CN114085292A - 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 - Google Patents
一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114085292A CN114085292A CN202111283155.7A CN202111283155A CN114085292A CN 114085292 A CN114085292 A CN 114085292A CN 202111283155 A CN202111283155 A CN 202111283155A CN 114085292 A CN114085292 A CN 114085292A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fibronectin
- titanium metal
- carrier
- titanium
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title claims abstract description 92
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 123
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims abstract description 115
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 115
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 101
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 101
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 6
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 10
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 claims description 8
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004080 punching Methods 0.000 claims description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OCC(N)(CO)CO ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开了一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，所述一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法包括如下步骤：材料准备；载体消毒；制备硅烷化载体；纤连蛋白固化；低温储存。本发明通过设置多张钛金属板和基板作为载体，钛金属板之间互不碰触，避免附着的纤连蛋白碰撞失活，钛金属板设置有多个分布均匀的冲孔，可提高纤连蛋白的附着面积，提高纤连蛋白储存活性，后期取用可直接取出基板和多张钛金属板，同时取用数量可根据钛金属板而定，方便取用，钛金属板的不存在流失的情况，基本没有损耗，使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属，涂层载体钛金属表面对蛋白质的吸附和释放能力大大增强。
Description
技术领域
本发明涉及纤连蛋白，具体为一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，属于蛋白质活性研究技术领域。
背景技术
纤维连接蛋白是一类细胞外基质蛋白，在细胞与细胞、细胞与基膜间起到桥联作用，维持细胞的正常形态和功能，它可以与肝素、肌动蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、DNA和细胞结合。其重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。
对于经常需要使用的纤连蛋白，一般将纤连蛋白放在-20度保存，为了避免纤连蛋白反复冻融，一般的做法是在纤连蛋白中加入一定量的甘油，但仅仅加入甘油，可以避免纤连蛋白反复冻融，但不能有效的防止纤连蛋白的降解。且由于保护剂的成分比较多，加入的量不同对纤连蛋白的影响也不一样，所以需要一种方法来保护纤连蛋白稳定性和生物学活性，常用的蛋白保护剂有甘油、甘露醇、聚乙二醇、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、牛血清白蛋白等。
现有专利(公告号：CN111848807A)公开了一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，涉及蛋白质活性研究技术领域。将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。发明人在实现该方案的过程中发现现有技术中存在如下问题没有得到良好的解决：该方法中采用纯钛粉作为载体，纯钛粉在消毒时容易流失，消耗较大；该方法中的纯钛粉作为载体后期取用时需要使用离心设备，钛粉之间相互碰撞容易损坏导致纤连蛋白失活；该方法中采用使用无水乙醇清洗后在120℃下固化反应6h以增强APTE与活化钛粉表面的结合，得到硅烷化钛粉，硅烷化钛粉表面对蛋白质的吸附和释放能力有限。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，所述保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法包括如下步骤：
(1)材料准备，准备活性纤连蛋白溶液、多张钛金属板和基板，使用工具对钛金属板表面冲孔，基板一侧表面设置有多个插槽，将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，得到载体钛金属组合。
(2)载体消毒，使用专用消毒液对载体钛金属组合进行超声波清洗，然后使用热风机充分干燥后备用。
(3)制备硅烷化载体，将活化载体钛金属组合加入到碱液中充分反应，再将3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)对钛表面进行硅烷化改性，使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属。
(4)纤连蛋白固化，将涂层载体钛金属加入到活性纤连蛋白溶液中反应30min～60min，倒去多余液体，然后使用缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白，得到固化纤连蛋白载体钛金属。
(5)低温储存，向固化纤连蛋白载体钛金属中加入储存液，然后密封放入-20℃的低温箱中储存。
优选的，步骤(1)中钛金属板为纯钛金属板，其厚度为100μm～1000μm，冲孔孔径为48μm～200μm。
优选的，步骤(1)中的基板上的插槽之间间距相等，安装后的冲孔钛金属板之间互不碰触。
优选的，步骤(1)基板处于1000℃高温环境中，然后使用夹持工具将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，然后自然冷却得到载体钛金属组合。
优选的，步骤(1)中的纤连蛋白溶液pH值为7.0，浓度为150μg/mL～300μg/mL。
优选的，步骤(2)中消毒液包含丙酮、无水乙醇和蒸馏水，依次采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水在超声环境下对载体钛金属组合进行清洗，每次清洗时间为10min-20min。
优选的，步骤(3)中采用甲基丙烯酸酐(MA)对明胶(Gelatin)进行接枝改性，合成了甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)。
优选的，步骤(4)中缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白的冲洗时间为10min-15min，缓冲液的PH值为7.0，冲洗温度为0℃～5℃。
优选的，步骤(5)中固化纤连蛋白载体钛金属完全浸没入储存液中。
优选的，使用时将基板固定在离心设备上，离心甩去储存液，然后将固化纤连蛋白载体钛金属放入到PBS中浸泡，即可得到纤连蛋白工作液。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过设置多张钛金属板和基板作为载体，钛金属板之间互不碰触，避免附着的纤连蛋白碰撞失活，钛金属板设置有多个分布均匀的冲孔，可提高纤连蛋白的附着面积，提高纤连蛋白储存活性；
(2)本发明通过设置多张钛金属板和基板作为载体，后期取用可直接取出基板和多张钛金属板，操作较为简单，同时取用数量可根据钛金属板而定，方便取用，钛金属板的不存在流失的情况，基本没有损耗；
(3)本发明使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属，涂层载体钛金属表面对蛋白质的吸附和释放能力大大增强。
附图说明
图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
请参阅图1，一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，所述保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法包括如下步骤：
(1)材料准备，准备活性纤连蛋白溶液、多张钛金属板和基板，使用工具对钛金属板表面冲孔，基板一侧表面设置有多个插槽，将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，得到载体钛金属组合。
(2)载体消毒，使用专用消毒液对载体钛金属组合进行超声波清洗，然后使用热风机充分干燥后备用。
(3)制备硅烷化载体，将活化载体钛金属组合加入到碱液中充分反应，再将3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)对钛表面进行硅烷化改性，使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属。
(4)纤连蛋白固化，将涂层载体钛金属加入到活性纤连蛋白溶液中反应30min，倒去多余液体，然后使用缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白，得到固化纤连蛋白载体钛金属。
(5)低温储存，向固化纤连蛋白载体钛金属中加入储存液，然后密封放入-20℃的低温箱中储存。
具体的，步骤(1)中钛金属板为纯钛金属板，其厚度为100μm，冲孔孔径为48μm，钛金属板设置有多个分布均匀的冲孔，可提高纤连蛋白的附着面积，通过设置纯钛金属板，钛具有质轻、无毒、生物相容性好及弹性模量与人骨相近等一系列优点在临床上被广泛用作种植体的基体材料，可用作纤连蛋白的载体，但钛属于生物惰性材料，只能与周围骨组织之间形成简单的机械锁合，不能形成强有力的化学性键合，因此植入体很容易松动甚至脱落，因此需要对钛进行活化。
具体的，步骤(1)中的基板上的插槽之间间距相等，安装后的冲孔钛金属板之间互不碰触，通过设置钛金属板之间互不碰触，避免附着的纤连蛋白碰撞失活。
具体的，步骤(1)基板处于1000℃高温环境中，然后使用夹持工具将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，然后自然冷却得到载体钛金属组合，通过设置基板处于1000℃高温环境中，使得冷却后的基板能夹紧钛金属板。
具体的，步骤(1)中的纤连蛋白溶液pH值为7.0，浓度为150μg/mL。
具体的，步骤(2)中消毒液包含丙酮、无水乙醇和蒸馏水，依次采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水在超声环境下对载体钛金属组合进行清洗，每次清洗时间为10min-20min，通过设置清洗时间为10min清洗较为充分。
具体的，步骤(3)中采用甲基丙烯酸酐(MA)对明胶(Gelatin)进行接枝改性，合成了甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)。
具体的，步骤(4)中缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白的冲洗时间为10min-15min，缓冲液的PH值为7.0，冲洗温度为0℃～5℃。
具体的，步骤(5)中固化纤连蛋白载体钛金属完全浸没入储存液中，储存液包括：终浓度50mM～200mM的精氨酸、蛋白保护剂总重0.22wt％～2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mlEDTA，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为Tris-NaCl缓冲液，所述Tris-NaCl缓冲液为终浓度50mM的Tris，终浓度100mM的NaCl，pH值为8.0。
具体的，使用时将基板固定在离心设备上，离心甩去储存液，然后将固化纤连蛋白载体钛金属放入到PBS中浸泡，即可得到纤连蛋白工作液，通过将基板固定在离心设备上避免在离心操作时纤连蛋白失活。
以上纯钛金属板为100μm的实施例。
实施例二：
请参阅图1，一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，所述保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法包括如下步骤：
(1)材料准备，准备活性纤连蛋白溶液、多张钛金属板和基板，使用工具对钛金属板表面冲孔，基板一侧表面设置有多个插槽，将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，得到载体钛金属组合。
(2)载体消毒，使用专用消毒液对载体钛金属组合进行超声波清洗，然后使用热风机充分干燥后备用。
(3)制备硅烷化载体，将活化载体钛金属组合加入到碱液中充分反应，再将3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)对钛表面进行硅烷化改性，使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属。
(4)纤连蛋白固化，将涂层载体钛金属加入到活性纤连蛋白溶液中反应50min，倒去多余液体，然后使用缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白，得到固化纤连蛋白载体钛金属。
(5)低温储存，向固化纤连蛋白载体钛金属中加入储存液，然后密封放入-20℃的低温箱中储存。
具体的，步骤(1)中钛金属板为纯钛金属板，其厚度为500μm，冲孔孔径为125μm，钛金属板设置有多个分布均匀的冲孔，可提高纤连蛋白的附着面积，通过设置纯钛金属板，钛具有质轻、无毒、生物相容性好及弹性模量与人骨相近等一系列优点在临床上被广泛用作种植体的基体材料，可用作纤连蛋白的载体，但钛属于生物惰性材料，只能与周围骨组织之间形成简单的机械锁合，不能形成强有力的化学性键合，因此植入体很容易松动甚至脱落，因此需要对钛进行活化。
具体的，步骤(1)中的基板上的插槽之间间距相等，安装后的冲孔钛金属板之间互不碰触，通过设置钛金属板之间互不碰触，避免附着的纤连蛋白碰撞失活。
具体的，步骤(1)基板处于1000℃高温环境中，然后使用夹持工具将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，然后自然冷却得到载体钛金属组合，通过设置基板处于1000℃高温环境中，使得冷却后的基板能夹紧钛金属板。
具体的，步骤(1)中的纤连蛋白溶液pH值为7.0，浓度为250μg/mL。
具体的，步骤(2)中消毒液包含丙酮、无水乙醇和蒸馏水，依次采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水在超声环境下对载体钛金属组合进行清洗，每次清洗时间为10min-20min，通过设置清洗时间为10min清洗较为充分。
具体的，步骤(3)中采用甲基丙烯酸酐(MA)对明胶(Gelatin)进行接枝改性，合成了甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)。
具体的，步骤(4)中缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白的冲洗时间为10min-15min，缓冲液的PH值为7.0，冲洗温度为0℃～5℃。
具体的，步骤(5)中固化纤连蛋白载体钛金属完全浸没入储存液中，储存液包括：终浓度50mM～200mM的精氨酸、蛋白保护剂总重0.22wt％～2wt％的牛血清白蛋白、终浓度0.3mg/mlEDTA，蛋白保护剂总重40wt％的甘油，采用溶剂为Tris-NaCl缓冲液，所述Tris-NaCl缓冲液为终浓度50mM的Tris，终浓度100mM的NaCl，pH值为8.0。
具体的，使用时将基板固定在离心设备上，离心甩去储存液，然后将固化纤连蛋白载体钛金属放入到PBS中浸泡，即可得到纤连蛋白工作液，通过将基板固定在离心设备上避免在离心操作时纤连蛋白失活。
以上纯钛金属板为500μm的实施例。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：所述保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法包括如下步骤：
(1)材料准备，准备活性纤连蛋白溶液、多张钛金属板和基板，使用工具对钛金属板表面冲孔，基板一侧表面设置有多个插槽，将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，得到载体钛金属组合；
(2)载体消毒，使用专用消毒液对载体钛金属组合进行超声波清洗，然后使用热风机充分干燥后备用；
(3)制备硅烷化载体，将活化载体钛金属组合加入到碱液中充分反应，再将3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)对钛表面进行硅烷化改性，使用紫外光辐照技术在钛表面构建甲基丙烯酸酰化明胶涂层，得到涂层载体钛金属；
(4)纤连蛋白固化，将涂层载体钛金属加入到活性纤连蛋白溶液中反应30min～60min，倒去多余液体，然后使用缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白，得到固化纤连蛋白载体钛金属；
(5)低温储存，向固化纤连蛋白载体钛金属中加入储存液，然后密封放入-20℃的低温箱中储存。
2.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(1)中钛金属板为纯钛金属板，其厚度为100μm～1000μm，冲孔孔径为48μm～200μm。
3.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(1)中的基板上的插槽之间间距相等，安装后的冲孔钛金属板之间互不碰触。
4.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(1)基板处于1000℃高温环境中，然后使用夹持工具将多张冲孔钛金属板分别插入到插槽中，然后自然冷却得到载体钛金属组合。
5.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(1)中的纤连蛋白溶液pH值为7.0，浓度为150μg/mL～300μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(2)中消毒液包含丙酮、无水乙醇和蒸馏水，依次采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水在超声环境下对载体钛金属组合进行清洗，每次清洗时间为10min-20min。
7.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(3)中采用甲基丙烯酸酐(MA)对明胶(Gelatin)进行接枝改性，合成了甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)。
8.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(4)中缓冲液冲洗未结合的纤连蛋白的冲洗时间为10min-15min，缓冲液的PH值为7.0，冲洗温度为0℃～5℃。
9.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：步骤(5)中固化纤连蛋白载体钛金属完全浸没入储存液中。
10.根据权利要求1所述的一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，其特征在于：使用时将基板固定在离心设备上，离心甩去储存液，然后将固化纤连蛋白载体钛金属放入到PBS中浸泡，即可得到纤连蛋白工作液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111283155.7A CN114085292A (zh) | 2021-11-01 | 2021-11-01 | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111283155.7A CN114085292A (zh) | 2021-11-01 | 2021-11-01 | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114085292A true CN114085292A (zh) | 2022-02-25 |
Family
ID=80298488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111283155.7A Pending CN114085292A (zh) | 2021-11-01 | 2021-11-01 | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114085292A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007031408A (ja) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Kanagawa Acad Of Sci & Technol | 生理活性物質固定化チタン材及びその製造方法 |
| JP2009229319A (ja) * | 2008-03-24 | 2009-10-08 | Fujifilm Corp | 固定化方法、生理活性物質固定化担体及び固定用担体 |
| CN110791798A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-14 | 中国人民解放军西部战区总医院 | 一种在仿生多孔钛合金表面构建壳聚糖-多聚胆碱磷酸/明胶涂层的方法 |
| CN111848807A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-30 | 安徽九川生物科技有限公司 | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 |
| CN112251751A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-22 | 西安交通大学 | 一种3d构型高结合强度钛酸钠纳米纤维涂层的制备方法 |
-
2021
- 2021-11-01 CN CN202111283155.7A patent/CN114085292A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007031408A (ja) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Kanagawa Acad Of Sci & Technol | 生理活性物質固定化チタン材及びその製造方法 |
| JP2009229319A (ja) * | 2008-03-24 | 2009-10-08 | Fujifilm Corp | 固定化方法、生理活性物質固定化担体及び固定用担体 |
| CN110791798A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-14 | 中国人民解放军西部战区总医院 | 一种在仿生多孔钛合金表面构建壳聚糖-多聚胆碱磷酸/明胶涂层的方法 |
| CN111848807A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-30 | 安徽九川生物科技有限公司 | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 |
| CN112251751A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-22 | 西安交通大学 | 一种3d构型高结合强度钛酸钠纳米纤维涂层的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张慧婷等: "利用ＭｉｃｒｏＢＣＡ和ＱＣＭ 对钛薄膜表面 固定纤连蛋白的量化研究与对比", 《》, vol. 43, no. 13, pages 2 * |
| 张林: "钛表面硅烷化-明胶凝胶涂层的制备及性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 09 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4960423A (en) | Method of enhancing the attachment of endothelial cells on a matrix and vascular prosthesis with enhanced anti-thrombogenic characteristics | |
| Fisher et al. | Thermoreversible hydrogel scaffolds for articular cartilage engineering | |
| Bellows et al. | Mineralized bone nodules formed in vitro from enzymatically released rat calvaria cell populations | |
| JP5508511B2 (ja) | 培養細胞シート、製造方法及びその利用した組織修復方法 | |
| CN1985778B (zh) | 生物型人工角膜 | |
| CN100400114C (zh) | 可控降解速率的生物医用植入材料及其应用 | |
| US5108923A (en) | Bioadhesives for cell and tissue adhesion | |
| US8158425B2 (en) | Cell culture scaffold containing gel having interpenetrating polymer network structure | |
| US4438198A (en) | Biochemically active matrix for use in a bio-artificial organ | |
| GB2414990A (en) | Biologically active native biomatrix composition | |
| Hsu et al. | Improved retention of endothelial cells seeded on polyurethane small‐diameter vascular grafts modified by a recombinant RGD‐containing protein | |
| CA2295163A1 (en) | Cell culture products | |
| JP2007215519A (ja) | 細胞培養担体 | |
| CN114085292A (zh) | 一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法 | |
| DE50201619D1 (de) | Polyphosphazen-haltige substrate als matrize für die züchtung von zellen | |
| Filová et al. | Vascular endothelial cells on two‐and three‐dimensional fibrin assemblies for biomaterial coatings | |
| JPS6255429B2 (zh) | ||
| CN104771784A (zh) | 一种组织脱细胞液 | |
| JP4262465B2 (ja) | 細胞培養方法 | |
| Taguchi et al. | Immobilization of human vascular endothelial growth factor (VEGF165) onto biomaterials: an evaluation of the biological activity of immobilized VEGF165 | |
| JP5150150B2 (ja) | 細胞培養用基質およびその製造方法 | |
| Rubens | Cardiopulmonary bypass technology transfer: musings of a cardiac surgeon | |
| CN114958713A (zh) | 一种管状结构的三维细胞培养支架 | |
| JPS63196273A (ja) | 細胞培養用基材 | |
| Sieminski et al. | Salmon fibrin supports an increased number of sprouts and decreased degradation while maintaining sprout length relative to human fibrin in an in vitro angiogenesis model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |