CN114088943A - 一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的金纳米探针及其制备方法和应用。一种用于检测白斑综合征病毒的金纳米探针的制备方法，由抗WSSV VP664多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒共同孵育，然后纯化制备得到所述的金纳米探针。一种非疾病诊断目的的检测对虾白斑综合征病毒的方法，包含以下步骤：(1)利用本发明所述的金纳米探针标记WSSV；(2)暗场显微镜观察样品。本发明建立的金纳米探针结合暗场显微镜检测体系操作简单、检测快速、对设备要求低且不需要专业人员操作，可用于克氏原螯虾等虾类养殖关键环节进行现场白斑综合征病毒快速定量定性检测。

Description

一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测克氏原螯虾白斑综合症病毒的金纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
白斑综合征(WSS)是一种病毒性疾病，它能感染全球大多数商业养殖的淡海水养殖虾类。白斑综合征于1992年首次在台湾地区被发现，此后每年该病都会阶段性爆发，并在几年内传播至许多对虾养殖国家[1]。起初这些疾病同时出现在不同地区，被认为是由不同病原体引起的，所以根据这些病原体的形态特点、病理症状、地域分布和研究侧重点等对这些病原体进行命名[2,3]，陈秀男将其命名为白斑综合征杆状病毒(WSBV)。进一步研究结果表明，各地区病毒分离株差异很小。Lightner等建议将这类病原体统一命名为白斑综合征病毒(WSSV)[4]。国际分类委员会(ICTV)在2005年第八次报告中，将WSSV归为线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属 (Whispovirus)[5]。WSSV是一种具有包膜的双链环状DNA病毒，病毒颗粒形状从杆菌状到卵圆形，长度为210-420nm，直径在70-167nm之间。
WSSV是对虾养殖的主要病原,对全球对虾养殖业造成了严重损失。近年来，国内克氏原螯虾(小龙虾)养殖业也开始受到WSSV的威胁。2016年以来，浙江舟山、江苏南京等地采集的人工养殖克氏原螯虾样品中均被检出WSSV。最近对江苏、湖北、安徽、湖南以及江西等主产区所进行的克氏原螯虾流行病学调查结果显示，WSSV已普遍存在于当前克氏原螯虾养殖群体之中，其携带率超过90％以上。每年5-6月份是国内克氏原螯虾养殖群体感染WSSV的高峰期，产业上又称该病为“五月瘟”或“五月魔咒”，给产业造成了极大的损失。
对WSSV进行早发现、早诊断、早检测是产业上减少损失的最佳方法。目前WSSV检测方法主要包括电镜观察检测法、PCR分子诊断法和免疫检测法等，其中以PCR技术(包括qRT-PCR) 为核心的分子诊断技术是当前WSSV检测的主要方法。这些检测技术对仪器设备和环境条件要求较高，一般只适合实验室研究使用，不能满足现场快速检测要求。因此迫切需要开发一种简便、快捷的WSSV检测技术，以期提早发现WSSV感染、及时采取对症措施，降低经济损失。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于检测白斑综合症病毒的金纳米探针及其制备方法。
本发明的另一目的是提供该金纳米探针的应用。
本发明的又一目的是提供一种非疾病诊断目的的检测对虾白斑综合症病毒的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于检测白斑综合症病毒的金纳米探针的制备方法，由抗WSSV VP664多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒共同孵育，然后纯化制备得到所述的金纳米探针。
作为本发明的一种优选，表面修饰protein A的金纳米颗粒粒径为10-20nm，进一步优选 15nm。由于透射电镜下WSSV的大小在200-400nm，需要选择粒径合适的金纳米颗粒来制备可以标记WSSV的金纳米探针。如果金纳米颗粒过大就会产生假阳性结果；而粒径过小，纳米粒子容易发生团聚现象。所以利用protein A可以和抗体的Fc段特异性结合的特点，本研究选择表面修饰有protein A、粒径为15nm的金纳米颗粒与制备的抗WSSV VP664多克隆抗体结合，制备可特异性标记WSSV的金纳米探针。
作为本发明的一种优选，所述的抗WSSV VP664多克隆抗体通过以下方法制备得到：
(1)从GenBank中获取编码WSSV核衣壳蛋白VP664的基因序列，序列号为：AF440570.1，设计引物VP664F/VP664R扩增目的基因，以提取的WSSV DNA为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；将上步回收纯化的目的基因和质粒pET-28a(+)双酶切，纯化后进行连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用PCR鉴定阳性菌，并将阳性菌进行测序；
(2)提取上一步的测序鉴定的阳性菌的质粒，将鉴定正确的质粒转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达；
(3)超声破菌得到粗蛋白溶液，采用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化在包涵体中表达的、带 His标签的重组蛋白；
(4)将纯化的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射免疫青壮年新西兰白兔，加免完7天后采集全血测定效价，取免疫兔子的血清进行抗体纯化得抗WSSV VP664多克隆抗体。
作为本发明的一种优选，每20μL金纳米颗粒结合约1μg的抗WSSV VP664多克隆抗体。
按照本发明所述的方法制备得到的金纳米探针。
本发明所述的金纳米探针在制备快速检测对虾白斑综合症病毒的试剂中的应用。
一种非疾病诊断目的的检测对虾白斑综合症病毒的方法，包含以下步骤：
(1)利用本发明所述的金纳米探针标记WSSV；
(2)暗场显微镜观察样品。
作为本发明的一种优选，步骤(1)将所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST混合均匀，离心弃上清，沉淀即为金纳米探针标记的WSSV。
作为本发明的一种优选，所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST的体积比为(40-55):1: (18-210)，优选50:1:200。
作为本发明的一种优选，取上一步沉淀用PBST重悬，调整使适宜浓度后通过暗场显微镜观察样品，同时设置金纳米探针和纯化的WSSV作为阴性对照；金纳米探针在单分散状态下散射光很弱，在暗场显微镜下不易观察到，金纳米探针与WSSV的结合样品在暗场显微镜下呈现出明亮的金黄色椭圆形结构，明显区别于暗场背景和阴性对照。
有益效果：
WSSV的囊膜是一个非常脆弱的结构，在WSSV提纯过程中囊膜易破裂脱落，只剩裸露的核衣壳结构。所以在设计检测WSSV的探针时，需考虑可特异性地标记WSSV的核衣壳结构，因此需要制备可特异性识别WSSV核衣壳的抗体。本发明从VP664基因中选取一段高度保守、免疫原性强的基因序列进行原核表达和蛋白纯化，得到重组蛋白，并将其作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，并进行相关检测，得到了特异性强，亲和力高的兔抗WSSVVP664的多克隆抗体，可用于金纳米探针的制备。
本研究基于protein A可以和抗体的Fc段特异性结合的特点，将粒径为15nm、protein A修饰的金纳米颗粒与制备的抗WSSV VP664多克隆抗体结合，制备可特异性标记WSSV的高效金纳米探针。通过TEM、SDS-PAGE和UV-Vis等方法对制备的金纳米探针进行表征，结果表明金纳米颗粒成功与抗体结合，探针制备成功，可用于下一步检测体系的构建。随后金纳米探针与纯化的WSSV进行反应，通过TEM对结合物进行表征，并置于暗场显微镜下观察。结合已建立的实时荧光定量PCR技术对构建的检测方法进行验证，并测试其检测限。结果表明金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV体系构建成功，检测限可低至5.7×101copies/μL，灵敏度比荧光定量PCR高10倍，在特异性和操作难度等方面该检测方法也要优于荧光定量PCR技术。而且荧光定量PCR不能直观的说明感染虾体内的病毒含量，而本发明建立的检测体系可以检测每克感染虾组织中的病毒含量，更加清楚地判断病情。本发明建立的金纳米探针结合暗场显微镜检测体系操作简单、检测快速(仅需要将虾体组织匀浆上清与探针孵育30min后通过暗场观察，并利用软件自动计数)、对设备要求低且不需要专业人员操作，有望用于养殖现场的WSSV 检测，为之后的WSSV定量检测提供了新的思路。
附图说明
图1重组菌的诱导表达；
M：Marker；1：BL21，IPTG诱导；2：重组菌，IPTG未诱导；3：重组菌，IPTG诱导
图2Western blot检测重组蛋白表达
M：Marker；1：Recombinant bacteria，IPTG诱导；2：Recombinant bacteria，IPTG未诱导图3诱导重组菌的电泳分析
A：SDS-PAGE检测超声破碎结果，M:Marker；1：超声破碎后上清；2：超声破碎后沉淀
B：SDS-PAGE检测重组蛋白纯化结果。M:Marker；1：穿透液；2：洗涤液；3：洗脱液(30mM 咪唑缓冲液)；4-6：洗脱液(300mM咪唑缓冲液)
图4多抗的WB检测M：Marker；1：WSSV病毒；2：阴性对照
图5金纳米探针的SDS-PAGE表征
M：Marker；1：20μL金纳米颗粒；2：5μg抗体；3：20μL金纳米探针
图6金纳米探针的吸收光谱表征
图7金纳米探针的粒径(A)电位(B)分析
图8金纳米探针的透射电镜观察
A：金纳米颗粒；B金纳米探针
图9金纳米探针结合暗场显微镜的WSSV检测方法示意图
图10暗场显微镜观察探针捕获WSSV的效果
A：WSSV；B：金纳米探针；C金纳米颗粒与WSSV的混合液；D：金纳米探针结合WSSV
图11透射电镜检测金纳米探针的特异性
A-C：探针结合WSSV样品；D：金纳米颗粒与WSSV混合；
E：探针与NDV混合；F：探针与LPAIV混合
图12不同浓度WSSV与金纳米探针结合的暗场显微镜观察
A：7.12×103copies/μL WSSV；B：1.42×103copies/μL WSSV；C：2.84×102copies/μL WSSV；D：5.7×101copies/μL WSSV
图13不同浓度WSSV的实时荧光定量PCR的扩增曲线
1-5WSSV浓度依次为：7.12×103、1.42×103、2.84×102、5.68×101、1.12×101copies/μL
图14暗场显微镜下观察探针捕获实际样品中的WSSV
A：感染WSSV的螯虾；B：未感染WSSV的螯虾
具体实施方式
实施例1质粒构建
1.1目的基因的扩增
从GenBank中获取编码WSSV核衣壳蛋白VP664的基因序列(序列号为：AF440570.1)，利用SnapGene4.1.9软件设计引物，引物VP664F/VP664R用于目的基因的扩增，引物 QVP664F/QVP664R用于实时荧光定量PCR检测，引物序列如下：
VP664F:5'-GGATCCATGGACCAGTACCCAGAAGT-3'(SEQ ID No.1)；
VP664R:5'-CTCGAGTTGTTT GGAAAAACAATTA-3'(SEQ ID No.2)；
扩增的产物长度为567bp。
以提取的WSSV DNA为模板，进行PCR扩增，反应程序为95℃预变性5min,1个循环；95℃变性，30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃终延伸5min，1个循环，得到PCR扩增产物。
1.2PCR产物的回收和纯化
取上述PCR扩增产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外凝胶成像系统下观察目的条带。通过胶回收获得目的基因，胶回收步骤按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明进行。
1.3重组质粒的构建
将上步回收纯化的目的基因和质粒pET-28a(+)用限制性内切酶BamH I、Xho I进行双酶切，反应条件为37℃，15min。
将获得的双酶切产物与10×Loading Dye混合均匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后通过紫外凝胶成像系统观察目标条带，并通过胶回收对目标条带进行回收纯化。将回收纯化的目的基因和pET-28a(+)载体通过T4 DNA连接酶进行连接。
1.4重组质粒的转化及提取
将上步得到的连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用PCR鉴定阳性菌，并将阳性菌送往南京擎科生物科技有限公司进行测序。测序正确的阳性菌部分于-80℃冻存，部分用于质粒提取。质粒提取按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明进行。
将获得的重组质粒通过限制性内切酶BamH I、Xho I进行双酶切，获得的双酶切产物加入染剂混合均匀后，通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
实施例2重组蛋白VP664的制备
2.1重组质粒在BL21感受态细胞中的诱导表达
将鉴定正确的质粒转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达，过夜培养的菌液按照1：100 接种于4mL液体LB培养基中(含卡那霉素50μg/mL)，在37℃培养箱中250rpm震荡培养3-4h，使菌液OD600达0.5-0.6。在菌液中加入IPTG使其终浓度至0.1mmol/L，37℃振荡培养4h。同时设置不加IPTG的菌液作为阴性对照。诱导结束后每管取1mL菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，吸去上清，用100μL无菌的PBS重悬菌体沉淀，作为待测样品进行 SDS-PAGE和Western blot分析，观察重组菌的诱导表达情况。
通过SDS-PAGE结果(图1)可以看出，与未诱导的对照组相比，诱导的重组菌在约32kDa 左右出现蛋白条带，与预期相符。使用抗His抗体作为一抗，Western blot检测重组蛋白的表达情况。如图2所示，在约32kDa处出现目的条带，与该蛋白大小预期相符，表明蛋白成功表达。
2.2重组蛋白的纯化
取300mL诱导表达的菌液于无菌的离心管中，5000rpm离心5min，收集菌体沉淀。菌体用10mL的PBS(pH 7.4)溶液重悬；在冰浴条件下100W超声破菌20min，至菌液接近澄清；超声结束后4℃，12000rpm离心10min，分别收集沉淀和上清；沉淀用10ml的8M 尿素溶液重悬，然后在冰浴下100W超声10min，超声后的沉淀4℃，12000rpm离心10min 收集上清，得到粗蛋白溶液。
本实验采用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化在包涵体中表达的、带His标签的重组蛋白。
(1)纯化蛋白所需要的试剂配制：
10mM、30mM、300mM咪唑缓冲液：分别称取0.068g、0.204g、2.04g咪唑和480g 尿素，用PBS定容至100mL待用。
透析缓冲液：分别量取50mL甘油，10g L型精氨酸，40g EDTA和尿素，用PBS定容至1L待用。
(2)向柱子中加入5mL去离子水过柱清洗一次。
(3)向柱子中加入5mL 10mM咪唑缓冲液平衡一次。
(4)将得到的粗蛋白溶液进行上样，收集的流出液重复上样一次，收集穿透液。
(5)用5mL的10mM咪唑缓冲液洗涤柱子，收集洗涤液。
(6)用5mL的30mM咪唑缓冲液洗脱蛋白，收集洗脱液并留样20μl电泳检测。
(7)用5mL的300mM咪唑缓冲液洗脱蛋白，洗脱液分三管收集并留样20μl电泳检测。
(8)用5mL的0.5M NaOH溶液洗柱。
(9)用5mL去离子水洗柱，重复三次。
(10)用20％乙醇平衡柱子，并保存。
取重组菌液超声破碎后的上清和沉淀、纯化蛋白过程中的清洗液、洗脱液等通过SDS-PAGE 电泳鉴定重组蛋白的纯化结果，得到的纯化重组蛋白通过紫外分光光度计测定蛋白浓度。
诱导表达的菌体经过超声破碎后，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测，结果显示目的蛋白主要表达在包涵体中(图3A)。沉淀经处理后通过Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化，通过 SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。如图3B所示，在300mM咪唑洗脱条下，可以得到大量高纯度的重组蛋白。通过紫外分光光度计测得重组蛋白的浓度为0.5mg/mL。
2.3动物免疫
(1)动物选择：本实验选取体重2.5kg左右、毛色光泽的青壮年新西兰白兔，并将兔子做好标记。
(2)将纯化的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂在振荡器上混合均匀至完全乳化，兔子采用皮下多点注射，每只兔子注射抗原用量为0.5mg。
(3)首免后每隔两周免疫一次。二免和三免的注射方法与首免相同，只是改为抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合完全乳化后免疫兔子，免疫抗原浓度减半。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后可进行加强免疫，加免完7天后可采集全血。待检血清通过间接ELISA法进行效价测定，通过间接ELISA对血清的效价进行测定。如表1所示，血清效价为1:256000(P/N>2.1)。
表1血清效价检测
Figure BDA0003387170970000071
Figure BDA0003387170970000081
2.4抗体纯化
取免疫兔子的血清进行抗体纯化，抗体采用Protein G琼脂糖预装柱进行纯化，具体操作步骤如下：
(1)抗体纯化所需要的试剂：Binding buffer(结合缓冲液):调节PBS的pH值至7.4；
Elution buffer(抗体洗脱液)：100mM甘氨酸,称取7.5g的甘氨酸溶于1L超纯水中，调节pH至2-3；
Neutralization buffer(中和缓冲液)：1M Tris-HCl,称取121g Tris-HCl溶于1L超纯水中，调节pH至8.8；
(2)依次用20mL纯水和Binding Buffer充分洗涤并平衡预装柱，流速5mL/min。
(3)取1mL待纯化的血清用孔径0.25μm的滤膜过滤后，用Binding Buffer按照1： 1的比例稀释血清。
(4)将血清样品以1mL/min流速上样，收集穿流液，并将穿流液重复上样两次，收集穿流液。
(5)用20mL Binding Buffer以1mL/min的流速清洗柱子。
(6)用5mL Elution Buffer以1mL/min的流速洗脱结合的抗体，收集洗脱液，收集管中需预先加入500μL Neutralization Buffer。
(7)洗脱液移至超滤管中，12000rpm离心1min，弃去滤液，加入500μL PBS重悬，重复三次，收集滤管的浓缩液，即为纯化的兔抗WSSV VP664多克隆抗体。
2.6多克隆抗体的特异性鉴定
Western blot分析
将纯化的WSSV进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE实验使用了8％的NCM FastPAGE聚丙烯酰胺凝胶预混液。电泳结束后进行Western blot检测，。
使用纯化的WSSV作为抗原，将抗体稀释液与纯化的兔抗WSSV VP664多抗按5000：1的比例稀释作为一抗溶液，将抗体稀释液与HRP标记的山羊抗兔IgG抗体按5000：1的比例稀释作为二抗溶液，通过Western blot鉴定制备抗体的特异性。如图4所示，在远大于190kDa处出现条带，但出现不止一条目的带，推测是VP664蛋白降解或者该蛋白没有完全转录翻译。 Western blot结果表明制备的多克隆抗体可以特异性的与WSSV反应。
实施例3金纳米探针的制备
3.1抗体修饰金纳米颗粒(GNP)
根据病毒的大小，制备的金纳米探针选择粒径为15nm、protein A修饰的金纳米颗粒(0.17 μg/μL)。
(1)吸取200μL的金纳米颗粒至低吸附的1.5mL离心管中，向管中加入800μL PBST，稀释GNP溶液，10000rpm，4℃离心10min，吸去上清液，最后用200μL PBST重悬GNP沉淀，混匀备用。
(2)取低吸附的离心管，加入50μL清洗好的GNP，再加入1μL WSSV多克隆抗体(5mg/mL)。最后用PBST定容至终体积为200μL，混合均匀。混合液置于样品混合器上，室温混合4h。
(3)8000rpm，离心15min，吸去上清液，用200μL PBST重悬沉淀。重复此操作三次，最后沉淀用50μL PBST重悬混匀。制备的纳米探针4℃保存备用。
3.2金纳米探针的SDS-PAGE表征
为验证抗体是否与金纳米颗粒成功结合，通过SDS-PAGE检测制备好的金纳米探针。取20 μL探针，同时取金纳米颗粒和抗体作为对照，测定金纳米颗粒可以结合抗体的最大量。由图5 可知，第三泳道的金纳米探针同时具有第一泳道GNP颗粒的protein A的蛋白条带，和第二泳道抗体的蛋白条带。证明金纳米颗粒与抗体成功结合，通过抗体与探针条带的灰度值比对，可以得出20μL金纳米颗粒可以结合约1μg的抗体，即每个纳米颗粒表面可以结合约50个抗体分子。
3.3探针的吸收光谱测定
将比色皿用PBS反复清洗三次。以PBS作为空白对照，通过紫外-可见光分光光度计分别对探针、GNP进行全波长扫描，并分析金纳米探针的紫外可见光吸收光谱的变化。金纳米颗粒和金纳米探针的吸收光谱显示(图6)，金纳米颗粒在波长528nm处有最大吸收峰，而金纳米探针的最大吸收峰在541nm，出现明显的“红移”现象，这是由于在金纳米颗粒表面修饰抗体引起的，证明金纳米探针制备成功。
3.4金纳米探针的动态光散射(DLS)、激光多普勒速度测量(LDV)分析
用去离子水清洗电位样品池和粒径样品池，通过马尔文纳米粒度电位仪测定金纳米颗粒、抗体和金纳米探针的流体动力学尺寸和Zeta电位。如图7所示，与金纳米颗粒相比，金纳米探针的流体动力学尺寸明显增大(图7A)；由于抗体的弱负电性，修饰了抗体的金纳米颗粒负电位降低(图7B)，表明抗体与金纳米颗粒成功结合。
3.5金纳米探针的透射电子显微镜表征
取制备好的探针，通过透射电子显微镜观察其形态大小和分散状态，同时取未结合抗体的 GNP作为阴性对照。
透射电镜制样：吸取10μL的样品滴加在200目铜网上，室温静置10min。将铜网置于红外灯下进行烘干，水分蒸发完毕后，通过透射电子显微镜观察金纳米颗粒和制备的金纳米探针的形貌及单分散状态。由图8可知，与金纳米颗粒相比，金纳米探针仍具有良好的单分散性，可以用来构建WSSV检测体系。
实施例4在暗场下观察探针结合WSSV样品
4.1探针标记WSSV
取1g感染WSSV(PCR检测阳性)的对虾肌肉组织，加入10mL PBS(pH7.4)后冰浴匀浆1min；匀浆液经4℃，8000rpm离心10min后取上清；上清液通过200目过滤网过滤后经0.45μm微孔滤膜过滤，得到的滤液为WSSV粗提液；将粗提液稀释10倍后于克氏原螯虾腹部第四腹节向第三腹节侧面进行肌肉注射，每只100μL；约5-7天后取垂死的螯虾，经PCR 鉴定阳性后进行病毒提纯。
将WSSV粗提液通过肌肉注射感染克氏原螯虾，使WSSV在螯虾体内增殖。取5-6只感染 WSSV的螯虾，将去除肝胰腺后的组织剪碎，按照1：10(W/V)加入预冷处理的PBS缓冲液后进行冰浴匀浆。匀浆液经4℃，3000rpm离心15min，取上清；上清经200目过滤网过滤后4℃，5000rpm离心15min，取上清；4℃，8000rpm离心15min后，将上清用0.45μm微孔滤膜过滤。得到的滤液经4℃，25000rpm超速离心1h后，去除上清；沉淀用适量PBS重悬后铺于不连续蔗糖密度梯度上，蔗糖梯度为40％、46％、52％和62％(W/W，PBS配制)，4℃，25000 rpm离心1.5h后取各区间条带，加入适量PBS，4℃，25000rpm离心1h，弃去上清，沉淀用PBS重悬，并通过透射电镜观察。
吸取50μL实施例3制备的探针和1μL纯化的WSSV加入500μL低吸附的离心管中，再吸取200μL的PBST加入离心管中。混合均匀后，置于样品混合器上室温混合30min-1h。之后8000rpm离心10min。吸弃上清液，沉淀用200μL PBST重悬。
4.2暗场显微镜观察样品
4.2.1制备样品涂片：
取洁净的载玻片和盖玻片，浸入无水乙醇中，超声清洗15min后，在超净台自然晾干。
由于上步制备的探针结合WSSV的浓度很高，在暗场下不易观察，所以将混合液稀释100 倍后观察。在载玻片中央滴加5μL制备的样品，静置5min，45℃角度轻轻推盖上盖玻片，通过暗场显微镜观察样品。同时设置金纳米探针和纯化的WSSV作为阴性对照。试验思路及步骤见示意图(图9)。如图10所示，纯化的WSSV样品由于散射光弱，单独置于暗场下时无法观察到；15nm的金纳米颗粒在单分散状态下散射光很弱，在暗场显微镜下不易观察到，可能由于个别金纳米颗粒的团聚而在暗场下观察到微弱的发光点。而由于金纳米探针紧紧包围在 WSSV周围，所以探针与WSSV的结合样品在暗场显微镜下呈现出明亮的金黄色椭圆形结构，明显区别于暗场背景和阴性对照。
4.2.2透射电镜检测探针标记WSSV的特异性
为检测探针标记WSSV的特异性，分别准备探针标记WSSV样品、金纳米颗粒和WSSV的混合样品、探针与新城疫病毒(NDV)溶液混合样品、探针与低致病性禽流感病毒H9N2(LPAIV) 溶液混合样品，通过透射电镜观察各个样品的结合状态。如图11所示，通过透射电镜观察发现制备的金纳米探针紧紧围绕在WSSV的核衣壳表面(图11A-C)，而未结合抗体的金纳米颗粒不能与WSSV结合(图11D)，表明金纳米颗粒与WSSV不存在特异性吸附现象。金纳米探针也不能和NDV和LPAIV特异性结合，只是均匀的散落在病毒周围(图11E、F)。结果表明，制备的金纳米探针可以特异性的标记WSSV。
4.2.3金纳米探针-暗场显微计数法检测WSSV灵敏度测定
将已知浓度的WSSV用PBS稀释成7.12×103、1.42×103、2.84×102、5.68×101、1.12×101copies/μL五个浓度梯度，取10μL各个浓度的WSSV分别与10μL制备好的探针工作液在低吸附的离心管中混合均匀，再分别加入200μL PBST，将离心管置于样品混合器上室温混合1h。然后8000rpm离心10min，吸去上清液，沉淀用10μL PBST重悬。取5μL样品制成样品涂片，置于暗场显微镜下观察并计数。并将其与实时荧光定量PCR定量结果作对比，验证金纳米探针结合暗场显微镜定量检测方法的准确性。
经梯度稀释的WSSV分别通过实时荧光定量PCR和建立的金纳米探针结合暗场显微镜体系测定其浓度。结果显示在暗场显微镜下观察到明亮的椭圆型结构数量随WSSV浓度的降低而减少。每个梯度设置3个重复样品，每次观察时随机挑选10个视野，计算WSSV的浓度。由于5 μL样品制备的涂片面积大约是200个暗场视野，所以平均一个视野观察到的数量乘以200即为5μL样品中WSSV的总数量，经换算可得WSSV的浓度。
结果表明通过暗场显微镜得到的定量结果与荧光定量PCR具有一样的趋势且数值相近。当 WSSV浓度稀释到5.7×101copies/μL时，荧光定量PCR的检测结果有偏差，而在暗场显微镜下仍能观察到单个明亮的椭圆型结合物(图12-13)。表明金纳米探针的捕获效率高，且具有良好的重复性，可用于WSSV的定量检测。
表2金纳米探针法与荧光定量PCR法计数的结果对比
Figure BDA0003387170970000121
实施例5WSSV实际样品的检测
为了探究建立的检测体系在实际应用中的效果，选取感染WSSV的克氏原螯虾鳃部组织作为样本进行检测，具体步骤如下：
将6只健康的克氏原螯虾分为两组，实验组(3只)感染WSSV，对照组(3只)不感染WSSV。PCR鉴定实验组螯虾感染WSSV后，分别采集实验组和对照组螯虾的鳃部组织，每1mg组织加入1mL PBS进行冰浴研磨，研磨液通过简单的梯度离心后取上清做为待检样本，取10μL样本与10μL制备好的金纳米探针混合后置于暗场显微镜下观察结果。同时将样本通过已建立的实时荧光定量PCR方法进行定量检测，与暗场定量结果作对比。
经PCR鉴定克氏原螯虾成功感染WSSV后，通过金纳米探针结合暗场显微镜定量检测感染虾鳃组织样本中的WSSV。结果显示，实验组的样本在暗场显微镜下可以清楚看到金黄色的椭圆形结构，而对照组看不到任何金黄色结构(图14)。本研究建立方法对实际样本中的WSSV 计数结果与荧光定量PCR法对比显示，两种方法的检测结果保持一致(表3)，证明了本研究建立的金纳米探针-暗场显微镜定量检测WSSV方法应用于实际样品的可行性和准确性。
表3金纳米探针法与荧光定量PCR法检测实际样品的结果对比
Figure BDA0003387170970000131
参考文献
[1]Sanchez-Paz,Arturo.White spot syndrome virus:an overview on anemergent concern[J].Veterinary Research, 2010,41(6):43.
[2]马晓燕，李鹏，严杰等.对虾白斑综合症病毒的概述[C].江苏省人工智能学术会议,F,2012.
[3]张吕平，胡超群.对虾白斑杆状病毒(WSBV)对斑节对虾的实验感染与病理学研究[J].热带海洋学报, 2000,19(2):69-73.
samples of shrimp white spot syndrome virus[J].Diseases of AquaticOrganisms,1999,35(3):175-185.
[4]Lighner D V.A Handbook of shrimp pathology and diagnosticprocedures for disease of cultured penaeid shrimp[J].1996.
[5]洪健，周雪平.ICTV第八次报告的最新病毒分类系统[J].中国病毒学:英文版,2006,021(1):84-96.
序列表
<110> 江苏省淡水水产研究所
<120> 一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgg accagtaccc agaagt 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagttgt ttggaaaaac aatta 25

Claims (10)

1.一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针的制备方法，其特征在于由抗WSSV VP664多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒共同孵育，然后纯化制备得到所述的金纳米探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于表面修饰protein A的金纳米颗粒粒径为10-20nm，优选15nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗WSSV VP664多克隆抗体通过以下方法制备得到：
(1)从GenBank中获取编码WSSV核衣壳蛋白VP664的基因序列，序列号为：AF440570.1，设计引物VP664F/VP664R扩增目的基因，以提取的WSSV DNA为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；将上步回收纯化的目的基因和质粒pET-28a(+)双酶切，纯化后进行连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，利用PCR鉴定阳性菌，并将阳性菌进行测序；
(2)提取上一步的测序鉴定的阳性菌的质粒，将鉴定正确的质粒转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达；
(3)超声破菌得到粗蛋白溶液，采用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化在包涵体中表达的、带His标签的重组蛋白；
(4)将纯化的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射免疫青壮年新西兰白兔，加免完7天后采集全血测定效价，取免疫兔子的血清进行抗体纯化得抗WSSVVP664多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于每20μL金纳米颗粒结合约1μg的抗WSSVVP664多克隆抗体。
5.按照权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的金纳米探针。
6.权利要求5所述的金纳米探针在制备快速检测对虾白斑综合征病毒的试剂中的应用。
7.一种非疾病诊断目的的检测对虾白斑综合征病毒的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)利用权利要求5所述的金纳米探针标记WSSV；
(2)暗场显微镜观察样品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)将所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST混合均匀，离心弃上清，沉淀即为金纳米探针标记的WSSV。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的金纳米探针和纯化的WSSV以及PBST的体积比为(40-55):1:(18-210)，优选50:1:200。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，取上一步沉淀用PBST重悬，调整使适宜浓度后通过暗场显微镜观察样品，同时设置金纳米探针和纯化的WSSV作为阴性对照；金纳米探针在单分散状态下散射光很弱，在暗场显微镜下不易观察到，金纳米探针与WSSV的结合样品在暗场显微镜下呈现出明亮的金黄色椭圆形结构，明显区别于暗场背景和阴性对照。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114935650A (zh) * 2022-07-22 2022-08-23 香港科技大学深圳研究院 一种采用金纳米颗粒测试新冠病毒的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1303942A (zh) * 1999-11-24 2001-07-18 国家海洋局第三海洋研究所 对虾白斑杆状病毒基因组DNA序列及c DNA序列
CN102046650A (zh) * 2008-06-20 2011-05-04 瓦赫宁恩大学 感染抑制剂
CN107271441A (zh) * 2017-07-07 2017-10-20 扬州大学 一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法
CN108226495A (zh) * 2018-01-19 2018-06-29 扬州大学 一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1303942A (zh) * 1999-11-24 2001-07-18 国家海洋局第三海洋研究所 对虾白斑杆状病毒基因组DNA序列及c DNA序列
CN102046650A (zh) * 2008-06-20 2011-05-04 瓦赫宁恩大学 感染抑制剂
CN107271441A (zh) * 2017-07-07 2017-10-20 扬州大学 一种利用暗场显微镜肉眼直接观察隐孢子虫的方法
CN108226495A (zh) * 2018-01-19 2018-06-29 扬州大学 一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANN-HORNG LEU ET.AL: "The Unique Stacked Rings in the Nucleocapsid of the White Spot Syndrome Virus Virion Are Formed by the Major Structural Protein VP664, the Largest Viral Structural Protein Ever Found", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 79, no. 1, pages 140, XP093073683, DOI: 10.1128/JVI.79.1.140-149.2005 *
熊生良 等: "对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白VP664的鉴定研究", 台湾海峡, vol. 26, no. 1, pages 46 - 51 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114935650A (zh) * 2022-07-22 2022-08-23 香港科技大学深圳研究院 一种采用金纳米颗粒测试新冠病毒的检测方法

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