CN109432426A - 一种负载dox的纳米贴剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种负载DOX的纳米贴剂及其制备方法，该制备方法包括(a)将羧基化石墨烯分散液与DOX溶液混合、避光反应、离心得到负载DOX的羧基化石墨烯；(b)将基底依次浸泡于负载DOX的羧基化石墨烯溶液和硫化铜纳晶溶液中，进行负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作，即得负载DOX的纳米贴剂。本发明提供的纳米贴剂能够选择性的粘贴在肿瘤生长位置，并且能够控制DOX药物的释放，解决了现有药物杀死正常细胞以及利用率低的问题。

Description

一种负载DOX的纳米贴剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种负载DOX的纳米贴剂及其制备方法。
背景技术
癌症严重危害着人类的生命健康，其发病率和死亡率在全世界范围内仅次于心脏病和传染疾病。目前，癌症的主要治疗手段有手术切除、放射疗法和化学疗法三种。如果肿瘤只在某个局部范围内生长或发现时间较早，适合采用手术切除和放射疗法这两种治疗手段。但是，通常病人发现肿瘤的时候己经处于癌症中晚期，且常常伴随着病灶转移和扩散的迹象，这种情况下化学疗法才是病人存活的唯一希望。
传统的化学疗法是通过口服或静脉注射抗癌药物(如阿霉素DOX、喜树碱、紫杉醇、顺铀等)，使这些抗癌药物经血液循环系统到达肿瘤部位，以此杀死癌细胞。然而，这些临床中使用的抗癌药物通常具有很强的细胞毒性，并且缺乏特异识别性，在杀死癌细胞的同时，也会杀死正常的组织细胞。此外，化学疗法还存在药物生物利用率低的缺点，具体表现为癌细胞对药物的摄入效率较低，药物在血液循环过程中难以跨过生理障碍到达肿瘤部位。
发明内容
本发明实施例的第一目的在于提供一种负载DOX的纳米贴剂，该纳米贴剂能够选择性的粘贴在肿瘤生长位置，并且能够控制DOX药物的释放，解决了现有药物杀死正常细胞以及利用率低的问题。
本发明实施例的第二目的在于提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法能够提高DOX的负载量，而且该制备方法操作简单，易于操作。
为实现上述目的，本发明实施例第一方面提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将羧基化石墨烯分散液与DOX溶液混合、避光反应、离心得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将基底依次浸泡于负载DOX的羧基化石墨烯溶液和硫化铜纳晶溶液中，进行负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；
(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作，即得负载DOX的纳米贴剂。
本发明通过上述制备方法将负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳米粒依次沉积在基底表面制备得到负载DOX的纳米贴剂，该负载DOX的纳米贴剂在激光照射下，能够促进DOX的释放，同时硫化铜纳晶释放高浓度的活性氧簇，在二者协同作用下能够快速高效的杀死肿瘤细胞。
本发明对基底的材质不做严格限制，优选地，所述基底材质选自无纺布；更优选地，在基底沉积负载DOX的羧基化石墨烯前对基底进行表面处理；具体地，所述的表面处理为采用等离子体表面处理技术处理基底表面。
本发明中对羧基化石墨烯的质量控制参数不做严格限制，优选地，所述羧基化石墨烯的尺寸为0.05-0.15μm2；本发明羧基化石墨烯可以通过市场购买得到，也可以通过如下制备方法制备得到：
首先将石墨粉和浓硫酸在冰水浴中混合搅拌，然后加入高锰酸钾进行加热，随后加入去离子水进行反应；反应结束后继续加入去离子水进行稀释，待冷却后向以上反应体系中滴加双氧水；最后对以上反应液进行过滤、洗涤，收集沉淀即得氧化石墨烯；将氢氧化钠和氯乙酸添加到氧化石墨烯的分散液中进行反应、淬火、离心洗涤至中性得到羧基化石墨烯。
本发明对硫化铜纳晶的质量控制参数不做严格限制，优选地，所述硫化铜纳晶粒径为10-20nm。
优选地，所述步骤(c)中，重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作2-4次；优选重复次数为3次。通过重复次数的增加能够提高DOX药物的负载量和释放量，然而，当重复3次时DOX药物释放量的最大；研究表明，层数过低DOX负载量较少，导致释放量较低，而层数过高由于通过激光照射使的光热材料释放量有限，影响了DOX的释放效率。
优选地，所述步骤(a)中，羧基化石墨烯分散液浓度为0.5-1.5mg/ml；DOX溶液浓度为1.5-2.5mg/ml；更优选地，所述步骤(a)中，避光反应时间11-13h；离心转速为6000-10000r/min，离心时间为8-12min。本发明通过控制反应条件以及反应物的浓度能够提高DOX在羧基化石墨烯表面的负载量，提高本发明制备得到的纳米贴剂的治疗效果。
优选地，所述步骤(b)中，负载DOX的羧基化石墨烯溶液浓度为0.8-1.2mg/mL；硫化铜纳晶溶液浓度为0.8-1.2mg/mL。
优选地，所述基底在负载DOX的羧基化石墨烯溶液中浸泡时间为1-2h；所述基底在硫化铜纳晶溶液中浸泡时间为1-2h。
本发明通过对基底表面沉积材料的浓度限定以及浸泡时间的限制，使得在基底表面沉积的负载DOX的羧基化石墨烯与硫化铜纳晶达到最佳比例，能够在激光照射下提高DOX的释放量。
本发明实施例第二方面提供一种负载DOX的纳米贴剂，所述纳米贴剂由上述制备方法制备得到；优选地，所述纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为0.39-2.12μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为0.47-2.43μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为18.2％-23.4％。该纳米贴剂能够选择性的粘贴在肿瘤生长位置，并且能够控制DOX药物的释放，能够实现特定部位用药，提高了药物的利用率，并避免药物对正常细胞造成损伤。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明实施例提供的纳米贴剂能够选择性的粘贴在肿瘤生长位置，并且能够控制DOX药物的释放，解决了现有药物杀死正常细胞以及利用率低的问题。
(2)本发明实施例提供了负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法能够提高DOX的负载量，而且该制备方法操作简单，易于操作。
(3)本发明实施例通过硫化铜纳晶的特定选择，不仅能够实现对DOX药物释放的控制，同时硫化铜纳晶在特定激光照射下能够释放高浓度的活性氧簇，在二者协同作用下能够快速高效的杀死肿瘤细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
本发明各实施例采用的原料如下：
硫化铜纳晶通过如下方法制备得到：
先配制氯化亚铜的油胺溶液，浓度为0.167mol/L；硫的十八烯溶液，浓度为0.25mol/L；再将上述两溶液混合，氮气保护下缓慢加热至180℃，并在此条件下反应15min，结束后冷却至室温；然后，加入10mL甲苯后再加入过量的乙二醇将硫化铜微晶沉淀后分离洗涤，并分散在氯仿中备用。
羧基化石墨烯由如下制备方法制备得到：
(1)将0.5g石墨粉和25ml浓硫酸在冰水浴中混合搅拌2h，然后加入2.5g高锰酸钾，加热到35℃保温4h，随后加入50ml去离子水，保持98℃反应40min；继续再加入150ml去离子水进行稀释，待冷却后向以上反应体系中滴加30％的双氧水，再用0.45μm的滤膜对以上反应液进行过滤，反复用去离子水进行洗涤，直至最后滤液的pH为5-6，收集沉淀即得氧化石墨烯；
(2)将氧化石墨烯添加的去离子水中得到浓度为2mg/ml的分散液；随后将1.4g氢氧化钠和1g氯乙酸添加到10ml的分散液中，在80℃条件下反应2h，采用20％的盐酸溶液进行淬火，离心洗涤至pH为中性得到羧基化石墨烯。
通过紫外-可见光谱、红外光谱以及原子力显微镜等方法对上述羧基化石墨烯进行表征检测，得到证明获得的羧基化石墨烯为纳米片，其尺寸为0.1μm2，厚度为1.0nm。
金纳米棒粒子通过如下方法制备得到：
(1)在缓慢搅拌下将250μL 0.01M的HAuCl4加入9.75mL 0.1M CTAB中制备金种子；随后，立即加入600μL 0.01M冰冷的NaBH4。将上述体系在28℃-30℃孵育2小时，留存备用；(2)将2mL 0.01M HAuCl4,400μL 0.01M AgNO3,800μL 0.1M HCl和40mL 0.1M CTAB混合用以制备纳米棒生长溶液；(3)当生长溶液变为无色时加入200μL金种子溶液，并将体系在30℃下储存过夜；收集Au NRs并通过离心(10,000rpm，10分钟)纯化，并将沉淀重悬浮于纯水中。
实施例1
本实施例提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将浓度为0.5mg/ml羧基化石墨烯分散液与浓度为1.5mg/mlDOX溶液混合、在室温下，避光反应11h，以10000r/min离心8min，得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将无纺布基底等离子处理5min，再浸泡于浓度为1mg/mL负载DOX的羧基化石墨烯溶液中90min，再将无纺布基底浸泡于浓度为1mg/mL硫化铜纳晶溶液中90min，实现在无纺布基底表面负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；即得负载DOX的纳米贴剂。
采用分光光度法对上述方法制备得到的负载DOX的纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的负载量以及负载DOX的羧基化石墨烯中DOX的含量进行检测，检测结果为负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为0.39μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为0.47μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为18.2％。
实施例2
本实施例提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将浓度为0.5mg/ml羧基化石墨烯分散液与浓度为1.5mg/mlDOX溶液混合、在室温下，避光反应11h，以10000r/min离心8min，得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将无纺布基底等离子处理5min，再将无纺布基底浸泡于浓度为1mg/mL负载DOX的羧基化石墨烯溶液中90min，再将无纺布基底浸泡于浓度为1mg/mL硫化铜纳晶溶液中90min，实现在无纺布基底表面负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；
(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作2次，即得负载DOX的纳米贴剂。
采用实施例1的方法对上述方法制备得到的负载DOX的纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的负载量以及负载DOX的羧基化石墨烯中DOX的含量进行检测，检测结果为负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为1.14μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为1.49μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为18.7％。
实施例3
本实施例提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将浓度为1.5mg/ml羧基化石墨烯分散液与浓度为2.5mg/mlDOX溶液混合、在室温条件下，避光反应13h，以6000r/min离心12min，得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将无纺布基底等离子处理5min，再将无纺布基底浸泡于浓度为0.8mg/mL负载DOX的羧基化石墨烯溶液中60min，再将无纺布基底浸泡于浓度为1.2mg/mL硫化铜纳晶溶液中60min，实现在无纺布基底表面负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；
(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作4次，即得负载DOX的纳米贴剂。
采用实施例1的方法对上述方法制备得到的负载DOX的纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的负载量以及负载DOX的羧基化石墨烯中DOX的含量进行检测，检测结果为负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为2.12μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为2.43μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为23.4％。
实施例4
本实施例提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将浓度为1mg/ml羧基化石墨烯分散液与浓度为2mg/mlDOX溶液混合在室温条件下，避光反应12h，以8000r/min离心10min，得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将无纺布基底等离子处理5min，再将无纺布基底浸泡于浓度为1.2mg/mL负载DOX的羧基化石墨烯溶液中120min，再将无纺布基底浸泡于浓度为0.8mg/mL硫化铜纳晶溶液中120min，实现在无纺布基底表面负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；
(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作3次，即得负载DOX的纳米贴剂。
采用实施例1的方法对上述方法制备得到的负载DOX的纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的负载量以及负载DOX的羧基化石墨烯中DOX的含量进行检测，检测结果为负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为1.64μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为1.92μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为20.1％。
对照例1
本对照例提供一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，该制备方法与实施例4的制备方法基本相同，区别仅在于将硫化铜纳晶替换成金纳米棒粒子。
采用实施例1的方法对上述方法制备得到的负载DOX的纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯和金纳米棒粒子的负载量以及负载DOX的羧基化石墨烯中DOX的含量进行检测，检测结果为负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为1.62μg/mm2；金纳米棒粒子的负载量为1.98μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为20.3％。
实验例1
选取人皮肤鳞癌细胞A431(从武汉大学细胞典藏中心购得)，生长培养液(基础培养基EMEM)中含10％(v/v)的胚胎牛血清，100u/ml的青、链菌霉素，1.0mM丙酮酸钠，培养液三天更换一次；培养箱(Thermo Scientific Heraeus CO2 incubator)为设定温度为37℃，CO2浓度为5％的湿气环境。在细胞对数生长期用0.05％的胰蛋白酶消化液消化用于细胞实验；
将浓度为1.5×104个/mL的细胞接种在24孔细胞培养板的每个孔中，将培养板分为八组，每三个孔作为一组；然后分别将实施例1-4和对照例1制备得到的纳米贴剂4mm2以及1ml蒸馏水置于每组培养孔中，在剩余两组中每孔中分别添加1ml的浓度为1.3μg/mL的DOX药物和7.7μg/mL的硫化铜纳晶；然后将培养板在808nm、0.7W cm-2激光照射10min，继续培养6h，然后通过CCK-8测定法对所有组的细胞活力进行定量，并计算得到每组平均值如表1所示：
表1
由表1可知：
由实施例3和实施例4比较可知，实施例3虽然沉积层数增加，但细胞毒性没有明显变化，说明层数增加的影响较低，综合材料成本以及实验复杂性，优选四个双层体系。
通过实施例4与对照例1，以及单纯的DOX药物组和单纯硫化铜纳晶组相比较可知，本发明中实施例4在在纳米贴剂中还有一部分DOX药物和硫化铜纳晶未释放的基础上，达到了更好的抑制肿瘤细胞的效果，由此可见，DOX药物与硫化铜纳晶起到了协同作用，能够更好的抑制肿瘤细胞活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种负载DOX的纳米贴剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将羧基化石墨烯分散液与DOX溶液混合、避光反应、离心得到负载DOX的羧基化石墨烯；
(b)将基底依次浸泡于负载DOX的羧基化石墨烯溶液和硫化铜纳晶溶液中，进行负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积；
(c)重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作，即得负载DOX的纳米贴剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化石墨烯的尺寸为0.05-0.15μm2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫化铜纳晶粒径为10-20nm。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，重复步骤(b)中负载DOX的羧基化石墨烯和硫化铜纳晶的沉积操作2-4次。
5.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，羧基化石墨烯分散液浓度为0.5-1.5mg/ml；DOX溶液浓度为1.5-2.5mg/ml。
6.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，反应时间11-13h；离心转速为6000-10000r/min，离心时间为8-12min。
7.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，负载DOX的羧基化石墨烯溶液浓度为0.8-1.2mg/mL；硫化铜纳晶溶液浓度为0.8-1.2mg/mL。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述基底在负载DOX的羧基化石墨烯溶液中浸泡时间为1-2h；所述基底在硫化铜纳晶溶液中浸泡时间为1-2h。
9.一种负载DOX的纳米贴剂，其特征在于，所述纳米贴剂由权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的纳米贴剂，其特征在于，所述纳米贴剂中负载DOX的羧基化石墨烯的固定量为0.39-2.12μg/mm2；硫化铜纳晶的负载量为0.47-2.43μg/mm2；负载DOX的羧基化石墨烯上DOX的含量为18.2％-23.4％。
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