CN1303942A - 对虾白斑杆状病毒基因组DNA序列及c DNA序列 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从感染白斑杆状病毒的对虾组织中提纯的病毒完整基因组DNA,通过构建随机克隆DNA文库和Sau3A1不完全酶解片段克隆DNA文库,采用自动测序方法,测定了白斑杆状病毒基因组的全DNA序列,共有305,108bp,为双链环状DNA病毒。其次,本发明通过构建感染该病毒对虾组织的cDNA文库,用标记的病毒DNA作探针,筛选了病毒的cDNA,进行测序,获得了病毒cNDA序列。以上序列经生物信息处理分析,获得了白斑杆状病毒全部的基因组DNA和部分cDNA序列的相关数据及信息。

Description

对虾白斑杆状病毒基因组DNA序列及cDNA序列
本发明涉及我国、东南亚和其他国家发生的对虾爆发性流行病的主要病原-白斑杆状病毒(简称“WSBV”)基因组DNA全序列的测定和对虾白斑杆状病毒cDNA表达序列标记(EST)的测定。
国内外有关对虾杆状病毒基因组DNA序列测定的报道不多。迄今为止,已申请专利、发表文章和存入公开基因文库中的序列仅有六项,测定的序列从420bp到2,424bp不等,均为小片段DNA。韩国的J.S.Kim等分别测定了2,424bp(wsu 92007,1997)和420bp(wsu 89843,1997);日本的K.Mitsuo等测定了1,447bp(PN JP 1997201196-A/2)和1,461bp(PN JP 1997201196-A/1)两个DNA片段;台湾大学罗初芳等测得1,461bp(PMU50923,1996);美国L.M.Nunan等在J.Virological Methods[1997(63):193-201页]上发表了868bp,其他尚未见报道。上述已测得的序列总共不足10kb,且为DNA片段随机测定,未经系统分析,也无法确定其功能。由于对虾白斑杆状病毒基因组DNA超出300kb,因此,对基因组全序列及其完整结构的分析、表达序列的测定及其功能预测均为全新科研成果,为此特申请本专利。
上述白斑杆状病毒(White Spot Baculiform Virus,WSBV),国际上尚无统一名称,另外的名称有:“对虾白斑杆状病毒(PWSBV)”,“白斑杆状病毒(White SpotBaculiform Virus,WSBV)”,“白斑综合症病毒”或“白斑综合症相关杆状病毒(WSBV)”,“白斑综合症病毒(WSSV)”,“白斑病毒(WSV)”,“白斑病病毒(WSDV)”,“日本对虾杆状核型病毒(RV-PJ)”,“皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)”,“淋巴细胞核型杆状病毒(LNBV)”等。
本发明的目的在于测定WSBV的基因组DNA全序列,获得表达序列标记并通过生物信息分析处理,为进一步研究WSBV的复制、表达、增殖和感染机理奠定基础。根据已知序列建立早期、快速的病毒感染诊断方法,发展基因工程防治技术,构建转基因抗病毒对虾,开发抗病饲料,重组酶类和对其他病毒特殊功能蛋白进行开发利用等,从而达到健康养殖对虾、培育抗病对虾新品种、提高经济效益的目的。另外,WSBV是第一个进行基因组DNA和cDNA序列测定的海洋无脊椎动物病毒,为研究其它海洋无脊椎动物病原体提供了先导模型和经验。
本发明中使用的WSBV基因组DNA是从感染病毒的病虾组织提取纯化的。由于体外培养的对虾细胞系尚未建立,研究人员无法获得病毒感染的合适材料,只能从感染病毒的对虾组织里分离病毒。但是,对虾组织成分极为复杂,又含有丰富的水解酶类,要获得纯化且完整的病毒颗粒难度很大,这就是国内外均未见到获得完整对虾病毒DNA的有关报道,也没有相关专利的原因之一。本发明是利用发明者研究成功的分离对虾白斑杆状病毒的方法[发表在1997年J.Virological Methods(67):1-4页],从感染白斑杆状病毒的对虾组织中分离、提取和纯化完整的病毒基因组DNA并对此测序。本专利申请的内容包括以下几方面工作:一、通过构建WSBV的基因组DNA文库,测得WSBV全DNA序列,确定WSBV是环状双链DNA病毒。基因组大小为305,108bp。用以下两种方法构建WSBV的基因组DNA文库:
1.用随机克隆(“Shotgun”,即“鸟枪法”)的方法,以超声波断裂基因组DNA,取0.8-2kb左右的DNA片段,克隆到pUC18载体,以DH5α为宿主菌,构建随机克隆DNA文库后自动测序,共测定4,295个序列。
2.用Sau3A1不完全酶切基因组DNA,选取5-10kb的DNA片段,以pBluescript为载体、XL-Blue为宿主菌,构建基因组文库。自动测序仪测序,共测定1,500个序列。
3.通过计算机分析(分别应用UNIX系统中的InnerPeace和DNAsis软件)拼接组合,最终获得全长为305,108bp的WSBV基因组全序列。二、构建感染对虾的cDNA文库,以地高辛标记的WSBV DNA作为探针,从cDNA文库中筛选WSBV的cDNA。测定两端的DNA序列,获得WSBV的表达序列标记(EST)。参照其基因组DNA序列,获得cDNA序列。三、计算机辅助生物信息分析处理结果:
WSBV基因组DNA大小为305,108bp,含有开放阅读框144个,其中52%与其它生物体的蛋白质相关。结果说明,本病毒是一种新的病毒,是迄今为止已知的最大动物病毒,也是最早测得基因组DNA序列的海洋生物病毒之一。
一种对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,共305,108bp;白斑杆状病毒的37个cDNA序列。
本发明所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,涵盖该病毒复制、增殖、感染所需的全部调控基因、结构蛋白基因和功能蛋白基因;调控基因包含顺式元件和反式因子基因;结构蛋白基因包括病毒外膜蛋白基因(含与宿主细胞相作用的各类蛋白基因)、核衣壳蛋白基因和非特异性DNA结合蛋白基因等;功能蛋白基因包括各种酶基因,以及修饰宿主功能的各种蛋白质基因。
本发明所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,其特征在于白斑杆状病毒cDNA序列包括各种调控蛋白cDNA、结构蛋白cDNA和各种功能蛋白及其他多肽类的cDNA;全部阅读框包括前导肽、信号肽等。WSBV基因组  全序列:WSBV总碱基对数:305108bp碱基对组成:92043A;62482C;62635G;87948T碱基百分比:30%  A;20%  C;21%  G;29%  T环状双链DNA    分子量(kDa):188071.61   GGATCCAGAC ATCACCCCAA CAATCGCAGA CCCGATTACA GTAGCAGAAG TTGGAAACCC61  TGTCGTGAGG ATAAAAACTC CTTCATGTGA TGAGTTGAAT AAATTCATGA GATTCTCTAC121 TAATTTCTCA TTTTTAAAAT ACGTCAAACG GTTTATGGCG CAGAGAGCTT CATCTAATAG181  TAGGAATGAT ATGTCCGCTT TCTTATTAGA TTTGATTTTT GAAAAATTGA TAGAGTTTTT241  ATTATCAACA GGATGGAATA GAGAAGCTCT GGGAGGAACT ACTGGGGCTA TTCTTATGAT301  CAGGACGGCA ACTTGTCGTC TAGCGCAATC TTATTACCCC CTCCCTGAAA CCGTTGGTAT361  GGACTTTTTG CAAACACCTG GGTTTGACTA CAATAAATCT TTCCCTAACA ATGAAAGGTA421  TATATATGAA TTTCAAGCTA CAATGTAAAT AATTGGTTAA TAAAATAAAG GTATATTTTT481  AAAAAATGTG TTTATTTTTC CCCAACCTTA AACAGATCAT TGCCAGGAGA AAATCGCATA541  CTTAACAGAT AATGCCTATT TGTATCATCG ATGTCTTCGT CAAACGTTGC TCCAAACACA601  AGTGTGTTGA TCCTATTTTT CTTCAAAACT GTTGGTTTGA AATATAATAC AAATTTGTTA661  GCTGAAAATT CCCTTCCTGT AGCATTTAGA CCTGGAGACA GTGAAACAGA GTCCACTGTT721  ATATCCCTCT TTGTATTATT GTATACTCTT GCATACAATT CTAATTCTTT AGATTCGGCT781  TTGTTTACAT TTAGTGTGTG GTCTCCGTCT CCAAGTAAAG ATGTGAGGAT TATGTCTCCT841  TTCTTTTTTA CCAGTTCAGA ATCGGACGTT CCTTGGCCAG CTACATATAC CTTTCCATAG901  TTCCTGGTTT GTAATGTGCC GTTTACAAAG TTAAAGTGGT TTCCTCTAGC AACACCGTTA961  ATGGTCAAGT TTATTATTTC AGATTCAACA GGGTAGGCGT CTTTATCCTT CTTGTCCAAT1021 TTCTTGTTAA GTTCTATGTT GGTTACAACT ATAGATATAA CCACGAGTAT CAATGTCAAA1081 CCCGCCAGTA TAGCGGCGTA AACCCCCCAC ATGTGCATTT TGAAGAAAGT TGTACAAAGG1141 TCATGAGAGA AAAAAACAGA TATTAAAGTT TGTTATATTT TATTTAGTCG TAGAAATCAC1201 CACTGAGATA TATTGTGAGC AGCAACTGCC GTTTCAGCAT ACTCGAAAGA AGAATAGTTG1261 CGATCCTTTG AAGCCGGCAT CTTGAAATGA TGTGCAGTAT TATTTCTGCT AGTTTTGTTG1321 AAGTACTGGA TAGCCTTTAC TGAGTTGAAA GTTTCACGGG AACAGCTTGA ACAGTTGATG1381 GAGGAAGAAG TTCGCCTGCA CTGGCAATTC ACAAAGGAGT GCTGATTATT GTTGTTATGA1441 TGGTACATTT TGAAGGTGAG AGCACGTCTT TCTTCAACCA AAGGTGTTTG TCTAATGTGG1501 CTCAGGTACA TCCACGCTCA CCTTTTATAC CAACGTCTTA CAGTTCCTTC AGATCTTCCG1561 TCATGGCTTT AATCTTGTTG GTTATCCCTC GATCTACGAA GAATCTAATA TCTCCCTCAG1621 ATCTGTTCAA AACTTTCCAC GACTCCATTG GGTCCAGAGT ATAATCTGAC CTTTCTATGT1681 TTTTGACAAC TACAGGATCT GGTTGAATAT ATGCAGATGA TGCATCAAAA TCTACTTCTT1741 CGCCGCTCAT GCCTGTTTCT AGTCTTGAAA GGAGTGTGTC CAAATCTTCC TCTTCTTCGT1801 CTTCTTCCAT TTCTTCTCCA CTATCTAAAA ATTCGTCTAT ATCATTATCA TCAAAGTCTA1861 TGTCTATATC ATCATCATCA TCTTCCCCAA GAGATGAAGA AGGAGATGGG GTTCGTGTCG1921 GGGGAGGTGG AGGAGTAGGA GTAGGAGTAG GTGGAGGAGT AGGAGTAGGA GTAGGAGGGG1981 GTGGAGGTAA CAAACCTTCT CCAGGCACAG TTCCTGTTCC TCCACCTCCT GTATTGGACC2041 CAGTATTTAC ACTCGGTTGT TCAAATTCAA AAACTTCCTC CTCTTCTTTT CCGTCTTCTA2101 CAGCACCTTC CTCGTCTCTT CCGATCGGCC TATTTTCAGG TTCCCTTCGC CCTAATACAG2161 CTCCTTCGGT GTCATCTTCT TTTTCCTTCT CTTTATCTTT CTTTGTTTTT TTATTGGATG2221 TTGTAGTAGT TTTATTTGGT CGTGACATGA AAATCACACC AACCACCACA CCCACAAAAC2281 ACACAAAAAG TATGAGAGAT AATAAAAGGA ACATCATTAT TATCCTTATT TTTTTACATT2341 CAATTATGGC ACCAGAAAAA TAAAATGATT TGTACAAACA CGAGTTACCC CTCCACACGC2401 CTGACCTCTG CCGCGAATTC TTCATACCCT TCCATATTCT TTGCTGCAAA GGTCACGTCA2461 TGTTGATGAG CTACCATTTC ATATCGCATA TCTCGCCAAA AAGATCCATC CGCAACAGCG2521 GCCGTGCATT CTTCTTCAAT GGCAGAAGTC ATGTCAGCTG TCATTTTTTT AATAAGATCA2581 CGTAGTATTT CCTCCCTATA CAAATCTATA ACCTTCTGCC TAAAGACAGG CCTCTCTGCT2641 AAAAGAGAAG GATTTTCTGT AAGCTGGTCC ATGGTGTAAT AAAGTGTTCA TTTATCTAAC2701 TTTTAAAACC CAAACTCTTC TAAAATATCT ACAGATTCCA GGTACTCTGC CGCCATTGTT2761 GTAATCATTG TATTTGCCTT GTCTATCACT GCTTGTCTTT TATCTTCCAC ATCTCCCACC2821 TCGTCTTCGT GTTTTTTCCT TTCTTCTTCT AGAAGCCGTC TAAAGACAGC TTCTCTAATT2881 GAAGGTATTA GCCCCTCAAC TACCTGAGAA GCTTCCTGTT TTACATCATT CACAAATTCG2941 GGCGATTGTA GTACGAGCGT GATCGCGCTC TTGTAGATGT CTTCCAAAAT GTCCATTTTT3001 GTTGTTTAGA CCTAGATAGA GAGTGGGAGA CGCTATTAAT TTTTTTGTTC ATGTGGCTCA3061 TGACCTCATG TCCGATATAT GTATTGGTTG GGTGTAATAC AAGTCTCTAC AAAGCAATAG3121 AAGGGGTAAA AACAAAACAC ACCATGGTGC TAACTCTTTC CTGTACGACT AGGCGCGTAG3181 CGTCTAGCAA GGGGAATTTC TCTAAGGAAG ATGCGGTGTT GGGGAACCAG TTCCCCATTT3241 TAAAGAAATC AAACAACTTG TCAATTGCAA GACCTCCCTC AATAGAATCT TTTTCTGCAT3301 CAGTGGAAAA AATATTCAGG GAATGGAACG AAAGTGGGGG AGAAAAAATT TTCGACATAT3361 CTCAGAATGA AGAAGAATGG ATGGATATCA TATCCTTAGT GGAAAGTGTA TATGAACCTG3421 TATTTTCTAA ATCACTTAAA CCTGATAAAT TGGCAGATAA AACATGTCTA ACCGCGGCTG3481 CCTTTGCAGC ACTAGCTTCT GCCGTGGATG AAAAATTGAC AATCTTATCA GGTAGTGATG3541 GGAGTGTGCT TCAACGTACA ACAAAGGTTA TGAAAAAGGA CCCCAAAAAA ATAGCAGAAT3601 CTCTTTTAAA TAATGAAAAA TGGACATCTA TTTTATTGGA CAGGTTAAAA ACAGCCAAGA3661 AACTTCTAAG CAGACGAGGT GCACTGAAAA GCGCCGAAAG AGTAGAAGTA CTTCATCGGT3721 TGAATAAACT CAAGGAGGCT CCTCTTCCCC ACCATCCGAG CCTATTTGAT AATTTTAGTG3781 GAGGAAAAAC ATCAGCAGTA TCTGCTGGAA CAGTCATCGC ATCAGATATG CATTTCAAAT3841   TGGTTGAACA TATTTTTAAG GTCTCCTTTA GAAAATGGGG TCCCTGTGGA GATAAAACTG3901   AAAGCGGGGA AGAAGAAGAT GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA AAAGAAACAT TCCATATCAA3961   GATTCGTGCT TCAATTTATG AACGGACACA ACGGGCAACA TTATCATAGG CCCGAAAGTG4021   CTTCTGTTTA CTTTTGTGAT TATTATGACT ATTTGGCCTA CAGGAATCTC CCTAATGAGT4081   ACAAA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该病毒能感染目前养殖的所有对虾,引起对虾急性死亡,死亡率达90-100%,因此此序列测定是了解该病毒感染机理、复制增殖机制及采取防治对策的必要前提。以下对本发明的具体思路及方法做详细描述:一、构建WSBV基因组DNA文库:(一)“鸟枪法”文库的建立1.DNA片段超声打碎:
取5微克纯化的WSBV DNA溶于200微升重蒸水中,用超声波仪(Sonics &Materials Inc.)打碎。超声波仪的设置为:振幅:20;超声时间为5秒。2.末端修复补平:
取上述超声后的DNA溶液(200微升),加10单位大豆核酸酶(GIBCO BRL),置30℃水浴中反应15分钟。加入等容积酚/氯仿(1∶1),振荡1分钟,在4℃下,以14,000rpm离心10分钟。取上层溶液,加入1/10容积1摩尔/升氯化钠及500微升95%乙醇,在-20℃环境中放置1小时后,于4℃下,以14,000rpm离心30分钟。弃上清,沉淀物在室温下干燥5分钟后加入25微升pH8.0的TE缓冲液溶解。测定该溶液中DNA的浓度。3.回收DNA:
在1xTAE缓冲液中配制0.9%低熔点琼脂糖胶(LMP,Seaplaque GTG)。取15微升上述DNA溶液进行电泳分离,电压为56V,电泳时间40分钟。切下长度为0.8-2kb之间的DNA胶带,用GENECLEAN试剂盒(BIO 101 Inc.)回收DNA,测定该DNA的浓度。4.连接:
取3微升上述DNA溶液(约100纳克)加入1微升连接缓冲液(GIBCO BRL),0.5微升pUC18/SmalI/BAP(50纳克/微升,Pharmacia BioTech)以及0.5微升T4 DNA连接酶(1单位/微升,GIBCO BRL),总容量为5微升。置14℃水浴中,反应过夜(超过16小时)。5.转化:
在冰浴中将1微升上述连接后的DNA溶液加入100微升DH5α(GIBCO BRL)化学感受态细胞,于42℃水浴中加热45秒后立即置于冰浴中。加入600微升SOC培养液(GIBCOBRL),于摇床中以225rpm的摇速,培养1小时,分别取100微升涂于六块琼脂平板上,37℃培养过夜。有WSBV DNA插入的克隆显白斑,无插入的克隆则为蓝斑。(二)Sau3A1部分酶解法构建WSBV基因组文库1.WSBV毒基因组DNA不完全酶切:1)缓慢吸取50微升(浓度为0.1微克/微升)WSBV基因组DNA至1.5毫升容量的离心管中;2)加入10×Sau3A1缓冲液50微升;3)再加无菌重蒸水400微升,轻轻混匀;4)最后加入1微升Sau3A1(浓度为10单位/微升);5)混匀后在37℃水浴中放置10分钟,加入500微升异丙醇并混匀,在室温下放置30分钟;6)用台式离心机以14,000rpm离心5分钟,去上清液;7)用乙醇清洗两次沉淀,吸干,加入20微升无菌重蒸水溶解病毒DNA片断。2.WSBV基因组DNA片断电泳回收并纯化:1)配制0.5%琼脂糖凝胶(1xTAE溶解),将胶泡入含0.5微克/毫升EB的1xTAE中30分钟后放入电泳槽;2)在20微升病毒DNA片断样品中加入2微升6x电泳上样缓冲液,混匀,加入胶孔中;3)在旁侧胶孔内加入10微升(浓度为50纳克/微升)λ核酸标准分子量标准品;4)电泳缓冲液为1xTAE,电压为2伏特/厘米,在电泳时不时用手提紫外灯(306nm)监视电泳情况;5)当DNA片断达适当分离程度时,在紫外灯下对照核酸分子量标准,切下5-10kbDNA片断所在的琼脂糖凝胶带,置1.5毫升离心管中;6)称重,加入3倍胶重量的6M碘化钾,置55℃水浴5分钟至胶完全溶解;7)加入5微升玻璃粉浆液,冰浴30分钟,其间摇动数次;8)以10,000rpm离心10秒种,弃上清,加入400微升洗涤液,充分悬浮玻璃粉;9)以10,000rpm离心10秒种,弃上清,重复洗涤1次;10)吸干液体并干燥,加入20微升无菌重蒸水,振荡玻璃粉成浆液;11)置水浴中5分钟,以14,000rpm离心3分钟;12)将上清(含纯化的病毒DNA片断)转移至无菌的0.5毫升离心管中,置-20℃备用。3.载体的酶切反应、去磷酸化和纯化:1)在0.5毫升离心管中加入2微克载体(pBluescript),2微升10×BamH1缓冲液,无菌重蒸水加至19微升,然后加入1微升的BamH1(浓度为10单位/微升),在37℃水浴中反应2小时;2)加入20微升异丙醇混匀,在室温放置30分钟,用台式离心机以14,000rpm离心5分钟,去上清液;3)用乙醇两次清洗沉淀物,吸干并干燥后加入17微升无菌重蒸水溶解沉淀物;4)加入2微升的10xCIP缓冲液,1微升CIP(1单位/微升),置37℃水浴中反应30分钟;5)加入2微升3M醋酸钠(pH5.2),20微升异丙醇,混匀,于室温下放置30分钟;6)用台式离心机以14,000rpm离心5分钟,去上清液,以70%乙醇两次清洗沉淀,吸  干并干燥后加A20微升无菌重蒸水溶解沉淀物;7)与方法2步骤一样,通过电泳和玻璃粉纯化得到去磷酸化的BamH1酶切载体,最后用无菌重蒸水溶解(浓度为25纳克/微升)。4.WSBV基因组DNA片断连接和转化反应:1)在0.5毫升离心管中分别加入2微升去磷酸化BamH1酶切载体,5微升Sau3A1不完全酶切纯化的WSBV基因组DNA片断,2微升T4 DNA连接酶缓冲液及1微升T4DNA连接酶(1单位/微升),混匀,在16℃进行连接反应20小时;2)迅速融化200微升E.coli XL-Blue化学感受态细胞,加入上述连接反应产物,在室温下放置30分钟;3)加入800微升LB液体培养基,于37℃摇床上低速摇动1小时;4)用台式离心机以4,000rpm离心3分钟,吸取大部分上清液(留下约200微升),重悬沉淀菌;5)涂布含Amp 100微克/毫升的LB培养基板(预先涂布50微升/50mM IPTG,50微升X-gal),于37℃培养15小时后出现蓝、白菌落(蓝色表示无DNA片断插入,白色表示有DNA片断插入)。5.质粒提取:1)挑取白色单菌落至5毫升LB液体培养基(含100微克/毫升Amp),在37℃(200转/分钟)振荡培养过夜;2)将菌液倒入1.5毫升离心管,以10,000rpm离心30秒,去上清液,重复离心2次后留下菌体;3)加入150微升溶液I,充分悬浮菌体;4)加入300微升溶液II,轻轻翻转待菌液裂解至清亮;5)加入225微升溶液III,温和振荡,以14,000rpm离心3分钟;6)用牙签挑去沉淀,加入500微升异丙醇,以14,000rpm离心3分钟;7)去上清液,吸干;8)加入50微升TE溶解沉淀物;9)加入50微升8M氯化锂,以14,000rpm离心3分钟;10)转移上清液至新的1.5毫升离心管,加入100微升异丙醇,以14,000rpm离心3分钟,用70%乙醇清洗两次,吸干;11)沉淀物用40微升TE溶解,加入1微升RNaseA(浓度为10毫克/毫升),置37℃反应60分钟;12)加A200微升硅藻土,混匀,在4℃下放置1小时;13)把DNA/硅藻土混合液转移到微型柱中,放到套管中(1.5毫升去盖离心管);14)以5,000rpm离心,去溶液;15)加入200微升洗液,以5,000rpm离心,重复2次;16)加入200微升50%乙醇,离心速度从5,000rpm逐渐增大至10,000rpm,甩干;17)加入适量预热至70℃的重蒸水,离心速度从2,000rpm逐渐增大至15,000rpm,离心至新的1.5毫升离心管中收集样品,-20℃冰箱保存备用。二.大规模DNA测序I.PCR反应:1.配制PCR反应液(25微升/反应孔),内容如下:
2.5微升10倍GeneAmp II缓冲液(PE Biosystems),0.2微升dNTPs(25毫摩尔,Amersham),0.125微升M13正向PCR引物(40微摩尔),0.125微升M13反向PCR引物(40微摩尔),1.5微升氯化镁(25毫摩尔,PE Biosystems),0.5微升Taq Gold(5单位/微升,PE Biosystems)和20.05微升重蒸水,总容量为25微升。挑取单个白斑克隆置于96孔PCR反应板中(每个反应孔中均预先加入25微升上述PCR反应液),混匀。分别取1微升制成甘油保存液,保存于-85℃超低温冰箱中备用。2.PE 9700型PCR仪中进行PCR反应的条件:
95℃12分钟1个循环;95℃15秒,58℃20秒及72℃2分钟,重复30个循环;然后在4℃下保持到停机取出样品。3.琼脂糖胶电泳鉴定:
取5微升PCR产物加入2微升3倍溴酚蓝进行电泳分离,电压200伏特,电泳时间30分钟,电泳毕拍照存档。4.纯化PCR产物:
取8微升PCR产物,加入0.30微升虾碱性磷酸酶(1单位/微升),0.15微升Exonuclease I(核酸外切酶I,10单位/微升)和1.55微升重蒸水(总容量为10微升),放置在37℃下反应5分钟,然后于℃反应15分钟。II.测序反应:1.预配测序反应液如下:
1微升“BigDye Terminator”混合液(PE Biosystems试剂盒),1微升M13测序引物(3.2微摩尔),2微升纯化的PCR产物和1微升重蒸水,总容量为5微升。2.PE 9700型PCR仪中进行反应的条件:
96℃30秒、50℃15秒及60℃ 4分钟,重复25个循环;然后在4℃下保持到停机取出样品。3.纯化:
在各反应孔中分别加入25微升乙醇/醋酸钠沉淀液,在4℃下以4,000rpm离心30分钟,弃上清。各孔加入50微升70%乙醇,在4℃下以4,000rpm离心10分钟。弃上清后,在室温下干燥5分钟。III.测序:1.配胶:
以每块胶50毫升的量,预先配制5.25%聚丙烯酰胺凝胶,灌入377测序仪配套玻璃板中,在室温下放置2小时后使用。2.装配胶板和检查:
用去离子水仔细清洗玻璃板,在室温下晾干后,插入配套的鲨齿梳,装配于377型测序仪上,进行扫描检查,4色扫描条带必须水平,如有尖锐的峰形,须重新清洗玻璃板。3.预电泳:
在377型测序仪上装配好上、下电泳槽,灌入约1.5升1xTBE缓冲液,进行半小时预电泳。5.样品准备:
于上述纯化后的测序反应样品中,各加入5微升样品缓冲液(PE Biosystems),在72℃下加热2分钟后立即置于冰浴中,待上样。6.电泳:
将约1.5微升的样品加入梳齿孔中,先上样于奇数梳齿孔道,电泳3分钟后,再上样于偶数梳齿孔道。电泳7小时。仪器自动收集数据。7.分析:
用PE公司的分析软件,分析所收集之数据。将数据传输到UNIX系统中储存。三.序列分析:I.序列拼接:
将所得的序列(共5,795个)用UNIX系统中的InnerPeace软件拼接(该软件是在华盛顿大学开发的Phred,Phrap及Consed的基础上设计而成)。II.序列的校正及最后完成:1.对模糊序列,找出相对应的克隆,重新对其PCR产物进行测序。2.对重复序列,有可能导致拼接错误,则设计引物,在原来PCR产物或重新制备的质粒DNA上进行“步行法”测序,即一步一步地设计引物,向前推进测序。3.对序列间隙,即有一克隆连接两个片段,则直接将该克隆序列测通,即可填补该间隙。4.对物理间隙,通过在片段间设计引物进行PCR或长片段PCR扩增,来确定及连接该间隙,再用引物“步行法”将PCR产物测通。5.对无法用PCR方法来填补的物理间隙,则直接在WSBV基因组DNA上进行“步行法”测序。四、WSBV cDNA文库的构建I.方法1.Poly(A)-mRNA的提纯:1)取出试剂盒中GTC抽提缓冲液、生物素标记的Oligo(dT)探针、不含核苷酸酶的重蒸水和0.5×SSC,恢复至室温;将稀释缓冲液预热至70℃;2)取20毫升容量玻璃管,加入4毫升抽提缓冲液和104微升β-巯基乙醇;3)尽快取病虾之消化腺,加入该玻璃管中制成匀浆;4)以8,000rpm离心10分钟,取上清;5)分别将8毫升稀释缓冲液(70℃预热)和164微升β-巯基乙醇加入匀浆管中,翻转几次混匀;6)加入5微升探针,混匀后在70℃下孵育5分钟;7)转移至15毫升无菌试管中,在室温下以40,000rpm离心10分钟;8)同时将SA-PMPs悬浮,取5毫升置于50毫升带盖无菌管中,放置在磁性平台上,倒去液体;加入同体积0.5xSSC,悬浮,弃去液体,重复二次后加入同体积0.5xSSC,悬浮;9)离心后取上清,转入SA-PMPs管中,翻转混匀;10)在室温下放置2分钟,置于磁性平台上至溶液澄清,弃去液体;11)加入2毫升0.5xSSC,轻扣管壁使之悬浮,转移到2毫升试管中,放置在磁性平台上,小心吸去液体,重复一次,尽量吸去液体;12)加入1毫升不含核苷酸酶的重蒸水,轻扣悬浮,放置于磁性平台上,小心吸去SSC液体,重复,直至提取物体积到达1微升;13)SA-PMPs以不含核苷酸酶的重蒸水悬浮,留样;14)加入0.1倍体积的3M NaAC和1倍体积的异丙醇,在-20℃下放置过夜;15)以40,000rpm离心10分钟,沉淀物用70%乙醇洗涤,离心后吸去残液;16)以不含核苷酸酶的重蒸水悬浮成0.5-1.0微升,置于-70℃冻存。2.mRNA逆转录成cDNA:1).第一链合成:a)在1.5毫升离心管中加入2微升Not I接头引物,随后加入2微升mRNA(2微克/微升)和5微升DEPC处理水;b)混合均匀,在70℃孵育10分钟后,置冰上迅速冷却;c)稍作离心,加入4微升第一链缓冲液,2微升0.1M DTT,1微升10mM dNTP混合液;d)轻轻振荡以使混匀,稍作离心,置37℃孵育5分钟以平衡温度;e)加入4微升SuperScript II RT(1微克/微升),混匀后置37℃孵育1小时;f)转移至冰上以终止反应。2).第二链合成:a)向该管中加入95微升DEPC处理水、30微升第二链缓冲液、3微升10mM dNTP混合液、1微升大肠杆菌DNA连接酶(10单位/微升)、4微升大肠杆菌DNA多聚酶I(10单位/微升)和1微升大肠杆菌RNase H(2单位/微升);b)轻轻振荡以使混匀,置16C2小时;c)加入2微升T4 DNA多聚酶,在16℃继续放置5分钟;d)转移至冰上并加入10微升0.5M EDTA;e)加入150μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),剧烈振荡,在室温下以14,000rpm离心2分钟以分相,小心取出上相140微升溶液转移至新的1.5毫升离心管中;f)加入70微升7.5M醋酸铵和0.5毫升无水乙醇(-20℃预冷),混匀后立即在室温下以14,000rpm离心20分钟;g)去上清,沉淀物用0.5毫升70%的乙醇(-20℃预冷)洗涤,以14,000rpm离心2分钟,去上清;h)置37℃干燥10分钟以使残余乙醇挥发。3).连接SalI接头:a)向该管内加入25微升DEPC处理水、10微升T4 DNA连接酶缓冲液、10微升Sal I接头和5微升T4 DNA连接酶;b)轻轻混匀,置16℃16小时;c)加入50微升酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),剧烈振荡,室温下用14,000g速度离心5分钟以分相,小心取出上相45微升转移至新的1.5毫升离心管;d)加入4.5微升3M醋酸钠和90微升无水乙醇(-20℃预冷),混匀后立即在室温下,以14,000g速度离心20分钟;e)去上清,沉淀物以0.5毫升70%的乙醇(-20℃预冷)洗涤,用14,000rpm离心2分钟,去上清;f)置37℃干燥10分钟以使残余乙醇挥发。4).NotI消化:a)向该管内加入41微升DEPC处理水、5微升缓冲液和4微升Not I;b)轻轻混匀,37℃孵育2小时;c)加入50微升酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),剧烈振荡,室温下用14,000rpm离心5分钟以分相,小心取出上相45微升转移置新的1.5毫升离心管;d)加入4.5微升3M醋酸钠和90微升无水乙醇(-20℃预冷),混匀后立即在室温下用14,000rpm离心20分钟;e)去上清,沉淀物以0.5毫升70%的乙醇(-20℃预冷)洗涤,用14,000rpm离心2分钟,去上清;f)置37℃干燥10分钟以使残余乙醇挥发。5).大片段分离:a)  向该管加入20微升TE缓冲液以溶解cDNA;b)用1%琼脂糖胶电泳分离cDNA,以分子量标准显示500bp电泳带,电压为60伏特;c)取1.5毫升离心管称重;电泳15分钟后割取大于500bp的cDNA条带,转移置该管,称重,计算胶的重量;d)加入3倍体积的6M碘化钾,55℃水浴加热15分钟,待胶溶解;e)加入5微升玻璃粉浆液,混匀,在4℃下放置1小时,其间经常振摇;f)在室温下以14,000rpm离心30秒钟,吸去液体;g)沉淀物用1毫升清洗溶液悬起,在室温下以14,000rpm离心30秒钟,吸去液体;h)沉淀物用1毫升80%的乙醇悬起,在室温下以14,000rpm离心5分钟,吸去液体,室温晾干10分钟;i)加入10微升重蒸水,在55℃下孵育5分钟;j)在室温下以14,000rpm离心2分钟,吸取液体,转移置1.5毫升离心管;k)在硅胶管中再加入5微升重蒸水,在室温下以14,000rpm离心2分钟,吸取液体,与上述吸取液合并,置-20℃保存。3.cDNA插入pSPORT载体:1)在1.5毫升离心管中加入5微升cDNA、2微升pSPORT、Not I-Sal I-Cut(50微克/微升)、4微升T4 DNA连接酶缓冲液和8微升重蒸水;2)混匀后加入1微升4 DNA连接酶,混匀;3)于16℃水浴孵育过夜;4)加入2微升3M醋酸钠和40微升无水乙醇(-20℃预冷),混匀后立即在室温下以14,000rpm离心20分钟;5)去上清,沉淀物用0.5毫升70%的乙醇(-20℃预冷)洗涤,以14,000rpm离心2分钟,去上清并重复一次;6)置37℃干燥10分钟以使残余乙醇挥发,用5微升重蒸水溶解,待电转化用。4.感受态细胞的制备:1)在40毫升LB液体培养基上接种DH10α,37℃培养至OD600为0.6-1.0;2)置冰上40分钟;3)转移至灭菌的45毫升离心管中,以4,000rpm离心10分钟,去上清;4)用40毫升灭菌重蒸水(4℃预冷)悬浮细胞,以4,000rpm离心10分钟,去上清;5)用20毫升灭菌重蒸水(4℃预冷)悬浮细胞,以4,000rpm离心10分钟,去上清;6)用1毫升灭菌重蒸水(4℃预冷)悬浮细胞,以4,000rpm离心10分钟,去上清;7)以200微升灭菌的10%甘油(4℃预冷)悬浮细胞,按每管100微升的量分装,置冰上待用。5.电转化方法:1)在100微升感受态细胞中,加入2微升连接产物,混匀,冰浴1分钟;2)转移到经预冷的0.2厘米电穿孔容器;3)用BTX600C电转化仪电击:脉冲时间约5-6毫秒,场强为12,500伏特/厘米,设定参数为:2,500伏特,R5(129欧姆);4)加入1毫升LB,转移到1.5毫升离心管中,在37℃下轻摇40分钟以使细胞复苏;5)取200微升涂布LB琼脂糖平板(含Amp),在37℃下培养过夜。6.地高辛标记DNA探针:1)取3微克纯化好的DNA置于1.5毫升离心管中,置100℃水浴10分钟变性DNA;2)随即加入4微升六核苷酸混合液,4微升dNTP混合液,38微升重蒸水和2微升Klenow酶(2单位/微升);3)混匀后置于37℃水浴中孵育20小时,其间补加1微升Klenow酶,并稍作离心;4)加A2微升EDTA(0.2M,pH8.0)以终止反应;5)加入2.5微升4M氯化锂和75微升的乙醇(-20℃预冷),于-20℃放置2小时;6) 12,000g离心10分钟,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤两次,吸去液体,室温晾干;7)以50微升TE缓冲液溶解探针,置于-20℃保存。7.原位杂交筛选阳性克隆:1).菌落裂解及DNA变性与固定:a)将保种甘油菌稀释成合适浓度后涂布在LB(含Amp)平板上,在37℃下培养过夜;b)当菌落大小在1-2毫米时,取出平板,于4℃放置1小时;c)取灭菌的尼龙膜,小心覆盖于平板上,放置5分钟后将尼龙膜揭下,室温晾干;d)取三个培养皿,各放入一张滤纸,然后分别加入杂交变性液、中和液、洗涤液,使滤纸浸透;e)将尼龙膜菌落面朝上放于浸透变性液的滤纸上,变性5分钟;f)将尼龙膜转到浸透中和液的滤纸上,中和5分钟;g)将尼龙膜转到浸透洗涤液的滤纸上,洗涤5分钟;h)将尼龙膜取出后放于滤纸上,室温晾干;i)将尼龙膜放于紫外交联仪上,用254纳米波长照射3分钟以固定DNA。2).与地高辛标记的探针杂交:a)将尼龙膜转入杂交袋,加入20毫升经65℃预热的预杂交液,密封后在65℃水浴中孵育1小时;b)取100纳克地高辛标记的探针,在100℃水浴中煮2分钟后加入3毫升经65℃预热的预杂交液配成杂交液;c)倒出杂交袋中的预杂交液,加入杂交液,密封后在65℃水浴中孵育至少6小时,  其间经常摇动以使杂交液能均匀覆盖尼龙膜;d)取出尼龙膜,以50毫升的2xSSC和0.1%SDS洗液洗涤5分钟,重复一次;e)用50毫升的0.1倍SSC和0.1%SDS洗液在68℃下洗涤15分钟,重复一次。4).显色:a)用20毫升杂交检测缓冲液1洗涤尼龙膜1分钟;b)换用100毫升杂交检测缓冲液2孵育尼龙膜30分钟;c)加入4微升抗地高辛-AP复合物于20毫升杂交检测缓冲液2中孵育尼龙膜30分钟;d)用100毫升的杂交检测缓冲液1洗涤尼龙膜15分钟,重复一次;e)用20毫升的杂交检测缓冲液3平衡尼龙膜2分钟;f)在10毫升的杂交检测缓冲液3中加入80微升显色液,在避光条件下显色尼龙膜;g)待显色到适当深度时,加入100毫升的TE缓冲液洗涤尼龙膜10分钟,重复一次,取出稍晾干后,观察结果或照相;尼龙膜可装入透明塑料袋置于-20℃保存。8.质粒抽提方法:1)挑取单菌落至5毫升LB液体培养基(Amp 100微克/毫升),在37℃下振荡过夜;2)将菌液倒至1.5毫升离心管中,以14,000rpm离心30秒钟,重复一次,留下菌体;3)加入200微升溶液I,充分悬浮;4)加入400微升溶液II,轻轻翻转,冰浴5分钟使细菌裂解至清亮;5)加入300微升溶液III,温和振荡,冰浴5分钟后,以14,000rpm离心5分钟;6)转移上清至新的1.5毫升离心管中,加入等体积预冷的异丙醇;7)以14,000rpm离心3分钟,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤两次,吸去液体,室温晾干;8)沉淀物用200微升TE溶解,加入等体积8M氯化锂,以14,000rpm离心3分钟;9)转移上清至新的1.5毫升离心管中,加入等体积经预冷的异丙醇;10)以14,000rpm离心3分钟,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤两次,吸去液体,室温晾干;11)沉淀物以100微升TE溶解,加入1微升RNase A,在37℃水浴中反应30分钟;12)加入10微升3M醋酸钠和200微升乙醇(-20℃预冷);13)以14,000rpm离心3分钟,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤两次,吸去液体,室温晾干;14)以40微升TE溶解质粒,加入200微升硅藻土,混匀,在4℃下放置1小时;15)把DNA/硅藻土转到魔力柱中,以5,000rpm离心,使其入柱;16)加入200微升洗液,以5,000rpm离心,重复3次;17)加入70%乙醇,离心速度从5,000rpm逐渐增大至15,000rpm,甩干;18)加入适量经70℃预热的重蒸水,离心速度从2,000rpm逐渐增大至15,000rpm,离心液由新的离心管收集;19)取1微升质粒稀释至100微升,测定OD260及OD280,其余置-20℃保存。附录:I.材料1.工具酶:Sau3A1为Biolab产品;BamH1为GIBCO BRL产品;T4 DNA连接酶为GIBCO BRL产品;碱性磷酸酶(CIP)为Boehringer Mannheim产品;RNase A为Sigma产品。2.商品试剂盒:2)地高辛标记杂交试剂盒(Dig labeling kit)为Boehringer Mannheim产品;3)Poly(A)-mRNA抽提试剂盒(PolyATtract System 1000)为Promega产品;4)cDNA合成及克隆试剂盒(SUPERSCRIPTTM Plasmid System for cDNA Synthesisand Plasmid Cloning)为GIBCO BRL公司产品;3.载体和菌株:pBluescript载体和XL-Blue均为Stratagene产品。4.试剂:dNTP为Boehringer Mannheim产品;Blocking Reagent为Boehringer Mannheim产品;琼脂糖(Agarose)为Sigma产品;三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Sigma产品;β-巯基乙醇为Sigma产品;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)为Sigma产品;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为Sigma产品;核酸分子量标准为MBI产品;蛋白胨为Oxoid产品;酵母浸出膏为Oxoid产品;5.引物M13正向PCR引物:21mer 5’-CGCTATTACGCCAGCTGGCGA-3’M13反向PCR引物:20mer 5’-ATGCAGCTGGCACGACAGGT-3’M13正向测序引物:18mer 5’-TATAAAACGACGGCCAGT-3’M13反向测序引物:18mer 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’II.常用溶液、培养基的配制:1.LB培养液:氯化钠1.0%酵母浸出膏0.5%蛋白胨1.0%琼脂1.5%2.LB培养液:氯化钠1.0%酵母浸出膏0.5%蛋白胨1.0%3.乙醇/醋酸钠沉淀液:2.5微升3M醋酸钠37.5微升95%乙醇4. 5.25%聚丙烯酰胺凝胶:
取30毫升GENE-PAGE PLUS 6%及50毫升GENE-PAGE PLUS 4.8%,混匀后,抽气5分钟。取50毫升上述5.25%聚丙烯酰胺凝胶,加A250微升新鲜配制的10%过硫酸铵及28微升TEMED,混匀后灌胶。6.TE缓冲液,pH8.0:
Tris-盐酸(pH8.0)                             10mM
EDTA(pH8.0)                                  1mM7.TAE缓冲液(1x):
Tris-醋酸                                    40mM
EDTA                                         1mM7.TBE缓冲液(1x):
Tris-硼酸                                    90mM
EDTA.                                        2mM8.琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液(6x)
溴酚蓝                                       0.25%
蔗糖                                         40%9.溶液I
葡萄糖                                       50mM
Tris-盐酸(pH8.0)                             25mM
EDTA(pH8.0)                                  10mM10.溶液II
氢氧化钠                                     0.2M
SDS                                          1%11.溶液III
醋酸钾                                       3M
醋酸                                         11.5%12.杂交变性液
氢氧化钠                                     0.5M
氯化钠                                       1.5M13.杂交中和液
氯化钠                                       1.5M
Tris-盐酸(pH7.4)                             0.5M14. 20xSSC贮液(pH7.0)
氯化钠                                       17.53%
    柠檬酸钠                          8.82%15. 2×SSC杂交洗涤液
    用20×SSC稀释10倍16. 5×SSC杂交液:将以下化学物品配在用20xSSC稀释4倍后的缓冲液中
    Blocking Reagent                  1%(w/v)
    N-lauroylsarcosine Na-Salt        0.1%(w/v)
    SDS                               0.02%(w/v)17.杂交检测缓冲液1:
    Tris-盐酸                         100mM pH7.5
    氯化钠                            150mM18.杂交检测缓冲液2:
    1%Blocking Reagent溶解于杂交检测缓冲液119.杂交检测缓冲液3:
    Tris-盐酸                         100mM/pH9.5
    氯化钠                            100mM
    氯化镁                            50mM20.杂交检测缓冲液4:
    Tris-盐酸                         10mM/pH8.0
    EDTA                              1mM21.6M碘化钾溶液(100ml)
    碘化钾                            90.8g
    亚硫酸钠                          2g22.洗脱液
    乙醇                              50ml
    Tris-盐酸(20mM/pH7.4)/EDTA(1mM)/氯化钠(100mM)50ml23.醋酸钠(3M pH5.2)
    醋酸钠                            40.81%
    用冰醋酸调节至pH5.2省略用词一览表:
省略词 英文名称 中文名称
DNA  deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
bp  base pair 碱基对
cDNA  complementary DNA 互补脱氧核糖核酸
EST  expressed sequence tag 表达序列标记
kb  kilo base pairs 千碱基对
UNIX  a multiuser,multitasking computeroperating system 多用户分时操作系统
rpm  rotor per minute 每分钟转数
Inc.  incorporation 公司
PCR  polymerase chain reaction 聚合酶链反应
M  mol/l 摩尔/升
mM  mmol/l 毫摩尔/升
pH  hydrogen ion exponent 氢离子指数
RNaseA  Ribonuclease A 核糖核酸酶A
E.coli  Escherichia coli 大肠杆菌
Amp  ampicillin 氨苄青霉素
w/v  weight/volume 重量/体积
Poly(A)  poly adenylic acid 聚腺苷酸
mRNA  messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸
Oligo(dT)  Oligo-deoxythymidine 寡聚脱氧胸苷
OD  optical density 光密度
dNTPs  dATP,dTTP,dGTP,dCTP 四种脱氧核苷酸混合液
Tris  Tris(Hydroxymethyl)Methylglycine 三(羟甲基)氨基甲烷
EDTA  Ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
DEPC  Diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
DTT  1,4-Dithiothreitol 1,4-二硫代苏糖醇
SDS  Sodium Dedecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠
TEMED  N,N,N’,N’-tetramethylethyl-enediamine N,N,N’,N’-四甲基乙二胺
A 脱氧腺嘌呤核苷酸
C 脱氧胞嘧啶核苷酸
G 脱氧鸟嘌呤核苷酸
T 脱氧胸腺嘧啶核苷酸

Claims (5)

1.一种对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,共305,108bp;白斑杆状病毒的37个cDNA序列。
2.根据权利要求1所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,其特征在于涵盖该病毒复制、增殖、感染所需的全部调控基因、结构蛋白基因和功能蛋白基因;调控基因包含顺式元件和反式因子基因;结构蛋白基因包括病毒外膜蛋白基因(含与宿主细胞相作用的各类蛋白基因)、核衣壳蛋白基因和非特异性DNA结合蛋白基因等;功能蛋白基因包括各种酶基因,以及修饰宿主功能的各种蛋白质基因。
3.根据权利要求1所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,其特征在于白斑杆状病毒cDNA序列包括各种调控蛋白cDNA、结构蛋白cDNA和各种功能蛋白及其他多肽类的cDNA;全部阅读框包括前导肽、信号肽等。
4.根据权利要求1所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,其特征在于WSBV基因组  全序列:WSBV总碱基对数:305108bp碱基对组成:92043A;62482C;62635G;87948T碱基百分比:30%A;20%C;21%G;29%T环状双链DNA     分子量(kDa):188071.61       GGATCCAGAC ATCACCCCAA CAATCGCAGA CCCGATTACA GTAGCAGAAG TTGGAAACCC61      TGTCGTGAGG ATAAAAACTC CTTCATGTGA TGAGTTGAAT AAATTCATGA GATTCTCTAC121     TAATTTCTCA TTTTTAAAAT ACGTCAAACG GTTTATGGCG CAGAGAGCTT CATCTAATAG181     TAGGAATGAT ATGTCCGCTT TCTTATTAGA TTTGATTTTT GAAAAATTGA TAGAGTTTTT241     ATTATCAACA GGATGGAATA GAGAAGCTCT GGGAGGAACT ACTGGGGCTA TTCTTATGAT301     CAGGACGGCA ACTTGTCGTC TAGCGCAATC TTATTACCCC CTCCCTGAAA CCGTTGGTAT361     GGACTTTTTG CAAACACCTG GGTTTGACTA CAATAAATCT TTCCCTAACA ATGAAAGGTA421     TATATATGAA TTTCAAGCTA CAATGTAAAT AATTGGTTAA TAAAATAAAG GTATATTTTT481     AAAAAATGTG TTTATTTTTC CCCAACCTTA AACAGATCAT TGCCAGGAGA AAATCGCATA541     CTTAACAGAT AATGCCTATT TGTATCATCG ATGTCTTCGT CAAACGTTGC TCCAAACACA601     AGTGTGTTGA TCCTATTTTT CTTCAAAACT GTTGGTTTGA AATATAATAC AAATTTGTTA661     GCTGAAAATT CCCTTCCTGT AGCATTTAGA CCTGGAGACA GTGAAACAGA GTCCACTGTT721     ATATCCCTCT TTGTATTATT GTATACTCTT GCATACAATT CTAATTCTTT AGATTCGGCT781     TTGTTTACAT TTAGTGTGTG GTCTCCGTCT CCAAGTAAAG ATGTGAGGAT TATGTCTCCT841     TTCTTTTTTA CCAGTTCAGA ATCGGACGTT CCTTGGCCAG CTACATATAC CTTTCCATAG901     TTCCTGGTTT GTAATGTGCC GTTTACAAAG TTAAAGTGGT TTCCTCTAGC AACACCGTTA961     ATGGTCAAGT TTATTATTTC AGATTCAACA GGGTAGGCGT CTTTATCCTT CTTGTCCAAT1021    TTCTTGTTAA GTTCTATGTT GGTTACAACT ATAGATATAA CCACGAGTAT CAATGTCAAA1081    CCCGCCAGTA TAGCGGCGTA AACCCCCCAC ATGTGCATTT TGAAGAAAGT TGTACAAAGG1141    TCATGAGAGA AAAAAACAGA TATTAAAGTT TGTTATATTT TATTTAGTCG TAGAAATCAC1201    CACTGAGATA TATTGTGAGC AGCAACTGCC GTTTCAGCAT ACTCGAAAGA AGAATAGTTG1261    CGATCCTTTG AAGCCGGCAT CTTGAAATGA TGTGCAGTAT TATTTCTGCT AGTTTTGTTG1321    AAGTACTGGA TAGCCTTTAC TGAGTTGAAA GTTTCACGGG AACAGCTTGA ACAGTTGATG1381    GAGGAAGAAG TTCGCCTGCA CTGGCAATTC ACAAAGGAGT GCTGATTATT GTTGTTATGA1441    TGGTACATTT TGAAGGTGAG AGCACGTCTT TCTTCAACCA AAGGTGTTTG TCTAATGTGG1501    CTCAGGTACA TCCACGCTCA CCTTTTATAC CAACGTCTTA CAGTTCCTTC AGATCTTCCG1561    TCATGGCTTT AATCTTGTTG GTTATCCCTC GATCTACGAA GAATCTAATA TCTCCCTCAG1621    ATCTGTTCAA AACTTTCCAC GACTCCATTG GGTCCAGAGT ATAATCTGAC CTTTCTATGT1681    TTTTGACAAC TACAGGATCT GGTTGAATAT ATGCAGATGA TGCATCAAAA TCTACTTCTT1741    CGCCGCTCAT GCCTGTTTCT AGTCTTGAAA GGAGTGTGTC CAAATCTTCC TCTTCTTCGT1801    CTTCTTCCAT TTCTTCTCCA CTATCTAAAA ATTCGTCTAT ATCATTATCA TCAAAGTCTA1861    TGTCTATATC ATCATCATCA TCTTCCCCAA GAGATGAAGA AGGAGATGGG GTTCGTGTCG1921    GGGGAGGTGG AGGAGTAGGA GTAGGAGTAG GTGGAGGAGT AGGAGTAGGA GTAGGAGGGG1981    GTGGAGGTAA CAAACCTTCT CCAGGCACAG TTCCTGTTCC TCCACCTCCT GTATTGGACC2041    CAGTATTTAC ACTCGGTTGT TCAAATTCAA AAACTTCCTC CTCTTCTTTT CCGTCTTCTA2101    CAGCACCTTC CTCGTCTCTT CCGATCGGCC TATTTTCAGG TTCCCTTCGC CCTAATACAG2161    CTCCTTCGGT GTCATCTTCT TTTTCCTTCT CTTTATCTTT CTTTGTTTTT TTATTGGATG2221    TTGTAGTAGT TTTATTTGGT CGTGACATGA AAATCACACC AACCACCACA CCCACAAAAC2281    ACACAAAAAG TATGAGAGAT AATAAAAGGA ACATCATTAT TATCCTTATT TTTTTACATT2341    CAATTATGGC ACCAGAAAAA TAAAATGATT TGTACAAACA CGAGTTACCC CTCCACACGC2401    CTGACCTCTG CCGCGAATTC TTCATACCCT TCCATATTCT TTGCTGCAAA GGTCACGTCA2461    TGTTGATGAG CTACCATTTC ATATCGCATA TCTCGCCAAA AAGATCCATC CGCAACAGCG2521    GCCGTGCATT CTTCTTCAAT GGCAGAAGTC ATGTCAGCTG TCATTTTTTT AATAAGATCA2581    CGTAGTATTT CCTCCCTATA CAAATCTATA ACCTTCTGCC TAAAGACAGG CCTCTCTGCT2641    AAAAGAGAAG GATTTTCTGT AAGCTGGTCC ATGGTGTAAT AAAGTGTTCA TTTATCTAAC2701    TTTTAAAACC CAAACTCTTC TAAAATATCT ACAGATTCCA GGTACTCTGC CGCCATTGTT2761    GTAATCATTG TATTTGCCTT GTCTATCACT GCTTGTCTTT TATCTTCCAC ATCTCCCACC2821    TCGTCTTCGT GTTTTTTCCT TTCTTCTTCT AGAAGCCGTC TAAAGACAGC TTCTCTAATT2881    GAAGGTATTA GCCCCTCAAC TACCTGAGAA GCTTCCTGTT TTACATCATT CACAAATTCG2941    GGCGATTGTA GTACGAGCGT GATCGCGCTC TTGTAGATGT CTTCCAAAAT GTCCATTTTT3001    GTTGTTTAGA CCTAGATAGA GAGTGGGAGA CGCTATTAAT TTTTTTGTTC ATGTGGCTCA3061    TGACCTCATG TCCGATATAT GTATTGGTTG GGTGTAATAC AAGTCTCTAC AAAGCAATAG3121    AAGGGGTAAA AACAAAACAC ACCATGGTGC TAACTCTTTC CTGTACGACT AGGCGCGTAG3181    CGTCTAGCAA GGGGAATTTC TCTAAGGAAG ATGCGGTGTT GGGGAACCAG TTCCCCATTT3241    TAAAGAAATC AAACAACTTG TCAATTGCAA GACCTCCCTC AATAGAATCT TTTTCTGCAT3301    CAGTGGAAAA AATATTCAGG GAATGGAACG AAAGTGGGGG AGAAAAAATT TTCGACATAT3361    CTCAGAATGA AGAAGAATGG ATGGATATCA TATCCTTAGT GGAAAGTGTA TATGAACCTG3421    TATTTTCTAA ATCACTTAAA CCTGATAAAT TGGCAGATAA AACATGTCTA ACCGCGGCTG3481    CCTTTGCAGC ACTAGCTTCT GCCGTGGATG AAAAATTGAC AATCTTATCA GGTAGTGATG3541    GGAGTGTGCT TCAACGTACA ACAAAGGTTA TGAAAAAGGA CCCCAAAAAA ATAGCAGAAT3601    CTCTTTTAAA TAATGAAAAA TGGACATCTA TTTTATTGGA CAGGTTAAAA ACAGCCAAGA3661    AACTTCTAAG CAGACGAGGT GCACTGAAAA GCGCCGAAAG AGTAGAAGTA CTTCATCGGT3721    TGAATAAACT CAAGGAGGCT CCTCTTCCCC ACCATCCGAG CCTATTTGAT AATTTTAGTG3781    GAGGAAAAAC ATCAGCAGTA TCTGCTGGAA CAGTCATCGC ATCAGATATG CATTTCAAAT3841    TGGTTGAACA TATTTTTAAG GTCTCCTTTA GAAAATGGGG TCCCTGTGGA GATAAAACTG3901    AAAGCGGGGA AGAAGAAGAT GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA AAAGAAACAT TCCATATCAA3961    GATTCGTGCT TCAATTTAT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5.根据权利要求1所述的对虾白斑杆状病毒基因组DNA全部序列,其特征在于WSBV cDNA序列:编号:      C001            长度:1642bp碱基对组成:    592 A   281 C   353 G    416 T1    CTTTAAACAA TTAAAAGTAA AAAATGGTAT TTGTTTGTCT GGGGAAAATA CCGAAAATTA61   TGAACGGGTA CTATTAACAT TCAAATCAGT CAAGAGTGTC AGGAGAAGTG AGCTAAAGGA121  AGGACATTTT ATAGTTCGTC TTAGAGACAA GGAAGTACTC CACATCAAGA ACGGTAACGA181  AAGATTGAGA CAATTAACAG GAGATCCTAC GCTTCAGATT GGACTAAAAT ACACATCCAG241  TCTCCCAAAA CAAGGTAGTT TCTTAGAAGA TGAAGACCCT AATTATGGAA AAAAATGGAA301  CGAATCACTA CCAAGCCCAT TCCAGGAAAT GAACAAAATT GTGGAAGAAA AGGCTCTAGT361  TAATGACAAG AACTTTAAAT TTTCACCCCT ATACAGAATC ATACATGAAC GTCTTTCAAA421  TGCGGCCGTT AAGAAATGTG ATTATATGAT AATCACAACA GACTTCTTAG TAGGGTGTGG481  GTTTTCTCCT AGAAATTGTA CCCGTACTCT TAAGAATATG GAACAAGTGT TAGTGCAACA541  CGGTGGTACC TCTTCTCGTG TATCAGTGTA TGATATCTGT GATAGGTTAA CGTACAATGG601  CTTAAGTATC GCAAACCCCA TAGTTGGCAG TTTTTCAAAT ATGTGCCTAA TTGTACCAAT661  GGATAAACTT GGATTACTTT TCTACAACAG CACACACCCG TCAGCTAAAA GCATTGGAAA721  TTACATGTCA TGCCTTTTCA ATGCTGCAGT TGTATACACG CTAGAAAAGA GTAATCAAAA781  ATTAGATAAT TTCGAAAAGG AAATCAGATT TGCAAAAAAT GAAGTCAACC TTCTAGTTAG841  CGAAAGAAGT GTTCTGGAAG AAAAACTTAA AGAATCCAAA AAGCTATATG CTGCCTCAGA901  AGAACAAAGG ATTTCTCTTC GAGATGTGCA TAAAAAGTCC TCAATTGCAT CATCCAGATA961  TGACGGCGGT GCCTGTCTGG TCTTTGCCTT TTCTGACCGA GATTTCTCCT TGTTGTGCAG1021 AACCAATGGA AATGGTTCCT TTTACTCTGC CACAGAAGAA GGAATCAGAT ACGTCTCTTC1081 GGACGACTAC AGAAAGAGGG ACGTGGATGA ACGTAGGCCC AGATTGGTCA TGTCCATAAC1141 TGGCTCAGAT GCACCTATAT GCATCAGAGA TAGTATACGA AACCATTTTA ATAACCATTT1201 CATTGCATCC GGAAAGGGTA ATGAAATATC ATTCATCGAT CCTCCGAATG AAAGGTTGTT1261 GATGGAGATG GTCAGAGAGG TTACTGGATC AGACATCAAA ATCTTCATGG ATAATGGAAA1321 AGTATATCAA GATGGTGTAG AAATAAAAGT GATTGACCCC TCTTCTAAAG AAGGCAAGGA1381 CATAATAAAA AAGGAAGAAA CATTACCAGA GGAGGAAAGG AAGCGTCTGC GCCGAGAGCG1441 TCGCATGATT TTCAACACAG TTAAGGCAAT TGAGACGTAC AACGAGGAAC GTGGGGAAGA1501 AGAAGAAGTA GCCACAAGCA GTGGAGGAAC AAAGAGAAAG AGGGAGGAGA AAGAAGGCGA1561 TTATGTTGCC CTTTTGAACA AGGCATGCAA AGAAATTAAA GTTTGTTGAA TATAATGGAC1621 AATAAAACAA GTTATAACAT TT编号:    C002                          长度:750bp碱基对组成:    226 A   186 C   165 G   173 T1    GCAAAAACTA AGTTGGGAGA AAATGGACGT TTCTTCCTAT AAGAGCACTA TTGACTACCA61   CAACATTGAA GATATGGACG ATCTCCAGCG CGCCACCTAC AAGGATCGTA TGGAGACGGA121  ATTGGTCCTC GAGATGGCTA AGAAGGAGGG AAGGTACGTC CGATCGTTGG CCACCATGGA181  CGAATTGGAG GTACCTGAAG AACCAGCCAC TTGCTACACT TGCGGCTACA CCTTTATTAG241  ACGCAGGGCA CCCCCACCAA AACGCAAGTC AATATTCAGA GAGCCTTGCG CTTACCCAGA301  ACTTCTCCCC GATGCACCAT CCCCCGTCCG TTTAGAAGAG CTTGTCGACG TGCCAGAAGG361  AGCGAGTTTT TTCACCTACC CTCCCTACGA CGACGGATCT TCTACATCGT CTTCACAAGC421  CGAATGTGAA GATGATTATC CTCCACCATA CGACCCATCA GAAAATCCAC AGAGGTCCCA481  AGTGTGTGAT TATTGTACCA CACGTCAAGT CCTCAGTTCT ATGACGGATC ACGCCAGGGC541  CAACCTCATA AAAAATCTGA AGAGGGAGAA GAAGGCCCTG GGTCTTGGCC GTCGCAACAA601  CTTTAGCTAC TAGGGTTGTA CAAGAAGAAA ATAGGATTGA TTGTATCGAT GACGAACTTT661  GCATGTTTTT GACCATTCTT TTGCTTGCTG AGTGTACATA GCTTTATATT TGCCAATAAA721  ACAGACCCCG AATGTAAAAA AAAAAAAAAA编号:    C003                长度:431bp碱基对组成:    146 A    68 C    99 G    118 T1   CTGAAGAATA TTGAAAGAAG ACTTCTTGAA GAGGACCGAT AAAAAAATGG CCACCTTCCA61  GACTGACGCC GATTTCTTGC TGGTGGGGGA TGATACTAGT AGATATGAAG AAGTGATGAA121 GACTTTTGAT ACTGTTGAGG CAGTCAGGAA GAGTGATCTA GATGACCGTG TTTACATGGT181 GTGCCTAAAG CAGGGATCTA CTTTTGTCCT CAATGGAGGC ATCGAAGAAT TGCGTCTTTT241 GACTGGAGAT TCAACGCTGG AGATTCAACC CATGATTGTG CCAACAACAG AATAAAATAA301 AGACGGTGAC GGGAGACTAA TATCTTTCTT AGTTTCCCGT CACGGTGAAA ATGTTGGTTA361 TTTCTTCCCT ATGTTTAAAA ATTTGTCTTG GTTAAAAAAA TAAAACGAAA ACTGTCAAAA421 AAAAAAAAAA A编号:    C004                   长度:624bp碱基对组成:    177 A    111 C    157 G    179 T1   GGCACAACAA CAGACCCTAC CCGCCCCAAT ATCATATTCT TTGAAAGTCT ACTCCCCAAC61  TCTGGTATTG AGGTGATGAA GAGGCGTCTC GTACGGCAAG GAAAGTGTGG GAATTTTGAA121 GCAAGTGGAG GTGCTATGTC GTATTTCTGG CTCGAAGATA ATGCAGAAGA TATGGAGAAT181 CTCAACAGTG GTTCCCATGT CAAGACAAAC TGCTTGGCAT TATTCCTTCA AGAGTTTATC241 AGCAACTGGA TTGAAGAGAC TGATCGACAT GGACAGTACT GTACTTTTCC CCAATACATG301 GACGGTGGGG ATGGTTCACG TGGGGGATAT TTTACTTCGC TAGCCATGAA ATGGATGGCT361 AGGGATGTGA CTTTCTTTGT GTTTGTTGAT AGGAATAATA CTGTAGAAAA TGCGGCATCC421 ATATGGATGT ACCAAAAACT ACTAGCAATT GGTGCAAAGG TAGTAAAGGT GATTGTTGAC481 AATGCATCAA ACCCAATGTT TTCTGTATGT AATGCGTGTA GGTGCAAGTA CCCAGGCCCA541 GTGTCATACG TTATTGAAGG CCATGGAGTG GGTCATTCTG ATTTGACATG TGATGAGATT601 TCTGGATTCT TTGTATAATA AAAC编号:    C005                   长度:221bp碱基对组成:    88 A    35 C    35 G    63 T1   GAAGTTTTAA GGGTATCTCA ACTCAGATGG AGCCGCTTGT TCAATGAACA ATACAACACT61  AGAATGTCCC TCAGCACCAA AAGATTGAGC CTCATGAAGA TCTTCAACCA TGATTTGGGT121 GTGTCTAAAT TTGGTGTATA CAAACTCCTA GATATTATTG AAATGTACTG TTTTACTTTA181 ATCTAAACAA TAAAAATAAT GTAAAGAAAA AAAAAAAAAA A编号:    C006                   长度:300bp碱基对组成:    141 A    30 C    79 G    50 T1   AAGAAGACAC TGCCAAAGGA ACCTGCCGTT AAGAAGGTGA AGCAGGAAGA AGATGTGGAG61  ATGGAGGAAG TGAAGGAAGC AGCAGCAGAA GAAGAAAAGA AAGAGGAACA GGAGGCGAAG121 GAGGAAGACG CTACTGAGTA TGACGACGAT ACAGAAGAGG ACGAGAAAGC AGTAGCATCT181 GATG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