CN114075589A - 黄牛骨多肽矿物质螯合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种黄牛骨多肽矿物质螯合物、制备方法及应用，方法包括：原料预处理：牛骨切块、烘干、粉碎、过筛，过筛后得到的牛骨粉加入正己烷，在40℃下进行脱脂；黄牛骨蛋白的制备：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比加入蒸馏水、再经过碱液提取、酸液沉淀、冷冻干燥，得到黄牛骨蛋白粉；蛋白多肽粉制备：称取适量黄牛骨蛋白粉，按料液比添加蒸馏水，经过酶解、沸水灭酶、冷却后离心，得到多肽液，并经过冷冻干燥得到多肽粉；多肽矿物质螯合物制备：将上述多肽粉溶于去离子水、调节pH、加入矿物质元素经过水浴加热、醇沉、离心得到的沉淀进行冷冻干燥，得到多肽螯合物粉末。本发明的黄牛骨清、球蛋白多肽与钙、铁离子螯合程度好，具有较强的抗氧化作用。
Description
技术领域
本发明涉及多肽矿物质螯合技术领域，具体涉及一种黄牛骨多肽矿物质螯合物、制备方法及应用。
背景技术
随着中国畜禽养殖产业的兴盛，其副产物的产量也随之增加。2018年，我国肉类总产量高达8624.63万吨，畜禽骨作为肉制品加工行业的主要副产物，约占动物体重的25％，是一种量大且营养丰富的天然资源。我国已成为世界上畜类生产消费大国，每年约有上千吨的各类畜禽骨产生。由于处理不当会造成环境的污染，同时给经济带来较大的负担。我国畜禽骨大多被丢弃或加工低价值产品，在综合利用方面还处于一个较低水平，不足1％，有大量的资源尚未被开发利用。因此对畜禽骨进行适当的处理，不仅可以提高畜禽骨的利用率，而且还可避免环境污染。
延边黄牛作为我国五大地方良种牛之一，产于延边朝鲜族自治州，体格高大健壮、适应性强、耐寒耐粗饲、遗传性稳定、产肉性能好。目前，其主要分布于吉林省、辽宁省及黑龙江省等，约有20万头以上，是国家资源保护品种，也是延边朝鲜族自治州优质特色生态畜牧业经济的核心产业。延边黄牛骨中富含脂肪、蛋白质、矿物质等人体必需营养元素，其中蛋白含量约占23％。目前，与牛骨相关的研究主要集中在初加工及相关产品研发等方面，金国通过对延边黄牛骨加工工艺的优化，制得延边黄牛浓骨汤；以牛骨粉为原料通过感官评定确定最优配方，制得牛骨粉咀嚼片。但其精深加工研究较少，研究前景十分广阔。
多肽螯合钙在胃肠道环境中有较好的稳定性，可促进胃肠道对钙离子吸收。螯合后可显著改善Caco-2细胞单层钙的转运，逆转磷酸盐和植酸盐对钙吸收的抑制作用。目前对畜禽骨的开发及利用度还存在局限性，动物骨没有被很好的利用，造成资源的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种黄牛骨多肽矿物质螯合物、制备方法及应用，以解决现有技术中资源浪费的问题，充分利用其中的资源可有效提高其综合价值，还可以实现变废为宝，并促进畜禽业、渔业等的可持续发展。
为实现上述目的，本发明提出黄牛骨多肽矿物质螯合物的制备方法，包括：
原料预处理：牛骨切块、烘干、粉碎、过筛，过筛后得到的牛骨粉加入正己烷，在40℃下进行脱脂；
黄牛骨蛋白的制备：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比加入蒸馏水、再经过碱液提取、酸液沉淀、冷冻干燥，得到黄牛骨蛋白粉；
蛋白多肽粉制备：称取适量黄牛骨蛋白粉，按料液比添加蒸馏水，经过酶解、沸水灭酶、冷却离心，得到多肽液，并经过冷冻干燥得到多肽粉；
多肽矿物质螯合物制备：将上述多肽粉溶于去离子水、调节pH、加入矿物质元素经过水浴加热、醇沉、离心得到的沉淀进行冷冻干燥，得到多肽螯合物粉末。
优选地，所述黄牛骨蛋白的制备包括清蛋白粉的制备和球蛋白粉制备，其中，所述清蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取上清液，调pH至4.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨清蛋白粉；
所述球蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取沉淀按料液比为1:10加入2％NaCl溶液，混匀后pH调至10.5，提取温度为 45℃，放置摇床提取，离心，取上清液，调pH至3.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨球蛋白粉。
优选地，所述蛋白多肽粉制备包括：清蛋白多肽制备：称取黄牛骨清蛋白粉，按1:20的料液比添加蒸馏水，加入碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为45℃，蛋白酶添加量为5％，沸水浴灭酶10min，冷却至室温后，转数为5000rpm，离心10min，取上清液，经过冷冻干燥得到清蛋白多肽粉。
优选地，所述蛋白多肽粉制备包括：球蛋白多肽制备：称取黄牛骨球蛋白粉，按1:20的料液比添加蒸馏水，加入碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为50℃，蛋白酶添加量为5％，沸水浴灭酶10min，冷却至室温后，转数为5000rpm，离心10min，取上清液，经过冷冻干燥得到球蛋白多肽粉。
优选地，所述多肽矿物质螯合物包括清蛋白多肽螯合钙或清蛋白多肽螯合钙，其中，所述清蛋白多肽螯合钙的制备包括：将所述清蛋白多肽粉与无水氯化钙按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度60℃，pH值为8，螯合时间为 40min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得清蛋白多肽螯合钙；
所述清蛋白多肽螯合铁的制备包括：将所述清蛋白多肽粉与氯化亚铁按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度40℃，pH值为7，螯合时间为45min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得清蛋白多肽螯合铁。
优选地，所述多肽矿物质螯合物包括球蛋白多肽螯合钙或球蛋白多肽螯合钙，其中，所述球蛋白多肽螯合钙的制备包括：将所述球蛋白多肽粉与氯化钙按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度60℃，pH值为8，螯合时间为40min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得球蛋白多肽螯合钙；
所述球蛋白多肽螯合铁的制备包括：将所述球蛋白多肽粉与氯化亚铁按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度40℃，pH值为7，螯合时间为45min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得球蛋白多肽螯合铁。
本发明还提供一种黄牛骨多肽矿物质螯合物黄牛骨多肽矿物质螯合物，由上述实施例所述方法制备得到。
优选地，黄牛骨多肽矿物质螯合物含有17种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸。
优选地，黄牛骨多肽矿物质螯合物，包括：
清蛋白多肽螯合钙，粒径为35.83μm；
清蛋白多肽螯合铁，粒径为33.81μm；
球蛋白多肽螯合钙，粒径为42.76μm；或
球蛋白多肽螯合铁，粒径为39.45μm。
本发明还公开一种牛骨多肽矿物质螯合物在抗氧化作用中的应用，牛骨多肽矿物质螯合物由上述实施例所述方法制备得到。
本发明的有益效果是：
根据本发明实施例的黄牛骨多肽矿物质螯合物，黄牛骨清、球蛋白多肽与钙、铁离子螯合程度均较好，并具有一定的抗氧化作用，可提高多肽的营养价值以及其副产品的利用价值，同时充分利用其中的资源可有效提高其综合价值，还可以实现“变废为宝”，并促进畜禽业、渔业等的可持续发展。
附图说明
图1是本发明的4种蛋白酶酶解清蛋白(A)、球蛋白(B)产物的水解度；
图2是本发明的料液比对清蛋白、球蛋白水解度的影响的曲线图；
图3是本发明的酶添加量对清蛋白、球蛋白水解度的影响的曲线图；
图4是本发明的温度对清蛋白、球蛋白水解度的影响的曲线图；
图5是本发明的采用原子吸收分光光度计测得矿物质(Ca、Fe)含量，四种多肽矿物质螯合率柱状图；
图6是本发明的多肽矿物质螯合物得率是通过螯合前两者质量之和与螯合后形成螯合物后的质量变化所得，其四种多肽矿物质螯合物得率的柱状图；
图7是本发明的AP、AP-Ca、AP-Fe傅里叶红外光谱扫描图；
图8是本发明的GP、GP-Ca、GP-Fe傅里叶红外光谱扫描图；
图9是本发明的AP、AP-Ca、AP-Fe、GP、GP-Ca、GP-Fe扫描电子显微镜图；
图10是本发明的多肽及多肽矿物质螯合物粒径柱状图；
图11是本发明的多肽及多肽矿物质螯合物ABTS+·清除率柱状图；
图12是本发明的多肽与多肽矿物质螯合物DPPH·的清除率柱状图，
图13是本发明的多肽与多肽矿物质螯合物羟自由基清除率柱状图
图14是本发明的多肽及多肽矿物质螯合物的总氧自由基捕获抗氧化参数的柱状图
图15是本发明的多肽及多肽矿物质螯合物的还原能力的柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下面对本发明的黄牛骨多肽矿物质螯合物的制备方法的各步骤进行描述
根据本发明实施例的黄牛骨多肽矿物质螯合物的制备方法，包括：
步骤1，原料预处理：将牛骨先用切骨机进行切块，于50℃烘干，用高速粉碎机进行粉碎，过筛，放置4℃保存，备用；粉碎后牛骨粉按一定比例加入正己烷，在40℃下进行脱脂。本发明中牛骨为延边黄牛骨。
本发明还包括对蛋白分级提取，利用Osborne法进行蛋白分级。称取脱脂后牛骨粉，加入10倍体积的水于40℃摇床120min，离心(10000rpm，30min)，取上清液A，放置4℃保存，备用；在沉淀A中加入10倍体积的2％NaCl溶液于40℃摇床120min，离心(4000rpm，30min)，取上清液B，放置4℃保存，备用；在沉淀B中加入10倍体积的75％乙醇溶液于40℃摇床120min，离心(4000rpm，30min)，取上清液C放置4℃保存，备用；在沉淀C中加入 10倍体积0.01mol/L的NaOH溶液于40℃摇床120min，离心(4000rpm，30 min)，取上清液D放置4℃保存，备用。采用考马斯亮蓝法分别测定上清液中蛋白质的含量。其中，清蛋白含量为20.0±1.2mg/g；球蛋白含量为10.0±3.0 mg/g；醇溶蛋白含量为7.0±1.0mg/g；碱溶蛋白含量为8.0±3.0mg/g。因此本发明主要制备含量高的清蛋白和球蛋白。
步骤2，黄牛骨蛋白的制备：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比加入蒸馏水、再经过碱液提取、酸液沉淀、冷冻干燥，得到黄牛骨蛋白粉。
称取适量脱脂牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取120min，第一次离心(10000rpm，15min)，取上清液，调pH至4.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心(5000rpm，10min)，取沉淀冷冻干燥制成延边黄牛骨清蛋白粉，备用。
在第一次离心后获得沉淀，并按料液比为1:10加入2％NaCl溶液，混匀后pH调至10.5，提取温度为45℃，放置摇床提取90min，离心(5000rpm， 15min)，取上清液，调pH至3.5，于4℃酸沉过夜，离心(5000rpm，10min)，取沉淀冷冻干燥制成延边黄牛骨球蛋白粉，备用。
步骤3，蛋白多肽粉制备：称取适量黄牛骨蛋白粉，按料液比添加蒸馏水，经过酶解、沸水灭酶、冷却离心，得到多肽液，并经过冷冻干燥得到多肽粉。
其中，所述清蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10 加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取上清液，调pH至4.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨清蛋白粉(Albuminpolypeptide，AP)；
球蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取沉淀按料液比为1:10加入2％NaCl溶液，混匀后pH调至10.5，提取温度为45℃，放置摇床提取，离心，取上清液，调pH至3.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨球蛋白粉(Globulinpolypeptides，GP)。
下面对于条件的筛选过程进行描述。
(1)对于蛋白酶的筛选
称取适量延边黄牛骨清蛋白、球蛋白，按1:20的料液比添加蒸馏水，分别添加不同种类的蛋白酶，在其最佳酶解条件下进行酶解(如下表1所示)，沸水浴10min，冷却至室温后进行离心(5000rpm，10min)，取上清液，通过水解度大小选择蛋白酶种类。
表1 蛋白酶最适条件
延边黄牛骨清蛋白、球蛋白，通过水解度大小选择蛋白酶种类。结果如图 1所示,(A)为蛋白酶酶解清蛋白的水解度,(B)为球蛋白产物的水解度。
由图1中的(A)可知不同的蛋白酶对延边黄牛骨清蛋白水解性能差异较大，随时间延长水解度也随之增大，且符合蛋白酶反应过程曲线。酶解时间在 0～30min增长幅度最大，是由于蛋白酶在酶解的过程初期水解速度比较快所导致，酶解时间在30～180min，碱性蛋白酶与复合蛋白酶的水解度呈上升趋势，中性蛋白酶与胰蛋白酶则趋势变化不明显。碱性蛋白酶180min水解度最高、复合蛋白酶210min水解度最高。水解度从大到小顺序：碱性蛋白酶>复合蛋白酶>胰蛋白酶>中性蛋白酶，因此选择碱性蛋白酶为延边黄牛清蛋白最佳蛋白酶，酶解时间180min。
图1中的(B)可知，不同的蛋白酶对延边黄牛球蛋白与清蛋白水解度趋势相近，碱性蛋白酶的水解度整体趋势高于其它三种，因此，同样选择碱性蛋白酶为延边黄牛骨球蛋白的最佳蛋白酶，酶解时间180min。
(2)料液比对水解度的影响
称取适量延边黄牛骨清蛋白、球蛋白分别按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、 1:60料液比添加蒸馏水，混匀。选择碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为40℃，蛋白酶添加量为1％，沸水浴10min，冷却至室温后进行离心(5000 rpm，10min)，取上清液，测定AP、GP的含量，研究料液比对二者水解度的影响。延边黄牛骨清蛋白、球蛋白，料液比对水解度的影响，结果如图2所示。图2表明，随着料液比的增加，水解度呈先增大后减小的趋势。当料液比在 1:10时，水解度较低，这是由于料液比过小导致交联聚合反应所造成的；当料液比在1:20时，水解度最大，主要是因为适量的料液比水解相对彻底；当料液比超过1:20时，由于料液比过大导致底物与蛋白酶接触率低，从而使水解度下降。因此，选择1:20为最佳料液比，此时水解度为20.68％。球蛋白水解度趋势与清蛋白相似，但从1:30之后料液比对水解度的影响差异较小，趋势趋于平缓，同样是由于底物与蛋白酶接触率低所造成，料液比在1:20时，水解度最大。因此，选择1:20为最佳料液比，此时水解度为14.44％。
(3)添酶量对水解度的影响
称取适量延边黄牛骨清蛋白、球蛋白分别按1:20料液比添加蒸馏水，混匀。选择碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为40℃，蛋白酶添加量分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％，沸水浴10min，冷却至室温后进行离心 (5000rpm，10min)，取上清液，测定AP、GP的含量，研究蛋白酶添加量对二者水解度的影响。延边黄牛骨清蛋白、球蛋白，酶添加量对水解度的影响，结果如图3所示。由图3表明，清蛋白水解度随着蛋白酶添加量的增加呈先增加后减小的趋势，蛋白酶添加量为1％～5％时清蛋白水解度增加，蛋白酶添加量为5％时清蛋白水解度最高，当蛋白酶添加量超过5％时清蛋白水解度下降，这是由于酶添加量5％时已使其全部水解，过量添加蛋白酶不仅清蛋白水解度没有增加，反而在成本上有所浪费，因而选择5％为最佳蛋白酶添加量，清蛋白水解度为23.33％；球蛋白在酶添加量的变化趋势与清蛋白的基本相同，酶添加量5％时，水解度最高，因此选择5％的酶添加量作为球蛋白酶解时最适添加量，球蛋白水解度为14.92％。
(4)温度对水解度的影响
称取适量延边黄牛骨清蛋白、球蛋白分别按1:20料液比添加蒸馏水，混匀。选择碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、 50℃、55℃、60℃，酶添加量为5％，沸水浴10min，冷却至室温后进行离心 (5000rpm，10min)，取上清液，测定AP、GP的含量，研究酶解温度对二者水解度的影响。延边黄牛骨清蛋白、球蛋白，酶解温度对水解度的影响，结果如图4所示。由图4可得，清蛋白的水解度在35～45℃之间呈上升趋势，45℃时达到最高，之后随着温度的升高水解度反而下降，是因为蛋白酶对存在最适的温度的作用，温度对蛋白酶的活性影响较大，本试验45℃为最适温度，其水解度为32.29％；球蛋白的温度从35～45℃变化不明显，50℃时水解度达到最高，随后温度的升高水解度并没有随之提高反而下降，这是由于蛋白酶仅在其最适的温度范围内的活性最佳，本试验选择50℃为其最适温度，水解度为 18.34％。
本发明中多肽含量测定方法为利用双缩脲比色法测定，配制1mg/mL GSH为标准溶液，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL标准溶液中，加入蒸馏水至1.0mL，按体积比1:1添加样品溶液与双缩脲试剂A，再加入200μL双缩脲试剂B，混合均匀静置30min，于540nm处进行比色，以GSH的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。多肽含量按上述方法进行测定。
本发明中水解度测定
采用pH-Stat法进行测定，将多肽溶液调至最适pH，反应至结束前需持续加入NaOH标准溶液以维持溶液pH，结束时记录NaOH标准液所消耗的体积，水解度计算公式如2-1所示。
公式中：B为试验中加入碱性液体的体积(mL)；
Nb为碱性液体的浓度(mol/L)；
α为蛋白质中的α-氨基的解离度；
Mp为试验中蛋白质的质量(g)；
htot为底物蛋白肽键总数(mmol/g)为总肽键毫摩尔数/总蛋白含量(清蛋白htot为7.899，球蛋白htot为8.040)。
步骤4，多肽矿物质螯合物制备：将上述多肽粉溶于去离子水、调节pH、加入矿物质元素经过水浴加热、醇沉、离心得到的沉淀进行冷冻干燥，得到多肽螯合物粉末。
其中，清蛋白多肽螯合钙(Albumin polypeptide chelatingcalcium，AP-Ca) 与球蛋白多肽螯合钙(Globulin polypeptides chelating calcium，GP-Ca)的制备如下：取AP、GP分别与CaCl2按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度60℃， pH值为8，螯合时间为40min。螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得AP-Ca、GP-Ca。
清蛋白多肽螯合铁(Albumin polypeptide chelating ferrous，AP-Fe)与球蛋白多肽螯合铁(Globulin polypeptides chelating ferrous，GP-Fe)的制备如下：取 AP、GP分别与FeCl2按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度40℃，pH值为 7，螯合时间为45min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得AP-Fe、GP-Fe。
下面对多肽矿物质螯合物的各项指标测定进行描述。
1、对多肽矿物质螯合率及螯合物得率进行测定。
(1)多肽矿物质螯合率测定
采用原子吸收分光光度计进行矿物质含量测定，计算螯合率公式如(3-1) 所示。
公式中：M1为多肽螯合后矿物质的质量(mg)；
M2为反应溶液中的矿物质质量(mg)。
采用原子吸收分光光度计测得矿物质(Ca、Fe)含量，多肽矿物质螯合率如图5所示。由图5可得，AP-Ca的螯合率为27.65％，GP-Ca的螯合率为24.78％，AP-Fe的螯合率为34.78％，GP-Fe的螯合率为29.89％。其中多肽与铁元素螯合的螯合率均大于钙螯合物。
(2)多肽矿物质螯合物得率
计算多肽矿物质螯合物得率公式如(3-2)所示。
公式中：Ma为多肽矿物质螯合物质量(mg)；
Mb为螯合前多肽质量(mg)；
Mc为螯合前矿物质质量(mg)。
多肽矿物质螯合物得率是通过螯合前两者质量之和与螯合后形成螯合物后的质量变化所得，其螯合物得率如下图6所示。由图6可知，AP-Ca得率为 23.99％，GP-Ca得率为21.03％，AP-Fe得率为41.65％，GP-Fe得率为33.50％。其中多肽与铁元素螯合物得率也均高于多肽与钙螯合物得率。
2、多肽及多肽矿物质螯合物傅里叶红外光谱检测
将适量冻干后多肽及多肽螯合物与100mg干燥溴化钾进行混合，在 4000～400cm-1范围内记录，分辨率为4cm-1，进行傅里叶红外光谱测定。
延边黄牛骨AP、AP-Fe、AP-Ca及GP、GP-Fe、GP-Ca红外光谱图，分别如图7、8所示。
由图7和8所示，AP、GP在与钙、铁离子螯合前后的红外光谱图发生了明显的变化。在特征区：3387.00cm-1处的吸收峰变化主要是因为N-H伸缩振动所导致，AP-Ca的吸收峰由3387.00cm-1蓝移至3406.29cm-1；AP吸收峰在 3387.00cm-1与铁螯合后移到3379.29cm-1；GP-Ca吸收峰由3381.21cm-1蓝移至 3413.00cm-1；GP-Fe的吸收峰由3381.21cm-1蓝移至3414.00cm-1，是因为N-H 被替代成N-Fe、N-Ca产生铵盐，且吸收峰有所增强。在指纹区：1639.49cm-1属于酰胺Ⅰ带，主要是由C＝O的伸缩振动所引起，AP-Ca的吸收峰由1639.49 cm-1红移至1624.06cm-1；AP-Fe的吸收峰由1639.49cm-1蓝移至1654.92cm-1； GP-Ca吸收峰由1631.78cm-1红移至1625.99cm-1；GP-Fe的吸收峰由1631.78cm-1蓝移至1645.28cm-1，是因为螯合过程中，氨基和羰基参与了酰胺键的形成。 1404.18cm-1则属于氨基酸残基的侧链基团-COO-的吸收峰，AP-Ca的吸收峰由1404.18cm-1蓝移至1419.61cm-1；AP-Fe的吸收峰由1404.18cm-1，螯合后移到 1427.32cm-1；GP-Ca的吸收峰由1404.18cm-1蓝移至1419.61cm-1；GP-Fe的吸收峰由1404.18cm-1蓝移至1421.54cm-1，是由于形成了-COO-Ca、-COO-Fe。
此外，AP的吸收峰997.20cm-1、927.76cm-1，GP在997.20cm-1处的吸收峰，与钙、铁离子螯合之后消失，表明多肽中的氨基和羧基均参与了与钙、铁离子的配位，进一步证实了螯合物的形成。
3、多肽及多肽矿物质螯合物扫描电子显微镜分析
为了探究样品的表面形态，对其进行扫描电子显微镜检测。由于样品的导电性不强，将样品进行真空喷金后，采用扫描电子显微镜分析多肽及多肽螯合物的微观形貌并进行观察拍照。AP、AP-Ca、AP-Fe、GP、GP-Ca、GP-Fe的扫描电子显微镜结果，如图9所示。由图3-5可得，在放大的倍数下观察到延边黄牛骨AP-Ca、AP-Fe与GP-Ca、GP-Fe结果相近。AP、GP表面并不光滑且无规律，但AP-Ca、AP-Fe、GP-Ca、GP-Fe的表面有许多游离的钙、铁球状体吸附在其表面，推测此类球状体为钙、铁晶体，二者均呈多孔状，AP-Ca、 GP-Ca结构较为疏松，AP-Fe、GP-Fe结构较为密集。这是由于多肽与钙、铁离子通过离子健、配位键的结合所形成小颗粒的聚集，因此，扫描电子显微镜再次证实了多肽矿物质螯合物的形成。
4、多肽及多肽矿物质螯合物氨基酸组成检测
氨基酸分析样品前处理根据国标(GB5009.124—2016)，通过全自动氨基酸分析仪对其组成进行测定。AP、AP-Ca、AP-Fe的氨基酸组成，如表2所示。
表2 AP、AP-Ca、AP-Fe氨基酸组成表
(单位：g/100g)
注：a.必需氨基酸、b.半必需氨基酸、c.非必需氨基酸；d.亲水性、e.疏水性； f.碱性、g.酸性。
GP、GP-Ca、GP-Fe的氨基酸组成，如表3所示。
表3GP、GP-Ca、GP-Fe氨基酸组成表
(单位：g/100g)
注：a.必需氨基酸、b.半必需氨基酸、c.非必需氨基酸；d.亲水性、e.疏水性； f.碱性、g.酸性。
由表2和表3可得，通过全自动氨基酸分析仪测得延边黄牛骨中AP、GP、 AP-Ca、AP-Fe、GP-Ca、GP-Fe均含有17种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸，高温强酸的条件下会对氨基酸造成一定的破坏，未检测出色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。螯合前后进行对比，发现氨基酸营养价值变化不大。
5、多肽及多肽矿物质螯合物粒径分布检测
采用激光粒度分布仪来测量样品粒径大小，使用超纯水清洗数次样品池直至玻璃清晰。将经处理的待测样品用移液枪缓慢加入样液池中，至浓度在 50～85％范围内，样品扫描3次。多肽和多肽矿物质螯合物的粒径分布情况如图10所示。由图10可得，AP粒径为28.81μm、AP-Ca粒径为35.83μm、AP-Fe 粒径为33.81μm、GP粒径为34.03μm、GP-Ca粒径为42.76μm，GP-Fe粒径为 39.45μm。与螯合前多肽相比螯合后的粒径大小显著增大(P<0.05)，这是由于小分子肽与矿物质钙和铁相结合，并且自身也有结合所导致。
本发明还公开牛骨多肽矿物质螯合物在抗氧化作用中的应用，具体通过以下几个方面进行测定。
1、多肽及多肽矿物质螯合物对清除ABTS+·活性测定
配制不同浓度的多肽、多肽矿物质螯合物及Vc溶液，测定其对ABTS+·清除率。ABTS溶液在使用前需要用磷酸缓冲液稀释，734nm波长处的吸光值在0.700±0.020范围内即可作为ABTS工作液。向96孔板中加入50μL不同质量浓度的样品溶液及对照品溶液，分别加入100μL ABTS工作液，室温避光反应3～5min，利用酶标仪于734nm处测定其吸光值，按公式(4-1)进行计算。
公式中：AB表示样品与ABTS+·的吸光值；
Ak表示空白组蒸馏水吸光值；
A734表示ABTS工作液的吸光值。
多肽及多肽矿物质螯合物ABTS+·清除率，如图11所示。通过各个样品的 ABTS+·清除率制得的拟合方程并计算其IC50值，如表4所示。
表4 ABTS+·清除率拟合方程及IC50值
从图11看出，螯合前后都随着其浓度增加，ABTS+·清除率有不同程度上升，并呈现出一定剂量效应关系。AP-Ca、AP-Fe的ABTS+·清除能力显著强于 AP(P<0.05)。除50μg/mL浓度外，GP-Ca、GP-Fe的ABTS+·清除能力显著强于GP(P<0.05)。此外，AP-Fe、GP-Fe的螯合物ABTS+·清除能力均显著高于 AP-Ca、GP-Ca的螯合物(P<0.05)。
由表4可得，经过比较IC50值AP-Fe、GP-Fe对ABTS+·的清除能力最强，但弱于Vc，其次清除能力较强的是GP-Ca、AP-Ca，由此可得，螯合后清除ABTS+·能力比螯合前强。
2、多肽及多肽矿物质螯合物对清除DPPH·活性测定
配制不同浓度的多肽、多肽矿物质螯合物及Vc溶液，测定其对DPPH·清除率。DPPH储备液，使用前需要稀释，517nm波长处的吸光值在0.700± 0.020范围内即可作为DPPH工作液。向96孔板中加入100μL不同质量浓度的样品溶液及对照的样品溶液，之后在分别加入100μL DPPH工作液，室温避光反应30min，利用酶标仪于517nm处测定其吸光值。按公式(4-2)进行计算。
公式中：AD表示样品与DPPH·吸光值；
AK表示空白组蒸馏水吸光值；
A517表示DPPH工作液的吸光值。
多肽与多肽矿物质螯合物DPPH·的清除率，如图12所示。从图12看出，螯合前后都随着其浓度增加，DPPH·清除率有不同程度上升，并呈现出一定剂量效应关系。AP、GP的螯合物DPPH·清除能力均显著强于其本身(P<0.05)。同时，除650μg/mL浓度外，AP-Fe、GP-Fe的螯合物DPPH·清除能力均显著高于AP-Ca、GP-Ca的螯合物(P<0.05)。
通过对DPPH·的清除率拟合方程及并计算IC50值，如表5所示。
表5 DPPH·清除率拟合方程及IC50值
由表5发现，IC50值清除DPPH·的能力顺序依次为：Vc>GP-Fe>AP-Fe> GP-Ca>AP-Ca>GP>AP。由此可得，螯合后比螯合前清除率高，多肽螯合铁的清除能力强于多肽螯合钙，且GP与铁螯合后略强于AP-Fe。
3、多肽及多肽矿物质螯合物对羟自由基清除能力的测定
配制不同浓度的多肽、多肽矿物质螯合物及Vc溶液，测定其对羟自由基清除能力。取500μL不同质量浓度的样品溶液及对照的样品溶液，加入500μL 硫酸亚铁溶液，再加入1mL稀释100倍后的过氧化氢溶液，混匀后静置反应 10min，最后加入500μL稀释10倍的水杨酸溶液，37℃水浴30min，离心(5000 rpm，10min)。取上清液向96孔板中加入200μL，利用酶标仪于510nm处测定其吸光值。按公式(4-3)进行计算。
公式中：AO表示空白组蒸馏水的吸光值；
Ai表示样品的吸光值。
多肽与多肽矿物质螯合物羟自由基清除率，如图13所示。从图13可知，螯合前后都随着其浓度增加，清除率有不同程度上升，并呈现出一定剂量效应关系。除30mg/mL浓度外，AP-Ca、AP-Fe的羟自由基清除能力均显著强于 AP(P<0.05)。GP-Ca、GP-Fe的羟自由基清除能力显著强于GP(P<0.05)。此外，除15mg/mL、30mg/mL浓度外，AP-Fe、GP-Fe的螯合物羟自由基清除能力均显著高于AP-Ca、GP-Ca的螯合物(P<0.05)。
通过各个样品的羟自由基清除率求得拟合方程，计算IC50值，如表7所示。
表7 羟自由基清除能力拟合方程及IC50值
表7可得，IC50值经过比较发现多肽及多肽矿物质螯合物对羟自由基的清除能力最强的是Vc，其次是GP-Fe、AP-Fe、GP-Ca、AP-Ca，较弱的清除能力是GP、AP。因此，螯合后均具有较高的清除能力，螯合铁后的清除能力较强于螯合钙后的物质，且GP-Fe的清除能力强于AP-Fe。
4、多肽及多肽矿物质螯合物对总氧自由基捕获抗氧化测定
配制不同浓度的多肽、多肽矿物质螯合物及Vc溶液，测定其对总氧自由基捕获抗氧化参数。取85μL不同质量浓度的样品溶液及对照的样品溶液，再加入5mL混合溶液置于各试管中，25℃水浴15min，测定734nm波长处的吸光值。空白组为醋酸缓冲液，标准参照为1mmol/L Vc溶液。按公式(4-4) 计算总氧自由基捕获抗氧化参数TRAP值。
公式中：AQ表示样品的吸光值；
AX表示空白组的吸光值；
AV表示Vc的吸光值；
Cv表示Vc盐浓度(μg/mL)；
TRAP值相当于多少mmol/L Vc。
多肽及多肽矿物质螯合物的总氧自由基捕获抗氧化参数，如图14所示。由图14可知，多肽及多肽矿物质螯合物的TRAP值随着质量浓度的增加而升高，并呈现一定的剂量效应关系。GP-Fe、AP-Fe、GP-Ca、AP-Ca各浓度下的TRAP值均显著高于AP、GP(P<0.05)，GP-Fe、AP-Fe的TRAP值显著高于 GP-Ca、AP-Ca(P<0.05)，且GP-Fe的TRAP值显著大于AP-Fe(P<0.05)。
5、多肽及多肽矿物质螯合物对铁离子还原能力的测定
配制不同浓度的多肽、多肽矿物质螯合物及Vc溶液，测定其对铁离子的还原能力。试管中加入500μL样品溶液，向各试管中加入2mL的磷酸盐缓冲溶液和2mL铁氰化钾溶液，混匀，水浴50℃，20min，将其迅速冷却加入2mL 三氯乙酸溶液，充分混匀，离心(4000rpm，10min)。取2mL上清液，加入 500μL三氯化铁溶液与2mL蒸馏水，混合均匀后静置10min，测定在700nm 波长处吸光值为A样，用蒸馏水代替样品溶液，测定吸光值为A空，吸光值越大表明铁离子总还原力越强，按公式(4-5)计算。
铁离子还原力＝A样-A空 (4-5)
公式中：A样表示样品的吸光值；
A空表示空白对照蒸馏水的吸光值。
多肽及多肽矿物质螯合物的还原能力，如图15所示。由图15可知，延边黄牛骨多肽及多肽矿物质螯合物对铁离子的还原能力较强，并随着浓度的增加，还原力也有所上升，AP-Ca、AP-Fe、GP-Fe、GP-Ca铁离子还原能力显著强于 AP、GP(P<0.05)，且GP-Fe、AP-Fe的还原能力均显著强于GP-Ca、AP-Ca (P<0.05)。
由此可见，本发明中的黄牛骨多肽及多肽矿物质螯合物均有较强的抗氧化能力，且螯合后的抗氧化作用较螯合前更好。
在本申请的另一个实施例中，根据抗氧化效果对，抗氧化较好的GP-Fe 进一步优化，经过正交试验优化GP-Fe的制备，具体制备过程可以为，按照 GP与FeCl2按质量比为3:1溶于去离子水，螯合温度50℃，pH值为8.5，螯合时间为25min，螯合时间为25min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得GP-Fe，GP-Fe螯合率可达74.39％。具体可见表2的正交实验结果。
表2 正交试验结果
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种黄牛骨多肽矿物质螯合物的制备方法，其特征在于，包括：
原料预处理：牛骨切块、烘干、粉碎、过筛，过筛后得到的牛骨粉加入正己烷，在40℃下进行脱脂；
黄牛骨蛋白的制备：称取脱脂后的所述牛骨粉，按料液比加入蒸馏水、再经过碱液提取、酸液沉淀、冷冻干燥，得到黄牛骨蛋白粉；
蛋白多肽粉制备：称取适量所述黄牛骨蛋白粉，按料液比添加蒸馏水，经过酶解、沸水灭酶、冷却后离心，得到多肽液，并经过冷冻干燥得到多肽粉；
多肽矿物质螯合物制备：将上述所述多肽粉溶于去离子水、调节pH、加入矿物质元素经过水浴加热、醇沉、离心得到的沉淀进行冷冻干燥，得到多肽螯合物粉末。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黄牛骨蛋白的制备包括清蛋白粉的制备和球蛋白粉制备，其中，
所述清蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取上清液，调pH至4.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨清蛋白粉；
所述球蛋白粉的制备包括：称取脱脂后的牛骨粉，按料液比1:10加入蒸馏水，混匀后pH调至10，提取温度为45℃，放置摇床提取，第一次离心，取沉淀按料液比为1:10加入2％NaCl溶液，混匀后pH调至10.5，提取温度为45℃，放置摇床提取，离心，取上清液，调pH至3.5，于4℃酸沉过夜，第二次离心，取沉淀进行冷冻干燥，制成黄牛骨球蛋白粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白多肽粉制备包括：
清蛋白多肽制备：称取黄牛骨清蛋白粉，按1:20的料液比添加蒸馏水，加入碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为45℃，蛋白酶添加量为5％，沸水浴10min，冷却至室温后，转数为5000rpm，离心10min，取上清液，经过冷冻干燥得到清蛋白多肽粉。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白多肽粉制备包括：
球蛋白多肽制备：称取黄牛骨球蛋白粉，按1:20的料液比添加蒸馏水，加入碱性蛋白酶，酶解时间为180min，酶解温度为50℃，蛋白酶添加量为5％，沸水浴10min，冷却至室温后，转数为5000rpm，离心10min，取上清液，经过冷冻干燥得到球蛋白多肽粉。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多肽矿物质螯合物包括清蛋白多肽螯合钙或清蛋白多肽螯合钙，其中，所述清蛋白多肽螯合钙的制备包括：
将所述清蛋白多肽粉与无水氯化钙按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度60℃，pH值为8，螯合时间为40min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得清蛋白多肽螯合钙；
所述清蛋白多肽螯合铁的制备包括：
将所述清蛋白多肽粉与氯化亚铁按质量比为(2-3):1溶于去离子水，螯合温度40℃，pH值为7，螯合时间为45min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得清蛋白多肽螯合铁。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多肽矿物质螯合物包括球蛋白多肽螯合钙或球蛋白多肽螯合钙，其中，所述球蛋白多肽螯合钙的制备包括：
将所述球蛋白多肽粉与无水氯化钙按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度60℃，pH值为8，螯合时间为40min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得球蛋白多肽螯合钙；
所述球蛋白多肽螯合铁的制备包括：
将所述球蛋白多肽粉与氯化亚铁按质量比为2:1溶于去离子水，螯合温度40℃，pH值为7，螯合时间为45min，螯合后将其取出冷却至室温，加入9倍体积的无水乙醇进行醇沉后离心，沉淀进行冷冻干燥，制得球蛋白多肽螯合铁。
7.一种黄牛骨多肽矿物质螯合物，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的黄牛骨多肽矿物质螯合物，其特征在于，含有17种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸。
9.根据权利要求7所述的黄牛骨多肽矿物质螯合物，其特征在于，包括：
清蛋白多肽螯合钙，粒径为35.83μm；
清蛋白多肽螯合铁，粒径为33.81μm；
球蛋白多肽螯合钙，粒径为42.76μm；或
球蛋白多肽螯合铁，粒径为39.45μm。
10.一种牛骨多肽矿物质螯合物在抗氧化作用中的应用，其特征在于，所述牛骨多肽矿物质螯合物由上述权利要求1-6任一项所述方法制备得到。
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| GR01 | Patent grant | ||
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