CN114032286A - 一种幽门螺旋杆菌检测板及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种幽门螺旋杆菌检测板及检测方法，该检测板包括吸收纸，所述吸收纸由定性滤纸浸泡在液浸泡液后干燥而得，所述浸泡液包括尿素酶底物，所述尿素酶底物为包含有显色基团的有机物。利用该检测板对患者的牙垢进行检测，患者牙垢中含有幽门螺旋杆菌分泌的尿素酶，尿素酶能使尿素酶底物分解，同时释放出显色基团，即显现出明亮的颜色，从而判断幽门螺旋杆菌的存在。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌检测板及检测方法。
背景技术
幽门螺杆菌生存于人体胃幽门部位，是最常见的细菌病原体之一。世界有多半人口受到过幽门螺杆菌的感染，而在有些国家几乎90%的人都感染过这种细菌。人们通常是在幼年时就受到感染，5岁以下达到50%。这种细菌感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者则发展为胃癌。
幽门螺杆菌的检查目前主要有直接检测法、C13-同位素呼吸检测法和试纸检测法等。幽门螺旋杆菌直接检查是指通过胃镜检查钳取胃粘膜(多为胃窦粘膜)作直接涂片、染色，组织切片染色及细菌培养来检测幽门螺旋杆菌。C13同位素呼吸试验检测法的原理是测试者口服C13尿素胶囊，胶囊进入胃部后，如果胃部存在幽门螺杆菌，则此菌就会分泌尿素酶水解尿素，尿素被水解后形成CO2（二氧化碳）随血液进入肺部并以气体排出，然后检测患者呼出的气体中有没有被标记的C13，如果有，则代表存在幽门螺杆菌。间接尿素酶检测法的原理是幽门螺杆菌产生的部分尿素酶会随食道进入口腔，测试时取牙齿缝隙中的牙垢，如果牙渍中含有尿素酶，则尿素酶会把尿素分解，产生氨气，氨气使湿润的酚酞试纸变红，从而判断幽门螺旋杆菌的存在。
现有技术的缺点和不足：
（1）直接检测法：需要取胃粘膜，测试者比较痛苦，心理负担大；需要制作图片、染色或细菌培养，对操作人员有较高的技术要求；需要其它的辅助设备，成本较高；耗时很长。
（2）同位素呼吸试验检测法：需要操作大型仪器，对操作人员有很高的技术要求；需要大型辅助设备，成本很高；需要空腹等待，耗时较长。
（3）间接尿素酶检测法：属于间接检测，检测的反应产物为气体，特异性不强，不易掌控，且试纸易受空气中二氧化碳的影响，准确度和灵敏性都不高。
发明内容
针对现有幽门螺旋杆菌检测的问题，本发明提出一种幽门螺旋杆菌检测板及检测方法，以方便、快速、准确的检测幽门螺旋杆菌。
一种幽门螺旋杆菌检测板，包括吸收纸，所述吸收纸由定性滤纸浸泡在液浸泡液后干燥而得，所述浸泡液包括尿素酶底物，所述尿素酶底物的化学结构式为：
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测板，其中，所述浸泡液还包括：
缓冲液；
聚乙二醇；
海藻糖。
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测板，其中，所述尿素酶底物的质量为所述浸泡液的质量的0.08%~0.2%。
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测板，其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测板，其中，所述缓冲液、所述聚乙二醇和所述海藻糖的质量比为50：（0.1~0.5）：（0.1~0.5）。
本发明还公开了一种幽门螺旋杆菌检测方法，应用于上述任意一项所述的幽门螺旋杆菌检测板，所述方法包括步骤：
制备处理液，所述处理液含有8~12g/L碳酸氢钠的磷酸盐-吐温20缓冲液和5~15mg/L还原性谷胱甘肽；
取适量牙垢，溶解在制备好的处理液中，并充分摇匀，得到待检测溶液；
将所述待检测溶液滴在所述幽门螺旋杆菌检测板的检测孔中，并观察检测孔中显现的颜色。
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测方法，其中，所述处理液还包括蔗糖。
进一步的，上述幽门螺旋杆菌检测方法，其中，所述蔗糖的质量为所述处理液质量的30%~40%。
本发明中，采用含有尿素酶底物浸泡液来浸泡吸收纸，从而制备检测板，该尿素酶底物中含有显色基团。患者的牙垢中含有幽门螺旋杆菌分泌的尿素酶，尿素酶能使尿素酶底物分解，同时释放出显色基团，即显现出明亮的颜色，从而判断幽门螺旋杆菌的存在。相交于传统的检测手段，本发明特异性强，准确度和效率较高，无需专业技术，操作简单，且不需要辅助设备，成本低廉，更重要的是，显色物是非气体物质，容易把控，且显色物不易受环境影响，显色后能长时间保持，显色效果明显，容易判断。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的幽门螺旋杆菌检测板的剖视结构示意图；
图2为本发明实施例中的幽门螺旋杆菌检测板的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。实施例中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
实施例1
请参阅图1和图2，为本发明实施例1中的幽门螺旋杆菌检测板，该幽门螺旋杆菌检测板包括可相互扣合的上壳体10和下壳体20，以及压制于上壳体10和下壳体20的两层玻璃纤维纸30，以及粘连在两层玻璃纤维纸30之间的吸收纸40。该上壳体10上开设有两个观察孔11，靠近该上壳体10的一侧玻璃纤维纸30上开设有与该观察孔11对应的通孔，以使该吸收纸40裸露在该观察孔中。该吸收纸40由定性滤纸浸泡在液浸泡液后干燥而得，具体实施时，该吸收纸40可选择多层定性滤纸重叠形成，例如本实施例中由十层定性滤纸重叠形成。该浸泡液包括尿素酶底物，该尿素酶底物为：
1，3-bis((5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl)oxy)ureaenzyme substtrate，或者为3-bis(4-nitrophenoxy)ureaenzyme substtrate，其化学结构式分别为：
具体的，该浸泡液还包括：缓冲液、聚乙二醇和海藻糖。该缓冲液、聚乙二醇和二糖主要起到对该尿素酶底物的保护作用。该缓冲液采用磷酸盐缓冲液，具体为PH值为7.2的磷酸盐缓冲液，以用于保持尿素酶底物的PH值的稳定性，抵消或减轻外部环境对该尿素酶底物的酸碱度影响，以免使尿素酶底物破坏。聚乙二醇和海藻糖在本实施例中均作为稳定剂，以保护尿素酶底物的稳定性。吸收纸由含有尿素酶底物的浸泡液浸泡后干燥所得，在吸收纸上的浸泡液干燥后，该聚乙二醇和海藻糖能取代水或作为玻璃样稳定剂。
并且，该海藻糖在幽门螺旋杆菌检测过程中作为尿素酶的激活剂与稳定剂的作用。本实施例中的检测板其检测原理是利用尿素酶使尿素酶底物分解以释放出显色基团，来判断幽门螺旋杆菌的存在。当含有尿素酶的溶液滴入该吸收纸上时，尿素酶与尿素酶底物反应，在该反应中，吸收纸上的海藻糖在生物酶制剂的反应中可以起到激活剂与稳定剂的作用，能阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变性，保持尿素酶的活性。
进一步的，上述浸泡液中，尿素酶底物的质量为所述浸泡液的质量的0.1%。
进一步的，上述浸泡液中，缓冲液、聚乙二醇和海藻糖的质量比为50：0.3：0.3。
具体的，制备该浸泡液的步骤包括：
取PH值为7.2的磷酸盐缓冲液50g，聚乙二醇0.3g，海藻糖的质量0.3g，1，3-bis((5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl)oxy)ureaenzyme substtrate 0.05g加入烧杯中混合搅拌均匀，得到混合溶液，将吸收纸浸泡在该混合溶液中，30min后取出，置于干燥室内干燥备用。
实施例2
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中，该尿素酶底物的质量为0.04g。
实施例3
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中，该尿素酶底物的质量为0.1g。
实施例4
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中，聚乙二醇0.1g，海藻糖0.5g。
实施例5
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中，聚乙二醇0.5g，海藻糖0.1g。
对比例1
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中未加入海藻糖。
对比例2
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
该浸泡液中未加入聚乙二醇和海藻糖。
实施例6
利用上述实施例1至实施例5以及对比例1至2中制备得到的幽门螺旋杆菌检测板进行幽门螺旋杆菌检测，检测步骤包括：
制备处理液，所述处理液含有10g/L碳酸氢钠的磷酸盐-吐温20缓冲液和10mg/L还原性谷胱甘肽；
取适量牙垢，溶解在制备好的处理液中，并充分摇匀，得到待检测溶液；
将所述待检测溶液滴在所述幽门螺旋杆菌检测板的检测孔中，并观察检测孔中显现的颜色。
本发明实施例中的尿素酶底物为含有显色基团的有机物，具体为1，3-bis((5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl)oxy)ureaenzyme substtrate，或者为3-bis(4-nitrophenoxy)ureaenzymesubsttrate。其中，
1，3-bis((5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl)oxy)ureaenzyme substtrate中的显色基团为5-溴-4-氯-3-吲哚，其颜色为红色；3-bis(4-nitrophenoxy)ureaenzymesubsttrat中的显色基团为对硝基苯酚，其颜色为黄色。
患者的牙垢中含有幽门螺旋杆菌分泌的尿素酶，尿素酶能使尿素酶底物分解，同时释放出显色基团，即显现出明亮的颜色，从而判断幽门螺旋杆菌的存在。
1，3-bis((5-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl)oxy)ureaenzyme substtrate和3-bis(4-nitrophenoxy)ureaenzymesubsttrat与尿素酶的反应式分别如下：
具体实施时，上述处理液可采用8~12g/L碳酸氢钠的磷酸盐-吐温20作为缓冲液。该处理液中还添加了还原性谷胱甘肽，其可以作为酶的激活剂，提高尿素酶的活性，进一步促进尿素酶底物的分解。可以理解的，上述处理液中还原性谷胱甘肽的浓度可以为5~15mg/L。
针对上述实施例1至实施例5，以及对比例1和2中的检测板进行有效期限，以及准确性的测试。取30名幽门螺旋杆菌携带者的牙垢，按照上述步骤分别制备待检测溶液。各测试实验中的检测板，在常温的存储环境中存放不同的时间后，对待检测溶液进行检测，测试结果如表1所示。
表1
从表1中可以看出，实施例1至实施例5，以及对比例1及2中的检测板在制备后立即使用时，均能够有效地检测出幽门螺旋杆菌患者，准确率均可达到100%。在存放6个月、18个月，30个月时，实施例1至实施例5中的检测板性质没有发生变化，30名患者均能检测到。存放6个月时，对比例1和对比例2中，分别检测出25和16名患者，存放18个月时，对比例1和对比例2中，分别检测出16和7名患者，存放30个月时，对比例1和对比例2中，分别检测出2和0名患者。由此可知，对比例1和对比例2中的检测板的有效期限较短，可以推测出聚乙二醇和海藻糖有促进尿素酶底物稳定性的作用，使该检测板的保持较长的有效期。
另外，上述测试过程中，分别记录每个实施例中检测板对待检测溶液的反应时间，从实验记录来看，实施例1至实施5，以及对比例1和对比例2中的检测板在滴入待检测溶液后，5min内可以看到检测板变色，即显示显色基团的颜色。
另取适量牙垢溶解在不含有还原性谷胱甘肽的处理液中，滴加在实施1中的检测板中，记录其显色时间为12min，由此，可以看出，还原性谷胱甘肽可以极大的促进尿素酶底物与尿素酶的反应，提高检测效率。
而对比例1和对比例2中，的检测板在滴入待检测溶液后，在12min左右显现颜色。因此，在加入海藻糖后，可以明显地提升尿素酶底物的分解速度。
进一步的，在进行幽门螺旋杆菌检测时，可在处理液中加入一定量的蔗糖，具体实施时，该蔗糖的质量为处理液质量的30%~40%。添加蔗糖的目的是增加样品比重,使得样品能够沉到加样孔底部，而不会漂出来。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种幽门螺旋杆菌检测板，其特征在于，包括吸收纸，所述吸收纸由定性滤纸浸泡在液浸泡液后干燥而得，所述浸泡液包括尿素酶底物，所述尿素酶底物的化学结构式为：
2.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌检测板，其特征在于，所述浸泡液还包括：
缓冲液；
聚乙二醇；
海藻糖。
3.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌检测板，其特征在于，所述尿素酶底物的质量为所述浸泡液的质量的0.08%~0.2%。
4.如权利要求2所述的幽门螺旋杆菌检测板，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求2所述的幽门螺旋杆菌检测板，其特征在于，所述缓冲液、所述聚乙二醇和所述海藻糖的质量比为50：（0.1~0.5）：（0.1~0.5）。
6.一种幽门螺旋杆菌检测方法，其特征在于，应用于上述权利要求1至5任意一项所述的幽门螺旋杆菌检测板，所述方法包括步骤：
制备处理液，所述处理液含有8~12g/L碳酸氢钠的磷酸盐-吐温20缓冲液和5~15mg/L还原性谷胱甘肽；
取适量牙垢，溶解在制备好的处理液中，并充分摇匀，得到待检测溶液；
将所述待检测溶液滴在所述幽门螺旋杆菌检测板的检测孔中，并观察检测孔中显现的颜色。
7.如权利要求6所述的幽门螺旋杆菌检测方法，其特征在于，所述处理液还包括蔗糖。
8.如权利要求7所述的幽门螺旋杆菌检测方法，其特征在于，所述蔗糖的质量为所述处理液质量的30%~40%。
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