CN114081998A - 皮肤支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织工程技术领域,具体涉及基于3D生物打印的皮肤支架,提供具有抗炎、镇痛、保护细胞活性和免疫调节功能的皮肤支架,方案是:支架具有生物3D打印的立体网格结构,包括重量百分比10~35%的海藻酸盐、60~85%的明胶和0.5~10%的芍药苷,优选芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和比值为0.03;该支架的制备方法,a.将0.5~10重量份的芍药苷完全溶解于400~850重量份的去离子水中,加入10~35重量份的海藻酸盐粉末和60~85重量份的明胶颗粒,30~50℃搅拌0.5~4小时,制成生物3D打印墨水;b.将生物墨水加入生物3D打印机热熔针筒中,调节为37℃恒温,向打印机输入所需形成的网格的参数打印出含水的芍药苷‑海藻酸盐‑明胶皮肤支架;c.将含水的皮肤支架在负温度和抽真空环境中去除水份。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域,具体涉及一种基于3D生物打印的皮肤支架及其制备方法。
背景技术
随着糖尿病患者的逐年增多,糖尿病足溃疡患者的发病率也逐年升高,糖尿病足溃疡的治疗已经成为临床上巨大的挑战,人工皮肤在糖尿病足溃疡的救治过程中发挥着重要的作用,近年来,生物3D打印技术飞速发展,通过该技术能够快速获得个性化的人工皮肤支架,逐渐在糖尿病足溃疡的救治方面展现出其独特的优势,但目前基于生物3D打印技术获得的皮肤支架仍处于起始阶段;
生物3D打印技术的关键是生物墨水的选择与制备,目前常用于生物墨水的材料有:海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、壳聚糖等,这些材料各有优缺点,比如,海藻酸钠是一种天然多糖,具有高稳定性、溶解性、粘性和安全性等特点,明胶是具有较高的生物相容性和可降解性,其在体内降解后不产生副产物、无免疫原性,但这类皮肤支架研制的出发点主要还是在于支架的物理支撑作用和与人体组织的融合度,在抗炎、镇痛、镇静、保护细胞活性和免疫调节等方面还存在不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提供一种具有抗炎、镇痛、镇静、保护细胞活性和免疫调节功能的皮肤支架,更加有助于病体的恢复。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种皮肤支架,具有生物3D 打印的立体网格结构,所述支架的组成物质包括重量百分比10~35%的海藻酸盐、 60~85%的明胶和0.5~10%的芍药苷。
具体的,所述的芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和的比值为0.03。
具体的,所述的海藻酸盐为海藻酸钠。
该皮肤支架的制备方法,具有如下过程:
a.生物墨水的制备:将0.5~10重量份的芍药苷完全溶解于400~850重量份的去离子水中,然后加入10~35重量份的海藻酸盐粉末和60~85重量份的明胶颗粒,30~50℃搅拌0.5~4小时,制成生物3D打印墨水;
b.立体网格3D打印:使用生物3D打印机,将步骤a制成的生物墨水加入热熔针筒中,针筒加热至40~45℃,然后调节为37℃恒温,向打印机输入所需形成的网格的参数打印出含水的芍药苷-海藻酸盐-明胶皮肤支架;
c.水份的去除:将含水的皮肤支架在负温度和抽真空环境中去除水份,得到成品的皮肤支架。
具体的,所述步骤a中的芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和的比值为0.03。
具体的,所述步骤a中海藻酸盐粉末为海藻酸钠粉末。
本发明的有益效果是:本发明的芍药苷-海藻酸盐-明胶皮肤支架,利用用于口服的中药材芍药苷作为支架材料之一,可以有效抑制支架局部的炎症反应,降低炎症因子水平,从而加快溃疡创面的修复。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明扫描电镜下不同含量芍药苷皮肤支架的表面形貌图;
图2是本发明的药物释放曲线图;
图3是本发明大鼠皮肤成纤维细胞在五组皮肤支架表面的生长情况图;
图4是本发明CCK-8检测的细胞增殖水平图;
图5是本发明的羟脯氨酸分泌水平图;
图6是本发明的IL-6表达水平图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明,这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成。
首先,由于本发明所使用的海藻酸盐和明胶为已经被使用的物质,而芍药苷是新使用的中药成份,为了更好的说明芍药苷不同用量时皮肤支架的性能,以下各示例中维持了海藻酸盐和明胶的使用重量不变,所以,以5个芍药苷不同用量为具体方式,皮肤支架中芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和的百分比分别为0%、1%、3%、5%和10%,重量百分比0%的示例作为不添加芍药苷时的对比示例;
下面是制备5组芍药苷不同含量皮肤支架的过程:
生物墨水的制备:将分别的0g、0.028g、0.084g、0.140g和0.280g的芍药苷分别完全溶解于20g去离子水,然后加入0.8g海藻酸钠(SA)粉末及装有 2g明胶颗粒的烧杯中,40℃水浴电磁搅拌2小时,按照芍药苷重量与SA-明胶重量和之比分别为0、1、3、5和10%制成生物3D打印墨水;
使用生物3D打印机(RegenHU,瑞士)及其配套BioCAD软件设计模型15×15 mm,厚度4层,间距0.8mm,将5种生物墨水分别加入热熔针筒中,针筒加热至40℃,然后调节为37℃恒温,气压0.25MPa,距离2mm,打印速度6mm/s,针头25G,分别打印出0、1、3、5和10wt%的芍药苷-SA-明胶皮肤含水支架;
将含水支架-20℃抽真空去除水份,得到5组皮肤支架。
肉眼可观察到五组皮肤支架均呈网格状,孔径均匀;扫描电镜观察到五组皮肤支架均为多孔网状立体结构,孔隙均匀,附图1为扫描电镜下不同含量芍药苷皮肤支架的表面形貌;A、B、C、D和E分别为制备过程中生物墨水中芍药苷重量与SA-明胶重量比分别为0%、1%、3%、5%和10%的皮肤支架,其中A1-E1 为50倍放大,A2-E2为300倍放大。
本发明皮肤支架的药物释放情况
将透析袋(截留相对分子量3500)置于沸水中煮10min,待其活化后剪成半透膜,固定于扩散池的供给池与接受池之间;向接受池中加入14.8mL己预热至35℃的生理盐水作为接受液,注意排除气泡,转速为200rpm,向供给池中加3mL生理盐水,并封口,将样品浸在200μL生理盐水中,30min后,供给池中加完生理盐水以及处理过后的样品35mg后立刻启动透皮仪并开始计时;分别于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72h的时候取出0.6mL的接受液于离心管中,加入0.6mL 35℃的生理盐水并排除气泡,样品12000rpm离心 10min,吸取上清,过0.22μm滤膜后液相色谱仪检测,色谱条件:1)流动相:甲醇:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(32:68);2)检测波长:230nm;3) 流速:1.0mL/min;4)柱温:30℃;
结果如附图2的药物释放曲线,药物累积释放量随着释放时间逐渐增加, 10%皮肤支架组在各个时间点的释放量均高于其他四组。
本发明皮肤支架的细胞粘附与增殖情况
将皮肤支架与大鼠皮肤成纤维细胞共培养3d后,使用Live/Dead染色,荧光显微镜下观察皮肤支架表面细胞存活及粘附情况,扫描电镜观察皮肤支架表面细胞粘附和生长情况;将大鼠皮肤成纤维细胞与皮肤支架置入24孔板中, 4×104/孔的密度种植,共培养1、2、3d,加入CCK-8,检测细胞的增殖情况;
采用SPSS18.0软件统计,所有实验至少重复3次,最后取其平均值,实验数据采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义;
大鼠皮肤成纤维细胞在五组皮肤支架表面的生长情况如图3;图中A1-E1为 Live/Dead染色40×;A2-E2为Live/Dead染色100×;A3-E3扫描电镜(SEM) 3000×;细胞与皮肤支架共培养3d后,其在各组皮肤支架表面均能较好地粘附与生长,其中3%组细胞数量多于另外四组;扫描电镜:细胞与皮肤支架共培养3d时,细胞能在皮肤支架表面粘附与生长;
CCK-8检测细胞的增殖水平如附图4,在第1d时,0%组细胞增殖率(0.47± 0.04)显著高于1%组(0.39±0.02,P=0.045)、3%组(0.39±0.01,P=0.035)、 5%组(0.38±0.02,P=0.032)、10%组(0.39±0.02,P=0.032),且1%、3%、 5%、10%四组之间差异无统计学意义(P>0.05);在第2d时,0%组细胞增殖率 (0.54±0)显著高于1%组(0.41±0.02,P<0.001)、3%组(0.4±0.02, P<0.001)、5%组(0.41±0.01,P<0.001)、10%组(0.42±0.01,P<0.001),且1%、3%、5%、10%四组之间差异无统计学意义(P>0.05);在第3d时,3%组细胞增殖率(0.85±0.05)显著高于0%组(0.74±0.01,P=0.022)、1%组(0.74±0.05,P=0.048)、5%组(0.7±0.05,P=0.020)、10%组(0.56± 0.04,P=0.002)。
本发明皮肤支架羟脯氨酸的分泌水平
上述检测细胞的增殖情况的同时检测羟脯氨酸的分泌水平,羟脯氨酸的分泌水平如附图5,细胞与皮肤支架共培养1、2和3d,在第1d时,0%组羟脯氨酸分泌量(2.51±0.03μg/ml)显著低于3%组(2.73±0.06μg/ml,P=0.006)、 5%组(2.77±0.12μg/ml,P=0.020);在第2d时,0%组羟脯氨酸分泌量(4.21 ±0.1μg/ml)显著低于1%组(5.19±0.28μg/ml,P=0.005)、3%组(5.13 ±0.23μg/ml,P=0.003)、5%组(4.79±0.33μg/ml,P=0.043)、10%组(5.11±0.1μg/ml,P<0.001);在第3d时,3%组羟脯氨酸分泌量(6.24 ±0.34μg/ml)显著高于0%组(4.93±0.12μg/ml,P=0.003)、1%组(5.66 ±0.17μg/ml,P=0.030)、5%组(5.28±0.17μg/ml,P=0.012)、10%组 (5.34±0.41μg/ml,P=0.042)。
本发明皮肤支架IL-6的表达水平
上述检测细胞的增殖情况的同时检测IL-6的表达水平,IL-6的表达水平如附图6,细胞与皮肤支架共培养1、2和3d,在第1d时,10%组IL-6表达水平 (56.21±8.04pg/ml)显著低于0%组(141.77±16.19pg/ml,P=0.001)、 1%组(150.32±0.69pg/ml,P<0.001)、3%组(136.77±15.03pg/ml, P=0.001)、5%组(116.99±10.12pg/ml,P=0.001);在第2d时,0%组IL-6 表达水平(177.88±8pg/ml)显著高于3%组(146.66±14.51pg/ml,P=0.031)、 5%组(136.32±4.91pg/ml,P=0.002)、10%组(127.21±3.34pg/ml,P <0.001);1%组(158.66±11.86pg/ml)IL-6表达水平高于5%组(136.32± 4.91pg/ml,P=0.040)、10%组(127.21±3.34pg/ml,P=0.011);在第3d 时,3%组IL-6表达水平(165.1±1.73pg/ml)显著低于0%组(231.21±10.59 pg/ml,P<0.001)、1%组(180.77±2.08pg/ml,P<0.001),但高于10%组 (142.54±1.54pg/ml,P<0.001)。
所以,使用SA、明胶和芍药苷作为生物墨水,可以获得较为理想的皮肤支架,虽然在宏观方面无法区分五组支架,但在微观结构上,芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量和之比3%的皮肤支架较其他四组明显光滑,这种结构方面的差异,也进一步影响了细胞的生长粘附,我们也证实了3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架组较另外四组更加适宜细胞的生长。
羟脯氨酸是构成结缔组织中胶原蛋白的主要成分之一,在促进糖尿病足溃疡创面修复的过程中发挥着极其重要的作用,胶原蛋白具有促进创面修复,维持新生肉芽组织弹性和强度等功能,胶原蛋白具有低免疫原性、良好的生物相容性,其量的多少直接影响糖尿病足溃疡创面的修复过程,3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架组羟脯氨酸分泌量显著高于其余四组,这与前面证实的3%芍药苷-SA- 明胶皮肤支架更适宜细胞的生长结果一致;另外,这也与芍药苷的药物浓度有关,随着芍药苷累积释放量的增加,其抗炎作用增强的同时也对细胞产生了一定的杀伤作用,细胞数量的多少是影响羟脯氨酸释放量的因素之一,因此,3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架组皮肤支架具有较高的生物相容性,并且可以促进胶原蛋白的分泌,从而加速糖尿病足溃疡创面的愈合。
IL-6是成纤维细胞产生的细胞因子之一,是炎症反应的一个重要指标,在炎症反应过程中起着重要作用,糖尿病足溃疡是严重的炎症反应的结果之一,炎症细胞及炎症因子的浸润导致了创面的难以愈合,10%芍药苷-SA-明胶皮肤支架的IL-6表达水平显著低于其余四组,这说明芍药苷可以很好的抑制IL-6的释放,减轻局部炎症反应水平,但其细胞毒性也随着芍药苷药物浓度的增加而增大,3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架在降低局部炎症反应的同时具有较低的细胞毒性,可以有效抑制支架局部的炎症反应,降低炎症因子水平,从而加快糖尿病足溃疡创面的修复。
总之,由于糖尿病足溃疡创面愈合是一个极其复杂的过程,包括抑制炎症反应、胶原蛋白沉积、新生表皮成纤维细胞的增殖、血运重建等,针对影响糖尿病足溃疡修复的主要因素进行了相应的体外研究,3%芍药苷-SA-明胶皮肤支架可以促进成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的释放,同时可以有效抑制炎症反应,可以为糖尿病足溃疡创面修复提供一种理想的皮肤支架。
以上述依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (6)
1.一种皮肤支架,具有生物3D打印的立体网格结构,其特征是:所述支架的组成物质包括重量百分比10~35%的海藻酸盐、60~85%的明胶和0.5~10%的芍药苷。
2.根据权利要求1所述的皮肤支架,其特征是:所述芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和的比值为0.03。
3.根据权利要求1所述的皮肤支架,其特征是:所述的海藻酸盐为海藻酸钠。
4.一种如权利要求1至3任一所述皮肤支架的制备方法,其特征是:具有如下过程:
a.生物墨水的制备:将0.5~10重量份的芍药苷完全溶解于400~850重量份的去离子水中,然后加入10~35重量份的海藻酸盐粉末和60~85重量份的明胶颗粒,30~50℃搅拌0.5~4小时,制成生物3D打印墨水;
b.立体网格3D打印:使用生物3D打印机,将步骤a制成的生物墨水加入热熔针筒中,针筒加热至40~45℃,然后调节为37℃恒温,向打印机输入所需形成的网格的参数打印出含水的芍药苷-海藻酸盐-明胶皮肤支架;
c.水份的去除:将含水的皮肤支架在负温度和抽真空环境中去除水份,得到成品的皮肤支架。
5.根据权利要求4所述的皮肤支架的制备方法,其特征是:所述步骤a中芍药苷重量与海藻酸盐和明胶两者重量之和的比值为0.03。
6.根据权利要求4所述的皮肤支架的制备方法,其特征是:所述步骤a中海藻酸盐粉末为海藻酸钠粉末。
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