CN114099440B - 一种装载疏水性抗氧化药物的传递体局部药物递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种装载疏水性抗氧化药物的传递体局部药物递送系统，属于药物制剂技术领域。所述传递体由大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和抗氧化药物制成。本发明将抗氧化药物包载于磷脂双分子层内形成载药传递体，通过传递体高度变型性，增强透皮效率的药物递送系统。本发明的局部药物递送系统能提高难溶性药物溶解度，避免抗氧化药物受到环境影响，例如紫外降解等影响，并且通过两种抗氧化药物联用起到了增强抗氧化的效果。与单用抗氧化药物对比，可有效抑制光老化的发生。

Description

一种装载疏水性抗氧化药物的传递体局部药物递送系统
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种装载疏水性抗氧化药物的传递体局部药物递送系统。
背景技术
皮肤光老化，除了内源性的自然衰老，太阳照射产生的紫外线是导致衰老的主要因素。紫外线通常分为长波紫外线、中波紫外线和短波紫外线。短波紫外线被臭氧阻挡基本上到不了地球表面，在日常生活当中能够接触到的紫外线主要是中波紫外线和长波紫外线。当没有云层的时候，日光中的中波紫外线就可以到达地面。再就是长波紫外线，长波紫外线的穿透能力非常强，太阳刚出来的时候无论有没有云层它都可以穿过，而且可以穿过玻璃。长波紫外线可以到达皮肤的浅层，引起皮肤的弹力纤维发生改变，导致皮肤产生皱纹，是引起皮肤光老化的重要因素。
研究表明，紫外线对皮肤的老化作用主要是通过诱导皮肤细胞生成活性氧自由基(ROS)来起作用的。ROS是一组具有一个或多个未配对电子的原子或分子，如超氧阴离子、单线态氧、羟自由基、过氧化氢等。紫外线照射产生的自由基，攻击DNA、蛋白质、辅酶、脂类等生物活性大分子，造成DNA复制错误；同时紫外线可降低皮肤细胞超氧化物歧化酶的活性，抑制皮肤免疫功能；紫外线照射还可导致弹性纤维变性，使毛细血管管壁增厚，使皮肤表面毛细血管扩张。
抗氧化药物众多，但是效果突出者水溶性均较差，影响药物的进一步应用。如补骨脂酚，主要存在于植物“补骨脂”(Psoralea corylifolia)的种子中，补骨脂酚是补骨脂挥发油的主要成分，约占60％，研究表明，补骨脂酚具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老等作用。近几年来，补骨脂酚的研究越来越多，其美容护肤作用也引起广泛关注，是一种极具潜力的具有多种功效的化妆品活性成分。又如艾地苯醌，一种亲脂性化合物，结构上与辅酶Q10相似，作为一种高效的抗氧化剂，它具有清除自由基、抑制脂质过氧化、抑制炎症、抑制DNA损伤、光保护、减轻色素沉着等化妆品功效性。
尽管补骨脂酚和艾地苯醌具有很强的抗氧化能力，然而基于其自身的难溶性特性限制了其应用。传递体具有双分子层结构，可以包裹补骨脂酚和艾地苯醌到疏水链中，促进补骨脂酚和艾地苯醌的释放。传递体(Transfersomes)又称为柔性纳米脂质体，由载体材料(磷脂和胆固醇)和称为边缘活化剂的表面活性剂(如胆酸钠、脱氧胆酸钠吐温、司盘、甘草酸二钾等)组成。边缘活化剂影响传递体的性质和功能，使类脂膜具有高度的形变能力，迫使药物分子变形，能顺利穿透比自身粒径小1/10的角质层小孔，与脂质体相比渗透率增强。本发明涉及到的制剂及技术可以增加药物的溶解性及透皮性能，从而发挥最大的药效，减缓皮肤光老化的程度。
发明内容
本发明的目的在于克服补骨脂酚和艾地苯醌难溶性特性，提供一种局部给药的传递体及其制备方法，使用该载体能提高原料药的稳定性、溶解性，发挥抗氧化作用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种传递体，该传递体由大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和抗氧化药物制成。
进一步地，所述抗氧化药物为疏水性抗氧化药物。
更进一步地，所述抗氧化药物为艾地苯醌和/或补骨脂酚。
上述传递体的制备方法，是将大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和抗氧化药物溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用去离子水水化，探头超声后得到脂质体溶液，然后除去游离的抗氧化药物，所得上清液即为传递体。
进一步地，所述有机溶剂是氯仿和甲醇的混合溶剂。
上述传递体在制备抗氧化外用制品中的应用。
本发明将抗氧化药物包载于磷脂双分子层内形成载药传递体，通过传递体高度变型性，增强透皮效率的药物递送系统。本发明的局部药物递送系统能提高难溶性药物溶解度，避免抗氧化药物受到环境影响，例如紫外降解等影响，并且通过两种抗氧化药物联用起到了增强抗氧化的效果。与单用抗氧化药物对比，可有效抑制光老化的发生。
本发明具有以下有益效果：
1.由于传递体的磷脂双分子层结构与天然的生物膜具有一定的相似性，使得传递体可以在一定程度上改变细胞膜的流动性并且可以与细胞膜融合，因此传递体在皮肤病治疗以及化妆品领域的运用具有不可估量的潜力。特别地，对于脂溶性低皮肤渗透性差的外源抗氧化剂补骨脂酚和艾地苯醌而言，以传递体为核心的载药系统具有几大明显的优点：首先，传递体呈近似球形，它可以把抗氧化剂包裹在其双分子层的结构当中，在一定程度上使得药物与光照、pH、温度和湿度等一系列可能对药物本身造成影响的外界环境隔离开来，使得药物的稳定性得到了提升；其次，传递体自身空白载体也可起到滋润皮肤的作用，在一定程度上增强了药效；最后，由于传递体与生物膜具有一定的相似性，使得传递体可以在一定程度上改变细胞膜的流动性并且与细胞膜融合，所以传递体可以模拟细胞膜成分，改善药物的递送效果，增强药物的透皮吸收。此外，与其他的材料相比，传递体还具有更为优秀的生物相容性与生物可降解性。
2.本发明还提供了一种装载艾地苯醌和补骨脂酚传递体的制备方法，该方法操作简单，工艺条件温和，采用常规设备即可实现。
附图说明
图1为艾地苯醌和补骨脂酚对3T3细胞的毒性结果。
图2为H2O2氧化损伤3T3细胞的结果。
图3为艾地苯醌及补骨脂酚单用及联用的抗氧化损伤效果。
图4为艾地苯醌和补骨脂酚共载传递体的粒径图和TEM图。
图5为载药传递体与普通载药脂质体的Franz扩散池皮肤滞留量结果。
图6为各组制剂与游离药物的紫外稳定性结果。
图7为艾地苯醌、补骨脂酚冻干前后粒径及包封率的变化结果。
图8为给药后小鼠皮肤的HE图。
具体实施方式
以下通过实施例对比本发明所述一种装载疏水性抗氧化药物的传递体局部药物递送系统及其制备方法作进一步说明。下述各实施例中，所述大豆卵磷脂(SPC)、胆固醇购买自上海太伟药业股份有限公司。所述吐温80购买自南京威尔药业、脱氧胆酸钠购买阿拉丁。补骨脂酚购自成都普菲德、艾地苯醌购买自毕得医药。
实施例1
补骨脂酚传递体制备
按照大豆卵磷脂：补骨脂酚、大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂：吐温80、大豆卵磷脂：脱氧胆酸钠的质量比分别为10：1、12：1、6：1、8：1，计量大豆卵磷脂、补骨脂酚、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠。
将大豆卵磷脂20mg、胆固醇1.667mg、吐温3.33mg、脱氧胆酸钠2.5mg和补骨脂酚2mg溶于15mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用4mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的补骨脂酚，所得上清液即为载补骨脂酚的传递体。
实施例2
艾地苯醌传递体的制备
按照大豆卵磷脂：艾地苯醌、大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂：吐温80、大豆卵磷脂：脱氧胆酸钠的质量比分别为20：1、8：1、8：1、6：1，计量大豆卵磷脂、补骨脂酚、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠。
将大豆卵磷脂40mg、胆固醇5mg、吐温5mg、脱氧胆酸钠3.33mg和艾地苯醌2mg溶于15mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用4mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的艾地苯醌，所得上清液即为载艾地苯醌的传递体。
实施例3
补骨脂酚、艾地苯醌共载传递体制备
按照大豆卵磷脂：药物(艾地苯醌：补骨脂酚)、大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂：吐温80、大豆卵磷脂：脱氧胆酸钠的质量比分别为29.22：1(13.23：1)、6：1、6：1、6：1，计量大豆卵磷脂、补骨脂酚、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠。
将大豆卵磷脂157.15mg、胆固醇26.19mg、吐温26.19mg、脱氧胆酸钠26.19mg、艾地苯醌5mg补骨脂酚0.378mg，溶于16mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用10mL去离子水水化，探头超声6min，得到传递体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的艾地苯醌和补骨脂酚，所得上清液即为艾地苯醌和补骨脂酚共载的传递体。
采用马尔文激光粒度仪，分别于上述脂质体溶液稀释完毕后取1mL检测粒径。粒径结果如图4。
实施例4
补骨脂酚、艾地苯醌共载传递体冻干粉的制备
按照大豆卵磷脂：药物(艾地苯醌：补骨脂酚)、大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂：吐温80、大豆卵磷脂：脱氧胆酸钠的质量比分别为29.22：1(13.23：1)、6：1、6：1、6：1，计量大豆卵磷脂、艾地苯醌、补骨脂酚、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠。
将大豆卵磷脂157.15mg、胆固醇26.19mg、吐温26.19mg、脱氧胆酸钠26.19mg、艾地苯醌5mg补骨脂酚0.378mg，溶于16mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用10mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的艾地苯醌和补骨脂酚，所得上清液即为艾地苯醌和补骨脂酚共载的传递体。
将甘露醇471.45mg、蔗糖628.60mg，加入艾地苯醌、补骨脂酚共载传递体混悬液中混匀，-20℃中预冻24小时，放入冻干机中冻干。
对比例1
按照大豆卵磷脂：补骨脂酚、大豆卵磷脂：胆固醇的质量比分别为10：1、12：1，计量大豆卵磷脂、补骨脂酚、胆固醇。
将大豆卵磷脂20mg、胆固醇1.667mg和补骨脂酚2mg溶于15mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用4mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的补骨脂酚，所得上清液即为载补骨脂酚的脂质体。
对比例2
按照大豆卵磷脂：艾地苯醌、大豆卵磷脂：胆固醇的质量比分别为20：1、8：1，计量大豆卵磷脂、艾地苯醌、胆固醇。
将大豆卵磷脂40mg、胆固醇5mg和艾地苯醌2mg溶于15mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用4mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的艾地苯醌，所得上清液即为载艾地苯醌的脂质体。
对比例3
按照大豆卵磷脂：(艾地苯醌：补骨脂酚)、大豆卵磷脂：胆固醇、大豆卵磷脂：吐温80、大豆卵磷脂：脱氧胆酸钠的质量比分别为29.22：(13.23：1)、6：1、6：1、6：1，计量大豆卵磷脂、补骨脂酚、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠。
将大豆卵磷脂157.15mg、胆固醇26.19mg艾地苯醌5mg补骨脂酚0.378mg，溶于16mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用10mL去离子水水化，探头超声6min，得到脂质体溶液。然后以3500r/min的转速离心3min以除去游离的艾地苯醌和补骨脂酚，所得上清液即为艾地苯醌和补骨脂酚共载的脂质体。
取艾地苯醌、补骨脂酚共载传递体混悬液6ml，分别加入到3个西林瓶中，每个瓶子中加入2ml，向每个西林瓶中加入甘露醇94.29mg、蔗糖125.72mg，混匀，-20℃中预冻24小时，放入冻干机中冻干。冻干前后粒径及包封率的变化见图7。
检测例1
将密度为5×104个/mL的3T3细胞(购自上海通派细胞库)悬液接种于两块96孔培养板内，每孔接种0.2mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后分别将艾地苯醌和补骨脂酚的DMSO溶液作为试验组，使艾地苯醌和补骨脂酚的终浓度分别为50μM、20μM、10μM、7.5μM、5μM和50μM、20μM、10μM、1μM、0.1μM。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于置37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，于48h弃去上清液，以PBS缓冲液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200L PBS缓冲液，再加入20L 5mg/mL的MTT溶液(将25mg MTT溶于5mL PBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入150L二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定490nm波长的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的相对增殖率。细胞毒性试验结果见图1，从图1可以看出，艾地苯醌在20μM、10μM、1μM，补骨脂酚在20μM、10μM、1μM浓度下不具有细胞毒性。
检测例2
将密度为5×105个/mL的3T3细胞(购自上海通派细胞库)悬液接种于三块96孔培养板内，每孔接种0.2mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后将10mM的H2O2溶液用完全培养基稀释成浓度为4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1(mM)的系列浓度。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于置37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，分别于6h、12h、24h弃去上清液，以PBS缓冲液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200L PBS缓冲液，再加入20L 5mg/mL的MTT溶液(将25mg MTT溶于5mLPBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入150L二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定490nm波长的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的相对增殖率。细胞毒性试验结果见图2，从图2可以看出，H2O2在0.6mM浓度下刺激12h对细胞具有明显的氧化损伤作用。
检测例3
将密度为5×105个/mL的3T3细胞(购自上海通派细胞库)悬液接种于六块96孔培养板内，每孔接种0.2mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。将艾地苯醌和补骨脂酚分别用完全培养基稀释为20μM、10μM、1μM；20μM、10μM、1μM浓度，以及将艾地苯醌和补骨脂酚两药混合稀释成浓度为IDBN20/BAK20、IDBN20/BAK10、IDBN20/BAK1、IDBN10/BAK20、IDBN10/BAK10、IDBN10/BAK1、IDBN7.5/BAK20、IDBN7.5/BAK10、IDBN7.5/BAK1系列药液，分别孵育6h、12h、24h后弃去上清液，以PBS缓冲液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，加入浓度为6mM的H2O2继续孵育，以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于置37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，于12h弃去上清液，以PBS缓冲液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200LPBS缓冲液，再加入20L 5mg/mL的MTT溶液(将25mg MTT溶于5mL PBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入150L二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定490nm波长的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的相对增殖率。细胞毒性试验结果见图3，从图3可以看出，两药在联合作用下可以抵抗H2O2的氧化损伤效果，并且在12h后IDBN7.5/BAK1浓度仍具有抗氧化的效果。
检测例4
对6只ICR小鼠(购自青龙山动物实验中心)(体重18～22g)断颈处死后，立即用充电式修剪器将小鼠腹部毛剃干净，立即剪取腹部皮肤，将取下的皮肤平铺于干净的玻璃板上，角质层朝下，仔细用沾有生理盐水的棉球擦除皮下脂肪层和结缔组织，用生理盐水反复冲洗干净，置于生理盐水中，于4℃冰箱保存备用。将小鼠分为六组，分别为补骨脂酚传递体(实施例1制得)、补骨脂酚脂质体(对比例1制得)、游离补骨脂酚、艾地苯醌传递体(实施例2制得)、艾地苯醌脂质体(对比例2制得)、游离艾地苯醌。将皮肤固定于已加有搅拌子的Franz扩散池上，使角质层面向上，用弹簧夹固定，在供给池中加满水，放置一段时间看其液面是否下降，若有渗漏情况，则调整弹簧夹，至不漏为止。用注射器慢慢将接收液加入接收池中，加完后检查皮肤与接收液接触界面间是否有气泡，如果有气泡，将扩散池稍稍倾斜排除气泡，加满接收液。再分别将制备好的各组制剂加入到池内，加入后用保鲜膜将供给池封闭。在1、2、4、6、8、10、12、24h用弯头取样针缓缓抽出1mL接收液，再补加1mL的新鲜接收液。样品过0.22μm的滤膜，最后采用高效液相方法检测补骨脂酚和艾地苯醌的含量，补骨脂酚检测条件为：安捷伦C18色谱柱(250×4.6mm,5μm,Agilent,USA)，检测波长为260nm，流动相为甲醇：水(95：5)，流速为1.0mL/min。艾地苯醌测条件为：安捷伦C18色谱柱(250×4.6mm,5μm,Agilent,USA)，检测波长为260nm，流动相为甲醇：水(90：10)，流速为1.0mL/min。补骨脂酚游离药物、补骨脂酚脂质体、补骨脂酚传递体、艾地苯醌游离药物、艾地苯醌脂质体和艾地苯醌传递体共六组制剂中的皮肤滞留情况见图5，从图5可知，使用本发明所述载药传递体与普通载药脂质体相比，本发明所述传递体具有更好的透过表皮的结果，真皮中药物储存量明显高于其他三组，进一步说明采用本发明的传递体，可以促进药物进入真皮，提高生物利用度。
检测例5
将实施例2制得的艾地苯醌传递体、实施例1制得的补骨脂酚传递体分别取3ml加入12孔板中，每孔1ml。另用DMSO配制浓度为0.5mg/ml的游离艾地苯醌和游离补骨脂酚溶液，同法加入12孔板中。将12孔板置于紫外辐照箱内，于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h每孔取200μl，用甲醇稀释至2ml，进HPLC测其含量。艾地苯醌和补骨脂酚在每组中的含量见图6，从图6可知，使用本发明所述的传递体，可以保护药物免受紫外的降解。
检测例6
将42只昆明小鼠(购自青龙山动物实验中心)用充电式修剪器将小鼠背部毛剃干净，再用薇婷脱毛膏将毛脱干净，分为七组，分别为正常组(Control)、模型组(Model)、游离艾地苯醌和补骨脂酚组(Free-I&B)、补骨脂酚传递体组(B-T)、艾地苯醌传递体组(I-T)、艾地苯醌和补骨脂酚共载脂质体组(I&B-L)、艾地苯醌和补骨脂酚共载传递体组(I&B-T)。每日每组分别抹上对应的制剂，一次给药体积为1ml/cm2。给药10min后进行UVB照射，波长311nm，照射10min，共照射6周。最后一次照射24h后断颈处死，立即剪取腹部皮肤，进行HE染色。HE染色结果见图8，相较于艾地苯醌和补骨脂酚传递体组，其他组呈现出较严重的皮肤损伤，较多的炎症细胞浸润，纤维大量紊乱并减少，表皮增厚等。验证了艾地苯醌和补骨脂酚共载传递体产生了联合抗氧化的作用。

Claims (5)

1.一种传递体，其特征在于：所述传递体由大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和抗氧化药物制成；
所述抗氧化药物为艾地苯醌和补骨脂酚；
其中：大豆卵磷脂和抗氧化药物的质量比为29.22:1、大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为6:1、大豆卵磷脂和吐温80的质量比为6:1、大豆卵磷脂和脱氧胆酸钠的质量比为6:1。
2.权利要求1所述的传递体的制备方法，其特征在于：将大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和抗氧化药物溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用去离子水水化，探头超声后得到脂质体溶液，然后除去游离的抗氧化药物，所得上清液即为传递体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂是氯仿和甲醇的混合溶剂。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂中氯仿和甲醇的体积比为2:1。
5.权利要求1所述的传递体在制备抗氧化外用制品中的应用。
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