CN114047331A - 一种过敏性紫癜的标志物及其应用 - Google Patents

一种过敏性紫癜的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种过敏性紫癜的标志物及其应用。该标志物包括Ezrin蛋白、补体C4‑A前体、微管蛋白和纤维蛋白原α链前体1亚型中的至少一种。本发明筛选得到了Ezrin蛋白、补体C4‑A前体(C4A)、微管蛋白(TUBB)和纤维蛋白原α链前体1亚型(FGA)作为儿童过敏性紫癜新的标志物。

Description

一种过敏性紫癜的标志物及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过敏性紫癜的标志物及其应用。
背景技术
过敏性紫癜(HSP)，也被称为免疫球蛋白A(IgA)血管炎，是儿童最常见的全身性血管炎，通常表现为可触及的紫癜、胃肠道疼痛、关节疼痛和肾小球肾炎，报告的发病率为每年3～27/10万，且存在种族差异。特征性的皮肤变化是HSP诊断的主要基础，但皮疹是多形性的，包括出血性、大斑疹和荨麻疹。HSP可引起多器官损伤，消化系统损伤通常表现为腹痛，特别是剑突下和脐周围，伴有呕吐和血便。以腹痛为第一症状，无皮肤紫癜，早期诊断很困难，需要与急性腹部疾病、急性胃肠炎等疾病区分，而复杂的消化道出血需要与溃疡、出血性坏死性肠炎区分。由于临床表现缺乏特异性和辅助检查，很容易被误诊。
虽然大多数HSP症状是自限性的，但永久性肾损伤是最严重的并发症，约20％的患者在确诊20年后发展为慢性肾脏疾病。HSP的长期预后主要取决于肾受累的严重程度，称为过敏性紫癜性肾炎(HSPN)。肾脏受累程度的检出率与检查方法有关。肾活检是诊断的金标准，但由于其创伤性，很少用于早期诊断。如果诊断仅基于早期的临床尿液变化，则HSPN的检出率发生在30％-50％的HSP儿童中，但研究显示在过敏性紫癜早期进行肾活检，约90％左右的患者存在病理改变。HSPN通常发生在HSP诊断后1个月内，平均时间为14天，也有报道称，发病1年后肾损伤高达35％。准确的诊断是判断疾病状态和采取适当治疗的先决条件。早期和适当的治疗将决定疾病的预后。因此，迫切需要识别新的、临床有用的HSP生物标志物，以增强目前的诊断和判断预后能力。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种儿童过敏性紫癜的标志物及其应用，筛选得到了Ezrin蛋白、补体C4-A前体(C4A)、微管蛋白(TUBB)和纤维蛋白原α链前体1亚型(FGA)作为过敏性紫癜新的标志物。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种过敏性紫癜的标志物，该标志物包括Ezrin蛋白、补体C4-A前体、微管蛋白(TUBB)和纤维蛋白原α链前体1亚型(FGA)中的至少一种。
进一步地，标志物为Ezrin蛋白。
检测标志物的试剂在制备诊断和/或预后检测过敏性紫癜的产品中的应用，该标志物包括Ezrin蛋白、补体C4-A前体和纤维蛋白原α链前体1亚型中的至少一种。
进一步地，产品包括试剂盒和芯片。
进一步地，Ezrin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，补体C4-A前体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，纤维蛋白原α链前体1亚型的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
进一步地，微管蛋白(TUBB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述标志物在制备治疗过敏性紫癜的药物中的应用。
进一步地，过敏性紫癜为儿童过敏性紫癜。
本发明的有益效果：
本发明为中国汉族HSP和HSPN儿童提供了潜在的血清肽生物标志物，从8个显著不同的多肽中鉴定出EZR、C4A、TUBB和FGA可以作为中国汉族儿童HSP和HSPN的潜在血清生物标志物，并通过ELISA对蛋白进行了验证。
附图说明
图1为质谱分析检测结果图；
图2为EZR、TUBB、C4A和FGA蛋白ELISA分析检测结果图；
图3为不同组合方式下不同预测因子的Roc曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
1、患者和样本
本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准(No：XJTUIAF2021LSK-023)。所有空腹血清样本均采集于2019年6月至2020年6月西安交通大学第一附属医院儿科HSP患者，经患者父母同意。
入组标准为：(1)患者年龄在4～14岁之间；(2)患者被诊断为HSP；(3)伴有其他继发性肾病、其他自身免疫性疾病、内分泌疾病、先天性或遗传性疾病、肿瘤的病例被排除在本研究之外。此外，还收集了健康志愿者的空腹血清。
76例来自38例治疗前和治疗后HSP患者的血清样本(平均年龄74±2.36；60％男性，40％女性)和22名健康对照组(平均年龄6.87±2.53；56.25％为男性，43.75％为女性)。所有血清样本均在3mL无抗凝剂的真空管中收集，室温保存在4小时以下，2000×g离心20min，-80℃保存至使用。
酶联免疫吸附试验(ELISA)验证仅验证了治疗前的HSP患者和健康对照组，因为在治疗前和治疗后的HSP患者之间的蛋白质观察没有显著差异。经过6个月的随访，根据中国医学协会儿科学会肾脏学组的指南，HSP患者中有30例出现紫癜肾炎(HSPN)，因此ELISA的血清样本来自62例非HSPN患者(NHSPN患者)、30例HSPN患者和38例健康对照组(平均年龄8.42±1.74；54.2％的男性，45.8％的女性)。样品按上述描述进行处理和存储。NHSPN和HSPN患者的一般资料见表1。
根据有腹部症状和粪便隐血阳性有无，将92例HSP患者重新分类为29例腹型(AB-HSP)和63例非腹型(NAB-HSP)，并与38例健康患者(平均8.42±1.74；54.2％的男性，45.8％的女性)。AB-HSP和NAB-HSP患者的一般资料见表2。
表1 HSP和HSPN儿童的基线特征
Figure BDA0003271918990000041
表2 BAB-HSP和NAB-HSP儿童的基线特征
Figure BDA0003271918990000042
Figure BDA0003271918990000051
WBC：白细胞计数，PLT：血小板计数，MPV：平均血小板体积，N/L：中性粒细胞与淋巴细胞之比率，P/L：血小板与淋巴细胞之比，ESO：嗜酸性粒细胞，β2-MG：β2-微球蛋白，ALB：白蛋白，FOBT：粪便隐匿血检测。a表示：与HSPN或AB-HSP相比，P值小于0.05。
实施例2质谱分析
血清样本的分离采用液体芯片-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术。磁珠在涡旋装置上彻底混合至少1min，然后将5μL血清样品用标准薄壁PCR管中的10μL结合缓冲液稀释，加入10μL的MB-WCX珠，然后通过机器人的混合特性仔细混合。室温孵育5min后，将管放入磁分离器，收集管壁上的珠子1min，直到上清清，然后用100μL洗涤缓冲液洗涤3次。在逐步应用样品和MB-WCX分离后，我们洗脱肽部分，用5μL洗脱溶液和5μL稳定缓冲液从磁珠中洗脱肽部分。在50％乙腈中使用1μL的MALDI-TOF4-羟基肉桂酸(布鲁克谷酸)上发现洗脱肽，并将0.5％三氟乙酸添加到MALDI锚芯片表面两次。为了保障质谱的重现性和稳定性，每个样本进行三次分析，其结果见图1。
图1中，A为治疗前血清样本HSP质谱分析结果；B为健康对照组血清样本的质谱分析结果；C为治疗后血清样本HSP质谱分析结果，代表性质量范围为1至10kDa。
D为健康对照组(图中部)、治疗前HSP(图中下部)和治疗后HSP(图中上部)血清样本的凝胶视图，质量范围为1至10kDa，显示每个样本重复之间的变异性较低。
E体现了主成分分析中两个差异最大的HSP峰：治疗前HSP患者、治疗后HSP患者和健康对照组(m/z:743，1620)。
根据图1的检测结果可知，治疗前HSP患者、治疗后HSP患者和健康对照组的蛋白质组学谱为1～10kDa。在这个质量范围内，检测到三组间的差异表达峰。成分分析显示，治疗前HSP患者(E中“×”形区域)与健康对照组(E中圆形区域)之间只有少数重叠区域，但治疗前和治疗后HSP患者(E中矩形区域)之间有大量重叠区域，说明患者和健康样本被准确区分，可能无法评估治疗的有效性。
实施例3 ClinProTools分析
采用FlexControl 2.0软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2×30次)之后生成质谱图，获得由不同质核比(m/z)组成的蛋白多肽谱图。采用ClinProTools 2.1软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列；应用遗传算法对各差异蛋白的敏感性及特异性进行初步评价，建立判别模型并验证。找出组间具有显著差异的蛋白多肽峰值(P<0.001)。
在所有分析组中共鉴定出97个峰，8/90峰的丰度在治疗前HSP患者和健康对照之间具有统计学意义的显著变化(P<0.0001，倍变化>1.6、基于Wilcoxon秩和检验)(表1)。峰值1-7(峰值1m/z：1468.34；峰值2m/z：1781.3；峰值3m/z：1619.6；峰值4m/z：1229.16；峰值5m/z：1743.26；峰值6：1694.12；峰值7m/z：1868.53)在治疗前HSP患者血清样本中上调，在治疗后略有下调，但倍数变化小于1.5。相比之下，与健康对照组相比，治疗前HSP患者的峰值8(峰值8，m/z：1947.6)倾向于下调，而在治疗后患者中略有上调，同样，倍数变化小于1.5多个(表3)。
表3对照组和治疗前HSP患者中8种差异表达蛋白的平均水平
Figure BDA0003271918990000071
所有8个肽峰(峰1，m/z：1468.34，峰2m/z：1781.3；峰3m/z：1619.6，峰41229.16，峰51743.26，峰61694.121868.53，峰81947.6)存在显著差异(表3)采用LC/MS-ESI-MS和Uniprot数据库确定。这些肽的MS/MS谱鉴定蛋白包括ALB、C4A、TUBB、FGA、EZR(表4)。这8个肽序列被进一步鉴定为C4A1338-1352(m/z：1781.22)、TUBB363-379(m/z：1868.41)、FGA558-574、587-601(m/z：1694.05)、EZR194-209(m/z：1947.41)(表4)。
表4对照组和治疗前HSP患者中8个差异表达峰的序列鉴定
Figure BDA0003271918990000081
实施例4多肽类物质的鉴定
磁珠提取后肽段溶液与800ul 5％乙腈0.5％甲酸溶液混合，加入1.5ml的超虑管小于10kDa，在低温离心机中设置20℃，7000转离心40min，浓缩至500ul。脱盐，最后用70％甲醇0.5％甲酸洗脱多肽，收集浓缩至100ul。Zip-tip柱处理浓缩。
1、毛细管高效液相色谱
每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC 1200进行分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈溶液。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到质谱预柱C18trap column(C18 3μm 0.10×20mm)，再经分析柱C18 column(C18 1.9μm 0.15×120mm)分离，流速为600nl/min。
2、质谱鉴定及数据分析
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Orbitrap Fusion质谱仪(ThermoSceientific)进行质谱分析。使用Sequest和Proteome Discoverer 2.5.0(ThermoScientific)在human Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中搜索质谱。
3、生物信息学分析
鉴定后的蛋白通过Blast2GO(https://www.blast2go.com/)进行GO分析。差异表达蛋白的相互作用网络由默认设置的STRING系统自动构建。
4、通过ELISA分析进行验证
所有血清样本均采用盲法检测，ELISA试剂盒的标准品和样本重复运行3份。EZR、TUBB、C4A、FGA的浓度分别使用人Ezrin ELISA试剂盒、人β-微管蛋白(TUBB)ELISA试剂盒，人类补充体4(C4A)ELISA试剂盒、纤维蛋白原链前体(FGA)ELISA试剂盒进行分析检测，根据制造商的说明，并在450nm处进行测试，其结果如图2所示，图中纵坐标表示蛋白质的浓度。横坐标表示验证的两组，***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。
HSP患者血清EZR、C4A、FGA的浓度分别为17.21±3.11ng/mL、197.55±38.05μg/mL、1553.24±162.82ng/mL，健康对照组血清浓度分别为21.27±3.86ng/mL、163.40±23.11μg/mL、1423.78±115.73ng/mL，EZR、C4A、FGA浓度与健康对照组有明显差异(图-2A，B，C)。TUBB在HSP患者与健康对照组的的血清中浓度的中位数分别为97.15pg/mL和94.79pg/mL，两组间差异无统计学意义(图2D)。
EZR在HSPN和AB-HSP患者中的血清浓度分别为17.78±2.91和16.41±2.64ng/mL，在NHSPN和NAB-HSP患者中的血清浓度分别为16.96±2.88ng/mL和17.50±3.25ng/mL，在健康组的浓度为21.27±3.86ng/mL，统计分析显示与健康组相比，血清EZR在HSPN和NHSPN组存在显著降低(图2-E)，同样的在AB-HSP和NAB-HSP组亦存在显著降低(图2-I)。
C4A和FGA在HSPN和AB-HSP患者的血清浓度分别为205.72±35.39μg/mL、1592.42±125.03ng/mL和195.79±39.43μg/mL、1562.53±56.57ng/mL，在NHSPN和NAB-HSP患者的血清浓度分别为195.42±27.56μg/mL、1530.14±145.46ng/mL和198.21±37.90μg/mL、1557.63±85.92ng/mL。健康对照组为163.40±23.11μg/mL，1423.78±115.73ng/mL。
统计分析显示HSPN和NHSPN患者C4A和FGA浓度较健康对照组明显升高(图2F，G)，而AB-HSP和NAB-HSP患者也明显高于健康对照组(图2-J，K)。TUBB在HSPN和AB-HSP患者中的浓度分别为96.36pg/mL和96.53pg/mL，在NHSPN和NAB-HSP患者分别为98.08pg/mL和94.64pg/mL，在健康对照组为94.79pg/mL，三组间差异无统计学意义(图2H，L)。HSPN组与NHSPN组、AB-HSP组与NAB-HSP组4项指标均无统计学差异(图2A-L)。
实施例5统计学分析
采用SPSS软件和GraphPad软件进行统计分析。所有数据均显示为平均±标准或中位数和范围四分位数，P<0.05被认为具有统计学意义。定量数据比较采用T检验、单因素方差分析检验、曼-惠特尼U检验和克鲁斯卡尔-沃利斯H检验。分类变量的比较采用卡方检验。根据单因素分析的结果，选择有统计学差异的变量进行逻辑回归分析。确定预测变量，并绘制ROC曲线，以达到AUC值，其结果见图3。
单因素分析显示，健康对照组与HSP患者之间的EZR、C4A、FGA的差异均有统计学意义。(图2A，B，C)。NHSPN和HSPN患者的发病年龄和血清IgA比较有统计学意义(表1)。AB-HSP和NAB-HSP患者的血清PLT、WBC、IgM、ALB和D二聚体比较有统计学意义(表2)。
多变量逻辑回归分析显示，血清EZR和C4A是HSP的独立危险因素，EZR和C4A联合使用的ROC曲线AUC为0.926,95％置信区间为0.869-0.984，P值小于0.001，Youden指数为78.6％，灵敏度为78.6％，特异性为100％(图3A)。
血清C4A和IgA是HSP肾损伤的独立危险因素，C4A和IgA联合治疗的ROC曲线AUC为0.816,95％置信区间为0.866-0.945，P值为0.001，Youden指数为0.559，敏感性为63.6％，特异性为92.3％(图3B)。
血清D-二聚体是腹型HSP的独立危险因素，ROC曲线的AUC为0.927,95％置信区间为0.839～1.000，P值小于0.001，Youden指数为0.757，敏感性为97.1％，特异性为78.6％(图3C)。
本研究生成了HSP患者的血清蛋白组图谱，可准确区分HSP患者与健康对照组，但治疗前后没有显著差异，表明HSP是一个自限和自身免疫性疾病，需要很长时间免疫炎症反应消失。在治疗前HSP患者和健康对照中，选择8个丰度变化最显著的肽进行进一步鉴定。7个上调肽被鉴定为ALB肽区(Peek1m/z：1228.95、Peek3m/z：1468.43，Peek4m/z：1619.53)、C4A(Peek2m/z：1781.22)，TUBB(Peek5m/z：1868.41)，FGA(Peek6m/z：1694.05，Peek7m/z：1743.25)，一个下调肽被鉴定为EZR肽区(Peek8m/z：1947.41)。
重要的是，EZR、C4A、FGA、TUBB四种潜在的血清生物标志物使用ELISA进行了验证，通过在NHSPN、HSPN患者和健康对照组中的全蛋白表达来验证。ELISA结果显示，NHSPN和HSPN患者中C4A和FGA蛋白的表达量高于健康对照组，但HSPN患者与NHSPN患者之间的差异无统计学意义。NHSPN和HSPN患者的EZR蛋白水平低于健康对照组，HSPN患者与NHSPN患者之间无统计学差异。与健康对照组相比，NHSPN和HSPN患者中TBUU的表达没有明显增加或降低。
AB-HSP和NAB-HSP患者，AB-HSP和NAB-HSP患者的血清EZR蛋白水平显著低于健康对照组，但AB-HSP与NAB-HSP患者之间无统计学差异。AB-HSP和NAB-HSP患者中C4A和FGA蛋白的表达均高于健康对照组，同样，AB-HSP和NAB-HSP患者之间也无显著性差异。与健康对照组相比，AB-HSP和NAB-HSP患者中TBUU的表达没有显著增加或降低。
EZR是Ezrin/Radixin/Moesin(ERM)家族的成员，是一种高度保守的蛋白，是一种含有n端FERM结构域和C端ERM结构域的细胞质外周蛋白。在其活性模式下，苏氨酸和酪氨酸激酶可以磷酸化C端苏氨酸567(Thr567)上的ezrin，从而稳定蛋白质的构象。
本发明为中国汉族HSP和HSPN儿童提供了潜在的血清肽生物标志物，从8个显著不同的多肽中鉴定出EZR、C4A、TUBB和FGA可以作为中国汉族儿童HSP和HSPN的潜在血清生物标志物，并通过ELISA对蛋白进行了验证。
序列表
<110> 西安交通大学医学院第一附属医院
<120> 一种过敏性紫癜的标志物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Ile Asn Tyr Phe Glu Ile
1 5 10 15
Lys Asn
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Gly Phe Lys Ser His Ala Leu Gln Leu Asn Asn Arg Gln Ile Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Glu Ser Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Gly Asp Ser Thr Phe Glu Ser Lys Ser Tyr
1 5 10 15
Lys
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Met Ala Val Thr Phe Ile Gly Asn Ser Thr Ala Ile Gln Glu Leu
1 5 10 15
Phe Lys Arg

Claims (10)

1.一种过敏性紫癜的标志物，其特征在于，所述标志物包括Ezrin蛋白、补体C4-A前体、微管蛋白和纤维蛋白原α链前体1亚型中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物为Ezrin蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的标志物，其特征在于，所述过敏性紫癜为儿童过敏性紫癜。
4.检测标志物的试剂在制备诊断和/或预后检测过敏性紫癜的产品中的应用，其特征在于，所述标志物包括Ezrin蛋白、补体C4-A前体和纤维蛋白原α链前体1亚型中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒和芯片。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Ezrin蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述补体C4-A前体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纤维蛋白原α链前体1亚型的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
9.权利要求1所述的标志物在制备治疗、诊断和/或预后检测过敏性紫癜的药物中的应用。
10.根据权利要求4或9所述的应用，其特征在于，所述过敏性紫癜为儿童过敏性紫癜。
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