MX2010013681A - Inhibidor de infeccion. - Google Patents
Inhibidor de infeccion.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca y una molécula de ácido nucleico de virus de Síndrome de Mancha Blanca que codifica la proteína. La misma también se refiere a composiciones que comprenden la proteína, su uso en una vacuna, vacunas que comprenden la proteína y pruebas de diagnóstico para la detección del virus de Síndrome de Mancha Blanca de ADN específico o material antigénico. Finalmente se refiere a anticuerpos en contra de la proteína.
Description
INHIBIDOR DE INFECCIÓN
Descripción de la Invención
La presente invención se refiere a la proteína del virus de Síndrome de Mancha Blanca y una molécula de ácido nucleico del virus de Síndrome de Mancha Blanca que codifica dicha proteína. Asimismo se refiere a composiciones que comprenden la proteína, su uso en una vacuna, vacunas que comprenden la proteína y pruebas diagnosticas para la detección del ADN específico del virus de Síndrome de Mancha Blanca o material antigénico. Finalmente la misma se refiere a anticuerpo en contra de esta proteína.
El virus del síndrome de mancha blanca (WSSV, por sus siglas en ingles) es un patógeno de mayor importancia económica en el camarón peneido. El virus no es únicamente presente un camarón pero también ocurre en crustáceos de agua fresca y marina incluyendo cangrejos y cangrejos de río. En camarón cultivado la infección con WSSV puede alcanzar la mortalidad cumulativa de hasta 100% dentro de los 3-10 días y puede causar grandes pérdidas económicas a la industria de * cultivo de camarón. El virus fue, por ejemple, encontrado en China en los principios de los noventas, de donde se esparció rápidamente a otras áreas de cultivo de camarón en Asia del Sur. WSSV inicialmente parecía ser limitado a Asia hasta que se encontró en Texas y Carolina de Sur en Noviembre del 1995. En el principio
del 1999 WSSV fue también reportado desde América Central a América del Sur y ahora ha sido detectado en Europa. La cultivación intensiva de camarón, la sanidad inadecuada y el comercio internacional ha incrementado la intensidad de enfermedad en crustáceos y diseminación de enfermedad aumentada. WSSV se ha convertido en una enfermedad epizoótica y no es la única amenaza mayor para el cultivo de camarón pero también para la ecología marina. La enfermedad es O.I.E. obligatoria .
WSSV es un virus de ADN largo. Los viriones de WSSV circulan de manera ubicua en la hemolinfa del camarón infectado. Los estudios de microscopio de electrón revelaron que los viriones de WSSV son partículas empacadas con una forma de bacilo a forma ovoide de aproximadamente 275 nm en longitud y 120 nm en ancho. La mejor característica es el apéndice en forma de cola en un extremo del virion, en suspensión.
La partícula del virus contiene al menos 6 proteínas de viriones mayores de las cuales tres (VP664, VP26, VP24 y VP15) son presentes en el nucleocápsido en forma de barra y dos (VP28 y VP19) reside en el empaque y aproximadamente 40 proteínas menores.
La secuencia completa del genoma de WSSV ha sido determinada (Van Hulten y col., Virology 286; 7.22 (2001), Yang y col., J. Virol. 75; 11811-11820 (2001), Chen y col., Virology 293; 44-53 (2002). El ADN tiene una medida de aproximadamente 300
kbp. El mismo contiene aproximadamente 180 cuadros de lectura abierta. La mayoría de las proteínas que codifican los genes que no se parecen a ninguna de las proteínas conocidas o motivos (Van Hulten y col., Virology 286; 7-22 (2001), Yang y col., J. Virol. 74; 11811-11820 (2001)).
A la fecha, la única posibilidad de proteger los camarones específicamente en contra de la infección con WSSV es la vacunación. Las vacunas más experimentales son basados en la proteína de empaque de WSSV VP28 (Wittevldt y col., en Fish Shellfish Immunol. 16: 571-579 (2004), Witteveldt y col., en J. Virol. 78:2057-2061 (2004)).
Una desventaja de vacunas en general es que la vacunación es una acción profiláctica para proteger en contra de una infección que puede o no suceder. Por consiguiente, si la presión de infección es baja, un método terapéutico para resolver el problema de la infección es más conveniente, disponible sobre demanda y más barato. Para propósitos terapéuticos, una vacuna no es una opción apropiada, a causa de que toma tiempo para construir una respuesta profiláctica.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar maneras mejoras o alternativas para la protección de camarones en contra de la infección con WSSV, más específicamente en contra de la infección oral.
Sorprendentemente, un nuevo gen fue encontrado en WSSV, que codifica una proteína novedosa que fue mostrada para jugar
un papel clave en el adjunto primario del virus de células epiteliales de camarón (o más generalmente; de crustáceo). El gen se convirtió para codificar el factor inicial principal en el proceso de infección oral. Esto será posteriormente explicado a continuación. Una secuencia de nucleotido del gen es presentada en la SEC ID NO. 1.
Es claro que, si únicamente debido a tambaleo en la segunda y tercera base de muchos codones, hay algunas variaciones en la secuencia de nucleotido entre los virus individuales. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 90% de identidad de secuencia de nucleotido con la secuencia de nucleotido presentada en SEC ID NO.; 1 también son consideradas para representar el nuevo gen de acuerdo con la invención.
El "% de identidad de secuencia de nucleotido" de una secuencia de nucleotido de molécula de ácido nucleico con la de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser determinada por la alineación de secuencia de nucleotido al total, o una parte relevante de la secuencia de nucleotido de SEC ID NO: 1. El porcentaje de identidad entre una molécula de ácido nucleico y una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleotido de SEC ID NO:1 puede ser determinado con el programa de computador "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionando el sub-programa : "BlastN" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS icrobiol. Letters, Vol. 1.
174, p. 247-250), que puede ser encontrado en la dirección de internet www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bs2seq/bl2.html. Los parámetros que se deben utilizar son los parámetros predeterminados: premio por un empalme: +1; penalidad por un desacoplamiento: -2, penalidad para un intervalo abierto: 5; penalidad de intervalo de extensión: 2 e intervalo x_dism¡nución: 50. - '- El programa BlastN no enlista similitudes, únicamente identidades: el porcentaje de nucleótidos que son idénticos como se indica por "identidades".
Después de usar algoritmos de computadora para determinar el nivel de identidad/desacoplamiento entre un ácido nucleico y un ácido nucleico de acuerdo con la invención, técnicas experimentales también pueden utilizarse. Especialmente apropiada es la hibridación bajo condiciones de estrechez controlada.
La definición de condiciones de hibridación rigurosas, como una función de la identidad entre dos secuencias de nucleótido, sigue de la fórmula para la temperatura de derretido TM de Meinkith y Wahl (1984, Anal. Biochem.,-vol. 138, p. 267-284):
Tm = [81.5°C + 16.6(log M) + 0.41 (%GC)-0.61 (%formamida)-500/LJ-1 °C/1%-desacopla miento
En esta fórmula: M es la molaridad de los cationes monovalentes; % GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares base;
y "desacoplamiento" es la falta de un acoplamiento idéntico.
Las condiciones de lavado posteriores a la hibridación pueden también hacerse más o menos rigurosas, de esta manera seleccionado porcentajes más altos o más bajos de identidad respectivamente.
En general, la estrechez más alta es obtenida reduciendo la concentración de sal, e incrementando la temperatura de incubación. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica seleccionar las condiciones de hibridación que se acoplan a un cierto nivel de porcentaje de identidad como se determina por el análisis de computadora.
Para el propósito de esta patente, "las condiciones rigurosas" son aquellas condiciones bajo las cuales una molécula de ácido nucleico hibridiza si tiene un desacoplamiento de 10% o menos: es decir si es al menos 90% idéntico a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEC ID NO:1.
Por consiguiente, si una molécula de ácido nucleico hibridiza bajo condiciones astringentes a la secuencia de nucleótido descrita en la SEC ID NO:1, es considerada como molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, una primera modalidad de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico del virus de Síndrome de Mancha Blanca (WSSV) que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con SEC ID NO:1 o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar bajo condiciones astringentes a la
molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con SEC ID NO:1.
Puesto que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención es específica para el virus del Síndrome de la Mancha Blanca, una prueba de diagnóstico con base en la molécula de ácido nucleico es muy apropiada para diagnosticar la presencia o ausencia de WSSV en agua, más específicamente en el agua de piscinas de granja de camarones. Una tal prueba puede ser una prueba de hibridación como se ha descrito anteriormente. La misma puede ser una prueba PCR estándar.
Por consiguiente, otra modalidad de la presente invención se refiere a unas pruebas de diagnóstico para la detección del ADN específico del virus de Síndrome de Mancha Blanca, caracterizado porque dicha prueba comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o cebadores PCR basados en la molécula de ácido nucleico. Los manuales de texto de PCR estándar proporcionan métodos para determinar la longitud de los cebadores para las reacciones PCR selectivas con ADN de WSSV de acuerdo con la invención. Los fragmentos de cebador con una secuencia de nucleótido de al menos 12 nucleótidos son frecuentemente utilizados, pero cebadores de más de 15, más preferiblemente de 18 nucleótidos son de alguna manera más selectivos. Especialmente cebadores con una longitud de al menos 20, preferiblemente al menos 30 nucleótidos son muy generalmente aplicados. Las técnicas PCR son
extensivamente descritas en Dieffenbach & Dreksler; cebadores PCR, un manual de laboratorio. ISBN 0-8799-447-5 (1995). Precisamente como un ejemplo, estos cebadores pueden, por ejemplo, comprender los primeros 20 y los últimos 20 nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidó de acuerdo con SEC ID. NO:1.
La proteína codificada por la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidó de acuerdo con la SEC ID NO:1 tiene una secuencia de aminoácido como se demuestra en SEC ID NO:2.
La proteína codificada por el gen tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kD. Análisis posterior de la proteína mostró que sorprendentemente cumple su papel en WSSV que es análogo al papel de la proteína P74 en los baculovirus, aunque la proteína P74 es mucho más pequeña; aproximadamente 74 kD. El hecho de que estas proteínas difieren mucho es indudablemente debido al hecho que el baculovirus y WSSV pertenece a familias de virus totalmente diferentes y tienen un rango hospedero totalmente diferente.
La proteína novedosa de acuerdo con la invención sería, por razones enlistados a continuación, serán referidas como a WSSP PAP, o brevemente PAP (Proteína de Adjunto Primario).
La gran diferencia en MW para WSSV PAP por un lado, y la proteína de baculovirus análoga P74 por otro lado sigue claramente de la tabla 1.
La distancia evolucionista de WSSV PAP de acuerdo con la invención y baculovirus P74 claramente muestra de la Figura 1. WSSV PAP y baculovirus P74 no tiene ninguna secuencia significante.
Tabla 1: comparación del número de aminoácidos en báculo P74 y WSSV PAP, PAP fue encontrado ser WSSV análogo de la proteína P74 de baculovirus.
Hay algunas maneras en la cual la proteína de la presente invención puede ser utilizada para mitigar o prevenir la infección de WSSV en camarón.
Un alcance es para utilizar la proteína o un fragmento del mismo capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas como un inhibidor de infección. La proteína aislada es muy apropiada como un inhibidor de infección cuando es administrada a camarones, debido al hecho de que su papel natural es dirigir el virus al receptor de virus de las células hospederas. Lo principal es fácil: agregando PAP de proteína aislada de acuerdo co la invención, por ejemplo, el alimento del agua, los receptores de virus celular de los camarones serán ocupadas por la proteína PAP aislada, y de esta manera bloqueando los receptores de virus de célula hospedera. Como una consecuencia las partículas de virus no pueden mas adjuntarse a las células hospederas; los sitios receptores son
bloqueados por PAP.
La proteína PAP de acuerdo con la invención puede exitosamente ser utilizada en tratamientos terapéuticos. Especialmente en regiones en donde la presión de infección es relativamente baja, los granjeros pueden deliberadamente tomar el riesgo y únicamente empezar el tratamiento en cuanto se '-manifiesten los primeros signos clínicos. El tratamiento inmediato sea con proteína aislada de longitud completa o un fragmento del mismo capaz de inhibir el adjunto del virus WSSV a las células hospederas previene la infección posterior, Esto tiene la ventaja de salvar costos; los costos se harán después de que actualmente ocurra la infección.
Como se ha mencionado anteriormente, la proteína de acuerdo con la invención es adjunta a un empaque viral. En la situación en vivo, solamente una parte de la proteína que protruye de la superficie de virus juega un papel en el adjunto. Por lo consiguiente, para el propósito de bloquear el receptor de virus celular, un pequeño fragmento de proteína viral, puesto que - comprende la parte de la proteína que es capaz de adjuntarse al receptor de virus celular de camarón debería de ser suficiente.
Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a una proteína o fragmento de virus de Síndrome de Mancha Blanca de la proteína capaz de inhibir la unión entre WSSV y las células hospederas crustáceas, en donde la proteína o fragmento de la misma es codificada por una molécula de ácido
nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con SEC ID NO.:1 o por una molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar bajo condiciones astringentes al ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEC ID N O . : 1.
En una forma preferida de la modalidad, la proteína del virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la invención es una proteína que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con SEC ID NO.:1 o un fragmento de la ducha proteína capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas.
Como se ha dicho anteriormente, en principio la proteína completa aislada puede utilizarse para inhibición. Sin embargo un fragmento de la proteína que es capaz de inhibir la unión entre WSSV y las células hospederas también puede utilizarse. Esto tuvo la ventaja que a menudo se puede producir de alguna manera fácil, debido a la regla general que las proteínas más cortas pueden hacerse en sistemas de expresión en cantidades más grandes. Además, los péptidos realmente cortos de <50 aminoácidos pueden eficientemente y muy barato para hacerla sintéticamente.
Otra ventaja para expresar un fragmento apropiado en vez de la proteína PAP entera es que el fragmento puede ser seleccionado que tiene regiones hidrofílicas o distribución de membrana. Esto evite que el fragmento de proteína se pegue a la
membrana de la célula después de la expresión. Los programas de computadora que predicen la hidrofilicidad son extensivamente conocidos en la técnica.
Preferiblemente, una proteína completa de acuerdo es utilizada. Sin embargo, si se prefiere utilizar un fragmento de la proteína que es capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas, su selección puede hacer muy fácilmente haciendo un fragmento y revisando un ensayo de bloque si inhibe la unión del virus a células epiteliales.
Un tal ensayo, en su forma básica, comprende las etapas de:
a) preparar un explante de tejido epiteliales, por ejemplo de estomago o branquias,
b) incubar el explahte de tejido epitelial sea con proteína de completa longitud de acuerdo con la invención (control) o el fragmento para ser probado
c) incubación del explante de tejido epitelial con WSSV, seguido por la eliminación de WSSV en exceso
d) incubación de "explante de tejido epitelial con anti-WSSV conjugado o anticuerpos anti-VP28 seguido por una reacción de coloración.
Si el fragmento de proteína para ser ensayado no es capaz de inhibir, WSSV se unirá a las células y una reacción de color enzimática con anti-WSSV conjugado o antisuero anti-VP28 revelará la presencia del virus en la superficie de célula.
Una falta de reacción de color indica una actividad inhibidora exitosa por el fragmento para ser ensayado.
Asimismo, como se ha mencionado, es claro que la proteína PAP de acuerdo con la invención puede exitosamente utilizarse en tratamientos terapéuticos. Especialmente en regiones en donde la presión de infección es relativamente baja, los granjeros pueden libremente tomar el riesgo y únicamente empezar el tratamiento en cuando se manifiestan los primeros signos clínicos. De esta manera salvarían costos significantes; los costos se harán después de que haya ocurrido la infección.
La manera de administrar la proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención puede ser muy directa: la proteína o fragmento de la misma puede ser administrada en composición farmacéutica que comprende la proteína o fragmento de la misma y un portador farmacéuticamente aceptable. Un tal portador puede ser el agua o una solución salina tal como PBS.
Para la administración oral el inhibidor es preferiblemente mezclado con un portador apropiado para administración oral. En este-caso, el portador es preferiblemente un vehículo al cual se adhiere"la proteína, preferiblemente sin ser covalentemente unido a la misma. Estos vehículos son, bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas y macrosoles, celulosa, alimento o sustancia metabolizable tal como celulosa alfa o diferentes aceites o emulsiones de origen vegetal o animal. Todos son conocidos en la técnica.
Un alcance atractivo es la administración de la proteína en altas concentraciones de organismos de alimento vivo, seguido por la alimentación de organismos de alimento vivo tales como artemia al animal objetivo, por ejemplo los camarones. Los portadores de alimento particularmente preferidos Dará suministro oral de la vacuna de acuerdo con la invención son organismos de alimento vivo que son capaces de encapsular la proteína. Otra posibilidad es de expresar la proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención en . levadura de alga, seguido por revestimiento de células de levadura o alga en el alimento.
Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de la proteína de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Un alcance alternativo es también probable, en vez de bloquear el receptor PAP de célula hospedera, se puede preferir bloquear la proteína PAP viral misma. Esto requiere anticuerpos capaces de unir PAP de proteína de Síndrome de Moncha Blanca y al menos capaces de unirse a un fragmento de ía proteína involucrada en la inhibición de la unión entre WSSV y las células hospederas crustáceas. La proteína de acuerdo con la invención o fragmentos de la misma proteína capaz de inhibir la unión entre WSSV y las células hospederas crustáceas pueden utilizarse para producir anticuerpos que pueden ser policlonales,
monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los mismos). Si los anticuerpos policlonales son deseados, las técnicas para producir y procesar suero policlonal son bien conocidas en la técnica (por ejemplo Mayer y Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academia Press, London, 1987).
Los anticuerpos monoclonales, reactivos en contra del polipéptido de acuerdo con la invención (o variantes o fragmentos de los mismos) de acuerdo con la invención, pueden ser preparados inmunizando ratones endogámicos por técnicas también conocidas en la técnica (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
Los métodos para la producción, a gran escala de anticuerpos de acuerdo con la invención son también conocidos en la técnica. Estos métodos se basan en la clonación de (fragmentos) la información genética que codifica la proteína de acuerdo con la invención en un fago filamentoso para muestra dé fago. Estas técnicas son descritas en "Antibody Engineering Page" bajo "muestra de fago fiL-imentoso" en http://aximt1.imt.uni-marburq de/~rek/aepphaqe. htl y en los documentos de revisión por Córtese, R; y col., (1994) en Trends Biotechn.12: 262-267., por Clackson, T. & Wells, J.A. (1994) en Trends Biotechn.12: 173-183, por Marks, J.D. y col. (1992) en J. Biol. Chem. 267:16007-16010, por Winter, G. y col. (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, N. y col (1994) Biotechn. Adv.12. 539-555.
Los fagos son posteriormente utilizados para monitorear librerías de expresión de camélidos que expresa anticuerpos de cadena pesada de camélido. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn.12:131-140 (1999) y Ghahroudi, M.A. y col., FEBS Letters 414:512-526 (1997)). Las células de la librería que expresan los anticuerpos deseados pueden ser replicadas y posteriormente utilizadas para expresión a gran escala de anticuerpos.
Una alternativa muy simple y eficiente para producir anticuerpo es la producción de anticuerpos aviares (yema de huevo): IgY. Estos métodos han sido descritos por Schade, R y col., en ATLA 24; 925-934 (1996). La aplicación de los anticuerpos producidos de esta manera es simple; la yema de huevo es, por ejemplo mezclada con el alimento y alimentada a los camarones.
Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a anticuerpos capaces de unirse a una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención, en donde estos anticuerpos son al menos capaces de unirse a un fragmento de la proteína involucrada en la inhibición de la unión entre WSSV y células hospederas de crustáceo.
Con relación a los anticuerpos capaces de unirse a una PAP de proteína de virus del Síndrome de Mancha Blanca; como se discutirá a continuación, estos anticuerpos son también
apropiados para pruebas de diagnóstico. En esas pruebas, no hay ningún requerimiento para los anticuerpos para ser al menos capaces de unirse a un fragmento de la proteína capaz involucrada en la unión entre WSSV y células hospederas de crustáceo. Para estos propósitos de diagnóstico, es suficiente que los anticuerpos sean capaces de unirse al PAP de proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca. - ^
Por consiguiente, otra modalidad de la presente invención se refiere a anticuerpos capaces de unirse al PAP de proteína de virus del Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento del mismo.
En regiones en donde la presión de infección es relativamente alta, sería deseable tomar medidas de profiláctica, más que terapéuticas. Esto se puede hacer vacunando camarones con la proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención.
Básicamente, hay dos alcances para vacunación; la vacunación oral y la vacunación a través de inyección. Ambas vías de vacunación han sido descritas para otra proteína WSSV.VP28. Por lo tanto, la vacunación se puede harcer, por ejemplo análoga a la vacunación con la proteína de empaque WSSV VP28 como se describe por Van Hulten y col., en Virol. 78:2057-2061 (2005) y Witteveldt y col., en Archives of Virology 150; 1121-1133 (2005).
Ambas, la vacunación oral y la vacunación a través de la inyección requieren la producción de la proteína de acuerdo con
la invención PAP.
Para la expresión de PAP o fragmentos de la misma, un constructo de expresión de PAP fusionado a (HIS)6-tag utilizando el vector pET28a (Novagen) puede utilizarse. Un vector pET28a vacio puede ser utilizado como un control. Ambos (HIS)6-PAP y el vector de control pET28a pueden ser sobre expresados de acuerdo con las instrucciones del ^ fabricante. Una cepa de expresión apropiada es E. coli BL21. Cuando la expresión ha alcanzado el nivel deseado, la desactivación de la bacteria se puede hacer en formalina por 15 minutos a 20 grados Celsius.
Para la aplicación de la vacunación oral, las gránulos de alimento comercial de aproximadamente 0.02 gramos (Coppens International, Países Bajos) pueden ser revestidas con aproximadamente 108 de la bacteria desactivada. A esta medida, la bacteria fue lavada dos veces en PBS, re suspendida en PBS, mezclada con cápsulas de alimento, incubada en hielo por 15 minutos para permitir la absorción de la suspensión bacteriana y revestida con aceite de hígado de bacalao para prevenir la dispersión de la bacteria desactivada en agua. Cada camarón puede ser alimentado con 8 gránulos divididos en dos raciones por día. Este alcance es atractivo puesto que la expresión en la bacteria es escasa.
Otra manera atractiva de expresar la proteína PAP es, utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Este sistema de expresión tiene la ventaja porque se obtiene altas cantidades
de proteína que es más de naturaleza de invertebrados.
El revestimiento de las partículas se puede hacer de la misma manera, ahora utilizando las preparaciones de célula crudas. La cantidad proteína PAP puede fácilmente ser determinada en gel y cantidades obtenidas pueden ser iguales a las cantidades obtenidas en un sistema de expresión bacteriana.
La vacunación a través de inyección, análoga al alcance seguido para VP28, es preferiblemente hecha con cantidades que oscilan entre 1 y 10 pg de proteína PAP en 330 mM de NaCI en un volumen final de 10 µ?. Una inyección de refuerzo con una cantidad comparable de proteína después de 5 días aumenta el nivel de protección.
Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a una vacuna para combinar la infección de virus de síndrome de Mancha Blanca en donde la vacuna comprende una proteína de virus de Mancha Blanca o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable para la vacunación oral ha sido anteriormente descrito. Un portador farmacéuticamente- aceptable para inyección es por ejemplo una solución salina fisiológica o una solución salina.
La proteína de WSSV VP28, mencionada anteriormente, es conocida para proporcionar algún nivel de protección, pero este nivel de protección disminuye después de un tiempo. Por consiguiente, una vacuna que comprende tanto PAP de WSSV y
VP"8 de WSSV se beneficia de la presencia de un antígeno adicional.
Por lo tanto, una forma preferida de la modalidad de refiere a una vacuna de combinación para combatir una infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la invención, caracterizada porque adicíonalmente comprende el proteína VP28 del virus de Síndrome de Mancha Blanca. - Como se ha establecido anteriormente, la presente invención describe por la primera vez la proteína PAP de WSSV novedosa. Las proteínas de WSSV conocidas: VP187 y VP110, descritas anteriormente por Hongyan Li y col., respectivamente (Virus Res. 115; 76-84 (2006)), Deng-Feng Li y col., (Virology 368; 122-132 (2007)) y por Li Li y col., (Journ. Gen. Virol. 87; 1909-1915 (2006)) son también conocidos para jugar un rol, o uno diferente, en el adjunto de virus.
Por lo tanto es muy atractivo proporcionar una vacuna de combinación que comprende tanto PAP y VP187, o PAP y VP110, o aún PAP, VP110 y VP187.
Una tal vacuna interfiere aún a un nivel, más alto con -el adjunto de WSSV a células hospederas, puesto que eleva una respuesta inmune en contra de dos o tres proteínas adjuntas virales. Por lo tanto, otra forma preferida de esta modalidad se refiere a una vacuna de combinación para combatir la infección del virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la invención, caracterizado porque adicíonalmente comprende la
proteína del virus de Síndrome de Mancha Blanca VP 110.
Aún otra forma preferida de esta modalidad se refiere a una vacuna de combinación para combatir la infección del virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la invención, caracterizado porque adicionalmente comprende una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca.
A menudo, la vacuna es mezclada con estabilizadores, por ejemplo para proteger las proteínas sujetas a degradación de ser degradadas, para mejorar la caducidad de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de secado por congelación. Los estabilizadores útiles son SPGA (Bovarnik y col., J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos, por ejemplo sorbitol, manitol, trehalosa, sucrosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación del mismo, y soluciones salinas tales como fosfatos de metal alcalino. Además, la vacuna puede ser suspendida en un diluyente fisiológicamente aceptable. Se entiende que otras vías de coadyuvar, agregar compuestos vehículo o diluyentes, emulsificar o estabilizar una proteína también se incluyen en la presente invención.
Las vacunas de acuerdo con la invención que son basadas en la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma pueden muy apropiadamente administrarse en cantidades que oscilan entre 1 y 100 microgramos de proteína por animal, aunque dosis más pequeñas puede utilizarse al principio. Una dosis que excede 100
microgramos, sería, aunque inmunológicamente muy apropiada, menos atractiva para razones comerciales.
Otra modalidad se refiere a la proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención para la elaboración de una vacuna que comprende infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca.
La proteína de acuerdo con la invención es también muy apropiada como una herramienta en un alcance de vacuna marcador. Si es posible hacer mutantes de WSSV que porta una eliminación en el gen PAP y no comprende la proteína PAP de acuerdo con la invención. Esto se puede hacer utilizando métodos estándar tales como recombinación homologa en células crustáceas después de la co-transfección con un plásmido que carga una eliminación de PAP y un gen marcador. Estos mutantes han sido descritos para la proteína P74 del báculo virus por Gutiérrez y col., (J. Biotechnol. 116; 135-143 (2205)) con un antecedente dado por Faulkner y col., (J. Gen. Virol 78; 3091-'3100 (1997)) y Slack y col., (J. Gen. Virol. 82; 2279-2287 (2001)). Un tal muíante puede ser propagado, por ejemplo a través de inyección en cangrejos-de río y puede utilizarse como vacuna atenuada viva, puesto que produce la proteína inmunogénica VP28, pero no puede causar infección debido a la falta de PAP.
Sin embargo, es importante ser capaz de discriminar entre la presencia, en un ambiente de granja de camarón, de un tal WSSV atenuado o WSSV virulento tipo salvaje. Una prueba de
diagnóstico que, por ejemplo comprende pozos separados revestidos sea con anticuerpos en contra de VP28 o anticuerpos en contra de PAP pueden fácilmente hacer este trabajo. En una tal prueba, el virus de tipo salvaje se adjuntaría a los pozos que comprenden VP28 y a los pozos que comprenden anticuerpos de PAP, en donde el virus muíante sin PAP se adjuntaría solamente ax los pozos que comprenden VP28. Una reacción de color estándar con anticuerpos anti-WSSV conjugados podrían utilizarse para el monitoreo de la presencia/ausencia del virus en los pozos respectivos.
Por consiguiente, otra modalidad de la presente invención se refiere a unas pruebas de diagnóstico para la detección de material antigénico del virus de Síndrome de Mancha Blanca, en donde estas pruebas comprenden anticuerpos en contra de la proteína del virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la invención o en contra de un fragmento de la proteína PAP capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Clonado de proteína PAP
Para la expresión de PAS de WSSV o fragmentos de los mismos, una constructo de expresión de PAP fusionado con un (HIS)6-tag utilizando el vector pET28a (Novagen) es utilizado.
La proteina PAP completa puede ser clonada como
fragmento BamH1/Pst1 en el vector pET28a después de PCR del genoma WSSV utilizando la terminal 5'- y 3' de 20-meros con los sitios adicionales respectivos BamHi/Pst1.
La expresión de hace en cepa de expresión E.coli BL21. Un vector vacío pET28a puede utilizarse como un control. Ambos, vectores de control (HIS)6-PAP y pET28a son sobre expresados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 2
Expresión de proteína PAP
La His6-PAP y las proteínas de control son sobre expresadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizada por electroforesis de gel de sulfato-poliacrilamida dodecil de sodio (SDSPAGE, por sus siglas en inglés) y la Mancha Western con un antisuero policlonal de WSSV. La concentración bacteriana después de la desactivación es determinada con un espectrómetro de foto Beckman DU-7500, en donde una densidad óptica a 600 nm de 1 se iguala a 109 bacterias por mi. Las bacterias son desactivadas en 0.5% de formalina, incubadas por 15 minutos a 20°C, revisadas para los niveles de desactivación, y almacenadas a 4°C' hasta su uso posterior.
Leyenda a la figura:
Figura 1: un árbol indicando la distancia evolucionista entre las proteínas involucradas en virus a adjunto hospedero de virus de ADN largos.
AcMNPV = Virus de la poliedrosis nuclear Autographa califórnica; CpGV = Granulovirus Cydia pomonella; NeleNPV = virus de poliedrosis nuclear Neodiprion lecontii; CuniNPV = virus de la poliedrosis nuclear Culex nigripalpus; GbNV = nüdivirus Gryllus bimaculatus; HzNV = nüdivirus Heliothis zea; GpSGVH = virus de hipertrofia glandular salival Glossina pallipides; MdSGHV = virus de hipertrofia de glandular salival de Mosca domestica; WSSV = Virus de Síndrome de Mancha Blanca.
Claims (14)
1. Molécula de ácido nucleico de virus de Síndrome de Mancha Blanca (WSSV, por sus siglas en inglés) que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con SEC ID NO:1 o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar bajo condiciones astringentes a la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de acuerdo con la SEC ID NO:1.
2. La proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de la proteína capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas, caracterizado porque la proteína o el fragmento de la misma son codificados por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
3. La proteína del virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO:2 o un fragmento de la proteína capaz de inhibir la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas.
4'. La composición farmacéutica que comprende una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de la proteína de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, y un portador farmacéuticamente aceptable.
5. La proteína del virus de Síndrome de la Mancha Blanca o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, para uso en una vacuna.
6. Uso de una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para la elaboración de una vacuna para combatir la infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca.
7. Vacuna para combatir la infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca caracterizada porque la vacuna comprende una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. Vacuna de combinación para combatir la infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque adicionalmente comprende la proteína VP28 del virus de Síndrome de Mancha Blanca.
9. Vacuna de combinación para combatir la infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque adicionalmente comprende la proteína VP110 del virus de Síndrome de Mancha Blanca.
10. Vacuna de combinación para combatir infección de virus de Síndrome de Mancha Blanca de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque adicionalmente comprende la proteína VP187 del virus del Síndrome de Mancha Blanca.
11. La prueba de diagnostico para la detección del virus del Síndrome de Mancha Blanca de ADN específico caracterizada porque la prueba comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o con base en los cebadores PCR con base en la molécula de ácido nucleico.
12. Prueba de diagnóstico para la detección de material antigénico del virus de Síndrome de Mancha Blanca caracterizado porque la prueba comprende anticuerpos en contra de una proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 2 o 3.
13. Anticuerpos capaces "desunirse a una proteína de virus del Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de ducha proteína, caracterizado porque la proteína o fragmento del mismo es codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
14. Anticuerpos capaces de unir la proteína de virus de Síndrome de Mancha Blanca o un fragmento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, los anticuerpos siendo al menos capaces de unirse a un fragmento de la proteína involucrada en la inhibición de la unión entre WSSV y células hospederas crustáceas.
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