CN114034680A - 一种同时检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的方法：确定硫氰酸钠和过氧化氢在生鲜乳中定性检测的特征峰；根据特征峰的峰强与浓度的关系，分别绘制硫氰酸钠标准曲线和过氧化氢标准曲线；在待测样品中加入蛋白沉淀剂，然后离心分层，取上层的提取液待测；在拉曼光谱的检测池中，加入提取液作为样品，再加入金属溶胶和团聚剂，混匀进行拉曼光谱检测；对采集的光谱进行平滑降噪预处理后分析定性特征峰位移处的峰强，将峰强带入到对应的标准曲线中，即可得到硫氰酸钠和过氧化氢的浓度。本发明样品预处理简单且无有毒试剂使用、灵敏性高、不需大型仪器设备、耗时短，配合手持拉曼分析仪能实现现场和户外的快速、高通量、实时分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱同时检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的方法，属于生鲜乳掺假检测技术领域。
背景技术
随着奶粉、酸奶、奶酪等乳制品种类以及消费量的增加，生鲜乳的质量安全是乳制品行业稳定发展的基石。然而，添加各种化学物质(如三聚氰胺、碳酸钠、乳清、硫氰酸钠和过氧化氢)的生鲜乳掺假，这有可能导致严重的健康问题。
硫氰酸钠是一种医学、化学、印染等行业常用的化工原料，同时也是天然存在于动物组织以及分泌液中的一种物质。牛乳中硫氰酸根的天然含量约为 5μg/mL-8.5μg/mL，是牛乳中起抑菌功能的过氧化物酶体系的组成部分。过氧化物酶体系的激活需要硫氰酸根的浓度达到20μg/mL左右，因此使用这种体系抑制牛奶中的细菌繁殖还需向牛奶中添加约15μg/mL的硫氰酸盐。但硫氰酸钠是一种致甲状腺肿因子,血浆中过高的硫氰酸根离子浓度会抑制甲状腺对碘的吸收从而导致非缺碘性甲状腺肿。对于孕妇、婴儿以及碘缺乏地区人口的危害更大。因此市售牛奶以及婴儿配方乳粉中过高的硫氰酸钠浓度将会增大瓶装牛奶哺乳的婴儿甲状腺功能紊乱的风险。从2008年起我国开始禁止在乳及乳制品中加入硫氰酸钠作为防腐剂，但由于乳品中硫氰酸钠的本底值，为加强乳制品中非法添加物的监管力度，防范乳品风险，总局将液态乳中硫氰酸钠的风险监测参考值确定为10mg/kg。其次，过氧化氢也被报道过曾被添加至生鲜乳中，为了达到延长保质期的作用。过多的H2O2会对牛奶的营养价值带来有害影响，如叶酸的降解，叶酸是人体必需的维生素；摄入高浓度的H2O2会导致严重的胃肠道问题，因此过氧化氢不允许被添加到的生鲜乳中。
目前我国尚未制定出台有关生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的国家检测标准，目前硫氰酸钠多采用分光光度计法和色谱法进行测定，这两种方法检测准确度高，但耗时较长，需要复杂的样本前处理过程和专业人员操作；过氧化氢的分析方法主要采用荧光分析法和电化学生物传感器，这两种方法需要复杂的预处理过程，分析设备通常很昂贵，而且寿命短。
表面增强拉曼光谱(SERS)分析因不需要样品前处理、操作简单、无损、快速的特点，近年来在食品检测的邻域中应用越来越广泛，但是，还没有应用表面增强拉曼光谱快速分析生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何同时检测生鲜乳中的硫氰酸钠和过氧化氢。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的方法，包括以下步骤，
步骤S1：确定硫氰酸钠和过氧化氢在生鲜乳中定性检测的特征峰；
步骤S2：根据特征峰的峰强与浓度的关系，分别绘制硫氰酸钠标准曲线和过氧化氢标准曲线；
步骤S3：在待测生鲜乳中加入蛋白沉淀剂，然后离心分层，取上层的提取液待测；
步骤S4：在拉曼光谱的检测池中，加入提取液作为样品，再加入金属溶胶和团聚剂，混匀进行拉曼光谱检测；对采集的光谱进行平滑降噪预处理后分析定性特征峰位移处的峰强，将峰强带入到对应的标准曲线中，即可得到硫氰酸钠和过氧化氢的浓度。
优选地，所述步骤S1中硫氰酸钠、过氧化氢在生鲜乳中定性检测的特征峰分别为2124cm-1和1394cm-1。
优选地，所述步骤S2中硫氰酸钠标准曲线的绘制方法为：取不同质量的硫氰酸钠加入生鲜乳混合均匀，得到不同浓度的掺假生鲜乳样品，对掺假生鲜乳进行测定，取2124cm-1处的特征峰强与硫氰酸钠的浓度制定标准曲线，相关方程为Y1＝98.475X1+455.213，其中，X1表示硫氰酸钠的物质浓度，单位mg/L，Y1表示硫氰酸钠的信号峰强度，取相关系数R2＝0.9909；过氧化氢标准曲线的绘制方法为：取不同质量的过氧化氢加入生鲜乳混合均匀，得到不同浓度的掺假生鲜乳样品，对掺假生鲜乳进行测定，取1394cm-1处的特征峰强与过氧化氢的浓度制定标准曲线，相关方程为Y2＝-73.841X2+1.6×104，其中，X2表示过氧化氢的物质浓度，单位mg/L，Y2表示过氧化氢的信号峰强度，取相关系数R2＝0.9940。
更优选地，所述硫氰酸钠标准曲线绘制时，掺假生鲜乳样品含有硫氰酸钠的浓度分别取0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L；所述过氧化氢标准曲线绘制时，掺假生鲜乳样品含有过氧化氢的浓度分别取0mg/L、 40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。
优选地，所述步骤S3具体为：按质量分数计，取1份的待测生鲜乳，加入 0.8-1份蛋白沉淀剂超声或旋涡混合1-2min，将混合液在8000-12000rpm/min下离心分层2-3min，取上层的提取液待测；所述的蛋白沉淀剂为质量百分浓度为 8-15％的三氯乙酸水溶液。
优选地，所述步骤S4中提取液、金属溶胶、团聚剂的质量比为1:0.1-2:0.1-1。
优选地，所述步骤S4中的金属溶胶为银纳米溶胶，团聚剂为L-半胱氨酸。
更优选地，所述银纳米溶胶中银纳米粒子的粒径在40-65nm之间；L-半胱氨酸的摩尔浓度为0.001M至其饱和液。
优选地，所述步骤S4中拉曼光谱的检测条件为：激光波长785nm，功率 10-50mw，激光扩束器直径5-10mm，采集时间3-5s/次，样品温度25±5℃；选择不同位置的6个点采集，取平均光谱为样品的拉曼光谱。
优选地，所述步骤S4中硫氰酸钠浓度的分析方法为：将样品在2124cm-1位移处的信号强度与硫氰酸钠标准曲线比较，确定样品中硫氰酸钠含量；过氧化氢浓度的分析方法为：将样品在1394cm-1位移处的信号强度与过氧化氢标准曲线比较，确定样品中过氧化氢含量。
本方法测定快速、准确，此外利用手持式拉曼光谱仪，采用本发明的方法可以方便的实现现场、户外生鲜乳中硫氰酸钠含量的实时、快速、准确测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明的检测方法可以对生鲜乳中的硫氰酸钠和过氧化氢同时进行定性和定量分析，方便快捷且适用性强。
2)本发明提供的快速检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢含量的方法无需复杂的样品处理，测定过程简单、快速，具有很好的实际应用价值。
附图说明
图1为纳米银粒子的紫外可见分光光谱图；
图2为Ag NPs、L-半胱氨酸+Ag NPs、硫氰酸钠+Ag NPs、硫氰酸钠+L-半胱氨酸+AgNPs的拉曼光谱图；
图3为L-半胱氨酸粉末、Ag NPs、L-半胱氨酸+Ag NPs、L-半胱氨酸+Ag NPs+3％过氧化氢的拉曼光谱图；
图4为生鲜乳中硫氰酸钠浓度为0、20、40、60、80、100mg/L的拉曼光谱图；
图5为硫氰酸钠的标准曲线；
图6为生鲜乳中过氧化氢浓度为0、40、80、120、160、200mg/L的拉曼光谱图；
图7为过氧化氢的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
本发明中若无特别说明，各百分比均指质量百分比。
实施例1：确定硫氰酸钠和过氧化氢的定性特征峰
SERS基底的制备：在一个干净的圆底烧瓶中加入100mL 0.18g/L硝酸银，将液体加热至沸腾后，快速加入2mL 1％柠檬酸钠溶液，反应1h，当溶液最终变成灰黄色时，停止加热。然后冷却至室温，得到原始的银纳米粒子(Ag NPs)，在12000rpm/min的条件下离心5min，去除一半上清液，加水后再次离心，以上操作重复3次，最终得到可用于SERS检测的基底。
SERS基底的表征：用超纯水将Ag NPs稀释10倍，然后用紫外-可见分光光度计在200～600nm处测量了Ag NPs的最大紫外吸收波长。由图1可知，Ag NPs 的最大紫外吸收波长在400nm处，纳米粒子的尺寸在40nm左右。
硫氰酸钠定性特征峰的确定：测定Ag NPs、L-半胱氨酸+Ag NPs的混合溶液、硫氰酸钠+Ag NPs的混合溶液、硫氰酸钠+L-半胱氨酸+Ag NPs的混合溶液的拉曼光谱图。表面增强拉曼光谱参数：激发光波长为785nm，功率350mW，光谱采集范围170-3900cm-1，光谱分辨率4cm-1，探头工作距离7.5mm，光斑直径小于2mm，积分时间3s。如图2所示为所得光谱图，表明在L-半胱氨酸聚集剂的作用下，Ag NPs增强了硫氰酸钠的拉曼信号，最终选择2124cm-1位移处作为硫氰酸钠的定性特征峰。
过氧化氢定性特征峰的确定：测定L-半胱氨酸粉末、Ag NPs、L-半胱氨酸+Ag NPs的混合溶液、L-半胱氨酸+Ag NPs+3％过氧化氢的混合溶液的拉曼光谱图。表面增强拉曼光谱参数：激发光波长为785nm，功率350mW，光谱采集范围170-3900cm-1，光谱分辨率4cm-1，探头工作距离7.5mm，光斑直径小于2mm，积分时间15s。如图3所示为所得光谱图，L-半胱氨酸+Ag NPs的混合溶液在 1394cm-1位移处有很强的拉曼信号峰，而在加入过氧化氢溶液后，因为过氧化氢的强氧化性导致银纳米粒子被氧化，从而1394cm-1位移处信号消失。由此可将1394cm-1位移处的信号峰作为过氧化氢的定性特征峰。
实施例2：硫氰酸钠和过氧化氢标准曲线的制定
生鲜乳中硫氰酸钠标准溶液的制备：在270μL生鲜乳中加入30μL不同浓度 (0、20、40、60、80、100mg/L)的硫氰酸钠标准溶液，再加入300μL的15％三氯乙酸。然后，将混合物离心处理5分钟(4℃，12000rpm/min)。将10μL上清液、10μL Ag NPs和10μL L-半胱氨酸充分混合，静置1min，然后进行拉曼检测。
生鲜乳中过氧化氢标准溶液的制备：在270μL生鲜乳中加入30μL不同浓度 (0、40、80、120、160、200mg/L)的过氧化氢标准溶液，再加入300μL的15％三氯乙酸。然后，将混合物离心处理5分钟(4℃，12000rpm/min)。将5μL上清液、10μL Ag NPs和10μL L-半胱氨酸充分混合，静置1min，然后进行拉曼检测。
拉曼光谱参数：激发光波长为785nm，功率350mW，光谱采集范围 170-3900cm-1，光谱分辨率4cm-1，探头工作距离7.5mm，光斑直径小于2mm，积分时间3s。
硫氰酸钠的标准曲线：如图4所示为，生鲜乳中硫氰酸钠浓度为0、20、40、 60、80、100mg/L的表面增强拉曼光谱图，在2124cm-1位移处信号峰强度随浓度的升高而增强。因此，分析了2124cm-1位移处信号峰强度和浓度的关系，建立了线性方程如图5所示。
过氧化氢的标准曲线：如图6所示为，生鲜乳中过氧化氢浓度为0、40、80、 120、160、200mg/L的表面增强拉曼光谱图，在1394cm-1位移处信号峰强度随浓度的升高而降低。因此，分析了1394cm-1位移处信号峰强度和浓度的关系，建立了线性方程如图7所示。
实施例3：生鲜乳样品中硫氰酸钠和过氧化氢的检测
为了验证此方法的准确性，实验室制备了10个盲样作为待测样品，在1000μL 生鲜乳中加入1000μL的15％三氯乙酸，离心处理5分钟(4℃，12000rpm/min)。将5μL上清液、10μLAg NPs和10μL L-半胱氨酸充分混合，静置1min，然后在激发光波长为785nm，功率350mW，光谱采集范围170-3900cm-1，光谱分辨率 4cm-1，探头工作距离7.5mm，光斑直径小于2mm，积分时间3s，条件下进行拉曼光谱检测。将获取的拉曼光谱进行平滑降噪及基线平移处理，将2124cm-1和 1394cm-1位移处信号峰强度，分别带入硫氰酸钠和过氧化氢的标准曲线中(硫氰酸钠：Y1＝98.475X1+455.213；过氧化氢：Y2＝-73.841X2+1.6×104，X表示物质浓度，Y表示信号峰强度)，计算出它们各自的浓度。
表1生鲜乳样品中硫氰酸钠和过氧化氢的检测结果
Claims (10)
1.一种同时检测生鲜乳中硫氰酸钠和过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤S1：确定硫氰酸钠和过氧化氢在生鲜乳中定性检测的特征峰；
步骤S2：根据特征峰的峰强与浓度的关系，分别绘制硫氰酸钠标准曲线和过氧化氢标准曲线；
步骤S3：在待测生鲜乳中加入蛋白沉淀剂，然后离心分层，取上层的提取液待测；
步骤S4：在拉曼光谱的检测池中，加入提取液作为样品，再加入金属溶胶和团聚剂，混匀进行拉曼光谱检测；对采集的光谱进行平滑降噪预处理后分析定性特征峰位移处的峰强，将峰强带入到对应的标准曲线中，即可得到硫氰酸钠和过氧化氢的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中硫氰酸钠、过氧化氢在生鲜乳中定性检测的特征峰分别为2124cm-1和1394cm-1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中硫氰酸钠标准曲线的绘制方法为：取不同质量的硫氰酸钠加入生鲜乳混合均匀，得到不同浓度的掺假生鲜乳样品，对掺假生鲜乳进行测定，取2124cm-1处的特征峰强与硫氰酸钠的浓度制定标准曲线，相关方程为Y1＝98.475X1+455.213，其中，X1表示硫氰酸钠的物质浓度，单位mg/L，Y1表示硫氰酸钠的信号峰强度，取相关系数R2＝0.9909；过氧化氢标准曲线的绘制方法为：取不同质量的过氧化氢加入生鲜乳混合均匀，得到不同浓度的掺假生鲜乳样品，对掺假生鲜乳进行测定，取1394cm-1处的特征峰强与过氧化氢的浓度制定标准曲线，相关方程为Y2＝-73.841X2+1.6×104，其中，X2表示过氧化氢的物质浓度，单位mg/L，Y2表示过氧化氢的信号峰强度，取相关系数R2＝0.9940。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫氰酸钠标准曲线绘制时，掺假生鲜乳样品含有硫氰酸钠的浓度分别取0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L；所述过氧化氢标准曲线绘制时，掺假生鲜乳样品含有过氧化氢的浓度分别取0mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：按质量分数计，取1份的待测生鲜乳，加入0.8-1份蛋白沉淀剂超声或旋涡混合1-2min，将混合液在8000-12000rpm/min下离心分层2-3min，取上层的提取液待测；所述的蛋白沉淀剂为质量百分浓度为8-15％的三氯乙酸水溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中提取液、金属溶胶、团聚剂的质量比为1:0.1-2:0.1-1。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中的金属溶胶为银纳米溶胶，团聚剂为L-半胱氨酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述银纳米溶胶中银纳米粒子的粒径在40-65nm之间；L-半胱氨酸的摩尔浓度为0.001M至其饱和液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中拉曼光谱的检测条件为：激光波长785nm，功率10-50mw，激光扩束器直径5-10mm，采集时间3-5s/次，样品温度25±5℃；选择不同位置的6个点采集，取平均光谱为样品的拉曼光谱。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中硫氰酸钠浓度的分析方法为：将样品在2124cm-1位移处的信号强度与硫氰酸钠标准曲线比较，确定样品中硫氰酸钠含量；过氧化氢浓度的分析方法为：将样品在1394cm-1位移处的信号强度与过氧化氢标准曲线比较，确定样品中过氧化氢含量。
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