CN114085272B - 一种isaridin类环酯肽衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种isaridin类环酯肽衍生物及其制备方法和应用。该衍生物经试验证明，表现出良好的抗炎和抗血栓活性，甚至活性均强于阳性对照药品，并且，海洋微生物来源的天然化合物具有不容易产生抗性、安全性高等特点，试验也证明本发明所述化合物的细胞毒性低。同时，本发明的isaridin类环缩酚肽衍生物由海鞘共附生真菌中提取得到，可以利用微生物进行规模发酵，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低等特点，具有广阔的应用前景。

Description

一种isaridin类环酯肽衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种isaridin类环酯肽衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
血栓性疾病是一种危险的病理过程，具有较高的发病率和死亡率，是对人类健康和生命的重大威胁。血栓形成可导致各种心血管疾病，包括冠心病、心肌梗死、缺血性中风、肺栓塞等。
目前，临床上最常用的抗血栓药物主要包括抗凝剂和抗血小板药物，通过直接阻碍血栓形成来治疗血栓性疾病。然而，大多数药物，如华法林和阿司匹林，都有严重的不良反应且效果不理想。本领域技术人员还研发了许多抗血栓化合物，如中国专利申请CN1228701A公开了一种具有溶解血栓活性的杂环化合物，实验证明其具有一定的抗血栓作用，但是对于血栓炎症没有明显的作用，而血栓炎症事件是静脉阻塞和血栓死亡的关键风险因素，很容易造成器官坏死；并且该化合物的合成制备方法复杂，所需试剂繁多，制备成本较高，极大地限制了该化合物的应用。现有抗血栓药物基本都具有上述缺陷与不足，因此，寻找新的抗血栓药物对进一步的临床应用具有特殊的意义和紧迫性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有抗血栓药物存在不良反应、无抗炎作用、效果不理想，制备方法复杂、制备成本高的缺陷和不足，提供一种具有显著抗炎和抗血栓效果，安全可靠的isaridin类环酯肽衍生物。
本发明的目的是提供所述isaridin类环酯肽衍生物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述isaridin类环酯肽衍生物的应用。
本发明另一目的是提供一种抗炎和/或抗血栓的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种isaridin类环酯肽衍生物，为式（I）结构化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化合物：
Figure 93164DEST_PATH_IMAGE002
其中，R1选自-H、-CH3中的一种；R2选自-H、-OH中的一种；R3、R8分别独立地选自-H、-CH3；R4、R5分别独立地选自-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH(OH)CH3、-CH2Ar；R6选自-CH2-或-CH2CH2-；R7选自-NH-、-O-；
进一步地，所述isaridin类环酯肽衍生物的化学特征在于含有一个2-羟基-4-甲基戊酸或其类似物亮氨酸，一个脯氨酸或3-甲基-脯氨酸，一个苯丙氨酸或酪氨酸，含有0~2个N甲基化的氨基酸，一个β-丙氨酸或甘氨酸。
优选地，所述isaridin类环酯肽衍生物具有以下任一结构：
Figure 221526DEST_PATH_IMAGE004
Figure 662872DEST_PATH_IMAGE006
Figure 243895DEST_PATH_IMAGE008
。
进一步地，所述isaridin类环酯肽衍生物药学上可接受的盐具有式（II）结构：
Figure 405886DEST_PATH_IMAGE010
其中，AA1为亮氨酸或2-羟基-4-甲基戊酸；AA2为脯氨酸或3-甲基脯氨酸；AA3为苯丙氨酸或酪氨酸；AA4、AA5独立地选自丙氨酸、2-氨基丁酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或其N甲基化衍生物中的任意一种或两种；AA6为甘氨酸或β-丙氨酸。
另外的，本发明还提供了所述isaridin类环酯肽衍生物的制备方法，所述isaridin类环酯肽衍生物由海洋海鞘来源真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908菌体中分离纯化得到；所述菌株于2020年7月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61059。
进一步地，具体包括以下步骤：
（1）、扩大培养海洋海鞘来源真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908，得到菌体，用有机溶剂对菌体进行提取，提取液浓缩后，得到浸膏；
（2）、将步骤S1所得浸膏萃取、浓缩后，将得到的萃取物经过硅胶柱层析、葡聚糖凝胶、反相高效液相色谱处理，即得。
更进一步地，步骤（1）中，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、甲醇或乙醇。
进一步地，步骤（2）中，所述萃取的溶剂为乙酸乙酯和/或氯仿。
更具体的，所述isaridin类环酯肽衍生物的制备方法包括以下步骤：
S1、将海鞘共附生真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908接入种子培养基，摇床/静置培养，得到种子培养液，接入发酵培养基发酵，培养得到菌体；
S2、发酵产物的获得：将步骤S1中发酵得到的菌体用有机溶剂提取2~5次，提取液浓缩后得到浸膏；
S3、化合物的分离纯化：将步骤S2所得浸膏萃取2~5次，浓缩得到萃取物；再采用硅胶柱层析梯度洗脱分离，以体积比为10%、20%、30%、45%、60%、100%的乙酸乙酯-石油醚溶液和5%、10%甲醇-乙酸乙酯溶液作为洗脱液进行洗脱，得到8个馏份，即Fr.A～Fr.H；
S4、收集30%、45%乙酸乙酯-石油醚溶液梯度洗脱组分Fr.C、Fr.D，分别经过反相硅胶柱层析，洗脱梯度为30%、50%、70%、90%甲醇/水溶液，收集50%~90%组份，分别采用热乙醇溶解，重结晶可得大量的化合物I-13，收集剩余的母液Fr.C-L1、Fr.D-L1。
S5、收集步骤S4中所述母液Fr.C-L1，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（二氯甲烷/甲醇 1:1），再采用反相高效液相色谱制备纯化，使用45~65%甲醇/水或30%~50%乙腈/水作为流动相等度洗脱，收集保留时间为10~30 min的流出组分，即可分别得到上述部分isaridin类环缩酚肽衍生物：化合物I-14，化合物I-4，化合物I-5，化合物I-6，化合物I-8和化合物I-9。
S6、收集步骤S4中所述母液Fr.D-L1，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（二氯甲烷/甲醇 1:1），再采用反相高效液相色谱制备纯化，使用45~65%甲醇/水或30%-50%乙腈/水作为流动相等度洗脱，收集保留时间为10~30 min的流出组分，即可分别得到上述部分isaridin类环缩酚肽衍生物：化合物I-1、化合物I-3、化合物I-10和化合物I-11。
S7、收集步骤S3中60%乙酸乙酯-石油醚洗脱组分Fr. E，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（甲醇），再经过反相硅胶柱层析，洗脱梯度为30%、50%、70%、90%甲醇/水，收集70%甲醇/水组份，采用制备反相高效液相色谱法，使用45~65%甲醇/水或30%-50%乙腈/水作为流动相等度洗脱，收集保留时间为10~30 min的流出组分，得到化合物I-12，化合物I-15，化合物I-2和化合物I-7。
进一步地，步骤S1中，所述种子培养基主要由市售马铃薯葡萄糖水培养基（每升含马铃薯200 g，葡萄糖20 g）、酵母蛋白胨葡萄糖水培养基（每升主要含蛋白胨50 g，酵母浸粉20 g，葡萄糖4 g）或酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基（每升主要含蛋白胨50 g，酵母浸粉20g，葡萄糖4 g，琼脂12 g）任意一种制成。
更进一步地，步骤S1中，所述发酵培养基主要由改良大米培养基、改良小米培养基、改良小麦培养基、改良玉米培养基、改良高粱培养基或酵母蛋白胨葡萄糖水培养基制成。
优选地，所述改良培养基是在原培养基（粮食与水比例为0.9~1.0:1.0~1.2）的基础上添加1~3%海盐、0.2%~0.5%的蛋白胨、0.1%~0.2%的酵母提取物。
进一步地，步骤S1中，所述培养基为固体培养基时，为静置培养，温度为15~30℃，时间14~35天；所述培养基为液体培养基时，所述培养为摇床震荡培养，培养的温度为15~30℃，时间为5~20天，转速为100~250 rpm。
更进一步地，步骤S5中，所用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210 nm，流动相为60%甲醇/水，流速为4 ml/min。
进一步地，步骤S5中，收集保留时间为11.9~12.3 min组分，并进一步HPLC纯化可得化合物I-5和I-8，收集保留时间为13.6 min 组分可得化合物I-6，收集保留时间为15.2~16.5 min组分，并进一步HPLC纯化可得化合物I-9和I-4，以及收集保留时间为18.2 min组分可得化合物I-14。
更进一步地，步骤S6中，所用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210 nm，流动相为65%甲醇/水，流速为4 ml/min。
进一步地，步骤S6中，收集保留时间为13.4 min组分可得化合物I-10，收集保留时间为16.8 min组分可得化合物I-11，收集保留时间为20.5 min组分可得化合物I-1，收集保留时间为25.6 min 组分可得化合物I-3。
更进一步地，步骤S7中所用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210 nm，流动相为50%乙腈/水，流速为4 ml/min。
进一步地，收集保留时间为13.4 min组分可得化合物I-12，收集保留时间为16.7min组分可得化合物I-15，收集保留时间为19.5 min 组分可得化合物I-7，和收集保留时间为22.3 min组分可得化合物I-2。
另外的，本发明还提供了所述isaridin类环酯肽衍生物在制备抗炎药物中的应用。
另外的，本发明还提供了所述isaridin类环酯肽衍生物在制备抗血栓药物中的应用。
所述isaridin类环酯肽衍生物经实验证明具有显著的抗炎、抗血栓作用，因此，本发明还要求保护一种抗炎和/或抗血栓药物，其含有所述isaridin类环酯肽衍生物。
本发明具有以下有益效果：
本发明一种isaridin类环缩酚肽衍生物，经试验证明可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO，表现出良好的抗炎活性，同时在体外还能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，表现出良好的抗血栓活性，并且其抗炎、抗血栓活性均强于阳性对照药品。另一方面，本发明的isaridin类环缩酚肽衍生物由海鞘共附生真菌中提取得到，可以利用微生物进行规模发酵，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低等特点；并且，海洋微生物来源的天然化合物具有不容易产生抗性、安全性高等特点，试验也证明本发明所述化合物的细胞毒性低，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备所得化合物I-2的单晶衍射结构图。
图2为本发明实施例1制备所得化合物I-13的单晶衍射结构图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
其中，种子培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g, 葡萄糖20 g，自来水1 L；
发酵培养基：大米90 g，海盐3 g，蛋白胨 0.5 g，酵母提取物0.2 g，自来水100mL。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 一种isaridin类环酯肽衍生物的制备方法
采用海鞘共附生真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908（2018年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61059，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼）进行发酵，对发酵液进行分离、提取，得到化合物I-1至化合物I-15。
具体的发酵、分离提、取过程如下：
1. 种子培养：
1.1 种子培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g, 葡萄糖20 g，自来水1 L，平均分装于5个500 mL锥形瓶，121℃灭菌15分钟。
1.2 种子的培养：将海鞘共附生真菌的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以180 rpm的转速，培养120小时得种子培养液。
2．发酵培养：
2.1 配制发酵培养基：每1 L三角锥瓶中含大米90 g，海盐3 g，蛋白胨 0.5 g，酵母提取物0.2 g，自来水100 mL。
2.2 发酵培养：无菌操作将种子液5 mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养28天。
3．化合物的分离纯化：
发酵菌体用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下减压浓缩得浸膏105 g；该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用乙酸乙酯体积为10%、20%、30%、45%、60%、100%的乙酸乙酯-石油醚溶液和5%、10%甲醇-乙酸乙酯溶液梯度淋洗，分为8组（Fr.A～Fr.H）。
收集30%、45%乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱组分Fr.C、Fr.D，分别经过反相硅胶柱层析，洗脱梯度为30%、50%、70%、90%甲醇/水溶液，收集50%、70%、90%组份，分别采用热乙醇溶解、重结晶可得大量的化合物I-13，收集剩余的母液Fr.C-L1、Fr.D-L1。
上述母液Fr.C-L1，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（二氯甲烷/甲醇 1:1），再采用反相高效液相色谱制备纯化，使用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210 nm，流动相为60%甲醇/水，流速为4 ml/min。收集保留时间为11.9~12.3 min组分，并进一步HPLC纯化可得化合物I-5和化合物I-8，收集保留时间为13.6 min 组分可得化合物I-6，收集保留时间为15.2~16.5 min组分，并进一步HPLC纯化可得化合物I-9和化合物I-4，以及收集保留时间为 18.2 min组分可得化合物I-14。
上述母液Fr.D-L1，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（二氯甲烷/甲醇 1:1），再采用反相高效液相色谱制备纯化，所用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210 nm，流动相为65%甲醇/水，流速为4 ml/min。收集保留时间为13.4 min组分可得化合物I-10，收集保留时间为16.8 min组分可得化合物I-11，收集保留时间为20.5 min组分可得化合物I-1，收集保留时间为25.6 min 组分可得化合物I-3。
60%乙酸乙酯-石油醚洗脱组分Fr. E，先经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（甲醇），再经过反相硅胶柱层析，洗脱梯度为30%、50%、70%、90%甲醇/水，收集70%甲醇/水组份，采用制备反相高效液相色谱法，所用色谱柱为 RP-C18（250 × 10 mm, 5 μm），检测波长为210nm，流动相为50%乙腈/水，流速为4 ml/min。收集保留时间为13.4 min组分可得化合物I-12，收集保留时间为16.7 min组分可得化合物I-15，收集保留时间为19.5 min 组分可得化合物I-7，和收集保留时间为22.3 min组分可得化合物I-2。
上述过程，分离得到15个化合物，即化合物I-1~I-15，其结构如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 998541DEST_PATH_IMAGE006
Figure 437219DEST_PATH_IMAGE012
Isaridin化合物的部分理化性质数据如下：
化合物I-1：白色粉末; mp 129-132 °C;
Figure DEST_PATH_IMAGE013
-164.3 (c 0.08, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3278, 2956, 2877, 1620, 1543,1446 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表1; HRESIMS m/z 655.41752 [M +H]+ (calcd forC35H55O6N6, 655.41776)。
化合物I-2：无色晶体; mp 145-157 °C;
Figure 646484DEST_PATH_IMAGE013
-122.2 (c 0.59, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.06), 266 (0.66) , 277 (0.08) nm; IR (neat) ν max 3496(br), 3270 (br), 2950, 1722, 1680, 1645, 1608, 1516, 1238, 1167 cm-1; 1H 和 13CNMR数据见表2; HRESIMS m/z 628.37022 [M +H]+ (calcd for C33H50O7N5, 628.37048)。
化合物I-3：白色粉末; mp 186-190 °C;
Figure 815428DEST_PATH_IMAGE013
-133.9 (c 0.64, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3350, 3292, 2958, 2871, 1724,1665, 1624, 1527, 1417, 1172 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表2; HRESIMS m/z670.41704 [M +H]+ (calcd for C36H56O7N5, 670.41743)。
化合物I-4: 白色粉末; mp 154-156 °C;
Figure 528169DEST_PATH_IMAGE013
-133.9 (c 0.64, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3538 (br), 3348 (br), 3296(br), 2964, 2871, 1728, 1691, 1645, 1548, 1238, 1180 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表3; HRESIMS m/z 642.38629 [M +H]+ (calcd for C34H52O7N5, 642.38613)。
化合物I-5: 白色粉末; mp 160-163 °C;
Figure 983421DEST_PATH_IMAGE013
-180.4 (c 0.05, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3350, 3292, 2958, 2871, 1724,1665, 1624, 1527, 1417, 1172 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表3; HRESIMS m/z628.37055 [M +H]+ (calcd for C33H50O8N5, 628.37048)。
化合物I-6: 白色粉末; mp 105-107 °C;
Figure 539036DEST_PATH_IMAGE013
-115.2 (c 0.70, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.06) nm; IR (neat) ν max 3359, 3282, 2958, 2873, 1724,1668, 1620, 1520, 1450, 1169 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表4; HRESIMS m/z642.38590 [M +H]+ (calcd for C34H52O7N5, 642.38613)。
化合物I-7: 白色粉末; mp 123-125 °C;
Figure 370726DEST_PATH_IMAGE013
-139.0 (c 0.27, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3351, 2962, 2873, 1724, 1666,1521, 1448,1342, 1170 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表4; HRESIMS m/z 658.38091 [M +H]+ (calcd for C34H52O8N5, 658.38104)。
化合物I-8: 白色粉末; mp 154-156 °C;
Figure 78919DEST_PATH_IMAGE013
-133.9 (c 0.64, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3538 (br), 3348 (br), 3296(br), 2964, 2871, 1728, 1691, 1645, 1548, 1238, 1180 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表5; HRESIMS m/z 670.38274 [M +H]+ (calcd for C35H52O8N5, 670.38214)。
化合物I-9: 白色粉末; mp 135-137 °C;
Figure 705073DEST_PATH_IMAGE013
-121.5 (c 0.32, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3350, 3292, 2958, 2871, 1724,1665, 1624, 1527, 1417, 1172 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表5; HRESIMS m/z642.38602 [M +H]+ (calcd for C34H52O7N5, 642.38613)。
化合物I-13: 无色晶体; mp 198-200 °C;
Figure 357771DEST_PATH_IMAGE013
-143.8 (c 0.18, MeOH) ; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 10.2 Hz, 1H),7.27 (m, 2H), 7.25 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 5.34 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 5.12 (d,J = 10.7 Hz, 1H), 4.65 (ddd, J = 10.9, 7.5, 5.0 Hz, 1H), 4.29 (d, J = 10.7Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.09 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.50 (dd, J = 9.8, 6.4 Hz,2H), 3.17 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 3.01 (m, 1H), 2.97 (s, 3H), 2.63 (dd, J =11.6, 2.8 Hz, 1H), 2.48 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 2.22 (mp, 1H),2.13(m, 1H), 1.96 (m, 1H), 1.96 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.30 (m, 1H), 1.24 (m,1H), 1.01 (d, J = 3.2 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 3.2 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz,3H), 0.89 (d, 3H), 0.87 (d, 3H), 0.87 (d, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ19.0, 19.6, 19.8, 20.4, 20.6, 22.1, 23.5, 24.9, 27.8, 27.8, 29.2, 29.8, 32.4,35.2, 35.5, 35.7, 38.9, 47.3, 53.9, 57.7, 61.1, 66.6, 73.5, 127.4, 128.8,128.9, 136.5, 168.8, 169.9, 170.1, 172.2, 173.8, 174.2. HRESIMS m/z 656.40183[M +H]+ (calcd for C35H54O7N5, 656.40178)。
化合物I-14: 白色粉末; mp 138-140 °C;
Figure 993151DEST_PATH_IMAGE013
-103.6 (c 0.85, MeOH); 1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ H: 8.07 (1 H, d, J 8.1), 7.23 (2 H, m), 7.17 (3 H, m),6.98 (1 H, d, J 8.7), 5.19 (1 H, d, J 9.5), 4.71 (1 H, m), 4.48 (1 H, t, J9.2), 4.33 (1 H, d, J 10.7), 4.11 (1 H, d, J 8.3), 3.50 – 3.45 (1 H, m), 3.44(1 H, m), 3.21 (1 H, t, J 12.5), 3.09 (1 H, dd, J 14.4, 5.9), 2.99 – 2.93 (1H, m), 2.92 (3 H, s), 2.64 (1 H, d, J 15.7), 2.53 (1 H, dd, J 12.1, 3.5),2.49 (1 H, m), 2.24 (1 H, m), 2.16 – 2.10 (1 H, m), 2.09 (1 H, m), 2.00(1 H,m), 1.93 (2 H, m), 1.73 (1 H, m), 1.30 – 1.24 (1 H, m), 0.98 (3 H, d, J 6.5),0.96 – 0.91 (9 H, m), 0.88 (6 H, t, J 6.4).; 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 18.9,19.6, 19.7, 20.3, 21.0, 21.9, 23.4, 25.0, 27.1, 29.3, 31.6, 32.2, 35.0, 35.3,37.4, 39.0, 47.2, 55.0, 55.2, 61.1, 66.6, 73.3, 127.2, 128.8, 129.0, 136.7,168.5, 169.9, 171.6, 172.1, 172.8, 173.7. HRESIMS m/z 642.38624 [M +H]+(calcd for C34H52O7N5, 642.38613)。
化合物I-15: 白色粉末; mp 131-133 °C;
Figure 775425DEST_PATH_IMAGE013
-64.2 (c 0.11, MeOH); UV(MeOH) λ max (log ε) 201 (2.10) nm; IR (neat) ν max 3282, 2956, 1728, 1639, 1541,1444 cm-1; 1H 和 13C NMR数据见表1; HRESIMS m/z 628.37012 [M +H]+ (calcd forC33H50O7N5, 628.37048)。
化合物I-1~ I-9和化合物I-15的核磁（NMR）数据如表1至表5所示。
表1化合物I-1和I-15的NMR数据（100MHz/400MHz，CDCl3，ppm）
Figure 838059DEST_PATH_IMAGE015
表1续表
Figure 712474DEST_PATH_IMAGE017
表 2 化合物I-2和I-3的NMR数据（100MHz/400MHz, CDCl3/DMSO-d6, ppm）
Figure 151546DEST_PATH_IMAGE019
表2续表
Figure 303172DEST_PATH_IMAGE021
表3 化合物I-4和I-5的NMR数据（100MHz/400MHz，CDCl3，ppm）
Figure 802287DEST_PATH_IMAGE023
表3续表
Figure 163998DEST_PATH_IMAGE025
表4 化合物I-6和I-7的NMR数据（100MHz/400MHz，CDCl3，ppm）
Figure 265815DEST_PATH_IMAGE027
表4续表
Figure 396582DEST_PATH_IMAGE029
表5 化合物I-8和I-9的NMR数据（100MHz/400MHz，CDCl3，ppm）
Figure 801019DEST_PATH_IMAGE031
表5续表
Figure 650026DEST_PATH_IMAGE033
其中，化合物I-2和化合物I-13的单晶数据如表6所示，其单晶衍射结构图如图1所示。
表6化合物I-2和化合物I-13的单晶数据
Figure 40687DEST_PATH_IMAGE035
表6续表
Figure 291540DEST_PATH_IMAGE037
实施例2 isaridin环酯肽的抗炎活性测试
以实施例1制备的12个化合物（化合物I-1~ I-9和I-13~ I-15）为研究对象，测试其对脂多糖LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞内NO释放量来评估化合物的抗炎活性，具体的过程如下：
1.1实验材料： 脂多糖（LPS），吲哚美辛（Indomethacin，Indo，阳性对照），小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），DMSO，四氮唑（MTT，5 mg/mL），Griess法NO试剂盒（碧云天公司）。
1.2 实验方法
化合物采用DMSO溶解，配成10 mM的储备液，使用时用DMEM培养基稀释至需要的使用浓度（DMSO含量低于2%）。
将RAW264.7细胞(1×105个/mL)每孔100 μL培养于96孔板中，37℃、5% CO2 培养箱孵育12 h；向每孔中加入含有脂多糖LPS（终浓度1 μg/mL）的不同浓度的样品，实验分组为：空白组(100 μL DMEM培养基)、LPS模型组(1 μL LPS+99 μL DMEM培养基)、LPS+ Indo组 (1μL LPS+25 μL Indo +74 μL DMEM细胞培养基)、LPS+样品组 (1 μL LPS+99 μL溶有样品的培养基)；其中，脂多糖和吲哚美辛的浓度分别为100 μg/mL和200 μg/mL；向培养板中加入各浓度的样品和 LPS后培养24 h，小心吸取50 μL上清液到另一96孔板，分别加入Griess法NO试剂盒中的NO I和NO II试剂，混合均匀后室温静置10 min，用酶标仪测定96 孔板各孔540 nm处的吸光值，根据标准曲线计算出各组细胞的NO释放水平。
小心吸取剩余的50 μL培养液，加入100 μL用DMEM稀释的MTT溶液，放入培养箱中培养4 h；吸取上清液，加入110 μL DMSO溶液，震荡10 min，用酶标仪测定 96 孔板各孔490nm 处的吸光值，评估细胞的存活率。
计算方法：
NO释放抑制率% = （ODLPS模型组- ODLPS+样品组）/( ODLPS模型组- OD空白组)×100%。
细胞存活率%＝ [（样品组测定的平均OD 值）/ 对照组测定的平均OD 值]×100%。
2.试验结果
所有测试isaridin类环酯肽化合物均具有良好的抗炎效果，IC50为6~30 μM，均强于阳性对照吲哚美辛（IC50为38 μM），具有强的抗炎活性；并且在MTT测试中，所有化合物对RAW264.7细胞均无细胞毒性，安全性高。
实施例3 isaridin环酯肽的体外抗血栓实验
以实施例1制备的12个化合物（化合物I-1~ I-9和I-13~ I-15）为研究对象，测试其体外对二磷酸腺苷ADP诱导血小板的聚集的抑制作用，来评估化合物的抗血栓活性，具体的过程如下：
取昆明小鼠，戊巴比妥钠麻醉后腹腔动脉取血，注射器提前加入3.2%枸橼酸钠抗凝（全血与抗凝剂体积比为9:1），轻轻混匀，1000 r/min离心10 min，取上清，即为富血小板血浆（PRP）；剩余部分3000 r/min离心10 min，得贫血小板血浆（PPP），用PPP将PRP调至血小板计数为3×108/mL。
每次测试取295 μL PRP，对照组取1% DMSO与PRP混匀；药物组取不同浓度isaridin药物5 μL（终浓度0~100 μM）与PRP混匀；对照组取阿司匹林与血浆混匀，终浓度120 μM。37℃孵育5 min后，放入血小板聚集仪检测孔内，用PPP对测定通道依次调零，之后样品组和对照组分别加入诱导剂二磷酸腺苷ADP 15 μL（0.5 mg/mL），每组三个平行样本，采用比浊法在37℃条件下测定血小板聚集率，记录 5 min 内最大聚集率。
血小板聚集率用血小板最大聚集率表示，结果用抑制率表示。抑制率（％）＝（对照组血小板聚集率－药物组血小板聚集率）/对照组血小板聚集率×100%。
结果显示：随着isaridin药物浓度的增加，最大血小板的聚集率逐渐减少，呈浓度依赖性，12个测试isaridin化合物的IC50约为10~100 μM，均强于阳性对照阿司匹林（120μM抑制率约为50%）。
血栓的形成主要包括三个阶段：①血小板的粘附和聚集②血液凝固③纤维蛋白的溶解。Isaridin环酯肽类衍生物能够抑制ADP诱导的血小板的聚集，从而降低血液粘度，可以直接影响到血栓形成的第一阶段。因此isaridin类环酯肽化合物具有抗血栓的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种isaridin类环酯肽衍生物，其特征在于，所述isaridin类环酯肽衍生物为式（I）结构化合物或其药学上可接受的盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
其中，R1选自-H、-CH3中的一种；R2选自-H、-OH中的一种；R3、R8分别独立地选自-H、-CH3；R4、R5分别独立地选自-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH(OH)CH3、-CH2Ar；R6为-CH2CH2-；R7为-O-；
且所述isaridin类环酯肽衍生物为以下任一结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
Figure DEST_PATH_IMAGE010A
Figure DEST_PATH_IMAGE012A
。
2.权利要求1所述isaridin类环酯肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述isaridin类环酯肽衍生物由海洋海鞘来源真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908菌体中分离纯化得到；所述菌株于2020年7月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61059。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、扩大培养海洋海鞘来源真菌菌株Beauveria felina SYSU-MS7908，得到菌体，用有机溶剂对菌体进行提取，提取液浓缩后，得到浸膏；
S2、将步骤S1所得浸膏萃取、浓缩后，将得到的萃取物经过硅胶柱层析、葡聚糖凝胶、反相高效液相色谱处理，即得。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、甲醇或乙醇。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述萃取的溶剂为乙酸乙酯和/或氯仿。
6.权利要求1所述isaridin类环酯肽衍生物在制备抗炎药物中的应用。
7.权利要求1所述isaridin类环酯肽衍生物在制备抗血栓药物中的应用。
8.一种抗炎和/或抗血栓药物，其特征在于，含有权利要求1所述isaridin类环酯肽衍生物。
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