー分析では、CTL:PBNPプラスNIRレーザーを用いた処置に続いて標的細胞の生存率の減少が示された(すなわち、標的細胞+CTL:PBNP+レーザー群;図21C&21D)。これとは対照的に、NIRレーザー単独またはPBNP単独のいずれかで処置された標的細胞の負の対照は標的細胞生存率に影響を与えなかった。標的細胞単独および標的細胞+DMSOの内部標準を使用して、細胞傷害性アッセイの精度を保証した。とりわけ、我々の結果は、「標的細胞+CTL:PBNP」と「標的細胞+PBNP+レーザー」群の両方と比べて「標的細胞+CTL:PBNP+レーザー」群では標的細胞生存率が有意に減少していた(両比較でp<0.05)ことを示しており、これはおそらく、いずれかの死滅モダリティー単独と比べて、CTL:PBNP構築物に保持されているPBNPの切除能力を構築物中のCTLそれ自体の細胞傷害能力を組み合わせた有利な効果に起因する。総合すると、我々の結果は、PBNPがCTLへのコンジュゲーション後でもその固有の吸収特性、光熱加熱/冷却プロファイルおよびPTT能力を保持していることを実証している。
ナノ粒子は、薬物カプセル封入および送達の方法として医薬ではかなりの関心がもたれてきたが、免疫療法のためのその適応性はまだ十分には探求されていない。本研究では、発明者らは、PBNPの媒体として抗原特異的T細胞を使用してバイオハイブリッドナノ免疫療法を生み出すための決定的に重大な最初の工程を提供する。発明者らは、一次EBV抗原特異的CTL上にPBNPをコンジュゲートする頑強な方法を記載し、個々の成分、ならびに最終CTL:PBNP構築物を特徴付けた。重要なことに、発明者らは、コンジュゲーション方法がPBNPとCTLの両方の個々の機能を維持することを実証した。
本実施例は、抗原特異的T細胞上にプルシアンブルーナノ粒子を結合させる実現可能性を実証する概念実証研究として役に立つ。PBNPとCTLの両方がCTL:PBNP内でその固有の物理的、表現型的および機能的特性を維持した。本研究は、新しいCTL:PBNPナノ免疫療法がウイルス関連悪性腫瘍、たとえば、EBV+がんを処置するのに効果的であることを実証した。発明者らは、バイオ機能付与技法(静電気的自己組織化および細胞表面ビオチン化)およびアビジン−ビオチン相互作用を伴う一般化可能計画を使用してドナー由来EBV抗原特異的CTL上へのPBNPのコンジュゲーションに成功したことを実証した(図17)。重要なことに、CTLとPBNPの両方が細胞−ナノ粒子構築物中でその固有の特性を保持していた。具体的に、PBNP被覆CTLは、非被覆CTLと比べて、T細胞特異的マーカーのその発現および増殖し、サイトカインを発現し、EBV抗原発現標的細胞(PHA芽細胞)を溶解するその能力を保持していた(図21)。PBNPはその特徴的Vis−NIR吸収ピーク、その光熱変換能力、および一次標的細胞のPTTのために使用されるその能力を保持していた(図22)。これらの研究により、がんの処置のためのならびに感染症の処置のための治療薬としての我々のバイオハイブリッドCTL:PBNPの潜在的使用が示唆される。
ナノ粒子は、薬物カプセル封入および送達の方法として医薬ではかなりの関心がもたれてきたが、免疫療法のためのその適応性はまだ十分には探求されていない。発明者らは、PBNPの媒体として抗原特異的T細胞を使用するための方法を開示し、T細胞上にプルシアンブルーナノ粒子をカップリングする方法を強化し、PBNP−Tc構築物の個々の成分ならびに併用新生成物を特徴付けた。バックパッキング方法はPBNPおよびT細胞の個々の機能を維持する。これは光熱免疫療法には価値がある。なぜならば、光熱免疫療法はナノ粒子とT細胞の両方の既存の確立したエフェクター特性を頼りにしており、いずれの大きな変更も利益にならないからである。
発明者らは、増殖しその標的を特異的に死滅させるT細胞の能力に対して細胞バックパッキングの効果がないことを示したが、試験された細胞は確かにサイトカイン産生の減少を示し、これは、環境への種々の表面受容体およびリガンドの関与を排除する表面ナノ粒子の存在に帰すことができると考えられる。
要約すると、発明者らは、免疫療法の長所とナノ医療の長所を組み合わせる臨床プラットフォームのさらなる発展の基礎を提供するPBNPバックパックドT細胞構築物を作成する実現可能性を実証してきた。
光熱療法は神経線維腫症1型関連悪性末梢神経鞘腫瘍においてMEK阻害剤の有効性を改善する
悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は生存率が低い侵襲性腫瘍であり、40歳未満の神経線維腫症1型(NF1)患者の死亡の主な原因である。外科的切除がMPNSTの標準治療であるが、不完全であることが多く、機能喪失を生じることがあり、この患者集団のためには新規の処置方法の開発を必要とする。本明細書では、発明者らは、MPNSTのためのMEK阻害およびナノ粒子ベースの光熱療法(PTT)を含む新規の併用療法を説明している。MEK阻害剤は、NF1関連MPNSTにおいて構成的に活性化されている発がん遺伝子である、Rasにより駆動される活性を遮断し、PTTは、がん細胞を切除する低浸潤法として役に立つ。MPNSTのためにこれら一見共通点のない技法を組み合わせる我々の理論的根拠は、局所的PTTを用いた全身化学療法の有効性を実証するいくつかの報告に基づいている。発明者らは、MEK阻害剤、PD−0325901(PD901)をPTT剤としてプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)と組み合わせて、MEK活性を遮断し同時にMPNSTを切除した。これらのデータはPD901とPBNPベースのPTTを組み合わせる相乗効果を示しており、この効果はRas経路に集中してアポトーシス、ネクローシス、および増殖の減少を生じ、それによって腫瘍成長を軽減し、MPNST保持動物の生存期間を増加する。これらの結果により、MPNSTを有する患者の処置のためのこの新規の局所的−全身的併用「ナノ化学療法」の可能性が示唆される。
悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は生存率が低い侵襲性腫瘍であり、40歳未満の神経線維腫症1型(NF1)患者の死亡の主な原因である。外科的切除がMPNSTの標準治療であるが、不完全であることが多く、機能喪失を生じることがあり、この患者集団のためには新規の処置方法の開発を必要とする。本明細書では、発明者らは、MPNSTのためのMEK阻害およびナノ粒子ベースの光熱療法(PTT)を含む新規の併用療法を説明している。MEK阻害剤は、NF1関連MPNSTにおいて構成的に活性化されている発がん遺伝子である、Rasにより駆動される活性を遮断し、PTTは、がん細胞を切除する低浸潤法として役に立つ。MPNSTのためにこれら一見共通点のない技法を組み合わせる我々の理論的根拠は、局所的PTTを用いた全身化学療法の有効性を実証するいくつかの報告に基づいている。発明者らは、MEK阻害剤、PD−0325901(PD901)をPTT剤としてプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)と組み合わせて、MEK活性を遮断し同時にMPNSTを切除した。これらのデータはPD901とPBNPベースのPTTを組み合わせる相乗効果を示しており、この効果はRas経路に集中してアポトーシス、ネクローシス、および増殖の減少を生じ、それによって腫瘍成長を軽減し、MPNST保持動物の生存期間を増加する。これらの結果により、MPNSTを有する患者の処置のためのこの新規の局所的−全身的併用「ナノ化学療法」の可能性が示唆される。
神経線維腫症1型(NF1)は、世界中で約3,500人に1人の個人が発症する神経系の障害である。Riccardi,V.M.&Smirniotopoulos,J.Neurofibromatosis,Phenotype,Natural History,and Pathogenesis.Journal of Neuropathology&Experimental Neurology 51,658(1992);およびKatz,D.,Lazar,A.&Lev,D.Malignant peripheral nerve sheath tumour(MPNST):the clinical implications of cellular signaling pathways.Expert Rev Mol Med 11,e30,doi:10.1017/S1462399409001227(2009)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。この障害は、良性の神経線維腫の発症、そのうちのかなりの部分の悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)への進行、低5年生存率の侵襲性腫瘍(<50%)および40歳未満のNF1患者の死亡の主な原因であることを特徴とする。Evans,D.G. et al.Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1.Journal of medical genetics 39,311−314(2002)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
外科的切除はMPNSTの標準治療である。Grobmyer,S.R.,Reith,J.D.,Shahlaee,A.,Bush,C.H.&Hochwald,S.N.Malignant peripheral nerve sheath tumor:molecular pathogenesis and current management considerations.Journal of surgical oncology 97,340−349(2008)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、手術は侵襲性で、消耗性で、不完全であり、機能の喪失をもたらすことがある。Ferner,R.E.&Gutmann,D.H.International consensus statement on malignant peripheral nerve sheath tumors in neurofibromatosis 1.Cancer research 62,1573−1577(2002)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。このせいで、MPNSTの管理のための新規の方法の開発が必要とされる。
この必要性に応えて、発明者らは、MPNSTを処置するための全身的(経口的)に投与されるMEK阻害剤と局所的(腫瘍内)に投与されるナノ粒子ベースの光熱療法(PTT)の新規の併用療法を説明している。MEK阻害とPTTを組み合わせる理論的根拠は、多様ながんを処置するための化学療法をPTTと組み合わせる有効性が改善されたことを実証した文献の前例に基づいている。Hauck,T.S.,Jennings,T.L.,Yatsenko,T.,Kumaradas,J.C.&Chan,W.C.W.Enhancing the toxicity of cancer chemotherapeutics with gold nanorod hyperthermia.Advanced Materials 20,3832−3838(2008);You,J.,Zhang,G.&Li,C.Exceptionally high payload of doxorubicin in hollow gold nanospheres for near−infrared light−triggered drug release.ACS Nano 4,1033−1041,doi:10.1021/nn901181c(2010);Zhang,W. et al.Synergistic effect of chemo−photothermal therapy using PEGylated graphene oxide.Biomaterials 32,8555−8561,doi:10.1016/j.biomaterials.2011.07.071(2011);Mehtala,J.G. et al.Synergistic effects of cisplatin chemotherapy and gold nanorod−mediated hyperthermia on ovarian cancer cells and tumors. Nanomedicine(Lond) 9,1939−1955,doi:10.2217/nnm.13.209(2014);Li,X.,Takashima,M.,Yuba,E.,Harada,A.&Kono,K.PEGylated PAMAM dendrimer−doxorubicin conjugate−hybridized gold nanorod for combined photothermal−chemotherapy.Biomaterials 35,6576−6584,doi:10.1016/j.biomaterials.2014.04.043(2014);Tao,Y. et al.Engineered,self−assembled near−infrared photothermal agents for combined tumor immunotherapy and chemophotothermal therapy.Biomaterials 35,6646−6656,doi:10.1016/j.biomaterials.2014.04.073(2014);Wu,M.,Wang,Q.,Liu,X.&Liu,J.Highly efficient loading of doxorubicin in Prussian Blue nanocages for combined photothermal/chemotherapy against hepatocellular carcinoma.RSC Advances 5,30970−30980(2015);Fay,B.L.,Melamed,J.R.&Day,E.S.Nanoshell−mediated photothermal therapy can enhance chemotherapy in inflammatory breast cancer cells.Int J Nanomedicine 10, 6931−6941,doi:10.2147/IJN.S93031(2015);およびXue,P.,Bao J.,Wu,Y.,Zhang,Y.&Kang,Y.Magnetic Prussian blue nanoparticles for combined enzyme−responsive drug release and photothermal therapy.RSC Advances 5,28401−28409(2015)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。研究はPTT用の薬剤としてグラフェンオキシド、金ナノロッド、およびナノシェルを使用して、がん、たとえば、炎症性乳がんおよび肝細胞癌における化学療法の有効性を改善することに成功してきた。PTTが化学療法の有効性を改善する1つの機構は、標的腫瘍細胞の膜透過性を増加して、化学療法剤の取込みを増やすことによる。反対に、PTTも化学療法から利益を得ており、化学療法は全身作用を誘発してPTTの固有の局所的効果を補完する。これら以前の所見が動機となって、発明者らは、NF1関連MPNSTという文脈でこれら相補的効果を利用しようと努めた。具体的には、発明者らは、MEK阻害剤、PD−0325901(PD901)とPTT剤としてのプルシアンブルーナノ粒子(PBNP)を組み合わせて、MEK活性を遮断し、同時に近赤外線(NIR)レーザーを照射するとMPNSTを切除した。本研究は、NF1関連MPNSTの処置のためのPTTと化学療法間の相乗作用を利用する最初の試みを表している。MEK阻害剤は、Rasシグナル伝達経路を標的にする小分子阻害剤である。NF1およびNF1関連MPNST患者は特徴的に、発がん性Rasシグナル伝達の負の制御因子であるニューロフィブロミンを欠く。ニューロフィブロミンタンパク質機能がなければ、Rasは構成的活性化を与えられる。Gottfried,O.N.,Viskochil,D.H.&Couldwell,W.T.Neurofibromatosis Type 1 and tumorigenesis:molecular mechanisms and therapeutic implications.Neurosurg Focus 28,E8,doi:10.3171/2009.11.FOCUS09221(2010);およびRad,E.&Tee,A.R.Neurofibromatosis type 1:Fundamental insights into cell signaling and cancer.Semin Cell Dev Biol 52,39−46,doi:10.1016/j.semcdb.2016.02.007(2016)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。Rasシグナル伝達経路は、RAF、MEK、およびERKを通じてリン酸化カスケードを生み出し、このERKはそのリン酸化された形態で(p−ERK)で、無制御細胞増殖およびがん進行の増加に関連する遺伝子の転写に影響を及ぼす。Tanoue,T.,Adachi,M.,Moriguchi,T.&Nishida,E.A conserved docking motif in MAP kinases common to substrates, activators and regulators.Nat Cell Biol 2,110−116,doi:10.1038/35000065 (2000);およびFarassati,F. et al.Ras signaling influences permissiveness of malignant peripheral nerve sheath tumor cells to oncolytic herpes. The American journal of pathology 173,1861−1872,doi:10.2353/ajpath.2008.080376(2008)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。調査によれば、MPNSTにおいてRas活性を遮断するのにMEK阻害剤を使用する可能性が示唆されるが、これらの研究は、細胞株または動物モデルのいずれかにおいて行われ、MPNSTの処置ではあまり重要ではない結果が得られた。Varin,J. et al.Dual mTORC1/2 inhibition induces anti−proliferative effect in NF1−associated plexiform neurofibroma and malignant peripheral nerve sheath tumor cells.Oncotarget,doi:10.18632/oncotarget.7099(2016);Dodd,R.D. et al.NF1 deletion generates multiple subtypes of soft−tissue sarcoma that respond to MEK inhibition.Molecular cancer therapeutics 12,1906−1917,doi:10.1158/1535−7163.MCT−13−0189(2013);Endo,M. et al.Prognostic significance of AKT/mTOR and MAPK pathways and antitumor effect of mTOR inhibitor in NF1−related and sporadic malignant peripheral nerve sheath tumors. Clin Cancer Res 19,450−461,doi:10.1158/1078−0432.CCR−12−1067(2013);Ambrosini,G. et al.Sorafenib inhibits growth and mitogen−activated protein kinase signaling in malignant peripheral nerve sheath cells.Molecular cancer therapeutics 7,890−896,doi:10.1158/1535−7163.MCT−07−0518(2008);およびJessen,W.J. et al.MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors.J Clin Invest 123,340−347,doi:10.1172/JCI60578(2013)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。化学療法とPTTを組み合わせる有効性が改善されたことに基づいて、発明者らは、MPNSTを処置するためにPBNPベースのPTTと組み合わされるとMEK阻害剤PD901の効果がさらに強力になることを期待した。PTTは光活性化ナノ粒子および低出力NIRレーザーを使用して腫瘍を破壊するための低浸潤的方法である。Loo,C.,Lowery,A.,Halas,N.,West,J.&Drezek,R.Immunotargeted nanoshells for integrated cancer imaging and therapy.Nano letters 5,709−711(2005);およびHuang,X.,Jain,P.K.,El−Sayed,I.H.&El−Sayed,M.A.Plasmonic photothermal therapy(PPTT) using gold nanoparticles.Lasers in medical science 23,217−228(2008)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。本研究では、発明者ら
がMPNSTのPTT用にPBNPを使用し、これは発明者らが以前、皮下神経芽細胞腫の切除のために使用していた。Dumont,M.F. et al.Biofunctionalized gadolinium−containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents.Bioconjugate chemistry 25,129−137,doi:10.1021/bc4004266(2014);Dumont,M.F.,Yadavilli,S.,Sze,R.W.,Nazarian,J.&Fernandes,R.Manganese−containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors.Int J Nanomedicine 9,2581−2595,doi:10.2147/IJN.S63472(2014);Hoffman,H.A.,Chakrabarti,L.,Dumont,M.F.,Sandler,A.D.&Fernandes,R.Prussian blue nanoparticles for laser−induced photothermal therapy of tumors.RSC Advances 4,29729,doi:10.1039/c4ra05209a(2014);およびVojtech,J.M.,Cano−Mejia,J.,Dumont,M.F.,Sze,R.W.&Fernandes,R.Biofunctionalized prussian blue nanoparticles for multimodal molecular imaging applications.J Vis Exp e52621,doi:10.3791/52621(2015)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PTT用に使用される代わりのナノ粒子と比べて、PBNPはいくつかの利点を提供する。すなわち、PBNPは単一のスケーラブルな工程において低コストで容易に合成することが可能であり、ヒト経口消費(放射性中毒の処置のために)では既にFDAの認可を受けており、PTT剤として使用するためのその潜在的安全性が示唆される。Faustino,P.J. et al.Quantitative determination of cesium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 47,114−125,doi:10.1016/j.jpba.2007.11.049(2008);およびYang,Y. et al.Quantitative determination of thallium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue. International journal of pharmaceutics 353,187−194,doi:10.1016/j.ijpharm.2007.11.031(2008)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
がMPNSTのPTT用にPBNPを使用し、これは発明者らが以前、皮下神経芽細胞腫の切除のために使用していた。Dumont,M.F. et al.Biofunctionalized gadolinium−containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents.Bioconjugate chemistry 25,129−137,doi:10.1021/bc4004266(2014);Dumont,M.F.,Yadavilli,S.,Sze,R.W.,Nazarian,J.&Fernandes,R.Manganese−containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors.Int J Nanomedicine 9,2581−2595,doi:10.2147/IJN.S63472(2014);Hoffman,H.A.,Chakrabarti,L.,Dumont,M.F.,Sandler,A.D.&Fernandes,R.Prussian blue nanoparticles for laser−induced photothermal therapy of tumors.RSC Advances 4,29729,doi:10.1039/c4ra05209a(2014);およびVojtech,J.M.,Cano−Mejia,J.,Dumont,M.F.,Sze,R.W.&Fernandes,R.Biofunctionalized prussian blue nanoparticles for multimodal molecular imaging applications.J Vis Exp e52621,doi:10.3791/52621(2015)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。PTT用に使用される代わりのナノ粒子と比べて、PBNPはいくつかの利点を提供する。すなわち、PBNPは単一のスケーラブルな工程において低コストで容易に合成することが可能であり、ヒト経口消費(放射性中毒の処置のために)では既にFDAの認可を受けており、PTT剤として使用するためのその潜在的安全性が示唆される。Faustino,P.J. et al.Quantitative determination of cesium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 47,114−125,doi:10.1016/j.jpba.2007.11.049(2008);およびYang,Y. et al.Quantitative determination of thallium binding to ferric hexacyanoferrate:Prussian blue. International journal of pharmaceutics 353,187−194,doi:10.1016/j.ijpharm.2007.11.031(2008)を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
PBNPベースのPTTと併用したPD901がMPNSTに対して処置成績の改善をもたらすかどうかを確定するため、発明者らは、in vitroでマウスM2 MPNST細胞、およびin vivoでMPNSTの同系皮下マウスモデルを使用した。Antoszczyk,S. et al.Treatment of orthotopic malignant peripheral nerve sheath tumors with oncolytic herpes simplex virus.Neurooncology 16,1057−1066,doi:10.1093/neuonc/not317(2014)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。第一に、発明者らは、in vitroでのMPNST細胞を処置する際のPD901およびPBNPベースのPTTの有効性を個別に評価した。具体的には、MPNST細胞生存率に対する個々の療法の効果および療法により誘導される細胞死の機構を発明者らは評価した。次に、in vitroでのMPNST細胞の処置でのPD901/PTT組合せの有効性およびPD901とPTTのこの組合せが相乗的かどうか(用量応答および薬物相互作用計算を使用して)を評価した。最後に、in vivoでの腫瘍進行および動物生存期間に対するPD901/PTT組合せの効果を確定した。これらの研究の所見によれば、最終的臨床解釈への重要な前触れである、MPNSTを前臨床的に処置するための新規種類のナノ化学療法の実現可能性が実証されている。
PD901は、ERK活性化を遮断することによりin vivoでMPNSTを効果的に処置する M2細胞におけるPD901の作用の推定される抗MEK機構を確認するため、発明者らは、Rasシグナル伝達経路でMEKの下流に位置している、ERKの活性化に対するその効果を測定した。M2細胞は溶媒(DMSO)または1μMのPD901で4または8時間処置し、次に収穫して、溶解して、ローディングコントロールとしてアクチンを使用してリン酸化ERK(p−ERK)および全ERKについて探索した。1μMのPD901は4時間でも8時間でもERK(p−ERK)の活性化を効果的に遮断したが、これは溶媒処置レーンで観察された明瞭なp−ERKバンドと比べて、PD901処置レーンでのウェスタンブロット上に目に見えるp−ERKバンドがないことにより実証された(図23a)。M2細胞におけるp−ERK発現が減少したという我々の所見は、公表されている文献の所見と一致しており、PD901処置の数時間後にはERK活性化が減少したことが確かめられる。Hennig,M. et al.Targeting mitogen−activated protein kinase with the inhibitor PD0325901 decreases hepatocellular carcinoma growth in vitro and in mouse model systems. Hepatology 51,1218−1225,doi:10.1002/hep.23470(2010)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
MPNST生存率に対するMEK阻害の効果を確定するため、発明者らはM2細胞を変動する用量のPD901で処置し、細胞生存率を測定した。PD901はM2細胞生存率を濃度依存的様式で減少させ、IC50はおおよそ1μMであった(図23b)。これらの結果は、他の細胞株でMEK阻害剤を使用する以前の研究と一致している。De Raedt,T. et al.PRC2 loss amplifies Ras−driven transcription and confers sensitivity to BRD4−based therapies.Nature 514,247−251,doi:10.1038/nature13561(2014)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
M2生存率の減少を引き起こす機構を確定するため、細胞死の機構(アポトーシス対後期アポトーシス/ネクローシス)およびM2細胞周期に対するPD901処置の効果を分析した。PD901は、試験されたすべての濃度でアポトーシス(AnnexinV+7AAD−)と後期アポトーシス/ネクローシス(7AAD+)の両方によりM2生存率を減少させることが見出された(図23c)。さらに、PD901は濃度依存的様式でM2細胞のG0/G1期での著しい停止を引き起こし(図23d)、処置後の増殖の減少が示された。M2細胞を用いたこれらの結果により、PD901を使用するMEK阻害が、ERK活性化の遮断により、in vitroでのMPNSTを処置するための実現可能なモダリティーであることが示唆されており、ERKの活性化はさもなければ細胞増殖および分裂を増加させると考えられる;Katz,D.,Lazar,A.&Lev,D.Malignant peripheral nerve sheath tumour(MPNST):the clinical implications of cellular signaling pathways,Expert Rev Mol Med 11,e30,doi:10.1017/S1462399409001227(2009)。
PBNPはin vitroでMPNSTのPTTのための効果的な薬剤として機能する PBNPがMPNSTのPTTのための効果的な薬剤として機能するかどうかを確定するため、研究はM2細胞を使用してin vitroで行われた。第一に、動的光散乱により測定される場合単分散粒径分布(平均流体力学的径68.1nm)を有し、透過型電子顕微鏡で観察した場合その特徴的立方体構造を有するPBNPが合成された(図24a)。合成されたPBNPは、1.5W/cm2レーザー出力密度の808nmNIRレーザーで10分間照射されると濃度依存的様式で熱くなった(図24b)。重要なことに、この増加性加熱は、PBNPがNIRレーザーで同じように照射されるとM2細胞の生存率の減少を一貫してもたらした(図24c)。約45℃およびそれよりも高い温度はM2細胞の生存率を類似する程度に減少させるように思われた(おおよそ15〜25%生存可能)。興味深いことに、PBNPベースのPTTは、M2細胞においてそれが加熱される温度範囲に応じて異なるレベルのアポトーシスおよび/または後期アポトーシス/ネクローシスを始動させた。レーザー出力もレーザー照射持続時間もこれらの研究では一定に保たれていたので、この温度範囲は、今度は、PTTのために使用されるPBNPの濃度に依存していた。45〜50℃温度範囲まで加熱されたM2細胞は主にアポトーシスを通じて細胞死を始動させ、1.5W/cm2で10分間照射後46.8℃の平均温度を達成した0.03mg/mLのPBNPで処置されたM2細胞は細胞の72.2%でアポトーシスが生じた。これとは対照的に、>50℃まで加熱されたM2細胞は主に後期アポトーシス/ネクローシスを通じて細胞死を始動させ、1.5W/cm2で10分間照射後51.3℃の平均温度を達成した0.05mg/mLのPBNPで処置されたM2細胞は細胞の73.2%で後期アポトーシス/ネクローシスが生じた(図24d)。アポトーシスまたはネクローシスのいずれかにより細胞死を優先的に始動させる温度範囲についてのこの所見は、腫瘍細胞をin vitroで切除するのに金ナノロッドを使用する以前の研究により確証される。Pattani,V.P.,Shah,J.,Atalis,A.,Sharma,A.&Tunnell,J.W.Role of apoptosis and necrosis in cell death induced by nanoparticle mediated photothermal therapy.Journal of Nanoparticle Research 17,1−11,doi:10.1007/s11051−014−2822−3(2015)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、PBNPはMPNSTのPTTのための効果的な薬剤として機能し、これらの細胞の生存率をin vitroで減少させる。さらに重要なことに、我々のデータによれば、PBNPベースのPTTを使用して細胞死を誘導する潜在的に調節可能な機構(アポトーシス対ネクローシス)が示唆され、これはin vivoでのMPNSTに対する処置成績を改善するためにそれに続く研究で活用することが可能である。
PD901とPTTは相乗的に組み合わされてin vitroでMPNSTに対して改善された処置成績をもたらす M2細胞をin vitroで処置する際のPD901とPBNPベースのPTT両方の個々の有効性を確定した後、発明者らは次に処置を組み合わせる潜在的な利点を調べようと努めた。細胞生存率研究では、2つの処置をin vitroで組み合わせると、M2細胞の生存率を施された処置のいずれかの単独よりも多く有意に減少させることができることが示された(図25a)。低用量(0.125μMのPD901、「低PD901」;0.005mg/mLのPBNPベースのPTT、「低PTT」)でも高用量(1μMのPD901、「高PD901」;0.05mg/mLのPBNPベースのPTT、「高PTT」)でも、併用処置により、同一条件下で施された個々の処置よりも細胞生存率を有意に減少させた。さらに、PD901+PTT(「高コンボ」)は機能してM2細胞においてp−ERK発現を効果的に遮断し、PD901処置単独の効果を写し出していた(図25b)。PD901単独でも高コンボ処置でも類似するウェスタンブロット読み出し情報がもたらされたが、これらの効果が2つの処置群で経時的に維持されるかどうかを解明するにはさらなる研究が必要であることを心に留めておくのが重要である。以前の研究では、MEK阻害後の経時的なp−ERK発現の救済が示されている。したがって、p−ERK発現の持続性の減少をもたらす療法は、MPNSTにおいて処置成績を改善するには重要である可能性がある。
興味深いことに、PTT単独でp−ERK発現を減らすことができ(図25b)、これはそのシグナル伝達経路に沿った点でのRasシグナル伝達に対してPTTが潜在的に影響を及ぼすことを示している。この所見により、PD901とPTTはM2細胞生存率を減少させるのに機能の仕方が異なる(それぞれ、細胞周期停止対アブレーション)が、これらの効果はRasシグナル伝達経路に沿って集中している。PTTを使用してがんにおいて際立ったシグナル伝達経路を変化させることは以前調査されたことがない。NF1関連MPNSTという文脈でのRasシグナル伝達に対するPTTの効果を確定するためのさらに深い機構的研究が進行中である。
in vitroでのPD901/PTT組合せの効果を評価する研究の別の構成要素として、発明者らは、M2細胞生存率の減少に対するPD901とPTTの効果が相乗的かどうかを確定しようと努めた。個々の処置またはPD901/PTT組合せのいずれかの増加濃度に応答したin vitroでのM2細胞の生存率を測定する用量応答曲線によれば、PD901とPTTは相乗的に組み合されてM2生存率を減らすことが示された(図25c)。試験された用量の3つ(用量2、3、および4)の薬物相互作用係数(CDI)は0.7未満であると計算され、PD901とPTTの間の有意な薬物相乗作用を示している。Xu,S.P. et al.Synergistic effect of combining paeonol and cisplatin on apoptotic induction of human hepatoma cell lines.Acta pharmacologica Sinica 28,869−878,doi:10.1111/j.1745−7254.2007.00564.x(2007)を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
PD901とPTTは組み合わされてin vivoでMPNST進行を減らし生存期間を増やす 我々のin vitro所見が動機となって、発明者らは以前の文献に基づいてB6129SF1/JマウスでM2細胞株を使用してMPNSTの同系マウスモデルを作成して、新規併用療法のin vivo有効性を試験した。マウスにはM2細胞を皮下に注射した。マウスが確立した腫瘍(径で約10mm)を示すと、MPNST保持マウスは4つの群に分け、1)非処置(n=5)、2)PD901で処置(n=5)、3)PTTで処置(n=5)、または4)PD901とPTTの両方で処置(n=5)であった。腫瘍進行は毎日に測定しマウス生存期間は処置後モニターした。非処置群の腫瘍はもっとも速い速度で進行し(図26a、黒色線)、この群のマウスは14日またはそれ未満後に高い腫瘍負荷に屈した(生存期間中央値=13日;図26b)。これとは対照的に、PD901とPTTで処置したマウスは、その腫瘍進行曲線の勾配が減少していることにより示されるように、他のすべての群と比べて腫瘍成長が遅いことを示した(図26a、紫色線)。この腫瘍成長が遅いことは、PD901処置およびPTT処置マウスでそれぞれ生存期間中央値18日と15日が観察された、他のすべての処置群のマウスと比べてPD901とPTTの両方で処置したマウスでは生存期間が有意に増加したと言い換えられた(生存期間中央値29日)(図26b;p<0.05)。処置の8時間後MPNST保持マウスから抽出された腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色により、併用処置後の腫瘍細胞死の増加というこれらの所見が確かめられた(図25a)。処置成績の改善は、PBNPベースのPTTの単回局所投与およびPD901の毎日経口投与を使用して観察されたことに注目するべきである。in vitroで観察されたこれら2つの療法の収束性の生物学的効果をテコ入れするこの併用療法のさらなる最適化により、潜在的な利点、たとえば、MEK阻害剤のより少ない服用回数を与えることに加えて、現在観察される成績よりもMPNSTでの処置成績がさらに改善される可能性がある。
総合すると、我々の所見により、in vivoでのMPNSTについての処置成績の改善を達成するためにPBNPベースのPTTと併用してPD901を使用する実現可能性が実証される。
要約すると、発明者らは、2つの異なるが相乗的な処置、すなわち、小分子阻害剤PD901を使用するMEK阻害およびPBNPベースのPTTを含む新しい併用療法を開示する。発明者らは、2つの処置戦略がRasシグナル伝達経路に収束していることを示しており、これによりERK活性化が減少した。これらの効果は、PTTを介した光熱アブレーションの効果と組み合わされると、in vitroでもin vivoでもMPNSTの成長を減少させた。我々のグループでの進行中の研究は、これらのデータを頼りにして、PD901およびPTTの組合せ効果をさらに機構的に説明し、NF1関連MPNSTを臨床的に処置する際のこの併用ナノ化学療法の相乗作用をもっとよく利用する。
以下の方法および材料が用いられた。
化学物質およびPBNP合成 PDお325901(#PZ0162;PD901)はSigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。PBNPは以前記載された通りにSigma−Aldrichから購入したその構成塩から合成した;Hoffman,H.A.,Chakrabarti,L.,Dumont,M.F.,Sandler,A.D.&Fernandes,R.Prussian blue nanoparticles for laser−induced photothermal therapy of tumors.RSC Advances 4,29729,doi:10.1039/c4ra05209a(2014)。
MPNST細胞 M2マウスMPNST細胞株は、Dr.Samuel A.Rabkinから寄贈され(Massachusetts General Hospital,Harvard Medical School;Boston,Massachusetts;Antoszczyk,S. et al.Treatment of orthotopic malignant peripheral nerve sheath tumors with oncolytic herpes simplex virus. Neurooncology 16,1057−1066,doi:10.1093/neuonc/not317(2014))、最初はLF Parada研究所から入手されたNf1/Trp53ヘテロ接合体マウスにおいて自然に生じた腫瘍から単離された。M2細胞は、10%のFBSおよび1%のペニシリン/ストレプトアビジンを有するDMEM(Life Technologies、Carlsbad、CA)で培養された。
ウェスタンブロット 処置されたM2細胞は1×RIPA緩衝液[50mMのTris−HCL(pH7.4)、150mMのNaCl、1%のTritonX−100、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、1mMのEDTA、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche、Basel、Switzerland)およびホスファターゼ阻害剤(Roche、Basel、Switzerland)]に溶解された。試料はSDS−PAGEにより分析され、PVDF膜(Millipore、Billerica、MA)上に移された。次に、ブロットはTBST中5%の脱脂乳で遮断され、続いて4℃で一晩一次抗体のインキュベーションを行った。洗浄後、ブロットは室温で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗体でインキュベートされた。シグナルはECLまたはECLプラス(GE healthcare、Little Chalfont、United Kingdom)を使用し続いてフィルム現像により検出された。使用された一次抗体は以下の通りである:p−ERK(1対1,000、ウサギ、Cell Signaling、Danvers、MA)、ERK(1対2,000、ウサギ、Cell Signaling、Danvers、MA)、およびβ−アクチン(1対10,000、マウス、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)。
細胞生存率アッセイ M2細胞は96ウェル細胞培養プレートに一晩、1つのウェルあたり50,000細胞で播種した。処置後、細胞はATPベースのCellTiter−Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega、Madison、WI)を使用して生存率について分析した。
発光はEnSpire Multimodeプレートリーダー(PerkinElmer、Waltham、MA)上で読み取った。
フローサイトメトリー 適切な処置後、M2細胞はPE−AnnexinV(BD Pharmingen、Franklin Lake、NJ)および7AAD(BD Pharmingen、Franklin Lake、NJ)で染色した。細胞周期分析では、M2細胞は処置後ヨウ化プロピジウム(ThermoFisher Scientific、Carlsbad、CA)で染色した。フローサイトメトリーはBD FACSCalibur上で実施し、FlowJo7.6ソフトウェアで分析した。
動的光散乱 PBNPの流体力学的径(10μg/mL)は、製造業者の仕様書によりZetasizer(Malvern Instruments Ltd.、Malvern、United Kingdom)上で動的光散乱より測定した。
透過型電子顕微鏡 PBNPは100メッシュの標準ホルムバール格子(Electron Microscopy Sciences、Hatfield、PA)上に落とし、JEM−2100 FEG高解像度透過型電子顕微鏡上、200kVで透過型電子顕微鏡により可視化した。
光熱療法 1.5W/cm2の808nmNIRレーザー(Laserglow Technologies、Toronto、Ontario、Canada)はすべてのPTT研究用に使用された。PBNPは種々の濃度で96ウェルプレートに添加され、10分間照射された。熱電対(Omega Engineering Stamford、CT)を使用して1分間隔でウェルの温度を測定した。
in vitroでのPD901とPBNPベースのPTTの相互作用の分析 薬物相互作用係数(CDI)を使用して、以前36に記載された通りに、M2細胞をin vitroで処置する際のPD901とPBNPベースのPTTの間の相互作用を分析した。手短に言えば、M2細胞を変化する用量のPD901、PBNPベースのPTT、または併用PD901/PTTに受けさせた。使用したPD901の用量は0.125〜100μMであり;PBNPベースのPTTの用量はNIRレーザーで10分間照射される0.005〜0.1mg/mLであった。PD901+PTT併用の用量は個々の処置ごとに使用された併用用量であった。それぞれの用量でのM2細胞の生存率は、ATPベースのCellTiter−Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega、Madison、WI)を使用して測定した。所与の用量のPD901、PBNPベースのPTT、または併用PD901/PTTについてのCDIは式:CDI=(PD901/PTTに応答したM2生存率)/(PD901に応答したM2生存率×PTTに応答したM2生存率)を使用して計算した。CDI<1の値は薬物相乗性を示しており、CDI<0.7は有意な薬物相乗性を示しており、CDI=1は加算性を示しており、CDI>1は薬物拮抗性を示した。
動物 すべての動物研究はChildren’s National Health Systemの施設動物管理使用委員会(IACUC)、Washington、DC(Protocol#00030571)の承認を受けた。研究は承認されたIACUCガイドラインに従って行った。生後4〜6週間の雌B6129SF1/JマウスはJackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から購入した。マウスは毒性の症状(たとえば、病気のマウスの不自然な姿勢、感染、損なわれた移動性、体重減少、自傷行為、出血)について毎日モニターした。毒性症状のせいで安楽死させたマウスはおらず、測定可能な体重減少は記録されなかった。動物は腫瘍接種に先立って3〜4日間気候順化させた。
in vivo研究 100万のM2細胞を100μLの50%リン酸緩衝食塩水(PBS、Life Technologies、Carlsbad、CA)/50%Matrigel(Corning、Corning、NY)中B6129SF1/Jマウスの背中に注射した。腫瘍が径で10mmに到達すると処置を開始した。動物は4つの群で処置した:(1)非処置(n=5):動物は処置を受けなかった、(2)PTT処置(n=5):動物は50μLの1mg/mL PBNPを腫瘍内に注射され、1.5W/cm2NIRレーザーを10分間照射された、(3)PD901処置(n=5):動物は0.5%ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび0.2%Tween80中経口胃管栄養法により毎日5mg/kgのPD901を与えられた、および(4)PD901とPTTコンボ処置(n=5):動物は上に収載されたPTTとPD901処置の両方を与えられた。動物は、腫瘍が径で>20mmに到達した場合、その腫瘍が潰瘍化した場合、または動物が苦痛の兆候を示した場合、安楽死させた。腫瘍は毎日、キャリパーで測定された。処置の効果の組織学的分析では、腫瘍は処置の8時間後に収穫され(上記の処置;n=群あたり2〜3)、処理され、それに続く顕微鏡検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色された。
統計分析 統計分析はPrismV5.00(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して行った。プロットでの群間の統計的有意性は両側スチューデントt検定を使用して決定し、p<0.05を有する値は統計的に有意であるとみなし、アスタリスク(*)を付けて2つの特定の群間の比較を示した。**はp値<0.01を示し、***はp値<0.001を示す。p値>0.05は統計的に有意でないとみなした。群ごとの試料サイズ(n)は、各群3以上であるか、または研究ごとに明示した。動物生存期間研究では、対数順位検定を使用して種々の群間の生存期間の統計的有意差を決定した(α=0.05、χ2が検定の臨界値を超える場合は帰無仮説を棄却した)。生存期間結果はカプラン・マイヤープロットを作成することにより分析した。本分析では、p値<0.05は統計的に有意であるとみなした。
前述の開示は本発明の例となる態様を説明しているだけである。当業者であれば理解するように、本発明はその精神または本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、本発明の開示は例を示すことを意図しているが、本発明の範囲ならびに他の特許請求の範囲を限定するものではない。本開示は、本明細書の教えの容易に識別できるいかなる変異形も含み、一部、前述の特許請求の範囲を規定する。
本明細書で言及される全ての出版物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを明確に個別に示されている場合と同じ程度に参照によりその全体を本明細書に組み込まれ、参照による組込みが現れる明細書の同じ文章、段落、頁または節に現われる開示が特に参照される。
Claims (99)
- 対象を処置するための組合せ方法であって、
プルシアンブルーナノ粒子、前記ナノ粒子を含有する組成物、または前記ナノ粒子を含む細胞をそれを必要とする対象に投与すること、
前記対象を少なくとも1つの他の免疫療法で処置すること、および
前記対象を光熱的に処置すること
を含み、
任意で、前記免疫療法は、前記プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしているまたは他の方法で会合しているT細胞を投与することを含み、
任意で前記対象はがんを有する、組合せ方法。 - 前記プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーから本質的になる、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子が、プルシアンブルーを前記光熱処置に関与させるのに十分な量でプルシアンブルーを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記プルシアンブルーが、化学式:
AxByMz[M’(CN6]a・n(H2O)
(式中、
Aは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Bは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
Mは、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
M’は、任意の酸化状態のVO”Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、In、Ga、Sr、lr、Nb、Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、TI、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Lu、Ba、Hf、Ta、W、Os、Pt、Hg、La、Eu、Gd、Tb、DyおよびHoならびにその任意の組合せのうちの少なくとも1つを表し;
xは、0.1〜約1であり;
yは、0〜約1であり;
zは、0.1〜約4であり;
aは、0.1〜約4であり;
nは、0.1〜約24である)
を有する化合物または組成物を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項1に記載の組合せ方法。 - 前記プルシアンブルー成分が、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2014/0271487号により開示されるプルシアンブルー化合物のうちのいずれか1つ以上を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、約1ナノメートル〜約10ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示す、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、光熱変換過程または他の機構により、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量が0.1〜100℃の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、約0.1%〜約90%の範囲の光熱変換効率で、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中での前記プルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間または前記ナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意で前記ナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意で前記ナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、前記プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、コーティングを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−970、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウム(AOT)、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTMA−Cl)、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、臭化デシルトリメチルアンモニウム(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間前記プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングをさらに含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子を細胞に(たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に)ターゲティングする少なくとも1つの薬剤、たとえば、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、またはたとえば、ビオチン、(ストレプト)アビジン、もしくは標的細胞上に天然に存在するもしくは位置する相補的部分に結合する他の成分をさらに含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が二機能性または多機能性であり、前記ナノ粒子が、
光熱療法に適した波長で、たとえば、約600nm〜約1,200nmの範囲の波長でピーク光子吸収を示し、および/または
腫瘍、がん、悪性、もしくは新生物細胞もしくは他の標的細胞に特異的に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれる、および/または
免疫系の細胞成分に、たとえば、T細胞もしくはマクロファージに特異的に結合する、および/または
前記ナノ粒子が投与される対象の免疫系の少なくとも1つの成分と、たとえば、T細胞もしくはマクロファージと相互作用する少なくとも1つの受容体、リガンドもしくは他の部分を含む、請求項1に記載の組合せ方法。 - 前記ナノ粒子が二または多機能性であり、前記ナノ粒子が、がん、新生物もしくは腫瘍細胞に、または他の標的細胞に、または標的細胞の成分、もしくはこれから放出される物質に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記ナノ粒子が二または多機能性であり、前記ナノ粒子が、非悪性細胞または血小板、たとえば、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞に結合する少なくとも1つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよく、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、(ストレプト)アビジン、または非悪性細胞もしくは血小板上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよい、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子が、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、TNF、もしくは他のサイトカイン、抗体もしくは抗体断片、アプタマー、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または免疫細胞(T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞を含むがこれらに限定されない)を含むがこれらに限定されない、宿主免疫系と相互作用する1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤、たとえば、前記標的細胞に影響を及ぼす免疫応答を誘導または促進する、たとえば、がん、悪性、新生物、もしくは腫瘍細胞の成長、転移を阻害する、もしくは破壊する免疫療法応答を誘導する免疫調節剤をさらに含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子が、標的細胞中への前記ナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する、1つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤をさらに含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する少なくとも1つの免疫調節剤、薬物、または物質で前記対象を処置することを含み、任意で、前記少なくとも1つの他の免疫療法が、前記ナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合している、免疫調節剤、薬物または物質により媒介されてもよい、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのケモカインまたは他のサイトカインで前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのコロニー刺激因子で前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターフェロンで前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのインターロイキンで前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのTNFまたは他のアポトーシス誘導サイトカインで前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つの抗体または抗体断片、たとえば、腫瘍もしくはがん関連抗原に結合する抗体、またはたとえば、がん、新生物もしくは腫瘍に対する免疫応答を調節する抗体で前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、少なくとも1つのアプタマー、センスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドで前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、細胞、たとえば、自家性または組織適合免疫細胞で前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞で前記対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、抗CD52)、チェックポイント阻害剤、または生物学的製剤(たとえば、必ずしもプルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしていない抗原特異的T細胞または抗原提示細胞)からなる群から選択される少なくとも1つ以上の薬剤で前記対象を処置することを含み、前記薬剤は、任意で前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合によって結合しているまたは会合しており、前記ケモカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインから選択してもよく、前記サイトカインは、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインから選択してもよい、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記少なくとも1つの他の免疫療法が、その全体が参照により組み込まれる、Galuzzi,et al.,Classification of current anticancer immunotherapies,Oncotarget 5(24):12472−12508(2014)により記載される免疫療法の群から選択される免疫療法で対象を処置することを含む、請求項1に記載の組合せ方法。
- ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、または前記ナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減する、あるいは、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象(複数可)の生存率と比べて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、もしくは60ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、平均生存期間を増やす、請求項1に記載の組合せ方法。
- ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400、500%もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍、または過形成、疣贅、もしくは異常な細胞増殖に関連している他の状態を有する、あるいはウイルス、細菌、真菌、酵母、または寄生虫に感染している、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がんを有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がんを有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成を有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- 前記対象が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、または寄生虫感染を有する、請求項1に記載の組合せ方法。
- プルシアンブルーナノ粒子および請求項1に記載の免疫療法を実施するのに適した少なくとも1つの免疫療法剤を含む組成物であって、前記免疫療法剤が、抗体(たとえば、抗腫瘍抗原抗体)、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、前記免疫系を調節する免疫調節剤、薬物、または物質であり、前記免疫療法剤が前記プルシアンブルーナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合していてもよい、組成物。
- プルシアンブルーナノ粒子と組み合わせて細胞または血小板を含む、請求項1に記載の方法を実施するのに適した組成物であって、前記細胞が、任意で、T細胞、NK細胞、B細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、および樹状細胞からなる群から選択され、標的細胞、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞と選択的に相互作用する、認識する、または結合する、組成物。
- プルシアンブルーナノ粒子および請求項1に記載の免疫療法を実施するための少なくとも1つの免疫療法剤を含むキットであって、任意で、前記ナノ粒子および免疫療法成分を投与するための、印刷された、コンピュータ可読のまたはリンクアドレスされた説明書、たとえば、投与量、投与経路、レジメン、および投与部位を含んでもよく、前記ナノ粒子および免疫療法成分を組み合わせた形態で、または異なる容器中の別々の成分として含有していてもよく、そのような成分は乾燥したまたは濃縮された形態で存在し、適切な復元用媒体、緩衝剤または生理的希釈剤を伴っていてもよい、キット。
- 標的細胞に対して、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞に対して少なくとも1つの免疫療法作用を示す、または示すように操作もしくは処理されているプルシアンブルーナノ粒子を含み、それと共有結合または非共有結合によって会合している細胞。
- 生細胞、不活化非増殖性細胞(たとえば、放射線または化学剤により処理されている細胞)または死んだもしくは断片化した細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 悪性細胞または他の標的細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 非悪性細胞、たとえば、免疫細胞または少なくとも1つのがん、新生物または腫瘍エピトープを特異的に認識する細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 幹細胞、臍帯血細胞、または他の免疫的無感作細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 少なくとも1種のヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、請求項50に記載の細胞。
- ペプチド抗原(複数可)をパルスされているまたはペプチド抗原(複数可)に曝露されている、自家性、同種、異種または合成抗原提示細胞に、たとえば、がん、新生物または腫瘍の1つ以上の抗原または病原体の1つ以上の抗原または1つ以上の自己抗原を表すオーバーラップペプチドライブラリーに曝露することにより刺激されている少なくとも1つのヒト単核末梢血単核(PBMC)細胞である、請求項50に記載の細胞。
- T細胞(細胞傷害性、ヘルパー、デルタ−ガンマ、およびNK細胞型を含む)、プレT細胞またはT細胞前駆細胞である、請求項50に記載の細胞。
- マクロファージまたは単球である、請求項50に記載の細胞。
- B細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 好中球、好酸球、好塩基球または他の白血球である、請求項50に記載の細胞。
- がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープ、あるいは過形成、疣贅、異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識するT細胞または他の免疫細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識するT細胞または他の免疫細胞である、請求項50に記載の細胞。
- 前記ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、請求項50に記載の細胞。
- 前記ナノ粒子を細胞に結合させる部分をさらに含み、前記部分がビオチンまたは(ストレプト)アビジンであり、前記ナノ粒子がそれぞれ(ストレプト)アビジンまたはビオチンを含む、請求項50に記載の細胞。
- 前記細胞に結合する部分および標的細胞に結合する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性ナノ粒子を含む、請求項50に記載の細胞。
- 少なくとも1つの検出可能マーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、請求項50に記載の細胞。
- 少なくとも1つ以上の非細胞性薬剤に共有結合または非共有結合によって会合しているプルシアンブルーナノ粒子を含むコンジュゲートであって、
前記非細胞性薬剤が、任意で、分子、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、酵素、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ポリエチレングリコール、一本鎖ポリマー、フラーレン;高次分子構造体、たとえば、四次タンパク質構造体、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様粒子、またはカプシド;架橋ポリマー、凝集体、ナノ粒子(金、銀、ニッケル、鉄、銅、亜鉛、またはその酸化物およびセラミックを含むナノ粒子;シリカナノ粒子;磁性ナノ粒子;放射性ナノ粒子;細胞傷害性ナノ粒子;重合体ミセルナノ粒子;ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子;タンパク質充填ナノ粒子、セリウム酸化物ナノ粒子;ならびに任意でタンパク質分子または化学療法剤に結合しているナノダイアモンドを含む)、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、または他の非細胞性構造物を含んでいてもよく;
前記コンジュゲートが標的細胞上で少なくとも1つの免疫療法作用を示す、たとえば、がん、悪性、新生物、または腫瘍細胞の成長、転移、代謝、アポトーシス、または増殖を阻害する、コンジュゲート。 - 前記少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上の少なくとも1つ以上の決定基に結合する、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記少なくとも1つの非細胞性薬剤が、標的細胞上または前記標的細胞周辺の免疫細胞上の少なくとも1つ以上の受容体と相互作用する、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記少なくとも1つの非細胞性薬剤が、二機能性または多機能性であり、前記プルシアンブルーナノ粒子と前記標的細胞の両方に結合することができ、または標的細胞上と前記標的細胞に隣接する免疫細胞上の両方の決定基に結合することができる、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、ケモカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Chemokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるケモカインのうちのいずれかを含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、サイトカイン、たとえば、https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine(最後のアクセスFebruary 12,2016)に記載されるサイトカインのうちのいずれかを含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、オリゴデオキシヌクレオチド、たとえば、標的細胞にまたはその成分に結合するアプタマー、核酸ベクターまたは構築物、センスまたはアンチセンスDNAまたはsi−RNAを含むRNAを含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、抗体(たとえば、抗CTLA4、抗GD2、抗PD1、抗PDL1、抗CD47、抗CD20、および抗CD52)、二特異性抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合部分、または抗体のCDR;特に標的細胞または標的細胞特異的抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体または抗体成分あるいは前記標的細胞上または前記標的細胞近傍の細胞上の受容体と特異的に相互作用する抗体または抗体成分を含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤がチェックポイント阻害剤である、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、少なくとも1つのがん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞、抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、過形成、疣贅、または異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしく寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに由来する少なくとも1つの抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、副腎皮質癌、AIDS関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌(DCIS)、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍(GIST)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(M−GUS)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍または関連する状態由来の少なくとも1つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも1つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が共有結合している、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が、たとえば、前記ナノ粒子上のビオチンまたは(ストレプト)アビジンの前記非細胞性薬剤上の(ストレプト)アビジンまたはビオチンへのそれぞれの結合を介して、非共有結合している、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 前記非細胞性薬剤が、二機能性であり、前記非細胞性薬剤に結合する部分および標的細胞に結合するまたは相互作用する部分を含む少なくとも1つの二機能性または多機能性プルシアンブルーナノ粒子を含む細胞を認識するまたは相互作用する、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 抗がん剤、毒素または放射性薬剤を含むがこれらの限定されない、少なくとも1つの検出可能なマーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、請求項70に記載のコンジュゲート。
- 被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中での前記プルシアンブルー成分の分解(たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解)を低減するまたは妨げる少なくとも1つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、プルシアンブルーナノ粒子。
- 血液、血漿、CSF、組織液、リンパ液または他の体液中にin vivoで導入されると、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60、120、180分間または前記ナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意で前記ナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意で前記ナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、前記プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、請求項90に記載のナノ粒子。
- 血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子の前記プルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つ、2つまたは3つの保護層を含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- コーティングを含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- ADOGEN(登録商標)464、ALKANOL(登録商標)6112、BRIJ(登録商標)52、BRIJ(登録商標)93、BRIJ(登録商標)S2、BRIJ(登録商標)S、BRIJ(登録商標)L4、BRIJ(登録商標)O10、BRIJ(登録商標)S10、BRIJ(登録商標)S20、エチレンジアミンテトラキス(エトキシレート−ブロック−プロポキシレート)テトロール、IGEPAL(登録商標)CA−210、IGEPAL(登録商標)CA−520、IGEPAL(登録商標)CA−720、IGEPAL(登録商標)CO−630、IGEPAL(登録商標)CO−890、IGEPAL(登録商標)DM−990、MERPOL(登録商標)DA、MERPOL(登録商標)HCS、MERPOL(登録商標)OJ、MERPOL(登録商標)SE、MERPOL(登録商標)SH、MERPOL(登録商標)A、ポリ(エチレングリコール)ソルビタンテトラオレエート、ポリ(エチレングリコール)ソルビトールヘキサオレエート、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレン−ブロック−ポリ(エチレングリコール)、ソルビタンモノパルミテート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシレート、2,4,7,9−テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオール、TRITON(商標)N−101、TRITON(商標)X−100、TRITON(商標)X−100 reduced、TRITON(商標)X−114、TRITON(商標)X−405 reduced、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)85、ZONYL(登録商標)FS−300、ZONYL(登録商標)FSA、ZONYL(登録商標)FSN、ZONYL(登録商標)FSOフッ素系界面活性剤、アクリル酸(AA)、4,4’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(ACPA)、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、ビス(2−エチルヘキシル)スルホコハク酸ナトリウム(AOT)、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム(AMA−80)、Amphi−Dex、アクリロニトリル(AN)、ビス(2−ピリジルメチル)−オクタデシルアミン(BPMODA)、BRIJ(登録商標)30(ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル)、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート([C4mim]PF6)、ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(CA897)、CMC−A9、カルボキシメチル化ポリ(エチレングリコール)(CMPEG)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTMA−Cl)、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム(DDAB)、ドデカン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(DDA−HEEE)、臭化デシルトリメチルアンモニウム(DeTAB)、ドデシルメルカプタン(DDM)、デキストランエステル(DexEst)、SG1ベース二機能性アルコキシアミン(DIAMA−Na)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、メタクリル酸ドデシル(DMA)、メタクリル酸(ジメチルアミノ)エチル(DMAEMA)、3−(N,N−ジメチルミリスチルアンモニオ)(DMMA−PS)、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、メタクリル酸コポリマー(EUDRAGIT(登録商標)L100−55)、ポリ(エチレン−co−ブチレン)−b−ポリ(エチレンオキシド)(KLE3729)、ラウリルメタクリレート(LMA)、モノメトキシ−ポリ(エチレングリコール)(mPEG)、モノメトキシ−ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(mPEO−PLA)、メタクリル酸メチル(MMA)、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド(OTAB)、ポリアニリン−ポリ(スチレンスルホン酸)(PANI−PSS)、ポリ(γ−ベンジル−1−グルタメート)−b−ポリ(エチレンオキシド)(PBG−PEO)、ポリ(ε−カプロラクタム)(PCL)、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)コポリマー(PE/F68)、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ヒドロキシルブチレート)(PHB)、ポリ(ヘプタデカフルオロデシルアクリレート)(PHDFDA)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)(PHEMA)、ポリ(ラクチド−フマレート)(PLAF)、ポリ(d,l−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリドフマレート)(PLGF)、ポリ(l−乳酸)(PLLA)、プルロニックF−108、ポリ(α,β−l−リンゴ酸)(PMA)、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−メタクリル酸)(P(NIPAM−MAA))、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)エチレンジアミンコポリマー(Poloxamine 908)、ポリ(スチレンスルホン酸)(PSS)、ポリ(トリメチレンカーボネート)(PTMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、4−(v−アクリロイルオキシアルキル)オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム(SABS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SOBS)、メタクリル酸ステアリル(SMA)、5−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル(SMTAPE)、ソルビタンモノパルミテート(SPAN(登録商標)40)、ソルビタンモノオレート(SPAN(登録商標)80)、ソルビタントリオレート(SPAN(登録商標)85)、および過硫酸ナトリウム(SPS)を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- 好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも1つの緩衝剤を含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- 血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも1つの保護層を含み、任意で、前記保護層がpH7.0〜8.0で安定であり、好ましくはpH7.3〜7.5で安定である、請求項90に記載のナノ粒子。
- 血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間前記プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも1つの天然または合成ポリマーコーティングを含む、請求項90に記載のナノ粒子。
- 請求項90に記載のナノ粒子を投与することを含む、光熱療法または組み合わされた光熱と免疫療法を必要とする対象を処置するための方法。
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