CN114085853A - Waxy突变体及其筛选方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物生物技术育种领域，尤其涉及Waxy突变体及其筛选方法和用途。Waxy突变体，编码所述Waxy突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。本发明采用辐射诱变加快了植物基因组变异率，在经诱变后的植物M2代的苗期运用高通量分子筛选技术从辐射诱变群体中检测Waxy等位基因的变异，克服了农艺性状表型鉴定易受育种家个体主观判断影响、肉眼难以识别、识别不准确、成本高、周期长等缺陷，并提高了对Waxy突变体筛选的效率和精准率。本发明筛选出一种突变体Waxy，含有突变体Waxy的植物相比野生型植物其直链淀粉降低了60％以上。

Description

Waxy突变体及其筛选方法和用途
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及Waxy突变体及其筛选方法和用途。
背景技术
农作物辐射诱变育种在确保世界粮食安全和增加营养供给方面具有重要的作用。根据联合国FAO/IAEA突变品种数据库最新统计，截至到2019年底，有60多个国家在214个植物种类上育成并通过商业注册的植物突变品种总数已达3299个，我国通过诱变育种技术直接或间接育成的新品种数1050个，占世界育成突变品种数接近三分之一，核辐射诱变育种技术作为一门传统生物育种技术已经产生巨大的社会和经济效应。在长期的自然环境条件下，生物体自身与外界环境相互作用，为了适应环境的改变，其体内的遗传物质会发生一定的自发突变，然而频率很低，约为10-5～10-8次。
植物种质资源缺乏成为制约植物育种的瓶颈，辐射诱变技术已成为创制植物种质资源的有效途径。近年来，高能重离子对生物体产生的总体生理损伤相对较小、对生物诱变作用强、诱发突变谱广、突变频率高；此外，与传统的X、γ射线辐射相比较，对生物体作用产生的DNA单链断裂少且不易修复，因此作为一种新兴诱变源具有独特的诱变优势，不断得到国内外科学家的关注。
水稻主要由碳水化合物组成，在胚乳中主要以淀粉(90％)的形式存在。淀粉广泛用于食品，造纸和化学工业。淀粉根据结构不同，可以分为直链淀粉和支链淀粉。在水稻中，Waxy(Wx)基因编码颗粒结合淀粉合成酶，该基因可以控制胚乳中的直链淀粉合成，Waxy位点内的自然等位基因变异是影响大米中的直链淀粉含量的主要原因。“直链淀粉”又称糖淀粉，是一种由葡萄糖组成的线性聚合物，各葡萄糖单体主要以α(1→4)糖苷键连接，每个直链淀粉分子通常含有数千个葡萄糖单体。直链淀粉含量是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10％～20％)、中(20％～25％)和高(＞25％)四类。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。
糯稻是酿酒、制醋、粽子的重要原料，市场需求量大，种植经济效益高，但目前市场缺乏主导的生产品种，很多现种植的糯稻品种多为农家品种，品种退化严重，品质不高。常规育种方法选育糯稻的方法，往往要费很长的时间周期和大量的数据检测以及稻米外观品质鉴定等，必须要等育种目标材料目标性状稳定以后才能进行鉴定和检测，因此存在选育时间长、目标性状选择效率低的问题。因此，本领域急需快速搜寻到一种新型的突变体Waxy，来降低直链淀粉含量，改善稻米的食用品质，同时使现有水稻品种得到整体改良。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供Waxy突变体及其筛选方法和用途，实现对诱变群体中Waxy等位基因变异的精准化识别与高通量筛选，实现重要Waxy基因变异的高通量筛选鉴定方法，突破了水稻基因编辑生物产品的产业化瓶颈问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明的目的之一在于提供Waxy突变体，编码所述Waxy突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。
本发明的目的之二在于提供与如所述的Waxy突变体相关的生物材料，包括如下任一种：
a)含有所述的Waxy突变体的核苷酸序列的重组表达载体；
b)含有所述的Waxy突变体的核苷酸序列的生物工程菌，或含有a)所述的重组表达载体的生物工程菌；
c)含有所述的Waxy突变体的核苷酸序列的转基因植物细胞，或含有a)所述的重组表达载体的转基因植物；
d)由上文所述的核苷酸编码的蛋白。
本发明的目的之三在于提供上述所述的Waxy突变体或所述的生物材料在植物种质资源改良中的用途。
根据本发明的技术方案，所述改良包括提高植物品质或提高植物产量的改良。优选地，所述改良包括降低植物中直链淀粉的含量。
本发明的目的之四在于提供一种筛选Waxy突变体的方法，包括如下步骤：
1)植物进行辐射诱变后，提取基因组DNA，根据所述的基因组DNA构建DNA文库；
2)根据野生型水稻Waxy基因设计探针；将所述探针与所述DNA文库杂交；
3)采用磁珠对杂交后的产物进行富集，构建富集文库；
4)对富集文库进行鉴定分析，筛选出与所述的野生型水稻Waxy基因的序列有差异的目标基因，得到所述的Waxy突变体。
根据本发明的技术方案，步骤1)中，所述辐射诱变包括γ射线诱变和重离子诱变。
在一个优选实施例中，所述γ射线诱变的诱变源选自60Co-γ射线。
在一个更优选实施例中，所述γ射线的剂量为200～500Gy。较佳的，所述γ射线的剂量为80～150Gy。具体地，所述γ射线的剂量为300Gy。
在一个更优选实施例中，所述γ射线的剂量率为2～16Gy/min。较佳的，所述γ射线的剂量率为8～12Gy/min。具体地，所述γ射线的剂量率为8Gy/min。
在一个优选实施例中，所述重离子诱变的诱变源选自12C+6重离子。
在一个更优选实施例中，所述重离子诱变的剂量为80～150Gy。较佳的，所述12C+6重离子的剂量为100～140Gy。所述12C+6重离子的剂量为120Gy。
在一个更优选实施例中，所述重离子诱变的剂量率为0.8～2.2Gy/min。较佳的，所述微重力诱变的剂量率为1.2～1.7Gy/Min。具体地，所述微重力诱变的剂量率为1.5Gy/min。
根据本发明的技术方案，步骤1)中的方法如下：
a)对植物的种子进行辐射诱变，种植，获得M1代种子；
b)将所述M1代种子进行种植，获得M2代种子；
c)将所述M2代种子进行种植，取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；
d)从混合后的叶片中提取得到所述的基因组DNA；
e)将所述的基因组DNA进行片段化处理，然后将片段化处理后的DNA片段加上A尾，连接测序接头，进行扩增，得到所述的DNA文库。
在一个优选实施例中，步骤b)中，将所述的M1代种子分单株种植后，按穗收法，收获每个单株的每一穗种子，以形成所述的M2代种子。
在一个优选实施例中，步骤c)中，将所述的M2代种子分单株进行种植，每100～1000植株为一个样本群，对每个样本群编号，取每个样本群内的植株的叶片混合以提取DNA。
在一个优选实施例中，步骤c)中，取各种植后单株上的叶片时，选取同一单株不同部位的叶片进行等量混合；不同单株之间等量混合。
根据本发明的技术方案，步骤2)中，所述探针包括多条根据野生型水稻Waxy基因设计的探针。
根据本发明的技术方案，步骤2)中，所述探针的序列包括如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.18所示序列。
根据本发明的技术方案，所述探针为生物素标记的探针。
根据本发明的技术方案，所述磁珠为链霉亲和素标记的磁珠。
根据本发明的技术方案，所述植物包括被子植物和裸子叶植物。
在一个优选实施例中，所述植物包括双子叶植物和单子叶植物。
在一个优选实施例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在一个优选实施例中，所述植物拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。更具体地，所述植物为水稻。
本发明的目的之五在于提供一种低直链淀粉含量的植物，包含所述的Waxy突变体或所述的生物材料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用γ射线诱变和重离子诱变加快了植物基因组变异率，在经诱变后的植物M2代的苗期运用高通量分子筛选技术从辐射诱变群体中检测Waxy等位基因的变异，克服了农艺性状表型鉴定易受育种家个体主观判断影响、肉眼难以识别、识别不准确、成本高、周期长等缺陷，并提高了对Waxy突变体筛选的效率和精准率。
本发明Waxy突变体，能显著降低水稻中的直链淀粉含量，提高水稻的品质，与野生型水稻相比，含有Waxy突变体的水稻中的直链淀粉含量降低了60％以上。
附图说明
图1显示为本发明的实施例2中野生型Waxy基因和Waxy突变体基因的部分序列比对示意图。
图2显示为本发明的实施例2中Waxy突变体基因在基因组上的位置示意图。
图3A显示为本发明的实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒的实拍图。
图3B显示为本发明的实施例2中含有野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒的实拍图。
图3C显示为本发明的实施例2中含有野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒的光透视实拍图。
图4显示为本发明的实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒经碘染色后的对比示意图。
图3A、3B、3C和4中附图说明如下：
W野生型水稻
M Waxy突变体水稻
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请下述实施例中，Serapure磁珠为Invitrogen公司的
Figure BDA0003375280840000051
M-270Streptavidin beads。
本申请下述实施例中，天根NG301试剂盒和NG303试剂盒，购买于天根生化科技有限公司。
本申请下述实施例中，
Figure BDA0003375280840000052
Hybridization and Wash Kit试剂盒，购买于Integrated DNA Technologies,Inc。
本申请下述实施例中，KAPA 文库扩增试剂盒，购买于上海捷易生物科技有限公司。
本申请下述实施例中，KAPAHiFi HotStart ReadyMix PCR Kit，购买于罗氏公司。
本申请下述实施例中，MiniSeq测序试剂盒购买于Illumina公司。
实施例1
本实施例中，依据育种目标农艺性状，在Gene bank数据库中查找到野生型水稻Waxy基因，使用Oligo6.0软件针对这个基因设计探针，其中，野生型水稻Waxy基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示序列。委托艾柏森生物科技有限公司合成标记有生物素的探针。
1、根据野生型水稻Waxy基因设计探针，探针包括Os06t0133000-1～Os06t0133000-16，探针的序列包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.18所示序列。
Os06t0133000-1
GCTTCACTTCTCTGCTTGTGTTGTTCTGTTGTTCATCAGGAAGAACATCTGCAAGTTATACATATATGTTTATAATTCTTTGTTTCCCCTCTTATTCAGATCGATCACATGCATCTTTCA(SEQ ID NO.3)
Os06t0133000-2
TTTTAGGCTCACCAAACCTTAAACAATTCAATTCAGTGCAGAGATCTTCCACAGCAACAGCTAGACAACCACCATGTCGGCTCTCACCACGTCCCAGCTCGCCACCTCGGCCACCGGCTT(SEQ ID NO.4)
Os06t0133000-3
CTGCCATGGCTGTAAGCACACACAAACTTCGATCGCTCGTCGTCGCTGACCGTCGTCGTCTTCAACTGTTCTTGATCATCGCATTGGATGGATGTGTAATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTT(SEQ ID NO.5)
Os06t0133000-4
GCAGGCGAATGGCCACAGGGTCATGGTGATCTCTCCTCGGTACGACCAGTACAAGGACGCTTGGGATACCAGCGTTGTGGCTGAGGTAGGAGCATATGCGTGATCAGATCATCACAAGAT(SEQ ID NO.6)
Os06t0133000-5
TGCAATTCATTGCAGATCAAGGTTGCAGACAGGTACGAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAAGCGTGGAGTCGACCGTGTGTTCATCGACCATCCGTCATTCCTGGAGAAGGTGGAG(SEQ ID NO.7)
Os06t0133000-6
CCACTGGTGATTTCAGGTTTGGGGAAAGACCGGTGAGAAGATCTACGGACCTGACACTGGAGTTGATTACAAAGACAACCAGATGCGTTTCAGCCTTCTTTGCCAGGTCAGTGATTACTT(SEQ ID NO.8)
Os06t0133000-7
AACTAATTCGTGTATTGATGCTACCTGCAGGCAGCACTCGAGGCTCCTAGGATCCTAAACCTCAACAACAACCCATACTTCAAAGGAACTTATGGTGAGTTACAATTGATCTCAAGATCT(SEQ ID NO.9)
Os06t0133000-8
ACTGACAACAGGTGAGGATGTTGTGTTCGTCTGCAACGACTGGCACACTGGCCCACTGGCGAGCTACCTGAAGAACAACTACCAGCCCAATGGCATCTACAGGAATGCAAAGGTCTATGC(SEQ ID NO.10)
Os06t0133000-9
CTGCAGGTTGCTTTCTGCATCCACAACATCTCCTACCAGGGCCGTTTCGCTTTCGAGGATTACCCTGAGCTGAACCTCTCCGAGAGGTTCAGGTCATCCTTCGATTTCATCGACGGGTAT(SEQ ID NO.11)
Os06t0133000-10
GGGATGCGAGCTCGACAACATCATGCGGCTCACCGGCATCACCGGCATCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAGTGGGATCCTAGCAAGGACAAGTACATCACCGCCAAGTACGACGCAAC(SEQ ID NO.12)
Os06t0133000-11
GGTACTGGAAAGAAGAAGTTCGAGAAGCTGCTCAAGAGCATGGAGGAGAAGTATCCGGGCAAGGTGAGGGCCGTGGTGAAGTTCAACGCGCCGCTTGCTCATCTCATCATGGCCGGAGCC(SEQ ID NO.13)
Os06t0133000-12
GACGTGCTCGCCGTCCCCAGCCGCTTCGAGCCCTGTGGACTCATCCAGCTGCAGGGGATGAGATACGGAACGGTATACAATTTCCATCTATCAATTCGATTGTTCGATTTCATCTTTGTG(SEQ ID NO.14)
Os06t0133000-13
TCCTTGTTGATTTCTCCAGCCCTGTGCTTGCGCGTCCACCGGTGGGCTCGTGGACACGGTCATCGAAGGCAAGACTGGTTTCCACATGGGCCGTCTCAGCGTCGACGTAAGCCTATACAT(SEQ ID NO.15)
Os06t0133000-14
TAAACGTCTTGTTCAGAAGTTCAGAGATTCACCTGTCTGATGCTGATGATGATTAATTGTTTGCAACATGGATTTCAGGGGCCTGCGAAGAACTGGGAGAATGTGCTCCTGGGCCTGGGC(SEQ ID NO.16)
Os06t0133000-15
ATCGAAGGCGACGAGATCGCGCCGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCTGCTCCTTGAAGAGCCTGAGATCTACATATGGAGTGATTAATTAATATAGCAGTATATGGATGAGAGACGAATGAA(SEQ ID NO.17)
Os06t0133000-16
GAGACGAATGAACCAGTGGTTTGTTTGTTGTAGTGAATTTGTAGCTATAGCCAATTATATAGGCTAATAAGTTTGATGTTGTACTCTTCTGGGTGTGCTTAAGTATCTTATCGGACCCTG(SEQ ID NO.18)
实施例2
本实施例中，筛选Waxy突变体，包括如下：
1、对植物进行辐射诱变处理，包括如下：
1)型号为XF1822的水稻干种子2000粒，使用重离子12C+6辐射诱变处理，剂量120Gy，剂量率为1.5Gy/Min，种植，获得M1代种子。
2)将获得的M1代种子分单株进行种植，M1代严格自交结实，按穗收法，收获每个单株的每一穗种子，获得M2代种子。
3)将获得的M2代种子分单株进行种植，种植14000株，每个群体100株，对每个群体编号；以每个样本群为单位，待幼苗生长到两叶一心时，对其中每个单株采用直径为6mm的打孔器取等量叶片进行混合，将不同植株之间等量混合，共有140个样本群。
2、提取步骤1得到的样本群的基因组DNA，将提取的基因组DNA进行片段化处理，然后将片段化处理后的DNA片段加上A尾，连接测序接头并纯化，扩增得到DNA文库，包括如下：
2.1、对样本群采用CTAB法来提取DNA
对步骤1得到的140个样本群编号，依次编号为POOL NO.1-POOLNO.140；每个样本群里面的每个单株也编号，以样本群POOL NO.1为例，依次编号为POOL NO.1-1～POOLNO.1-100。
采用CTAB对每个样品群提取DNA后，经Qubit荧光定量，浓度≥20ng/μL，总量≥1μg；样品纯度：OD260/280＝1.7～2.0，OD260/230≥1.8；琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，要求电泳主条带大于2000bp。本实施例中，实际经检测于低于2000bp的DNA占比低于50％。
2.2、DNA片段化/DNA片段加A尾
使用天根NG301试剂盒进行DNA片段化、末端修复、DNA片段加上A尾。
将步骤2.1得到的140个样本群分别与试剂盒中的10×FEA Reaction Buffer和5×FEA enzyme混合，按照表1配制DNA片段化/末端修复/DNA片段加A尾，至于冰上，融化后颠倒混匀，离心，然后按照表2进行反应。
表1
组分 每反应量(μL)
步骤2.1的样本群DNA X
10×FEA Reaction Buffer 5
5×FEA enzyme Mix 10
ddH<sub>2</sub>O 35-X
表2
温度 时间
热盖70℃ On
4℃ 1min
32℃ 16min
65℃ 30min
4℃ Hold
2.3、接头连接
使用天根NG303试剂盒进行接头连接。按照下表3配制接头连接的反应体系，离心，按照表4进行连接反应，得到连接产物。
表3
组分 每反应量(μL)
步骤2.2获得的反应产物 50
5×Ligase buffer 20
TIANSeq DNA Ligase 10
DNA Adapter X 2.5
ddH<sub>2</sub>O 17.5
表4
温度 时间
热盖 Off
20℃ 15min
4℃ Hold
2.4、DNA纯化
1)取100μL步骤2.3得到的连接产物(Adapter Ligation)和130μL的Serapure磁珠置于PCR管中，充分混匀，室温静置2min；
2)将PCR管放置于磁力架，进行磁珠吸附，静置5min，弃上清；
3)然后加入200μL的75％乙醇，弃去上清液；
4)重复步骤2.4中的3)一次，尽量弃去上清液，室温静置5min直至残余乙醇完全挥发；
5)加入23μL的洗脱液(10mM Tris-HCl，pH 8.0-pH 8.5)洗脱，充分混匀后室温静置5min，再放置于磁力架静置2min，取23μL上清液保存至新的PCR管中，得到纯化后的DNA文库，纯化的连接产物。
2.5、DNA文库扩增
2.5.1DNA文库的扩增
以步骤2.4得到的纯化后的DNA文库为模板，按照表5配制反应体系，涡旋混匀，离心，然后按照表6进行PCR扩增，得到DNA文库扩增产物。扩增采用KAPA文库扩增试剂盒。
表5
Figure BDA0003375280840000091
Figure BDA0003375280840000101
表6
Figure BDA0003375280840000102
2.5.2DNA文库扩增后的纯化
(1)50μL步骤2.5.1得到的DNA文库扩增产物与55μL Serapure磁珠在PCR管中充分混匀，室温静置2min；
(2)将PCR管放置磁力架静置5min，弃上清；
(3)然后加入200μL的75％乙醇，静置半分钟后，弃去上清液；
(4)重复步骤2.5.2中的(3)一次，尽量弃去上清液，室温静置5min直至残余乙醇完全挥发；
(5)加入27μL超纯水洗脱，充分混匀后室温静置5min，再放置于磁力架静置2min，将符合文库标准要求的上清液保存至新的PCR管中用于探针捕获。
纯化后利用Qubit HS定量。DNA文库符合标准为：条带集中在200-400bp，浓度大于5ng/μL。合格的DNA文库进入杂交捕获环节。
3、探针和文库的杂交
使用
Figure BDA0003375280840000104
Hybridization and Wash Kit试剂盒进行探针和文库的杂交。
将步骤2.5.2中纯化合格的DNA文库经真空浓缩仪进行浓缩干燥，离心，其中，真空浓缩仪设定65℃；然后按照表7中配制反应体系，置于PCR管中。
表7
Figure BDA0003375280840000103
按照下表8中成分加入上述表7的反应体系中，用枪头上下吹打混匀并冲洗管壁，室温孵育5-10min；离心，于95℃孵育10min；接着加入实施例1构建的探针混匀；然后65℃孵育过夜(仪器盖子温度设为75℃)，不超过15h。
表8
试剂 体积(μL)
Nuclease-Free Water 1.8
Hybridization Buffer Enhancer 2.7
2×Hybridization Buffer 8.5
4、采用磁珠对杂交后的产物进行富集，构建富集文库
富集时，按照表9制备1×Bead Wash Buffer，按照表10制备10×Wash Buffer I和Stringent Wash Buffer。
表9
Concentrated buffer(μL) Nuclease-Free Water(μL)
2×Bead Wash Buffer 250 250
10×Wash Buffer I 30 270
10×Wash BufferⅡ 20 180
10×Wash BufferⅢ 20 180
10×Stringent Wash Buffer 40 360
表10
Figure BDA0003375280840000111
4.1、磁珠对步骤3的杂交后的产物进行富集
1)采用1×Bead Wash Buffer对链霉亲和素标记的磁珠进行清洗，得到纯净的磁珠。
2)将步骤3得到杂交产物转移至含有磁珠的PCR管管，混匀，置于震荡仪器中，65℃孵育45min，使DNA结合到磁珠上，得到富集DNA的磁珠。孵育过程中，孵育5min后震荡3s以混匀；之后每隔8min涡旋震荡3s确保磁珠仍处于悬浮状态，震荡仪器转速调至1500。
4.2、清洗磁珠以去未杂交的产物
将步骤4.1得到的富集DNA的磁珠转移至离心管中，置于磁力架上，使磁珠和上清分离，去除上清液。
接着加入200μL预热的1×Stringent Wash Buffer，上下吹打10次混匀，然后于65℃水浴中孵育3min，置于磁力架上，使磁珠和上清分离，去除上清液。
然后加200μL室温的1×Wash Buffer I，吹打10次混匀后再涡旋震荡1min；置于磁力架上，使磁珠和上清完全分离，去除上清；加200μL室温的1×Wash Buffer II(1×WashBufferⅡ是由表9中10×Wash BufferⅡ加水稀释10倍得到)，涡旋震荡1min；离心管放置于磁力架上，使磁珠和上清完全分离，去除上清；加200μL室温的1×Wash Buffer III(1×Wash Buffer III是由表9中10×Wash Buffer III加水稀释10倍得到)，移液器吹打混匀或涡旋震荡30秒，离心管放置于磁力架上，使磁珠和上清完全分离，去除上清。
从磁力架上取下离心管，离心管中加入22μL的Nuclease-Free Water，上下吹打10次，重悬磁珠，得到富集杂交产物的磁珠。
4.3、得到目标基因，对目标基因进行PCR扩增
4.3.1按下表11准备PCR混合物，短暂震荡以混匀，确保磁珠悬浮在溶液中。然后放入PCR仪(BioRad T100)，保持仪器盖子温度为105℃，按照表12的反应程序进行扩增，得到PCR反应产物。扩增所用的试剂盒为KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit，购买于罗氏公司。
表11
组分 反应量(μL)
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) 25
TruSeq Primer 1.0 1.5
TruSeq Primer 2.0 1.5
步骤4.2富集杂交产物的磁珠 22
总量： 50
表12
Figure BDA0003375280840000121
实验可暂停点：PCR反应液可4℃保存过夜。
反应结束后Qubit HS定量，电泳确认捕获DNA的条带。总量大于125ng/μL。
4.3.2扩增后纯化
1)每50μl步骤4.3.1中得到的PCR反应产物中加入65μL Serapure磁珠，充分混匀，室温静置2min；
2)将PCR管放置磁力架静置5min，弃上清；
3)在磁力架上每管加入200μL的75％乙醇，静置半分钟后，弃去上清液；
4)重复步骤4.3.2中的3)一次，尽量弃去上清液，室温静置5min直至残余乙醇完全挥发；
5)加入25μL的EB洗脱，充分混匀后室温静置5min，再放置磁力架静置2min，取上清液，得到富集文库。
纯化后采用Qubit HS定量。要求，浓度大于质量5ng/μL，条带集中在200-400bp，用于后续测序。
5、对步骤4.3.2得到的富集文库进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析，筛选出与野生型水稻Waxy基因序列有变异的目标基因，变异情况包括点突变、基因片段插入、基因片段缺失。
采用MiniSeq测序试剂盒，在MiniSeq 500测序仪平台完成测序，具体流程参照说明书的标准流程。
表13为检测到的基因变异情况。发现编号POOL NO.121样本群的基因与野生型水稻Waxy基因的序列存在差异，编号为POOL NO.121样本群的基因的1767006和1767007之间插入CCACGGGTTCCAGGGCCTCAAGC碱基片段。
表13基因变异情况
Figure BDA0003375280840000131
6、根据步骤5的测序数据结果，存在差异位点的基因的序列利用Primer Premier5.0软件设计分子引物，分别对编号为POOL NO.121的样本群中100个M2代单株样品的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行直接测序。
根据Waxy突变体的基因设计分子引物：
正向引物：5'-AGCTAGACAACCACCATGTC-3'(SEQ ID NO.19)
反向引物：5'-ACGAACACGACGTTCATGC-3'(SEQ ID NO.20)
表14PCR扩增体系
Figure BDA0003375280840000141
Waxy突变体的核苷酸序列全长为SEQ ID NO:1所示序列。
7、将步骤6中基因组序列存在差异的单株种植至大田，严格自交繁殖后代，在分蘖盛期分别取每一个分蘖的叶片再次进行突变验证。最终选择出遗传稳定，综合性状优良、符合育种目标性状的突变体。
图1为本实施例2中野生型Waxy基因和Waxy突变体基因的部分序列比对示意图。
图2为本实施例2中Waxy突变体基因在基因组上的位置示意图。
从图1和图2可知，与野生型水稻Waxy基因相比，突变体Waxy基因的1767006和1767007之间插入片段CCACGGGTTCCAGGGCCTCAAGC。
图3A为本实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒的实拍图。其中，W：表示野生型；M：表示突变体。
从图3A可知，与野生型水稻相比，Waxy突变体水稻的米粒大小无显著差异。
图3B为本实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻经种植后的米粒的实拍图。
从图3B可知，Waxy突变体水稻的米粒很透亮，而野生型水稻呈乳白色、不透亮。
图3C为本实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻经种植后的米粒的透光实拍图。
从图3C可知，Waxy突变体水稻的米粒光可以穿透，而野生型水稻的米粒光不能穿透。
从图3A、3B和3C可知，Waxy突变体，对子粒大小无影响，但对水稻的直链淀粉含量具有重要影响，可以降低水稻的米粒中直链淀粉的含量。
图4为本实施例2中野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒经碘染色后的对比示意图。其中，W：表示野生型；M：表示突变体。
分别以野生型水稻和Waxy突变体水稻的米粒对研究对象，称取0.01～0.02g经烘干后的米粒于研钵中研碎，然后采用直链淀粉含量检测试剂盒(购于苏州科铭生物技术有限公司)检测米粒中的直链淀粉含量。同时设有空白对照组。图中，W表示野生型；M表示突变体；CK空白对照组。检测原理为：直链淀粉遇碘形成蓝色的络合物，颜色越深，说明直链淀粉含量越高。
从图4可知，空白对照组CK经碘染色后呈澄清透亮，而Waxy突变体水稻经碘染色后呈为红色，野生型水稻经碘染色呈深蓝色，经测定后，野生型水稻中的直链淀粉平均含量为15.5％，含有Waxy突变体水稻中的直链淀粉平均含量5.2％。由此说明，本实施例获得Waxy突变体可以明显降低水稻中直链淀粉的含量，与野生型水稻相比，直链淀粉含量降低了60％以上。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 湖南省核农学与航天育种研究所
<120> Waxy突变体及其筛选方法和用途
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5054
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 60
ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 120
caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 180
cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 240
taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 300
catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 360
attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 420
ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 480
aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 540
tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 600
agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 660
aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 720
atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 780
ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 840
ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 900
gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 960
aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 1020
atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 1080
tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 1140
attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 1200
atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 1260
agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacca tgtcggctct caccacgtcc 1320
cagctcgcca cctcggccac cggcttcggc atcgccgaca ggtcggcgcc gtcgtcgctg 1380
ctccgcacgg gttccagggc ctcaagccca cgggttccag ggcctcaagc cccgcagccc 1440
cgccggcggc gacgcgacgt cgctcagcgt gacgaccagc gcgcgcgcga cgcccaagca 1500
gcagcggtcg gtgcagcgtg gcagccggag gttcccctcc gtcgtcgtgt acgccaccgg 1560
cgccggcatg aacgtcgtgt tcgtcggcgc cgagatggcc ccctggagca agaccggcgg 1620
cctcggtgac gtcctcggtg gcctcccccc tgccatggct gtaagcacac acaaacttcg 1680
atcgctcgtc gtcgctgacc gtcgtcgtct tcaactgttc ttgatcatcg cattggatgg 1740
atgtgtaatg ttgtgttctt gtgttctttg caggcgaatg gccacagggt catggtgatc 1800
tctcctcggt acgaccagta caaggacgct tgggatacca gcgttgtggc tgaggtagga 1860
gcatatgcgt gatcagatca tcacaagatc gattagcttt agatgatttg ttacatttcg 1920
caagatttta acccaagttt ttgtggtgca attcattgca gatcaaggtt gcagacaggt 1980
acgagagggt gaggtttttc cattgctaca agcgtggagt cgaccgtgtg ttcatcgacc 2040
atccgtcatt cctggagaag gtggagtcat cattagttta ccttttttgt ttttactgaa 2100
ttattaacag tgcatttagc agttggactg agcttagctt ccactggtga tttcaggttt 2160
ggggaaagac cggtgagaag atctacggac ctgacactgg agttgattac aaagacaacc 2220
agatgcgttt cagccttctt tgccaggtca gtgattactt ctatctgatg atggttggaa 2280
gcatcacgag tttaccatag tatgtatgga ttcataacta attcgtgtat tgatgctacc 2340
tgcaggcagc actcgaggct cctaggatcc taaacctcaa caacaaccca tacttcaaag 2400
gaacttatgg tgagttacaa ttgatctcaa gatcttataa ctttcttcga aggaatccat 2460
gatgatcaga ctaattcctt ccggtttgtt actgacaaca ggtgaggatg ttgtgttcgt 2520
ctgcaacgac tggcacactg gcccactggc gagctacctg aagaacaact accagcccaa 2580
tggcatctac aggaatgcaa aggtctatgc ttgttcttgc cataccaact caaatctgca 2640
tgcacactgc attctgttca gaaactgact gtctgaatct ttttcactgc aggttgcttt 2700
ctgcatccac aacatctcct accagggccg tttcgctttc gaggattacc ctgagctgaa 2760
cctctccgag aggttcaggt catccttcga tttcatcgac gggtatgagt aagattctaa 2820
gagtaactta ctgtcaattc gccatatatc gattcaatcc aagatccttt tgagctgaca 2880
accctgcact actgtccatc gttcaaatcc ggttaaattt caggtatgac acgccggtgg 2940
agggcaggaa gatcaactgg atgaaggccg gaatcctgga agccgacagg gtgctcaccg 3000
tgagcccgta ctacgccgag gagctcatct ccggcatcgc caggggatgc gagctcgaca 3060
acatcatgcg gctcaccggc atcaccggca tcgtcaacgg catggacgtc agcgagtggg 3120
atcctagcaa ggacaagtac atcaccgcca agtacgacgc aaccacggta agaacgaatg 3180
cattcttcac aagatatgca atctgaattt tctttgaaaa agaaattatc atctgtcact 3240
tcttgattga ttctgacaag gcaagaatga gtgacaaatt tcaggcaatc gaggcgaagg 3300
cgctgaacaa ggaggcgttg caggcggagg cgggtcttcc ggtcgacagg aaaatcccac 3360
tgatcgcgtt catcggcagg ctggaggaac agaagggccc tgacgtcatg gccgccgcca 3420
tcccggagct catgcaggag gacgtccaga tcgttcttct ggtataatat aatacactac 3480
aagacacact tgcacgatat gccaaaaatt cagaacaaat tcagtggcaa aaaaaaaact 3540
cgaatattag ggaaggacct aataatatca aataattaga aggggtgagg ctttgaaccc 3600
agatcgtcta gtccaccacc ttgtggagtt agccggaaga cctctgagca tttctcaatt 3660
cagtggcaaa tgatgtgtat aattttgatc cgtgtgtgtt tcagggtact ggaaagaaga 3720
agttcgagaa gctgctcaag agcatggagg agaagtatcc gggcaaggtg agggccgtgg 3780
tgaagttcaa cgcgccgctt gctcatctca tcatggccgg agccgacgtg ctcgccgtcc 3840
ccagccgctt cgagccctgt ggactcatcc agctgcaggg gatgagatac ggaacggtat 3900
acaatttcca tctatcaatt cgattgttcg atttcatctt tgtgcaatgc aatgcaattg 3960
caaatgcaaa tgcatgatga ttttccttgt tgatttctcc agccctgtgc ttgcgcgtcc 4020
accggtgggc tcgtggacac ggtcatcgaa ggcaagactg gtttccacat gggccgtctc 4080
agcgtcgacg taagcctata catttacata acaatcagat atgacacatc ctaataccga 4140
taagtcggta cactactaca catttacatg gttgctggtt atatggtttt tttggcagtg 4200
caaggtggtg gagccaagcg acgtgaagaa ggtggcggcc accctgaagc gcgccatcaa 4260
ggtcgtcggc acgccggcgt acgaggagat ggtcaggaac tgcatgaacc aggacctctc 4320
ctggaaggta taaattacga aacaaattta acccaaacat atactatata ctccctccgc 4380
ttctaaatat tcaacgccgt tgtctttttt aaatatgttt gaccattcgt cttattaaaa 4440
aaattaaata attataaatt cttttcctat catttgattc attgttaaat atacttatat 4500
gtatacatat agttttacat atttcataaa attttttgaa caagacgaac ggtcaaacat 4560
gtgctaaaaa gttaacggtg tcgaatattc agaaacggag ggagtataaa cgtcttgttc 4620
agaagttcag agattcacct gtctgatgct gatgatgatt aattgtttgc aacatggatt 4680
tcaggggcct gcgaagaact gggagaatgt gctcctgggc ctgggcgtcg ccggcagcgc 4740
gccggggatc gaaggcgacg agatcgcgcc gctcgccaag gagaacgtgg ctgctccttg 4800
aagagcctga gatctacata tggagtgatt aattaatata gcagtatatg gatgagagac 4860
gaatgaacca gtggtttgtt tgttgtagtg aatttgtagc tatagccaat tatataggct 4920
aataagtttg atgttgtact cttctgggtg tgcttaagta tcttatcgga ccctgaattt 4980
atgtgtgtgg cttattgcca ataatattaa gtaataaagg gtttattata ttattatata 5040
tgttatatta tact 5054
<210> 2
<211> 5031
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 60
ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 120
caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 180
cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 240
taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 300
catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 360
attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 420
ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 480
aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 540
tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 600
agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 660
aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 720
atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 780
ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 840
ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 900
gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 960
aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 1020
atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 1080
tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 1140
attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 1200
atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 1260
agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacca tgtcggctct caccacgtcc 1320
cagctcgcca cctcggccac cggcttcggc atcgccgaca ggtcggcgcc gtcgtcgctg 1380
ctccgcacgg gttccagggc ctcaagcccc gcagccccgc cggcggcgac gcgacgtcgc 1440
tcagcgtgac gaccagcgcg cgcgcgacgc ccaagcagca gcggtcggtg cagcgtggca 1500
gccggaggtt cccctccgtc gtcgtgtacg ccaccggcgc cggcatgaac gtcgtgttcg 1560
tcggcgccga gatggccccc tggagcaaga ccggcggcct cggtgacgtc ctcggtggcc 1620
tcccccctgc catggctgta agcacacaca aacttcgatc gctcgtcgtc gctgaccgtc 1680
gtcgtcttca actgttcttg atcatcgcat tggatggatg tgtaatgttg tgttcttgtg 1740
ttctttgcag gcgaatggcc acagggtcat ggtgatctct cctcggtacg accagtacaa 1800
ggacgcttgg gataccagcg ttgtggctga ggtaggagca tatgcgtgat cagatcatca 1860
caagatcgat tagctttaga tgatttgtta catttcgcaa gattttaacc caagtttttg 1920
tggtgcaatt cattgcagat caaggttgca gacaggtacg agagggtgag gtttttccat 1980
tgctacaagc gtggagtcga ccgtgtgttc atcgaccatc cgtcattcct ggagaaggtg 2040
gagtcatcat tagtttacct tttttgtttt tactgaatta ttaacagtgc atttagcagt 2100
tggactgagc ttagcttcca ctggtgattt caggtttggg gaaagaccgg tgagaagatc 2160
tacggacctg acactggagt tgattacaaa gacaaccaga tgcgtttcag ccttctttgc 2220
caggtcagtg attacttcta tctgatgatg gttggaagca tcacgagttt accatagtat 2280
gtatggattc ataactaatt cgtgtattga tgctacctgc aggcagcact cgaggctcct 2340
aggatcctaa acctcaacaa caacccatac ttcaaaggaa cttatggtga gttacaattg 2400
atctcaagat cttataactt tcttcgaagg aatccatgat gatcagacta attccttccg 2460
gtttgttact gacaacaggt gaggatgttg tgttcgtctg caacgactgg cacactggcc 2520
cactggcgag ctacctgaag aacaactacc agcccaatgg catctacagg aatgcaaagg 2580
tctatgcttg ttcttgccat accaactcaa atctgcatgc acactgcatt ctgttcagaa 2640
actgactgtc tgaatctttt tcactgcagg ttgctttctg catccacaac atctcctacc 2700
agggccgttt cgctttcgag gattaccctg agctgaacct ctccgagagg ttcaggtcat 2760
ccttcgattt catcgacggg tatgagtaag attctaagag taacttactg tcaattcgcc 2820
atatatcgat tcaatccaag atccttttga gctgacaacc ctgcactact gtccatcgtt 2880
caaatccggt taaatttcag gtatgacacg ccggtggagg gcaggaagat caactggatg 2940
aaggccggaa tcctggaagc cgacagggtg ctcaccgtga gcccgtacta cgccgaggag 3000
ctcatctccg gcatcgccag gggatgcgag ctcgacaaca tcatgcggct caccggcatc 3060
accggcatcg tcaacggcat ggacgtcagc gagtgggatc ctagcaagga caagtacatc 3120
accgccaagt acgacgcaac cacggtaaga acgaatgcat tcttcacaag atatgcaatc 3180
tgaattttct ttgaaaaaga aattatcatc tgtcacttct tgattgattc tgacaaggca 3240
agaatgagtg acaaatttca ggcaatcgag gcgaaggcgc tgaacaagga ggcgttgcag 3300
gcggaggcgg gtcttccggt cgacaggaaa atcccactga tcgcgttcat cggcaggctg 3360
gaggaacaga agggccctga cgtcatggcc gccgccatcc cggagctcat gcaggaggac 3420
gtccagatcg ttcttctggt ataatataat acactacaag acacacttgc acgatatgcc 3480
aaaaattcag aacaaattca gtggcaaaaa aaaaactcga atattaggga aggacctaat 3540
aatatcaaat aattagaagg ggtgaggctt tgaacccaga tcgtctagtc caccaccttg 3600
tggagttagc cggaagacct ctgagcattt ctcaattcag tggcaaatga tgtgtataat 3660
tttgatccgt gtgtgtttca gggtactgga aagaagaagt tcgagaagct gctcaagagc 3720
atggaggaga agtatccggg caaggtgagg gccgtggtga agttcaacgc gccgcttgct 3780
catctcatca tggccggagc cgacgtgctc gccgtcccca gccgcttcga gccctgtgga 3840
ctcatccagc tgcaggggat gagatacgga acggtataca atttccatct atcaattcga 3900
ttgttcgatt tcatctttgt gcaatgcaat gcaattgcaa atgcaaatgc atgatgattt 3960
tccttgttga tttctccagc cctgtgcttg cgcgtccacc ggtgggctcg tggacacggt 4020
catcgaaggc aagactggtt tccacatggg ccgtctcagc gtcgacgtaa gcctatacat 4080
ttacataaca atcagatatg acacatccta ataccgataa gtcggtacac tactacacat 4140
ttacatggtt gctggttata tggttttttt ggcagtgcaa ggtggtggag ccaagcgacg 4200
tgaagaaggt ggcggccacc ctgaagcgcg ccatcaaggt cgtcggcacg ccggcgtacg 4260
aggagatggt caggaactgc atgaaccagg acctctcctg gaaggtataa attacgaaac 4320
aaatttaacc caaacatata ctatatactc cctccgcttc taaatattca acgccgttgt 4380
cttttttaaa tatgtttgac cattcgtctt attaaaaaaa ttaaataatt ataaattctt 4440
ttcctatcat ttgattcatt gttaaatata cttatatgta tacatatagt tttacatatt 4500
tcataaaatt ttttgaacaa gacgaacggt caaacatgtg ctaaaaagtt aacggtgtcg 4560
aatattcaga aacggaggga gtataaacgt cttgttcaga agttcagaga ttcacctgtc 4620
tgatgctgat gatgattaat tgtttgcaac atggatttca ggggcctgcg aagaactggg 4680
agaatgtgct cctgggcctg ggcgtcgccg gcagcgcgcc ggggatcgaa ggcgacgaga 4740
tcgcgccgct cgccaaggag aacgtggctg ctccttgaag agcctgagat ctacatatgg 4800
agtgattaat taatatagca gtatatggat gagagacgaa tgaaccagtg gtttgtttgt 4860
tgtagtgaat ttgtagctat agccaattat ataggctaat aagtttgatg ttgtactctt 4920
ctgggtgtgc ttaagtatct tatcggaccc tgaatttatg tgtgtggctt attgccaata 4980
atattaagta ataaagggtt tattatatta ttatatatgt tatattatac t 5031
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttcacttc tctgcttgtg ttgttctgtt gttcatcagg aagaacatct gcaagttata 60
catatatgtt tataattctt tgtttcccct cttattcaga tcgatcacat gcatctttca 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttaggctc accaaacctt aaacaattca attcagtgca gagatcttcc acagcaacag 60
ctagacaacc accatgtcgg ctctcaccac gtcccagctc gccacctcgg ccaccggctt 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgccatggc tgtaagcaca cacaaacttc gatcgctcgt cgtcgctgac cgtcgtcgtc 60
ttcaactgtt cttgatcatc gcattggatg gatgtgtaat gttgtgttct tgtgttcttt 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggcgaat ggccacaggg tcatggtgat ctctcctcgg tacgaccagt acaaggacgc 60
ttgggatacc agcgttgtgg ctgaggtagg agcatatgcg tgatcagatc atcacaagat 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcaattcat tgcagatcaa ggttgcagac aggtacgaga gggtgaggtt tttccattgc 60
tacaagcgtg gagtcgaccg tgtgttcatc gaccatccgt cattcctgga gaaggtggag 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccactggtga tttcaggttt ggggaaagac cggtgagaag atctacggac ctgacactgg 60
agttgattac aaagacaacc agatgcgttt cagccttctt tgccaggtca gtgattactt 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aactaattcg tgtattgatg ctacctgcag gcagcactcg aggctcctag gatcctaaac 60
ctcaacaaca acccatactt caaaggaact tatggtgagt tacaattgat ctcaagatct 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actgacaaca ggtgaggatg ttgtgttcgt ctgcaacgac tggcacactg gcccactggc 60
gagctacctg aagaacaact accagcccaa tggcatctac aggaatgcaa aggtctatgc 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgcaggttg ctttctgcat ccacaacatc tcctaccagg gccgtttcgc tttcgaggat 60
taccctgagc tgaacctctc cgagaggttc aggtcatcct tcgatttcat cgacgggtat 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggatgcgag ctcgacaaca tcatgcggct caccggcatc accggcatcg tcaacggcat 60
ggacgtcagc gagtgggatc ctagcaagga caagtacatc accgccaagt acgacgcaac 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtactggaa agaagaagtt cgagaagctg ctcaagagca tggaggagaa gtatccgggc 60
aaggtgaggg ccgtggtgaa gttcaacgcg ccgcttgctc atctcatcat ggccggagcc 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacgtgctcg ccgtccccag ccgcttcgag ccctgtggac tcatccagct gcaggggatg 60
agatacggaa cggtatacaa tttccatcta tcaattcgat tgttcgattt catctttgtg 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccttgttga tttctccagc cctgtgcttg cgcgtccacc ggtgggctcg tggacacggt 60
catcgaaggc aagactggtt tccacatggg ccgtctcagc gtcgacgtaa gcctatacat 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taaacgtctt gttcagaagt tcagagattc acctgtctga tgctgatgat gattaattgt 60
ttgcaacatg gatttcaggg gcctgcgaag aactgggaga atgtgctcct gggcctgggc 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcgaaggcg acgagatcgc gccgctcgcc aaggagaacg tggctgctcc ttgaagagcc 60
tgagatctac atatggagtg attaattaat atagcagtat atggatgaga gacgaatgaa 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagacgaatg aaccagtggt ttgtttgttg tagtgaattt gtagctatag ccaattatat 60
aggctaataa gtttgatgtt gtactcttct gggtgtgctt aagtatctta tcggaccctg 120
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctagacaa ccaccatgtc 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgaacacga cgttcatgc 19

Claims (10)

1.Waxy突变体，其特征在于，编码所述Waxy突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。
2.与如权利要求1所述的Waxy突变体相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一种：
a)含有权利要求1所述的Waxy突变体的核苷酸序列的重组表达载体；
b)含有权利要求1所述的Waxy突变体的核苷酸序列的生物工程菌，或含有a)所述的重组表达载体的生物工程菌；
c)含有权利要求1所述的Waxy突变体的核苷酸序列的转基因植物细胞，或含有a)所述的重组表达载体的转基因植物；
d)由权利要求1中所述的核苷酸编码的蛋白。
3.如权利要求1所述的Waxy突变体或权利要求2所述的生物材料在植物种质资源改良中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述改良包括提高植物品质，优选为，降低植物直链淀粉含量。
5.一种筛选Waxy突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)植物进行辐射诱变后，提取基因组DNA，根据所述的基因组DNA构建DNA文库；
2)根据野生型水稻Waxy基因设计探针；将所述探针与所述DNA文库杂交；
3)采用磁珠对杂交后的产物进行富集，构建富集文库；
4)对富集文库进行鉴定分析，筛选出与所述的野生型水稻Waxy基因的序列有差异的目标基因，得到所述的Waxy突变体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辐射诱变包括γ射线诱变和重离子诱变；当辐射诱变为γ射线诱变时，包括下述的一项或多项：
所述γ射线诱变的诱变源选自60Co-γ射线；
和/或，所述γ射线的剂量为200～500Gy；
和/或，所述γ射线的剂量率为2～16Gy/min；
当辐射诱变为重离子诱变时，包括下述的一项或多项：
和/或，所述重离子诱变的诱变源选自12C+6重离子；
和/或，所述重离子诱变的剂量为80～150Gy；
和/或，所述重离子诱变的剂量率为0.8～2.2Gy/min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述探针的序列包括如SEQ ID NO:3～SEQID NO:18所示序列；
和/或，所述探针为生物素标记的探针；
和/或，所述磁珠为霉亲和素标记的磁珠。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中的方法如下：
a)对植物的种子进行辐射诱变，种植，获得M1代种子；
b)将所述M1代种子进行种植，获得M2代种子；
c)将所述M2代种子进行种植，取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；
d)从混合后的叶片中提取得到所述的基因组DNA；
e)将所述的基因组DNA进行片段化处理，然后将片段化处理后的DNA片段加上A尾，连接测序接头，进行扩增，得到所述的DNA文库。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤c)中，将所述的M2代种子分单株进行种植，每100～1000植株为一个样本群，对每个样本群编号，每个样本群的叶片混合以提取DNA；
和/或，步骤c)中，取各种植后单株上的叶片时，选取同一单株不同部位的叶片进行等量混合；不同单株之间等量混合。
10.一种低直链淀粉含量的植物，其特征在于，包含权利要求1所述的Waxy突变体或权利要求2所述的生物材料。
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